使用转座子的用于转化的载体、通过该载体转化的微生物及用其生产L-赖氨酸的方法

摘要

本发明涉及一种使用转座子基因的用于转化的载体，用所述载体转化的微生物，以及用所述微生物生产赖氨酸的方法。

权利要求

1.一种用于转化的载体，其特征在于，包含源自棒状杆菌菌株属微生物的转座子基因片段和多克隆位点，所述转座子基因片段由序列号1和序列号2的核苷酸序列组成，所述多克隆位点位于转座子基因片段之间。

2.权利要求1所述的用于转化的载体，其特征在于，在所述多克隆位点处插入了一个或多个选自下组的基因，所述的组由源自棒状杆菌菌株属微生物的编码天冬氨酸激酶的lysC基因、编码天冬氨酸半醛脱氢酶的asd基因、编码二氢吡啶二羧酸合酶的dapA基因和编码二氢吡啶二羧酸的dapB基因构成。

3.权利要求1所述的用于转化的载体，其特征在于，在所述多克隆位点额外地插入了编码外源性果糖激酶的srk基因。

4.权利要求3所述的用于转化的载体，其特征在于，所述的srk基因源自丙酮丁醇梭菌ATCC824。

5.一种具有L-赖氨酸生产力的谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，其由权利要求1-4中任一项所述的载体转化。

6.权利要求5所述的具有L-赖氨酸生产力的谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，所述转化微生物是谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P。

7.权利要求5所述的具有L-赖氨酸生产力的谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，所述的谷氨酸棒状杆菌是保藏号为KCCM10939P的谷氨酸棒状杆菌。

8.权利要求5所述的具有产L-赖氨酸生产力的谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，插入到转化载体多克隆位点的基因通过二次交换整合到染色体上。

9.一种生产L-赖氨酸的方法，包括以下步骤：将权利要求5-8中任一项所述的微生物进行培养，在细胞中或培养液中产生L-赖氨酸；并从细胞中或培养液中回收赖氨酸。

说明书

使用转座子的用于转化的载体、通过该载体转化的微生物

及用其生产L-赖氨酸的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种使用转座子基因以用于转化的载体、用所述载体转化的微生物以及用所述微生物制备赖氨酸的方法。

背景技术

[0002] 棒状杆菌，尤其是谷氨酸棒杆菌是一种用于生产L-氨基酸的革兰氏阳性微生物。L-氨基酸，特别是L-赖氨酸广泛用于生产动物饲料，人用药物及化妆品。该氨基酸是通过棒状杆菌发酵产生的。

[0003] L-赖氨酸的传统生产方法一般是使用这样的棒状杆菌，其具有增强的L-赖氨酸生物合成相关基因。例如，美国专利US6,746,855记载了一种通过培养棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)生产L-赖氨酸的方法，所述的棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)中的赖氨酸释放载体基因lysE得到了增强，同时还导入了选自下组中的另一基因，该组基因由编码二氢吡啶二羧酸合成酶的dapA、编码天冬氨酸激酶的lysC、编码丙酮酸羧化酶的pyc和编码二氢吡啶二羧酸还原酶的dapB组成。并且，美国专利6,221,636记载了一种用重组DNA转化的棒状杆菌，其对L-赖氨酸和L-苏氨酸的反馈抑制基本不敏感，所述重组DNA包含编码二氨基庚二酸盐脱羧酶和天冬氨酸激酶的DNA序列。

[0004] 在缺乏抗生素抗性序列的情况下增强所述的L-赖氨酸生物合成相关基因，可以提高基因的拷贝数也可以通过突变提高酶活。迄今为止有两种提高基因拷贝数的方法。

[0005] 提高基因拷贝数的两种方法之一是在其内部原有基因的旁边再插入额外的基因形成串联重复序列。另一种方法是在棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)染色体区的一个或多个地方插入额外的基因(US7,160,711)。然而，这些方法均受限于基因插入位点，在插入多个基因时非常困难。为克服该问题，人们试图在基因组rDNA的多拷贝区插入靶基因。据报道，该方法比之前的方法更成功。尽管如此，由于破坏两个或更多个rDNA拷贝会影响微生物的生长，因此该方法仍有不足。

[0006] 转座子也称为插入序列元件，是一种能在染色体或质粒上移动的序列。转座子包括转座酶，转座酶具有识别特定的插入序列的活性。迄今为止，各种细菌中已有数百种转座子被报道(TRANSPOSON-BASEDSTRATEGIES FOR MICROBIAL FUNCTIONAL GENOMICS ANDPROTEOMICS(2003)Annual Review of Genetics 37：3-29Finbarr Hayes)。

发明内容

[0007] 技术问题

[0008] 本发明人试图利用转化载体生产一种能生产高浓度赖氨酸的菌株，所述载体可与位点无关地插入两个或更多靶基因的拷贝而不抑制该微生物的生长。本发明人证实使用转座子基因的用于转化的载体对插入外源基因非常有用，并最终完成了本发明。

[0009] 因此，本发明的目的之一是提供一种使用转座子基因的用于转化的载体。

[0010] 本发明的另一目的是提供一种棒状杆菌属微生物，其通过由所述转化载体转化而具有增强的赖氨酸生产能力。

[0011] 本发明的另一目的是提供一种由所述棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)培养液生产赖氨酸的方法。

[0012] 技术方案

[0013] 为完成上述目标，本发明提供一种包含转座子基因和多克隆位点的用于转化的载体。

[0014] 本发明还提供一种棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)微生物，其通过由所述用于转化的载体转化而具有增强的赖氨酸生产能力。

[0015] 本发明还提供一种由所述棒状杆菌属微生物的培养液生产赖氨酸的方法。

[0016] 有益效果

[0017] 本发明提供一种能够生产高浓度赖氨酸的棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)微生物。其通过将天冬氨酸激酶基因(lysC)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)、二氢吡啶二羧酸合酶基因(dapA)和二氢吡啶二羧酸还原酶基因(dapB)连续的插入到棒状杆菌属基因组上将转座子基因作为多拷贝存在的区域，从而提高了内源生活性，同时还将棒状杆菌原本没有的果糖激酶基因(srk)额外地插入到转座子基因区域从而被赋予了新的活性。

附图说明

[0018] 根据随后描述的优选实施方式和附图，本发明所述物品、特点和优点将更加显而易见。附图中：

[0019] 图1是棒状杆菌染色体插入载体pDZTn的示意图。

[0020] 图2是棒状杆菌染色体插入载体pDZTn-lysC/asd的示意图。

[0021] 图3是棒状杆菌染色体插入载体pDZTn-dapA/dapB的示意图。

[0022] 图4是载体pDZTn-srk的示意图。

具体实施方式

[0023] 本发明提供一种包含转座子基因和多克隆位点的用于转化的载体。

[0024] 所述转座子基因可源自棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)。棒状杆菌属有多个类型的转座子。例如，谷氨酸棒状杆菌ATCC13032包括9个群的24种转座子(The complete Corynebacterium glutamicum ATCC 13032genome sequence and its impact on the production of-aspartate-derivedamino acids and vitamins(2003)Journal of Biotechnology 104，5-25JornKalinowski et al)。其中ISCg1和ISGg2分别包括4个和5个拷贝，各拷贝之间具有至少99％的同源性。

[0025] 本发明转座子基因优选源自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032(基因库登录号：NC_003450，NCgl1021)的ISCg1(序列号：22)家族的成员，特别是具有序列号1和2所示序列的转座子。

[0026] 所述多克隆位点是为了通过多个限制性内切酶容易被识别而人工插入的核苷酸序列，从而方便靶基因的插入。

[0027] 能够插入到所述多克隆位点的基因是aspB(编码天冬氨酸氨基转移酶的基因)，lysC(编码天冬氨酸激酶的基因)，asd(编码天冬氨酸半醛脱氢酶的基因)，dapA(编码二氢吡啶二羧酸合酶的基因)，dapB(编码二氢吡啶二羧酸还原酶的基因)和lysA(编码二氨基庚二酸脱羧酶的基因)，这些基因是涉及生产L-氨基酸的棒状杆菌属内源基因。另外，还可插入外源性基因srk(编码果糖激酶的基因)。

[0028] 优选选自aspB，lysC，asd，dapA，dapB和lysA的一种或多种基因插入到所述多克隆位点。也可以将选自上组的内源性基因和外源性基因一起插入多克隆位点。更优选将lysC/asd和dapA/dapB连续插入多克隆位点，或同时插入棒状杆菌属缺乏的外源srk基因。

[0029] 在本发明优选的实施方式中，所述lysC，asd，dapA和dapB分别具有源自谷氨酸棒状杆菌KCCM 10770Pb(基因库登录号：NC_003450，NCgl0247～0248和NCgl1896～1898)的如序列号17，18，19和20所示的核苷酸序列。外源基因srk可以是具有源自厌氧性梭孢杆菌Clostridiumacetylbutyricum ATCC 824(基因库登录号：NP 347064)的如序列号21所示的核苷酸序列。

[0030] 本发明转化载体中插入的基因可以通过二次交换整合到棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)微生物的染色体中。

[0031] 本发明利用转座子基因的用于转化的载体不仅能扩增至少2拷贝的内源性基因，并且由于含有复合转座子，还能通过高效交换的方式插入基因。该载体还可以用于生产使用同一载体扩增一系列不同的基因的菌株。转座子基因是不影响微生物的生长并有助于提高减少基因的不稳定。此外，即使缺乏特异性靶位点外源基因能够被插入，并能一系列地制备。

[0032] 本发明还提供一种棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)，其通过由所述转化载体转化从而具有增强的赖氨酸生产力。

[0033] 本发明中，可用所述载体转化的具有赖氨酸生产力的微生物可以是下面任意一种棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)。例如，本发明可利用的棒状杆菌属是，谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032或热产氨棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)FERM BP-1539。另外还包括，由这两种菌株获得的产L-氨基酸株或突变株，例如谷氨酸棒状杆菌KFCC10881，谷氨酸棒状杆菌KFCC 11001和谷氨酸棒状杆菌KCCM10770。最优选地该微生物是谷氨酸棒状杆菌KCCM 10770P。

[0034] 在本发明的一个优选实施例中，本发明所述棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)可以由转化载体pDZTn-lscC/asd，pDZTndapA/dapB或pDZTn-crk转化，这三种载体的酶切图分别如图2，3或4所示。所述转化载体可以顺次转入棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)中，也可同时转入棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)中。可通过同源重组等本领域公知的方法将载体插入染色体中。

[0035] 本发明还提供一种用所述棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)培养液生产赖氨酸的方法。

[0036] 培养棒状杆菌属生产赖氨酸，可以使用本领域公知的传统方法。例如，补料分批培养或重复补料分批培养。

[0037] 此处使用的培养基应满足特定菌株的特定培养条件。棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)的培养基在现有技术中已有教导(例如，Manualof Methods for General Bacteriology.American Society for Bacteriology.Washington D.C.，USA，
1981)。

[0038] 可用的糖原质例如碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉、纤维素；油和脂如豆油、葵花籽油、蓖麻子油和椰子油；脂肪酸如软脂酸、硬脂酸和亚麻酸；醇类如甘油和乙醇；以及有机酸如醋酸。上述物质之一或其组合物都可以使用。

[0039] 可用的氮源例如有机氮源蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆和豆粉，以及无机氮源尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。上述物质之一或其组合物都可以。

[0040] 这里的培养基还可进一步包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾及其含钠盐作为磷源。培养基还可包括金属盐如硫酸镁或硫酸铁。另外，氨基酸、维生素及其适当的前体也可加入培养基中。培养基或其母液可以分批或连续地加入培养液中。在培养过程中，可通过加入氨水、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸等来调整培养液的pH值。培养过程中，可通过加入如聚甘油脂肪酸酯的消泡剂来抑制气泡的产生。为维持需氧的条件，可向培养液中注入氧气或含氧气体(如空气)。优选的培养温度为20-45℃，更优选25-40℃。可以进行连续培养，直到L-氨基酸的浓度达到理想浓度，优选的培养时间是10-160小时。L-赖氨酸释放到培养液中或位于细胞内。

[0041] 本发明提供的在实际应用中优选的实施方式，通过随后的实施例进行了说明。

[0042] 然而，应当理解，对于本发明的内容，本领域技术人员可以在本发明的精神和范围内进行改进和提高。

[0043] 实施例

[0044] 实施例1：构建引入转座子基因的载体(pDZTn)以及用该载体插入基因的方法。

[0045] 在这个实施例中，用于棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)染色体插入的pDZ载体作为为基础载体，构建引入棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)转座子基因的pDZTn载体。构建方法如下。

[0046] 为获得转座子基因，从NIH基因库获得了源自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的全核酸序列转座子基因的核苷酸序列信息(NCBI登录号NC_003450，NCgI1021)，并合成了两对引物(表1，序列号3-6)。

[0047] 以谷氨酸棒杆菌ATCC13032染色体DNA为模板，以序列号3-6所示的寡核苷酸为TM引物，用PfuUltra 高保真DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶进行PCR。PCR条件如下：
96℃下变性30秒，58℃下退火30秒，72℃下聚合1分钟，从变性到聚合重复30个循环。

[0048] 表1

[0049]引物 序列 序列号
Tn-A-F atcctctagagtcgaccatcgctgacaccatctgcc 3
Tn-A-R gggcccactagtctcgagttcaccgcgggagccaagcc 4
Tn-B-F ctcgagactagtgggccctggattccaaggctacgcc 5
Tn-B-R atgcctgcaggtcgaccctgaatggataaggcaccg 6

[0050] 结果获得了两对包含约500bp长启动子区域的转座子基因(Tn-A，Tn-B)。Tn-A(序列号1)用序列号3和4的作为引物扩增，而Tn-B(序列号：2)用序列号：5和6作为引物扩增。扩增产物克隆到pDZ载体上，该pDZ载体利用BD in-Fusion试剂盒用Sal I限制性内切酶进行预处理，从而构建了pDZTn载体。在所述两个扩增产物之间有很多在引物构件中人工插入的限制性内切酶的识别位点。

[0051] 图1是棒状杆菌染色体插入载体pDZTn的示意图。

[0052] 谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P是一株授予专利权的赖氨酸生产菌株，通过将该谷氨酸棒状杆菌通过插入靶基因(Tn-A and Tn-B)构建的pDZTn载体进行转化(使用Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52：541-545所述的转化方法)。然后，在含有25mg/L卡那霉素的选择培养基中筛选通过通过染色体上的同源基因插入了靶基因的菌株。如果在含有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的固体培养基中菌落显示蓝色，则证明所述载体成功插入到染色体中。插入初级染色体的菌株在培养基中震荡培养(30℃，8h)，然后稀-4 -10释到10 到10 ，涂布在含有X-gal的固体培养基上。大多数菌落是蓝色的，而一些菌落是白色的。筛选这些低概率的白色菌落，继续筛选通过二次交换消除了插入在染色体上的载体序列的菌株。

[0053] 实施例2：源自赖氨酸生产菌谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P的lysC/asd的克隆、重组载体(pDZTn-lysC/asd)的构建以及插入了lysC/asd的菌株的开发

[0054] 为获得源自谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P的lysC/asd基因，从NIH基因库中获得lysC/asd(NCBI登录号NC_003450，Ncgl0247～0248)的核苷酸序列信息，由此合成一对引物(表2，序列号7和8)。

[0055] 以谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P的基因组DNA为模板，以序列号：7和8所示核苷TM酸为引物，用PfuUltra 高保真DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶进行PCR。PCR条件如下：96℃下变性30秒，52℃下退火30秒，72℃下聚合3分钟，从变性到聚合重复30个循环。

[0056] 表2

[0057]引物 序列 序列号
lysC-F1(SpeI) tgtcgggcccactagttcccagggtagttgactaaag 7
asd-R1(XhoI) gaatgagttcctcgagtatcaacgcgtcggtaga 8

[0058] 结果，分离了包括2,805bp长启动子区域的lysC/asd基因。将扩增产物克隆到通过BD灌输试剂盒的Spe I和Xho I预处理的pDZTn载体中，构建了重组载体pDZTn-lysC/asd。图2显示了棒状杆菌染色体插入载体pDZTn-lysC/asd的示意图。

[0059] 谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P是一株授予专利权的赖氨酸生产菌株，其用构建的载体pDZTn-lyC/asd转化。二次交换后，一个lysC/asd基因拷贝额外地被插入到染色体上的转座子中。结果制备了具有lysC/asd基因的三个拷贝的赖氨酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P-CJ1。为验证菌株，利用转座子和lysC/asd基因之间扩增连接区域(表3)的引物9和引物10来进行PCR。

[0060] 表3

[0061]引物 序列 序列号
Tn-A-F gctaccgctgcaccaacccc 9
asd-1 ttcacgccgaattcgacaaggcaatcaccg 10

[0062] 实施例3：源自赖氨酸生产菌谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P的dapA/dapB的克隆、重组载体(pDZTn-dapA/dapB)的构建以及插入了dapA/dapB的菌株开发。

[0063] 为按照实施例2的方法，获得源自谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P的dapA/dapB基因，从NIH基因库中获得dapA/dapB(NCBI登录号NC_003450，Ncgl1896～1898)的核苷酸序列信息。结果，确认了dapA构成dapB和操纵子，在它们之间有一个功能未知的ORF(Ncgl1987)。因此，为了对包括dapB启动子区在内的dapB-ORF(Ncgl1897)-dapA基因全长进行扩增，合成了两对引物(表4，序列号：11-12)。

[0064] 以谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P的染色体DNA为模板，以序列号：11-12所示核苷TM酸为引物，用PfuUltra 高保真DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶进行PCR。PCR条件如下：96℃下变性30秒，52℃下退火30秒，72℃下聚合3分钟，从变性到聚合重复30个循环。

[0065] 表4

[0066]引物 序列 序列号
dapA-F(SpeI) tgtcgggcccactagttcattggcgtttccggatcc 11
dapA-R(XhoI) gaatgagttcctcgagacaagcgccaaggaactacc 12

[0067] 结果，分离了包括3,210bp长启动子区域的dapA/dapB基因。将扩增产物克隆到利用BD灌输试剂盒的Spe I和Xho I预处理的pDZTn载体中，构建了重组载体pDZTn-dapA/dapB。图3显示了棒状杆菌染色体插入载体pDZTn-dapA/dapB的示意图。

[0068] 将实施例2中制备的赖氨酸产生菌谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P-CJ1用构建的载体pDZTn-dapA/dapB进行转化。经过二次交换以后，dapA/dapB基因拷贝额外地被插入到染色体的转座子中，结果产生了具有dapA/dapB基因拷贝的赖氨酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P-CJ2。为验证菌株，用扩增转座子和dapA/dapB基因之间连接区域的引物9和引物13(表5)进行PCR。

[0069] 所述的谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P-CJ2已经于2008年3月31日保存于国际权威保藏机构，位于韩国首尔361-221，Hongje-1-dong，Seodaemun-gu的韩国微生物培养中心，保藏号为KCCM10939P。

[0070] 表5

[0071]引物 序列 序列号
Tn-A-F gctaccgctgcaccaacccc 9
dapA-1 acaagcgccaaggaactacc 13

[0072] 实施例4：源自丙酮丁醇梭菌的srk的克隆、重组载体(pDZTn-srk)的构建以及插入了srk的菌株的开发

[0073] 源自丙酮丁醇梭菌ATCC 824的果糖激酶基因已经众所周之。本发明者从NIH基因库中获得源自丙酮丁醇梭菌ATCC 824的果糖激酶基因信息(登录号NP_347064)。根据获得的核苷酸序列合成一对引物(表6，序列号：14和15)。以丙酮丁醇梭菌ATCC 824的染色体DNA为模板进行PCR扩增该基因。PCR条件如下：94℃下变性20秒，52℃下退火20秒，72℃下聚合1分10秒，变性到聚合重复30个循环。

[0074] 表6

[0075]引物 序列 序列号
Srk-F(SpeI) tgtcgggcccactagtcatatgaataatgttttatgtatgggagaa 14
srk-R(XhoI) gaatgagttcctcgagataccattctagagggcttaaagctaccgg 15[0076] 结果，获得了包含1,200bp长启动子区的srk基因。将扩增产物克隆到用BD in-Fusion试剂盒的Spe I和Xho I预处理的pDZTn载体中，构建了重组载体pDZTn-srk。
图4显示了棒状杆菌染色体插入载体pDZTn-srk的示意图

[0077] 谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P是一株授予专利权的赖氨酸生产菌株，其用构建的载体pDZTn-srk转化。二次交换后，srk基因克隆被插入到染色体上的转座子之间。结果，制备了赖氨酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P-CJ3。为验证菌株，用扩增转座子和srk基因的连接区域的引物9和引物16(表7)来进行PCR。

[0078] 表7

[0079]引物 序列 序列号
Tn-A-F gctaccgctgcaccaacccc 9
Srk-1 ataccattctagagggcttaaagctaccgg 16

[0080] 实施例5：对L-赖氨酸生物合成复合-插入基因菌株的天冬氨酸激酶活性检测[0081] 用天冬氨酰异羟肟酸检测L-赖氨酸产生产菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P-CJ2的天冬氨酸激酶活性(Pecher J-F，Capony J-P(1968)Onthe colorimetric determination of acyl phosphates.Anal Biochem 22：536～539)。结果，验证了谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P-CJ2的天冬氨酸激酶活性是其母株谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P相应酶活性的2.1倍。

[0082] 表8

[0083]活性 倍数
KCCM10770P 26.77 1.00
KCCM 10770P-CJ2 56.25 2.10

[0084] 实施例6：srk基因插入菌株的果糖激酶活性的检测

[0085] 用已知的方法检测在细胞中由果糖激酶表达载体的是否表达了果糖激酶，及其是否有果糖激酶活性(Andreas Pikis et al，Microbiology，148，843-852(2002))。将谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P-CJ3在LB中培养1天，接着离心获得细胞。将获得的细胞悬于适当的缓冲液中，接着超声裂解所述细胞，超速离心取上清。将上清与反应液反应，反应液包+括果糖，磷酸葡萄糖，异构酶，葡萄糖-6磷酸脱氢酶，ATP和NADP。产生的NADPH用分光光度计测OD340进行定量，据此可直接计算果糖激酶的活性。结果如表9所示。如表11所示，验证了谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P-CJ3果糖激酶的活性至少是其母株谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P果糖激酶活性的两倍，这表明果糖激酶基因得到了表达。

[0086] 表9

[0087]实验株 KCCM10770P KCCM10770P-CJ3
活性a 5.14 12.13

[0088] a nmol(产生的果糖-6-磷酸)min-1mg(蛋白)-1

[0089] 实施例7：在L-赖氨酸生物合成复合-插入基因菌株的L-赖氨酸的生产[0090] 将实施例3中制备的L-赖氨酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P-CJ2进行如下培养生产L-赖氨酸。

[0091] 将谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P-CJ2及其母株谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P接种到装有25ml种子培养基的250ml三角烧瓶中，在30℃，200rpm摇瓶培养20小时。将1ml种子培养基接种到装有24ml生产培养基的250ml三角烧瓶中，在30℃，200rpm摇瓶培养120小时。

[0092] 培养结束后，用HPLC检测L-赖氨酸的产量。谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P和谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P-CJ2培养液中L-赖氨酸的含量如表10所示。

[0093] 表10

[0094]

[0095] 种子培养基(pH7.0)

[0096] 粗糖20g、蛋白胨10g、酵母浸出物5g、尿素1.5g、KH2PO4 4g、K2HPO48g、MgSO4·7H2O0.5g、生物素100μg、盐酸硫胺素1000μg、泛酸钙2000μg，尼克酰胺2000μg(溶于1L蒸馏水中)。

[0097] 生产培养基(pH7.0)

[0098] 葡萄糖100g、(NH4)2SO4 40g、大豆蛋白2.5g、玉米浸出物5g、尿素3g、KH2PO41g、MgSO4·7H2O 0.5g、生物素100μg、盐酸硫胺素1000μg、泛酸钙2000μg、尼克酰胺
3000μg、CaCO3 30g(溶于1L蒸馏水中)。

[0099] 如表10所示，插入了两个赖氨酸生物合成基因的谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P-CJ2比其母株KCCM10770P的赖氨酸产量提高了10％。

[0100] 本领域的技术人员能够明白，前面说明书中公开的概念和特定实施方案可以容易地用于修改和设计实现本发明同样目的其它实施方案的基础。本领域的技术人员也将会明白，这种等同变化都不脱离所附权利要求公开的本发明的实质和范围。