羟基苯并吡喃酮类化合物在制备治疗白血病药物中的应用

摘要

本发明涉及“羟基苯并吡喃酮类化合物在制备治疗白血病药物中的应用”，属于化学药物领域。实验表明式(I)所示的化合物特别是式II化合物淫羊藿素，能以浓度依赖性的方式抑制CML细胞增殖，并以浓度依赖性的方式诱导CML患者骨髓细胞发生凋亡；能明显降低外周血白细胞计数和CD45+白血病细胞比例；同时还能明显减轻白血病小鼠的脾脏重量；还能以浓度依赖性的方式抑制K562细胞中ERα-36受体蛋白表达量，因此表明式(I)结构的化合物能治疗慢性粒细胞性白血病。

权利要求

1.式(II)的化合物及其药学上可接受的盐在制备改善、预防和治疗慢性粒细胞性白血病药物中的应用，其中，

所述慢性粒细胞性白血病是雌激素受体ER-α36表达阳性的慢性粒细胞性白血病。

说明书

羟基苯并吡喃酮类化合物在制备治疗白血病药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及羟基苯并吡喃酮类化合物的用途。本发明化合物适用于预防和治疗慢性粒细胞性白血病。本发明还涉及包含这些化合物的药物组合物，并且涉及使用所述化合物，单独使用或与其他药剂联合使用，治疗慢性粒细胞性白血病。

背景技术

[0002] 雌激素是由体内内分泌系统产生的一种类固醇激素，在生殖系统、心血管系统、中枢神经系统、免疫系统和骨骼系统中都发挥着重要的作用。近年来的研究表明，雌激素通过细胞核途径和细胞膜途径两种信号转导通路发挥生物效应；雌激素及其受体信号转导系统广泛参与体内多个系统组织中细胞生长、分化和凋亡过程。已有大量研究证实雌激素受体ER-α存在于白血病患者的白血病细胞中，且其受体表达水平与临床治疗预后存在相关性；ER-α介导的信号转导途径很可能参与了白血病的形成和发展过程。

[0003] 目前研究证实雌激素受体分为α和β两种亚型；其中ER-α包括三个同源异构体ER-α66、ER-α46和ER-α36。异构体ER-α36从位于ER-α66基因的第一个内含子中的启动子开始转录，利用ER-α66的部分外显子进行编码。因此，ER-α36缺失两个转录功能区，保留了DNA结合功能区和二聚化功能区；更为重要的是ER-α36的激素配体结合区缺失了部分螺旋区，从而完全改变了其与激素配体结合的专一性和亲和力。ER-α36主要分布于细胞膜和细胞浆中，少量存在于细胞核中。ER-α36可以通过雌激素的细胞膜信号转导途径调节细胞生长和凋亡(1.ZY，Wang；XT，Zhang；P，Shen；BW，Loggie；YC，Chang；TF，Deuel.A variant of estrogenreceptor-α，hER-α36：Transduction of estrogen-and antiestrogen-dependent membrane-initiatedmitogenic signaling.PNAS.2006，103(24)：9063-9068.2.LMJ，Lee；J，Cao；H，Deng；P，Chen；Z，Gatalica；ZY，Wang.ER-α36，a novel variant of ER-α，is expressed in ER-positive and-negativehuman breast carcinomas.Anticancer Res.2008，28(1B)：479-483)。

发明内容

[0004] 本发明的化合物用作调节雌激素受体生物信息系统，可以用于预防和治疗慢性粒细胞性白血病。

[0005] 本发明涉及式(I)的化合物，其药学上可接受的盐或药物组合物在制备改善、预防和治疗白血病药物中的应用，

[0006]

[0007] 其中，

[0008] R1、R2和R3彼此独立地选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基。

[0009] 在本发明的一个特别优选实施方案中，式(I)的化合物是：3，5，7-三羟基-2-(4-甲氧基苯基)-8-(3-甲基-2-丁烯-)-4H-苯并吡喃-4-酮(又名：淫羊藿素，Icaritin)，也即式(I)的化合物具有式(II)的结构：

[0010]

[0011] 在本发明的一个特别优选实施方案中，式(I)的化合物是式(II)化合物的去甲基产物，即式(III)所示的去甲基淫羊藿素：3，5，7-三羟基-2-(4-羟基苯基)-8-(3-甲基-2-丁烯-)-4H-苯并吡喃-4-酮。

[0012]

[0013] 所述白血病是指慢性粒细胞性白血病(Chronic myeloid leukemia，CML)。

[0014] 所述的式(I)化合物，及其药学上可接受的盐或药物组合物，在制备受雌激素受体ER-α或ER-β亚型调控的相关疾病的药物中的应用，

[0015]

[0016] 其中，

[0017] R1、R2和R3彼此独立地选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基。

[0018] 在本发明的一个特别优选实施方案中，式(I)的化合物是：3，5，7-三羟基-2-(4-甲氧基苯基)-8-(3-甲基-2-丁烯-)-4H-苯并吡喃-4-酮(又名：淫羊藿素，Icaritin)，也即式(I)的化合物具有式(II)的结构：

[0019]

[0020] 在本发明的一个特别优选实施方案中，式(I)的化合物是式(II)化合物的去甲基产物，即式(III)所示的去甲基淫羊藿素：3，5，7-三羟基-2-(4-羟基苯基)-8-(3-甲基-2-丁烯-)-4H-苯并吡喃-4-酮。

[0021]

[0022] 所述的式(I)、(II)、(III)化合物，及其药学上可接受的盐或药物组合物，在制备受雌激素受体ER-α或ER-β亚型调控的相关疾病的药物中的应用，所述ER-α亚型包括ER-α36，ER-α46和ER-α66。

[0023] 所述式(I)、(II)、(III)化合物，及其药学上可接受的盐或药物组合物是作为雌激素受体ER-α和ER-β亚型的调节剂。

[0024] 术语“式(I)化合物”包括如这里定义的式(I)以及这化合物的所有实施方案，优选实施方案，更优选实施方案以及特别优选实施方案，包括有具体名称的或实施例中公开的化合物，这些化合物的每个都是通式定义的化合物的特别优选实施方案。关于“本发明的化合物”是指上述定义的式(I)中的任何化合物。

[0025] 本发明还涉及到本发明的化合物的盐，多晶型物，溶剂化物和水合物。这里使用的术语“药学上可接受的盐”，除非另有所述，包括可以在本发明的化合物中存在的盐。

[0026] 用于本发明的动词“治疗”，除非另有所述，是指逆转、减轻、抑制疾病或病症的过程，或预防这样的疾病或病症。这里使用的名词“治疗”是指治疗的行为，其中的治疗如上面所定义。

[0027] 本发明还涉及一种药物组合物，所述的药物组合物包括式(I)的化合物和一种药学上可接受的载体。例如，药物组合物可以以片剂、胶囊、丸剂、粉末、缓释剂、溶液、悬浮液的形式口服给药；药物组合物也可以以无菌液、悬浮液或乳液的形式肠胃外注射给药；药物组合物也可以以软膏或霜膏的形式局部给药；药物组合物也可以以栓剂的形式直肠给药。药物组合物可以做成单位剂型，其适于精确剂量的单一给药。药物组合物包括常规的药物载体或赋形剂和作为活性成分的本发明的化合物。另外，药物组合物可以包括其它医学或药学制剂、载体、助剂等等。

[0028] 合适的药物载体包括惰性稀释剂或填料、水和各种有机溶剂。如果需要，本药物组合物可以含有其它的成分，例如调味剂、粘合剂、赋形剂等等。因此对于口服给药，片剂可以包含各种赋形剂，例如可以使用柠檬酸和各种崩解剂例如淀粉、褐藻酸和某些复杂的硅酸盐和粘合剂例如蔗糖、明胶和阿拉伯胶。另外，经常在片剂中使用润滑剂例如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石粉。固体组合物的一个相似类型也可以使用软的和硬的填充胶囊。优选的材料包括乳糖或奶糖和高分子量的聚乙二醇。当希望通过可口服给予本发明活性化合物时，水悬浮液或酏剂可以与各种增甜剂或调味剂、色素或染料以及，如果需要，乳化剂或悬浮剂，以及稀释剂例如水、乙醇、丙二醇、甘油或其组合结合给药。

[0029] 示范性的肠胃外给药形式包括活性化合物在无菌水溶液中的溶液或悬浮液，例如，丙二醇或右旋糖水溶液。如果需要，这样的剂型可以适当地缓冲。视情况而定，本发明的含水组合物可以包括其它药学上可接受的溶质，包括添加剂及其它药物。合适的添加剂是本领域熟知的那些，包括但不限于，抗氧化剂、抗菌药物、表面活性剂、螯合剂、糖、以及防腐剂。本发明的含水组合物可以通过注射给药，其中注射可以是肌肉注射、静脉注射或皮下注射。

[0030] 在给药的预定途径和标准药物操作方面，本发明的化合物可以单独给药，但常常与本领域公知的合适的药物赋形剂、稀释剂或载体一起给药。如果合适的话，可以加入辅助剂，所述的辅助剂包括防腐剂、抗氧化剂、调味剂、或着色剂。本发明的化合物可以配制成合适的药物组合物，以提供直接的、延迟的、改性的、持久的、脉冲的或控制的释放，取决于具体给药途径以及释放分布的特异性，与治疗需要相对应。

[0031] 本发明的化合物可以按以下路线给药，例如，但不限于，本领域公知的口服(包括口腔、舌下等等)形式。在这种情况下，“口服”是指口服给药方式，其中动物的口服使用量是明文规定的，例如在食物或饮料中，直接放入口腔中，或者是自由选择使用量。在本发明中，术语“动物”是指动物界拥有适应性机能的温血动物，例如犬和人类。

[0032] 典型的口服的固体形式可以包括片剂、粉剂、多微粒制剂(颗粒)、胶囊、咀嚼剂、锭剂、膜剂、贴片等等。典型的口服液体(包括半固体和胶质)形式可以包括溶液、酏剂、凝胶剂、喷雾剂、液体填充的咀嚼剂等等。也可以使用其它口服给药形式，其中活性剂悬浮在液体或半固体载体相中，例如悬浮液。

[0033] 本发明的化合物还可以通过肠胃外给药。术语肠胃外给药是指给药路线不通过口腔。优选对于本发明的化合物，肠胃外给药可以包括局部和经皮、直肠、阴道、鼻腔、吸入和注射给药(需要通过针和无针方法渗透皮肤屏障的给药方式，包括植入物和储层)。

[0034] 本发明的组合物包括片剂。在一种优选实施方案中，片剂通过选自直接压片或湿、干或熔融造粒、熔融凝结方法和挤出的方法制备。在另一个实施方案中，本发明的组合物的片剂核部分可以是单层或多层的，用本领域公知的合适包衣材料进行包衣。

[0035] 本发明化合物的口服液形式优选是溶液或悬浮液，其中活性化合物是充分溶解或部分溶解的。在一种实施方案中，溶液包含活性化合物和药学上有先例的适于口服的溶剂。在一种优选实施方案中，溶剂是一种对本发明的化合物显现出良好溶解度的溶剂。这些溶剂通常占配方的主要部分，即大于50％(按重量计算)，优选大于80％，例如95％。在一种优选实施方案中，溶液进一步包含辅助剂或添加剂。在其一种优选的实施方案中，添加剂或辅助剂是一种掩味剂、可口剂、调味剂、抗氧化剂、稳定剂、质地改性剂、粘度调节剂和增溶剂。

[0036] 另一个实施方案是制备本发明化合物的优选口服液形式的方法，其中在适宜温度范围内，各个优选组分以一种有利于溶解速度的方式任选通过机械搅拌或超声波搅拌混合。

[0037] 本发明化合物的制备从中药材原料中提取分离得到。本发明的化合物的制备参照另一发明专利“淫羊藿素的制备方法”(孟坤，CN 101302548A)中所述的方法，自中药材淫羊藿中分离提取出化学成份淫羊藿素，也即本分明实施例化合物。

[0038] 去甲基淫羊藿素从上海友思生物技术有限公司购买。

[0039] 生物实验及测试

[0040] 1.化合物对CML细胞的抑制增值和诱导凋亡效应：

[0041] 用MTT实验观察不同浓度的化合物对K562细胞和来自CML患者骨髓的原代细胞的增殖抑制率，CML患者的骨髓细胞分为急变期和慢性期两种，另采集正常人骨髓细胞作为对照；用流式细胞仪检测不同浓度化合物作用于CML患者骨髓的原代细胞后凋亡细胞的百分率。

[0042] 2.化合物对移植K562细胞株的NOD-SCID小鼠的治疗作用：

[0043] 用无菌生理盐水调整K562细胞浓度为1×107/ml，每只NOD-SCID小鼠经尾静脉注6
射K562细胞2×10/0.2mL。荷瘤小鼠随机分为四组；空白对照组给予等量溶剂；阳性对照组给予Imatinib(Glivec，格列卫)50μg/g；实验组分别给予两个浓度的化合物。每日一次+
给予荷瘤小鼠腹腔注射不同药物，连续45日。每周检测小鼠外周血白细胞数和CD45 白血病细胞数，小鼠死亡后通过HE染色观察小鼠脾的病理学变化，并通过免疫组化检测小鼠脾脏白血病细胞ERα-36受体的表达。

[0044] 3.化合物对K562细胞中ERα-36受体表达的影响：

[0045] 用流式细胞仪和间接免疫荧光显微镜检测无干预和8μM化合物作用后K562细胞中表达ERα-36受体的细胞的比例，用Western blot方法检测不同浓度化合物干预后K562细胞中ERα-36受体蛋白表达量情况。

[0046] 实验结果表明，具有式(I)结构的化合物特别是式(II)，能以浓度依赖性的方式抑制CML细胞增殖，并以浓度依赖性的方式诱导CML患者骨髓细胞发生凋亡；能明显降低外+周血白细胞计数和CD45 白血病细胞比例；同时还能明显减轻白血病小鼠的脾脏重量；还能以浓度依赖性的方式抑制K562细胞中ERα-36受体蛋白表达量，因此表明式(I)结构的化合物能治疗慢性粒细胞性白血病。

附图说明

[0047] 图1化合物(II)对K562细胞的增殖抑制效应MTT试验。

[0048] 图2化合物(II)对19例CML患者骨髓原代白血病细胞和11例非血液肿瘤患者骨髓单个核细胞的增殖抑制效应MTT试验。

[0049] 图3化合物(II)对CML患者骨髓原代白血病细胞凋亡率的影响(与对照组相比* **P＜0.05，P＜0.01)。

[0050] 图4化合物(II)对小鼠外周血白细胞计数随生存时间变化的影响。

[0051] 图中IC 8为化合物(II)8μg/g组，IC 4为化合物(II)4μg/g组，Con为空白对照组，Ima 50为Imatinib50μg/g组。

[0052] 图5化合物(II)对小鼠外周血人CD45抗原表达随生存时间变化的影响。

[0053] 图中IC 8为化合物(II)8μg/g组，IC 4为化合物(II)4μg/g组，Con为空白对照组，Ima 50为Imatinib50μg/g组。

[0054] 图6化合物(II)对荷瘤小鼠脾脏大小的影响。

[0055] 图中Control为空白对照组，IC162 8为化合物(II)8μg/g组，IC162 4为化合物(II)4μg/g组，Ima 50为Imatinib50μg/g组。

[0056] 图7化合物(II)对荷瘤小鼠脾脏平均重量的影响。

[0057] 图中Con为空白对照组，IC 8为化合物(II)8μg/g组，IC 4为化合物(II)4μg/*g组，Ima 50为Imatinib50μg/g组(与空白对照组比较，P＜0.05；与阳性对照组比较，#P＞0.05；与化合物(II)4μg/g组比较，△P＞0.05)。

[0058] 图8化合物(II)对荷瘤小鼠脾脏ERα-36受体表达的影响。

[0059] 其中A、B、C和D分别为空白对照组、Imatinib50μg/g组、化合物(II)4μg/g组和化合物(II)8μg/g组。

[0060] 图9化合物(II)对K562细胞膜ERα-36受体表达的影响。

[0061] 图10化合物(II)对K562细胞ERα-36受体蛋白表达的影响。具体实施例

[0062] 下面的实施例说明制备本发明的化合物和方法。应该理解，本发明并不受下面提供的具体内容的限制。

[0063] 下面的实施例说明式(II)化合物的制备。

[0064]

[0065] 3，5，7-三羟基-2-(4-甲氧基苯基)-8-(3-甲基-2-丁烯基-)-4H-苯并吡喃-4-酮(又名：淫羊藿素，Icaritin；在生物测试实验中又名IC162和IC)

[0066] 该实施例化合物的制备参照另一发明专利“淫羊藿素的制备方法”(孟坤，CN101302548A)中所述的方法，自中药材淫羊藿中分离提取出化学单体淫羊藿素，也即本发明实施例化合物。

[0067] 实施例化合物的生物实验

[0068] 前面已描述了本发明涉及式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或药物组合物适用于治疗慢性粒细胞性白血病。现以实施例的化合物(II)为例，对其进行详细说明。

[0069] (1)实施例化合物(II)对CML细胞的抑制增值和诱导凋亡效应：

[0070] 本实验具体实验方法如前生物实验及测试部分中实验1(化合物对CML细胞的抑制增值和诱导凋亡效应)所述。除对K562细胞周期的影响采用单一浓度外，其余实验中实施例化合物(II)所用浓度均为0μM、4μM、8μM、16μM、32μM、64μM。

[0071] 实验结果显示实施例化合物(II)能以浓度依赖性的方式抑制CML细胞增殖，并以浓度依赖性的方式诱导CML患者骨髓细胞发生凋亡。具体结果见图1-3。

[0072] (2)实施例化合物(II)对移植K562细胞株的NOD-SCID小鼠的治疗作用：

[0073] 本实验具体实验方法如前生物实验及测试部分中实验2(化合物对移植K562细胞株的NOD-SCID小鼠的治疗作用)所述。实施例化合物(II)采用4μg/g和8μg/g两个剂量。

[0074] 实验结果显示实施例化合物(II)能明显降低外周血白细胞计数和CD45+白血病细胞比例；实施例化合物(II)能明显减少白血病小鼠的脾脏体积同时减轻白血病小鼠的脾脏重量。实验结果还显示空白对照组小鼠脾脏中ERα-36受体表达较多，实施例化合物(II)处理后的小鼠脾脏则未见ERα-36受体表达。具体结果如图4-8，图中IC 8和IC1628表示实施例化合物(II)8μg/g组，IC 4和IC162 4表示实施例化合物(II)4μg/g组，Con和Control表示空白对照组，Ima 50表示Imatinib50μg/g组。

[0075] (3)实施例化合物(II)对K562细胞中ERα-36受体表达的影响：

[0076] 本实验具体实验方法如前生物实验及测试部分中实验3所述(化合物对K562细胞中ERα-36受体表达的影响)。实施例化合物(II)采用8μM浓度作用于K562细胞，免疫荧光和流式细胞仪检测表达ERα-36受体的细胞的比例。实施例化合物(II)采用0μM、4μM、8μM、16μM、32μM和64μM浓度处理细胞，Western blot方法检测细胞中ERα-36表达情况。

[0077] 实验结果显示K562细胞膜存在ERα-36受体强表达情况，实施例化合物(II)能够显著降低K562细胞膜ERα-36受体的表达。实施例化合物(II)还能以浓度依赖性的方式抑制K562细胞中ERα-36受体蛋白表达量。具体结果见图9-10。