一种植物促生菌及其菌剂与其制备方法和应用转让专利
申请号 : CN201010529293.4
文献号 : CN102031231B
文献日 : 2013-04-03
发明人 : 师尚礼 , 李剑峰 , 张淑卿 , 霍平慧
申请人 : 甘肃农业大学
摘要 :
本发明公开了一种植物促生菌及其菌剂与其制备方法和应用，即肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)及以其作为活性成分的菌剂，该菌剂的制备方法，以及在溶磷、固氮方面的应用。本发明的优点在于：提供了一种以集溶磷、固氮和产生长素多种促生能力为一体的固氮溶磷菌，制备成固氮溶磷菌剂，具有促生性能全面，肥效高、造价低廉的特点，适用于氮磷缺乏，土壤瘠薄的区域，制备工艺简便，固氮溶磷肥效高，有良好的发展前景。
权利要求 :
1.肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) RSN19，其微生物保藏号为：CGMCC No.4128；所述肺炎克雷伯氏菌的形态学特征为：直杆菌，直径0.5～0.8μm，长3.2～
5.0μm，单个分布、有荚膜，革兰氏染色阴性，不运动、生长在YMA培养基上产生圆形半透明菌落并分泌大量多糖，有固氮、溶解无机磷的作用，以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉和甘露醇为唯一碳源。
2.如权利要求1所述的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) RSN19微生物保藏号为：CGMCC No.4128在作为植物促生菌剂中的应用。
3.一种如权利要求1所述的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) RSN19微生物保藏号为：CGMCC No.4128作为植物促生菌剂的制备方法，其特征在于按照下列步骤进行：(1)肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)RSN19接种培养基中，在26℃～28℃活化18～24h；
(2)活化后的Klebsiella pneumoniae RSN19接种于液体培养基中进行发酵培养，温度为25℃～29℃，培养至每毫升发酵液中的Klebsiella pneumoniae RSN19菌数为4～
10
6×10 个；
(3)将上述步骤(2)中的Klebsiella pneumoniae RSN19的发酵菌液、无菌液体培养基和无菌磷酸缓冲液按照体积比为4～8：2～4：1的比例混合，封装，制成单菌种液体菌剂；
(4)将述步骤(3)中制备的液体菌剂与无菌泥炭粉按照体积比为1：4～8的比例混合，制成固体微生物菌剂。
4.根据权利要求3所述的一种植物促生菌剂的制备方法，其特征在于所述促生菌剂的液体培养基组成为，按照重量分数比由0.5～1份的KH2P04，l～2份的酵母粉，5～10份的葡萄糖，0.2～0.4份的MgSO4，0.05～0.1份的NaCl，900～1000份的水组成，其中液体培养基的pH值为6.4～7.4。
5.根据权利要求3所述的一种植物促生菌剂的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中发酵菌液、无菌液体培养基和无菌磷酸缓冲液按照体积比为6：3：1的比例混合。
6.根据权利要求3所述的一种植物促生菌剂的制备方法，其特征在于所述步骤(4)中液体菌剂与无菌泥炭粉体积比为1：6。
7.根据权利要求3制备而成的一种植物促生菌剂在固氮溶磷中的应用。
说明书 :
一种植物促生菌及其菌剂与其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种植物促生菌剂，具体地说是一种植物促生菌及其菌剂、及其制备方法和应用，属于生物肥料领域。
背景技术
[0002] 氮和磷作为植物必需的矿质元素，是植物活细胞内蛋白质、核酸、磷脂、酶、植物激素等多种结构和功能物质的重要组成成分，在植物能量代谢、有机物合成与代谢、物质运转、基因表达与调控及细胞信号转导等过程中起重要作用。氮素和磷素的缺乏、将使植物的生长发育受抑，引起作物产量和品质的下降。长期大量施用化肥不但提高了农业生产成本，而且造成了土壤中某些元素的选择性积累和土壤理化性质的恶化，对环境造成污染。因此以微生物肥料替代或部分替代化肥是维持农业持续发展的必然趋势。存在于植物根际的土壤细菌可以通过根际固氮、产生生长素、溶解土壤中大量存的难溶性磷供植物吸收来促进作物的生长，达到促生促产的目的。
[0003] 由于同时具有多种高效促生作用的菌种较难获得、因此目前投入生产的溶磷固氮植物促生菌剂多为多菌种混合菌剂，存在菌种间拮抗，菌剂内营养需求和代谢不平衡等问题。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于，针对上述问题，本发明提供了一种以集溶磷、固氮和产生长素多种促生能力为一体的固氮溶磷菌，制备成固氮溶磷菌剂，具有促生性能全面，肥效高、造价低廉的特点，适用于氮磷缺乏，土壤瘠薄的区域，有良好的发展前景。
[0005] 本发明的技术方案为：肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，其微生物保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏日期2010年8月31日，保藏号为：CGMCC No.4128；所述肺炎克雷伯氏菌的形态学特征为：直杆菌，直径0.5～0.8μm，长3.2～5.0μm，单个分布、有荚膜，革兰氏染色阴性，不运动、生长在YMA培养基上产生圆形半透明菌落并分泌大量多糖，有固氮、溶解无机磷的作用，可以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉和甘露醇为唯一碳源。
[0006] 肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，微生物保藏号为：CGMCC No.4128，在作为植物促生菌剂中的应用。
[0007] 一种植物促生菌剂的制备方法，于按照下列步骤进行：(1)肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)RSN19接种于YMA固体培养基中，在26℃～28℃活化18～24h；(2)活化后的Klebsiella pneumoniae RSN19接种于液体培养基中进行发酵培养，温度为
25℃～29℃，培养至每毫升发酵液中的Klebsiella pneumoniae RSN19菌数为4～6？？
10
10 个；(3)将上述步骤(2)中的Klebsiella pneumoniae RSN19的发酵菌液、无菌液体培养基和浓度为10％的pH 7.0无菌磷酸缓冲液按照体积比为4～8∶2～4∶1的比例混合；以无菌铝箔袋或无菌聚丙烯袋封装，制成单菌种液体菌剂；(4)将述步骤(3)中制备的液体菌剂与无菌泥炭粉按照体积比为1∶4～8的比例混合，制成固体微生物菌剂。
25℃～29℃，培养至每毫升发酵液中的Klebsiella pneumoniae RSN19菌数为4～6？？
10
10 个；(3)将上述步骤(2)中的Klebsiella pneumoniae RSN19的发酵菌液、无菌液体培养基和浓度为10％的pH 7.0无菌磷酸缓冲液按照体积比为4～8∶2～4∶1的比例混合；以无菌铝箔袋或无菌聚丙烯袋封装，制成单菌种液体菌剂；(4)将述步骤(3)中制备的液体菌剂与无菌泥炭粉按照体积比为1∶4～8的比例混合，制成固体微生物菌剂。
[0008] 所述促生菌剂的液体培养基组成为，按照重量分数比由0.5～1份的KH2PO4，1～2份的酵母粉，5～10份的葡萄糖，0.2～0.4份的MgSO4，0.05～0.1份的NaCl，900～1000份的水组成，其中液体培养基的pH值为6.4～7.4。
[0009] 所述步骤(3)中发酵菌液、无菌液体培养基和无菌磷酸缓冲液按照体积比为6∶3∶1的比例混合。
[0010] 所述步骤(4)中液体菌剂与无菌泥炭粉体积比为1∶6。
[0011] 跟据上述制备方法制备而成的一种植物促生菌剂，在固氮溶磷中的应用。
[0012] 本发明的优点在于：提供了一种以集溶磷、固氮和产生长素多种促生能力为一体的固氮溶磷菌，制备成固氮溶磷菌剂，具有促生性能全面，肥效高、造价低廉的特点，适用于氮磷缺乏，土壤瘠薄的区域，制备工艺简便，固氮溶磷肥效高，有良好的发展前景。
[0013] 本发明菌剂为具备固氮、溶无机磷和产生长素能力的单菌种植物促生菌剂，能够充分利用土壤中含量最为丰富的难溶性无机磷酸盐，在具备多种促生能力的同时解决了多菌种菌剂中存在的菌种间拮抗和营养需求不一致的问题；菌种单一，制备工艺简便，对生产和封装设备的要求较低；对苜蓿、燕麦、红豆草幼苗的促生作用显著，较同等肥效的多菌种菌剂产品造价低廉，易于推广应用。
具体实施方式
[0014] 以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0015] 实施例1肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的分离、鉴定和纯化：RSN19菌株以无氮固体培养基和PKO溶无机磷培养基自表面灭菌的红豆草(Onbrychis viciaefoliacv.)根瘤中分离，纯化后的菌株经形态学鉴定符合肠杆菌科的一般定义。菌株纯培养物于2010年经中国科学院微生物鉴定保藏中心鉴定为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)(2010微检字第084号)；该菌株对80mg/L卡那霉素和200mg/L氨苄青霉素有耐受性。RSN19菌株固氮酶活性达6695±174nmolC2H2d-1，4d的溶磷量(磷酸钙)为15.29±0.46mg/L，6d的生长素产量为8.38mg/L。在无氮，仅提供磷酸钙条件下的沙培试验中，施用RSN19菌液60d后的苜蓿幼苗比不施菌液的空白对照植株生物量增加
119％，株高增加53％，叶片数增加95％，用于浸种，能显著加快胚根的伸长。在氮磷缺乏的条件下对植物有很明显的促生作用。
119％，株高增加53％，叶片数增加95％，用于浸种，能显著加快胚根的伸长。在氮磷缺乏的条件下对植物有很明显的促生作用。
[0016] 实施例2一种植物促生菌剂的制备方法，于按照下列步骤进行：(1)肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)RSN19接种于YMA(酵母甘露醇-琼脂)固体培养基中，在26℃～28℃活化18～24h；(2)活化后的Klebsiella pneumoniae RSN19接种于液体培养基中进行发酵培养，温度为25℃～29℃，培养至每毫升发酵液中的Klebsiella pneumoniae
10
RSN19菌数为4～6？？10 个；(3)将上述步骤(2)中的Klebsiella pneumoniae RSN19的发酵菌液、无菌液体培养基和浓度为10％的pH 7.0无菌磷酸缓冲液按照体积比为
6∶3∶1的比例混合；以无菌铝箔袋或无菌聚丙烯袋封装，制成单菌种液体菌剂；(4)将述步骤(3)中制备的液体菌剂与无菌泥炭粉按照体积比为1∶6的比例混合，制成固体微生物菌剂。
10
RSN19菌数为4～6？？10 个；(3)将上述步骤(2)中的Klebsiella pneumoniae RSN19的发酵菌液、无菌液体培养基和浓度为10％的pH 7.0无菌磷酸缓冲液按照体积比为
6∶3∶1的比例混合；以无菌铝箔袋或无菌聚丙烯袋封装，制成单菌种液体菌剂；(4)将述步骤(3)中制备的液体菌剂与无菌泥炭粉按照体积比为1∶6的比例混合，制成固体微生物菌剂。
[0017] 所述促生菌剂的液体培养基组成为，按照重量分数比由0.5～1份的KH2PO4，1～2份的酵母粉，5～10份的葡萄糖，0.2～0.4份的MgSO4，0.05～0.1份的NaCl，900～1000份的水组成，其中液体培养基的pH值为6.4～7.4。
[0018] 实施例3本发明菌剂在控制氮、磷营养条件下的沙培促生作用一、实验材料1.1试验材料本发明的液体菌剂：肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，其微生物保藏号为：CGMCC No.4128。
[0019] 1.2植物材料紫花苜蓿陇东(Medicogosativa.cv.LongDong)和皇后(Medicogo.sativa.cv.Queen)的种子，甘肃红豆草(Qnobrychisspp.cv.Gansu)和燕麦(Calibre)(Avena.sativa L.Calibre)种子由草业生态系统教育部重点实验室提供，种子净度98％，种子以70％乙醇溶液消毒5min。为消除种带根瘤菌和固氮菌对实验结果的影响，种子经无菌水浸泡催芽，去除种皮，最后经无菌去离子水冲洗5～8遍后播种。
[0020] 1.3沙培营养液Hoagland′s完全营养液：大量元素：Ca(NO3)2·4H2O 1417mg/L；KNO3 607mg/L；MgSO4 493mg/L；(NH4)3PO4 115mg/L；微 量 元 素：H3BO3 2.86mg/L；MnCl2·4H2O 1.81mg/L；ZnSO4·7H2O 0.22mg/L；CuSO4·5H2O 0.08mg/L；H2MoO4·H2O
0.02mg/L；FeSO450mg/L。营养液以无菌去离子水稀释至1/4浓度后用NaOH(1mol/L)或HCl(1mol/L)调节pH值为7.0±0.2。
0.02mg/L；FeSO450mg/L。营养液以无菌去离子水稀释至1/4浓度后用NaOH(1mol/L)或HCl(1mol/L)调节pH值为7.0±0.2。
[0021] Hoagland′s无氮无磷营养液以Hoagland′s完全营养液为基础，将配方中的KNO3607mg/L改为KCl 582mg/L，并去除(NH4)3PO4后配制，并调节溶液pH值至7.0±0.1。
[0022] 二、实验方法2.1.试验设计试验于2010年4月于甘肃农业大学草业学院培养室内进行，栽培基质使用清洁河砂，经HCl浸泡48h后，冲洗6次，最后以蒸馏水冲洗3次，150℃烘干并干热灭菌6h备用。在直径7cm、容积400ml的塑料培养杯中装入280g干燥河沙，将沙面整平，用镊子挑选10粒大小一致的饱满种子均匀摆放于细沙表面，覆沙20g。
对各处理幼苗浇灌以无菌水稀释100倍的本产品液体菌剂(活菌数＞106cfu/ml)，在栽培用的砂基质中添加20g/kg的磷酸钙，以1/4Hoagland′s无氮无磷营养液浇灌。对不接菌液处理，仅以1/4Hoagland′s无氮无磷营养液浇灌的处理作为空白对照(CK1)；以
1/4Hoagland′s完全营养液浇灌的处理作为充足营养对照(CK2)。每处理4次重复。处理过程中以称量法测定各盆栽水分含量，并以无菌水补充水分至沙基质最大持水量的70％。
处理50d后进行生长和形态指标的测定。
对各处理幼苗浇灌以无菌水稀释100倍的本产品液体菌剂(活菌数＞106cfu/ml)，在栽培用的砂基质中添加20g/kg的磷酸钙，以1/4Hoagland′s无氮无磷营养液浇灌。对不接菌液处理，仅以1/4Hoagland′s无氮无磷营养液浇灌的处理作为空白对照(CK1)；以
1/4Hoagland′s完全营养液浇灌的处理作为充足营养对照(CK2)。每处理4次重复。处理过程中以称量法测定各盆栽水分含量，并以无菌水补充水分至沙基质最大持水量的70％。
处理50d后进行生长和形态指标的测定。
[0023] 肥效试验的测定指标和方法活苗率：将各处理盆栽洗出苗后统计活苗数，计算活苗率。
[0024] 株高和主根长：各处理盆栽中随机选取4株幼苗测定株高和主根长度。将洗净植株平铺于在玻璃平板上，用直尺测出苗的自然高度，后再用镊子将植株根系拉直，测定主根长度。
[0025] 单叶面积和单株叶片数：取单株记录叶片数目，单叶面积采用描形称重法。
[0026] 植株单株体积与单株根体积：将所选苗置于滤纸上，将水吸干，采用量筒排水法测定植株体积和根体积。
[0027] 植株生物量积累：取整植株于烘箱中，80℃烘至恒重，用电子天平称出植株单株干重。
[0028] 2.2数据分析试验数据用SPSS16.0软件以LSD法进行统计分析。
[0029] 三.试验结果3.1本发明菌剂对低有效磷条件下幼苗存活率的影响处理50d后，施用本发明菌剂可显著提高供试作物的幼苗存活率。陇东和皇后苜蓿幼苗存活率比CK1分别提高32％和28％，比CK2分别提高8％和12％，使红豆草和燕麦的幼苗存活率比CK1分别提高27％～44％表1本发明菌剂对苜蓿、燕麦和红豆草幼苗存活率的影响(％)植物材料 CK1 CK2 本发明液体图形处理
陇东苷蓿 52％ 76％ 84％
皇后苷蓿 60％ 68％ 88％
甘肃红豆草 56％ 88％ 83％
燕麦(Calbre) 41％ 85％ 79％
CK1为1/4Hoagland′s无氮无磷营养液+磷酸钙处理，CK2为1/4Hoagland′s完全营养液处理，以其作为通常一般营养条件下的对照。下同。
陇东苷蓿 52％ 76％ 84％
皇后苷蓿 60％ 68％ 88％
甘肃红豆草 56％ 88％ 83％
燕麦(Calbre) 41％ 85％ 79％
CK1为1/4Hoagland′s无氮无磷营养液+磷酸钙处理，CK2为1/4Hoagland′s完全营养液处理，以其作为通常一般营养条件下的对照。下同。
[0030] 3.2本产品菌剂对作物幼苗株高和主根长的影响处理50d后，本产品菌剂使陇东苜蓿平均株高比CK1和CK2分别增高68.5％和26.67％，使皇后苜蓿比CK1和CK2高出70.92％和35.9％，使燕麦幼苗的株高比CK1、CK2高出49.08％、40.54％，差异显著(P＜0.05)。并能使甘肃红豆草株高比CK1和CK2分别提高21.14％和17.35％。
[0031] 表2本发明菌剂对苜蓿、燕麦和红豆草幼苗株高的影响(单位：cm)接种本产品的陇东苜蓿根系长度比CK1和CK2分别增高50.2％和18.98％，使皇后苜蓿根系长度比CK1和CK2高出56.23％和30.5％，使燕麦幼苗的根长高出CK1和CK2高出76.51％和53.09％。使甘肃红豆草根系长度比CK1和CK2分别提高25.69％和91.62％，差异显著(P＜0.05)。
[0031] 表3本发明菌剂对苜蓿、燕麦和红豆草主根长度的影响(单位：cm)3.3本产品菌剂对作物幼苗单叶面积、单株叶片数和生物量积累的影响使用本产品菌剂后，两种苜蓿的叶面积比CK1提高123.33％～353.76％，比CK2提高36.73～66.63％；甘肃红豆草叶面积比其CK1和CK2的处理分别增长107.36％和42.76％；燕麦(Calibre)幼苗的叶面积比其CK1和CK2的处理分别增长87.40％和71.99％，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
[0032] 表4本发明菌剂对苜蓿、燕麦和红豆草单叶面积的影响(单位：cm2)本产品菌剂对植株的叶片数也有明显的促进作用，两种苜蓿的叶片数比其CK1的处理提高53.75％～26.63％；甘肃红豆草叶片数比其CK1和CK2的处理分别增长118.52％和56.69％；燕麦(Calibre)幼苗的叶片数比其CK1和CK2的处理分别增长39.95％和33.80％，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
[0033] 表5本发明菌剂对苜蓿、燕麦和红豆草单株叶片数的影响(单位：叶片/株)与CK1相比，使用本产品菌剂的两种苜蓿单株干重平均增加90.18％以上。甘肃红豆草干重较CK1增加86.33％、较CK2增加26.19％。燕麦植株干重较其CK1的处理增加217.54％，差异有统计学意义。
[0034] 表6本发明菌剂对苜蓿、燕麦和红豆草单株生物量干重的影响(单位：mg/株)