基于寡核苷酸链的汞离子荧光检测芯片、制作及使用方法转让专利
申请号 : CN201010533018.X
文献号 : CN102031306B
文献日 : 2013-12-25
发明人 : 娄新徽 , 刘美英 , 赵建龙
申请人 : 中国科学院上海微系统与信息技术研究所
摘要 :
本发明涉及一种基于寡核苷酸链的汞离子荧光检测芯片、制作方法及其使用方法。所述的检测芯片由Hg2+能特异性地与富T寡核苷酸链上的T碱基共价结合，介导两条富T寡核苷酸链上的T-T配对形成稳定的分子间T-Hg2+-T结构，从而诱导已经与富T寡核苷酸链杂交的互补链的释放。检测芯片使用时只需要将待测样品添加到芯片上，并保持一段时间，然后利用芯片信号分析系统扫描芯片，并对荧光信号进行分析。通过荧光信号的变化，实现对的Hg2+检测。样品中Hg2+浓度越高，荧光信号减弱的越多。该方法可以检测的Hg2+的浓度范围是1nM-100μM。
权利要求 :
1.一种汞离子荧光检测芯片的制作方法，其特征在于将合成的富T寡核苷酸链固定在经修饰的玻片上；然后荧光标记的互补链与固定在玻片上的富T寡核苷酸链杂交，形成双链结构，包括以下步骤：（1）化学修饰的富T寡核苷酸链固定在化学修饰的玻片上
2-20 μM 化学修饰的富T寡核苷酸链按1:1体积比加入2×点样缓冲液，通过以接触式Cartesian microarray制作系统点阵于化学修饰的载玻片表面；点样完毕，将玻片置于70%湿度，室温条件下48～72 h进行固定；分别用0.2％ SDS、去离子水洗2次，每次2 min，然后用醛基封闭液封闭15 min；再依次用0.2％ SDS、去离子水各洗2次，每次2 min，吹干；
（2）互补链与富T寡核苷酸链的杂交
标记了荧光基团的互补链用杂交液稀释成1-10 μM，将稀释好的互补链溶液加在芯片的斑点处，盖上盖玻片；芯片置于25℃湿盒中，12-16h后用10 mM MOPS, 100 mM NaNO3, pH
7.2洗5-10 min，吹干；
所述的化学修饰的富T寡核苷酸链的序列为5’-NH2-C12-TTTTTTTTTTTTTT-3’；所述的互补链的序列为5’- Cy5-AAAAAAAAAAAAAA-3’。
2.按权利要求1所述的制作方法，其特征在于步骤（1）中所述的封闭液是由0.1g硼氢化钠、30mlPBS和10ml质量百分数为99%的乙醇组成。
3.使用由权利要求1的方法制作的汞离子荧光检测芯片的方法，其特征在于用杂交液
2+ 2+
稀释制备好不同浓度的Hg ，加不同浓度的Hg 溶液于芯片斑点处，室温，反应10-60min；
用10mM MOPS，100mM NaNO3，pH7.2洗3次，吹干；然后用General Scanning公司的芯片信号分析系统Scanarray 3000扫描并分析结果。
4.按权利要求3所述的方法，其特征在于：
2+
①加入100 μM 、10 μM的Hg 后反应2 min，相对于缓冲液对照组，荧光强度分别下降了63％，45％；20 min完成了95％的反应；
2＋ 2+
②在Hg 离子存在的情况下，芯片斑点处荧光强度减弱，当Hg 浓度为10 nM时，与缓
2＋
冲液组的荧光强度相比，斑点处荧光强度减弱20％，随着Hg 浓度增加，荧光信号逐渐减弱。
5.按权利要求3所述的方法，其特征在于用10 mM MOPS, 100 mM NaNO3, pH 7.2稀释制备10 μM的不同的二价金属离子，加不同二价金属离子溶液于制备好的芯片斑点处，室温，反应1 h；用10 mM MOPS, 100 mM NaNO3, pH 7.2缓冲液洗3次，吹干；用General
2+
Scanning公司的芯片信号分析系统Scanarray 3000扫描照片；只有在Hg 存在的情况下，
2+
芯片斑点处荧光强度大大减弱，Hg 为10μM时，与缓冲液组的荧光强度相比，荧光强度减弱了85％；而当加入10μM其他二价金属离子，荧光强度只有在0.9％～2.6％范围的微小的减弱。
说明书 :
基于寡核苷酸链的汞离子荧光检测芯片、制作及使用方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种基于寡核苷酸链的汞离子荧光检测芯片、制作及使用方法，属于生物分析技术领域。
背景技术
[0002] 汞是高毒的全球性环境污染物，尤其是其具有高迁移性、持久性、甲基化作用性、生物富集性及食物链放大性的特点，即便是极微量的存在于环境中，对动植物及人类的健康也是极大的威胁。全世界的汞一年的排放量约1.5万吨，主要来源于汞矿、冶金、氯碱工2+
业、电器工业和矿物燃料的燃烧。汞以多种形式存在与环境中，水溶性的二价汞离子(Hg )是汞污染最常见和最稳定的形式之一。
业、电器工业和矿物燃料的燃烧。汞以多种形式存在与环境中，水溶性的二价汞离子(Hg )是汞污染最常见和最稳定的形式之一。
[0003] 如何有效地进行环境中汞离子含量的测定，成为摆在广大分析工作者面前的一个问题。目前传统的汞离子检测方法主要有：原子(吸收，发射，荧光)光谱法及电感耦合等离子质谱仪(Inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)。虽然这些方法能够得到比较精确的检测结果，但这些技术依赖大型仪器设备、耗费耗时、需进行样品预处理，需要专门的技术人员进行操作，检测成本高，很难满足产地现场快速检测的要求，并且其中有些方法还需要用到有毒试剂，难以被分析人员接受。因此，在很多重要的场合，人们迫切需要简便、快速、经济、准确的分析检测汞离子的方法。目前，国内外对汞离子进行现场检测的方法在灵敏度和专一性上不能够满足要求。
[0004] 近来的研究表明，一个汞离子能特异性地与两个胸腺嘧啶碱基(T)共价结合形2+ 2+
成稳定的T-Hg -T结构。基于汞离子的这一特殊的性质，已发展了各种Hg 检测方法：如荧光法(A.Ono，H.Togashi，Angew.Chem.Iht.Ed.Engl.2004，43，4300.)、纳米金聚集比色法(J.S.Lee，M.S.Han，C.A.Mirkin，Angew.Chem.Iht.Ed.Engl.2007，46，4093.)，电化学法(Z.Zhu，Y.Su，J.Li，D.Li，J.Zhang，S.Song，Y.Zhao，G.Li，C.Fan，Anal.Chem.2009，81，
7660.)。这些方法普遍具有选择性好、特异性强等特点，但操作繁琐，并不适合高通量的检测。
成稳定的T-Hg -T结构。基于汞离子的这一特殊的性质，已发展了各种Hg 检测方法：如荧光法(A.Ono，H.Togashi，Angew.Chem.Iht.Ed.Engl.2004，43，4300.)、纳米金聚集比色法(J.S.Lee，M.S.Han，C.A.Mirkin，Angew.Chem.Iht.Ed.Engl.2007，46，4093.)，电化学法(Z.Zhu，Y.Su，J.Li，D.Li，J.Zhang，S.Song，Y.Zhao，G.Li，C.Fan，Anal.Chem.2009，81，
7660.)。这些方法普遍具有选择性好、特异性强等特点，但操作繁琐，并不适合高通量的检测。
[0005] 生物芯片是本世纪八十年代末在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，它主要是指通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA及其他物质的准确、快速、大信息量的检测。生物芯片的主要特点是高通量、微型化和自动化，能够实现对微量样品快速、准确的检测。
[0006] 本发明的发明人设想如能将上述汞离子的特异性地与两个胸腺嘧啶碱基(T)共2+
价结合形成稳定的T-Hg -T结构的这一特性以及生物芯片的优点结合起来，提供一种基于
2+ 2+
寡核苷酸链的Hg 检测芯片，以实现对Hg 低成本、高灵敏、准确、快速的检测。从而引导出本发明的构思。
价结合形成稳定的T-Hg -T结构的这一特性以及生物芯片的优点结合起来，提供一种基于
2+ 2+
寡核苷酸链的Hg 检测芯片，以实现对Hg 低成本、高灵敏、准确、快速的检测。从而引导出本发明的构思。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于提供一种寡核苷酸链的汞离子检测芯片。本发明所述的汞离子2+
检测芯片的特征在于：利用Hg 可特异性地与DNA的两个胸腺嘧啶碱基(T)共价结合，介
2+
导T-T配对形成稳定的T-Hg -T结构。具体的说，将合成的富T寡核苷酸链固定在经修饰的玻片上；然后荧光标记的互补链与固定在玻片上的富T寡核苷酸链杂交，形成双链结构，
2+ 2+ 2+
制备好Hg 检测芯片；再加入待测样品，检测荧光信号。若待测样品中含Hg 时，则Hg 能特异性地与富T寡核苷酸链上的T碱基共价结合，介导两条富T寡核苷酸链上的T-T配对
2+
形成稳定的分子间T-Hg -T结构，从而诱导带有荧光基团的互补链的释放，导致芯片斑点处荧光减弱。汞离子存在与否，可通过荧光扫描仪定量分析。
检测芯片的特征在于：利用Hg 可特异性地与DNA的两个胸腺嘧啶碱基(T)共价结合，介
2+
导T-T配对形成稳定的T-Hg -T结构。具体的说，将合成的富T寡核苷酸链固定在经修饰的玻片上；然后荧光标记的互补链与固定在玻片上的富T寡核苷酸链杂交，形成双链结构，
2+ 2+ 2+
制备好Hg 检测芯片；再加入待测样品，检测荧光信号。若待测样品中含Hg 时，则Hg 能特异性地与富T寡核苷酸链上的T碱基共价结合，介导两条富T寡核苷酸链上的T-T配对
2+
形成稳定的分子间T-Hg -T结构，从而诱导带有荧光基团的互补链的释放，导致芯片斑点处荧光减弱。汞离子存在与否，可通过荧光扫描仪定量分析。
[0008] 本发明的基于寡核苷酸链的Hg2+检测芯片的制作方法及其应用方法，其特征在于：
[0009] 本发明中Hg2+检测芯片的制作方法包括如下步骤：
[0010] (1)化学修饰的富T寡核苷酸链固定在化学修饰的玻片上
[0011] 2-20μM化学修饰的富T寡核苷酸链按1∶1(V/V)的比例加入2×点样缓冲液。通过以接触式Cartesian microarray制作系统点阵于化学修饰的载玻片。点样完毕，将玻片置于一定湿度，比如70％湿度、室温条件下48～72h进行固定。分别用0.2％SDS、去离子水洗2次，每次2min，然后用醛基封闭液(0.1g硼氢化钠，30mL PBS，10mL 99％乙醇)封闭15min。再依次用0.2％SDS、去离子水各洗2次，每次2min，吹干，备用。
[0012] (2)互补链与富T寡核苷酸链的杂交
[0013] 标记了荧光基团的互补链用杂交液稀释成1-10μM。将稀释好的互补链溶液加在芯片的斑点处，盖上盖玻片。芯片置于25℃湿盒中，12-16小时后，用10mM MOPS[(3-(N-吗啉代)丙磺酸]，100mM NaNO3，pH 7.2洗5-10min，吹干，备用。
[0014] 所述的Hg2+检测芯片的使用方法包括如下步骤：
[0015] 用杂交液稀释制备好不同浓度的Hg2+，加不同浓度的Hg2+溶液于芯片斑点处，室温，反应10-60min。10mM MOPS，100mM NaNO3，pH 7.2洗3次，吹干。用General Scanning公司的芯片信号分析系统Scanarray 3000扫描并分析结果。
[0016] 综上所述，本发明利用了在Hg2+存在的情况下，Hg2+能特异性地与富T寡核苷酸链2+
上的T碱基共价结合，介导两条富T寡核苷酸链上的T-T配对形成稳定的分子间T-Hg -T结构，从而诱导已经与富T寡核苷酸链杂交的互补链的释放。如果互补链预先标记荧光基团，释放使荧光信号降低。汞离子荧光检测芯片的制备包括三个步骤：首先设计相应的化学修饰的富T寡核苷酸链和荧光修饰的互补链，然后将末端修饰的富T寡核苷酸链固定在经修饰的玻片上，最后将荧光标记的互补链与玻片上的富T寡核苷酸链杂交，制备好汞离子检测芯片。使用上述芯片进行汞离子的检测只需要将待测样品添加到芯片上，并保持一段时间，然后利用芯片信号分析系统扫描芯片，并对荧光信号进行分析。通过荧光信号的变化，
2+ 2+ 2+
实现对的Hg 检测。样品中Hg 浓度越高，荧光信号减弱的越多。该方法可以检测的Hg的浓度范围是1nM-100μM。该汞离子检测芯片也可以使用其它各种各样的信号标记，比如放射性标记、量子点、酶或纳米金等。
上的T碱基共价结合，介导两条富T寡核苷酸链上的T-T配对形成稳定的分子间T-Hg -T结构，从而诱导已经与富T寡核苷酸链杂交的互补链的释放。如果互补链预先标记荧光基团，释放使荧光信号降低。汞离子荧光检测芯片的制备包括三个步骤：首先设计相应的化学修饰的富T寡核苷酸链和荧光修饰的互补链，然后将末端修饰的富T寡核苷酸链固定在经修饰的玻片上，最后将荧光标记的互补链与玻片上的富T寡核苷酸链杂交，制备好汞离子检测芯片。使用上述芯片进行汞离子的检测只需要将待测样品添加到芯片上，并保持一段时间，然后利用芯片信号分析系统扫描芯片，并对荧光信号进行分析。通过荧光信号的变化，
2+ 2+ 2+
实现对的Hg 检测。样品中Hg 浓度越高，荧光信号减弱的越多。该方法可以检测的Hg的浓度范围是1nM-100μM。该汞离子检测芯片也可以使用其它各种各样的信号标记，比如放射性标记、量子点、酶或纳米金等。
[0017] 本发明的技术效果：
[0018] 1、本发明基于寡核苷酸链的Hg2+检测芯片的制作方法简单、易行。
[0019] 2、本发明基于寡核苷酸链的Hg2+检测芯片具有检测灵敏度和专一性高。
[0020] 3、应用本发明基于寡核苷酸链的Hg2+检测芯片检测Hg2+时，样品、试剂消耗量少，成本低。
[0021] 4、使用本发明的检测的结果用普通的扫描仪扫描观察及分析即可，不需要复杂的昂贵设备，使现场检测更方便、易行。
附图说明
[0022] 图1是芯片上基于寡核苷酸链荧光检测汞离子的原理图。
[0023] 图2(A)-图2(G)，是本发明一个实施例中基于寡核苷酸链荧光检测汞离子的时间动力学。荧光扫描照片中荧光强度平均指依次是：反应2min时(A)，缓冲液组61356，2+ 2+ 2+
10μM Hg 组33296，100μM Hg 组22273。反应5min时(B)，缓冲液组59859，10μM Hg
2+ 2+
组28697，100μM Hg 组15833。反应10min时(C)，缓冲液组60761，10μM Hg 组18440，
2+ 2+ 2+
100μMHg 组10121。反应20min时(D)，缓冲液组662187，10μM Hg 组12726，100μM Hg
2+ 2+
组6755。反应40min时(E)，缓冲液组59893，10μM Hg 组9441，100μM Hg 组5369。反
2+ 2+
应60min时(F)，缓冲液组61789，10μM Hg 组7882，100μM Hg 组3612。G为制备好的
2+ 2+
100μM Hg (曲线1)和10μMHg (曲线2)荧光强度随时间曲线减弱。
10μM Hg 组33296，100μM Hg 组22273。反应5min时(B)，缓冲液组59859，10μM Hg
2+ 2+
组28697，100μM Hg 组15833。反应10min时(C)，缓冲液组60761，10μM Hg 组18440，
2+ 2+ 2+
100μMHg 组10121。反应20min时(D)，缓冲液组662187，10μM Hg 组12726，100μM Hg
2+ 2+
组6755。反应40min时(E)，缓冲液组59893，10μM Hg 组9441，100μM Hg 组5369。反
2+ 2+
应60min时(F)，缓冲液组61789，10μM Hg 组7882，100μM Hg 组3612。G为制备好的
2+ 2+
100μM Hg (曲线1)和10μMHg (曲线2)荧光强度随时间曲线减弱。
[0024] 图3(A)-图3(B)，是本发明一个实施例中基于寡核苷酸链荧光检测的检测芯片检2+
测Hg 的荧光扫描照片(A)及标准曲线(B)。荧光扫描照片中荧光强度平均指依次是：缓
2+ 2+ 2+ 2+
冲液组61789，10nM Hg 组49411，100nM Hg 组35127，1μM Hg 组20666，10μM Hg 组
2+
7882，100μM Hg 组3612。
测Hg 的荧光扫描照片(A)及标准曲线(B)。荧光扫描照片中荧光强度平均指依次是：缓
2+ 2+ 2+ 2+
冲液组61789，10nM Hg 组49411，100nM Hg 组35127，1μM Hg 组20666，10μM Hg 组
2+
7882，100μM Hg 组3612。
[0025] 图4(A)-图4(B)，发明一个实施例中基于寡核苷酸链荧光检测的检测芯片检测2+
Hg 和其他二价离子的荧光扫描照片及结果。荧光扫描照片中荧光强度平均指依次是：缓
2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+
冲液组60961，Hg 组8996，Pb 组59408，Zn 组59753，Ca 组59945，Cu 组59630，Ni
2+
组59370，Mg 组60433。
Hg 和其他二价离子的荧光扫描照片及结果。荧光扫描照片中荧光强度平均指依次是：缓
2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+
冲液组60961，Hg 组8996，Pb 组59408，Zn 组59753，Ca 组59945，Cu 组59630，Ni
2+
组59370，Mg 组60433。
[0026] 图5(A)-图5(C)，是本发明一个实施例中基于寡核苷酸链荧光检测的检测芯片检2+ 2+
测相同浓度的标准缓冲液中Hg 和饮用水中掺入的Hg 荧光扫描照片及结果。
测相同浓度的标准缓冲液中Hg 和饮用水中掺入的Hg 荧光扫描照片及结果。
具体实施方式
[0027] 下面，通过实施例的描述，进一步阐明本发明的实质性特点和显著的进步。为清楚起见，先将本发明使用的核酸探针的序列列于表1
[0028] 表1：本发明中使用的核酸探针序列。
[0029]核酸探针名称 序列
探针A 5’-NH2-C12-TTTTTTTTTTTTTT-3’
探针B 5’-Cy5-AAAAAAAAAAAAAA-3’
2+
探针A 5’-NH2-C12-TTTTTTTTTTTTTT-3’
探针B 5’-Cy5-AAAAAAAAAAAAAA-3’
2+
[0030] 实施例1：利用探针A和探针B制备Hg 检测芯片。
[0031] 将探针A配成浓度为20μM的溶液，然后与相同体积的Spotting Solution混合，用Cartesian公司的微阵列芯片制作系统点阵在醛基修饰的载玻片表面，置于室温下，70％相对湿度保存48-72h进行固定，然后，室温下将玻片浸入0.2％SDS中振荡数分钟，再浸入纯水中振荡数分钟，再浸入0.2％SDS两次，每次2min，再浸入纯水中两次，每次2min，晾干。用杂交液(10mM MOPS，100mM NaNO3，pH 7.2)将探针B稀释，终浓度为2-5μM，滴于芯片上，盖上盖玻片，室温杂交12-16h。然后依次用0.2％SDS，2×SSC，0.2×SSC洗3min，吹干备用。
[0032] 实施例2：利用探针A和探针B制备的芯片考察Hg2+的反应时间动力学。
[0033] 用10mM MOPS，100mM NaNO3，pH 7.2稀释制备好100μM、10μM的Hg2+，将Hg2+溶液加在制备好的芯片斑点处。室温反应1小时取出芯片，用10mM MOPS，100mM NaNO3，pH 7.2缓冲液洗3次，吹干。用General Scanning公司的芯片信号分析系统Scanarray 3000扫描照片(图2A-F)并分析结果(图2G)。
[0034] 结果表明，Hg2+诱导探针B的释放是个快速的过程，加入100μM、10μM的Hg2+后反应2min，相对于缓冲液对照组，荧光强度分别下降了63％，45％。20min基本完成了95％的反应。
[0035] 实施例3：利用探针A和B制备的芯片检测不同浓度的Hg2+。
[0036] 用10mM MOPS，100mM NaNO3，pH 7.2稀释制备好不同浓度的Hg2+，加不同浓度的2+
Hg 溶液于制备好的芯片斑点处，室温，反应1h。用10mMMOPS，100mM NaNO3，pH 7.2缓冲液洗3次，吹干。用General Scanning公司的芯片信号分析系统Scanarray 3000扫描照片(图3A)并分析结果(图3B)。
Hg 溶液于制备好的芯片斑点处，室温，反应1h。用10mMMOPS，100mM NaNO3，pH 7.2缓冲液洗3次，吹干。用General Scanning公司的芯片信号分析系统Scanarray 3000扫描照片(图3A)并分析结果(图3B)。
[0037] 结果表明，在Hg2+离子存在的情况下，芯片斑点处荧光强度减弱，当Hg2+浓度为2+
10nM时，与缓冲液组的荧光强度相比，斑点处荧光强度减弱20％，随着Hg 浓度增加，荧光
2+
信号逐渐减弱。按照空白标准偏差的三倍计算，该芯片检测Hg 的检测限为1nM。
10nM时，与缓冲液组的荧光强度相比，斑点处荧光强度减弱20％，随着Hg 浓度增加，荧光
2+
信号逐渐减弱。按照空白标准偏差的三倍计算，该芯片检测Hg 的检测限为1nM。
[0038] 实施例4：考察探针A和B制备的芯片对Hg2+检测的特异性。
[0039] 用10mM MOPS，100mM NaNO3，pH 7.2稀释制备10μM的不同的二价金属离子，加不同二价金属离子溶液于制备好的芯片斑点处，室温，反应1h。用10mM MOPS，100mM NaNO3，pH7.2缓冲液洗3次，吹干。用General Scanning公司的芯片信号分析系统Scanarray 3000扫描照片(图4A)并分析结果(图4B)。
[0040] 结果表明，只有在Hg2+存在的情况下，芯片斑点处荧光强度大大减弱，Hg2+为10μM时，与缓冲液组的荧光强度相比，荧光强度减弱了85％。而当加入10μM其他二价金属离2+
子，荧光强度只有微小的减弱，在0.9％～2.6％左右。说明该芯片对Hg 检测具有很好的特异性。
子，荧光强度只有微小的减弱，在0.9％～2.6％左右。说明该芯片对Hg 检测具有很好的特异性。
[0041] 实施例5：用探针A和B制备的芯片检测掺入在饮用水中的Hg2+。
[0042] 用饮用水配制含10mM MOPS，pH 7.2，100mM NaNO3的缓冲液，再向其中掺入一定体积的汞存储液，使汞离子的浓度为5μM、500nM。将制备好的汞离子溶液加入芯片斑点处，同时设立饮用水缓冲液对照。并同时检测标准缓冲液中相同浓度的汞离子。室温反应1h，用10mM MOPS，pH7.2，100mM NaNO3缓冲液洗3次，每次2min，吹干。用激光共聚焦扫描仪扫描照片(图5A、5B)并用信号分析系统Scanarray 3000分析结果(图5C)。
[0043] 结果显示，用该芯片检测相同浓度的掺入在饮用水中的Hg2+及标准缓冲液中的2+ 2+
Hg 时，荧光信号减弱的程度无明显差别，说明用该芯片可以检测掺入在饮用水中的Hg 。
Hg 时，荧光信号减弱的程度无明显差别，说明用该芯片可以检测掺入在饮用水中的Hg 。