一种制备禽霍乱外膜蛋白H和A基因及融合DNA疫苗的方法包括利用聚合酶链式反应法获得禽霍乱外膜蛋白H和A基因、禽霍乱外膜蛋白H基因的酶切回收纯化、真核表达载体pcDNA3.1(+)的酶切回收纯化、纯化后的连接和转化、pcM质粒溶液提取、pcM质粒溶液的酶切回收纯化过程、禽霍乱外膜蛋白A基因的酶切回收纯化、A基因与pcM质粒溶液的连接和转化以及H和A基因制备融合DNA疫苗共九项内容。经动物实验检测表明，本发明的方法所制备出的融合DNA疫苗可有效地为被免疫的鸡提供抵抗禽多杀性巴氏杆菌攻击的能力，保护率可达75%，能够有效预防禽多杀性巴氏杆菌引起的禽霍乱。
1.一种制备禽霍乱外膜蛋白H和A基因及融合DNA疫苗的方法，该方法中将：
基因序列5’-CGGGATCCAaaaaaacagcaattgc-3’ 自定义为引物①；
基因序列5’-TAATGGATCCGAAGTGTACGCGTAAAC-3’自定义为引物②；
基因序列5’-TGAGGTACCATGAAAAAGACAATCGTAG-3’ 自定义为引物③；
基因序列5’-CGCGCGAATTCTTATTTGTTACCTTTAACAGCG-3’ 自定义为引物④；
Ⅰ、利用聚合酶链式反应法获得未经酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白H基因和禽霍乱外膜蛋白A基因
ⅰ)在聚合酶链式反应管a中同时加入引物①和引物②各1微升，再依次加入DNA聚合酶0.5微升、聚合酶缓冲液2.5微升、四种双脱氧核糖核苷酸混合物3微升、禽霍乱菌基因组模板1微升和水16微升，再将聚合酶链式反应管a放入聚合酶链式反应扩增仪中，设定反应温度94ºC时的预变性时间为5分钟，然后再将在94ºC时变性1分钟到降至55ºC时的复性1分钟以及再升温至72ºC的延伸2分钟称为一个循环，将所述一个循环重复30次，
30次循环结束后在72ºC时再延伸10分钟制备出未经酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白H基因；
ⅱ)在聚合酶链式反应管b中同时加入引物③和引物④各1微升，其余过程同ⅰ)，在该过程中将所述一个循环中的“55ºC”变为“53ºC”，将“聚合酶链式反应管a”替换为“聚合酶链式反应管b”即可制备出未经酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白A基因；
Ⅱ、未经酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白H基因的酶切回收纯化过程
第一步，取1.5毫升的离心管a，在离心管a中依次加入未经酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白H基因20微升、限制性内切酶KpnⅠ3微升、限制性内切酶BamHⅠ3微升、限制性内切酶缓冲液5微升和水19微升，将加入有上述H基因和试剂的离心管a充分混匀后放入37ºC的水浴中3小时得到混合物H；然后称取1.0克琼脂糖粉末加入到100毫升的电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充分溶解，将充分溶解的琼脂糖溶液倒入制胶板中，凝固后的固体称为凝胶a；将所述凝胶a放入电泳缓冲液中，将所述混合物H加入到所述凝胶a中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪得到凝胶b；
第二步，取1.5毫升的离心管b并称其重量，然后在紫外灯下将凝胶b上的混合物H切下来，将切下来的混合物H放在已称重的1.5毫升的离心管b中，称取离心管b的总重并计算出切下来的混合物H的重量，然后将离心管b中切下来的混合物H捣碎，在离心管b中加入等体积的溶液I，颠倒离心管b混匀，将离心管b放置在50℃水浴中加热10分钟至混合物H完全融解，融解过程需颠倒离心管b数次以加速混合物H的融解，将融解后的混合物H倒入DNA纯化柱a上，该DNA纯化柱a已事先放置在收集管a中，在室温下将收集管a放置
1分钟，然后将收集管a放在离心机中离心1分钟，设定离心机的转速为12000转/分钟，离心后倒掉收集管a内的液体，再向收集管a内的DNA纯化柱a上加入700微升的溶液II，在室温下将收集管a放置1分钟，再将收集管a在12000转/分钟的转速下离心1分钟，离心后倒掉收集管a内的液体，随后再向DNA纯化柱a上加入500微升的溶液II，将收集管a在12000转/分钟的转速下离心1分钟，再次倒掉收集管a内的液体并在13000转/分钟的转速下离心1分钟，取出4次离心后的DNA纯化柱a并放置于1.5毫升的离心管c中，在离心管c的DNA纯化柱a上加入30微升溶液III，将离心管c室温下放置1分钟，再将离心管c在13000转/分钟的转速下离心1分钟，取出DNA纯化柱a得到离心管c中的30微升液体，该液体就是酶切回收纯化后的禽霍乱外膜蛋白H基因；
Ⅲ、真核表达载体pcDNA3.1(+)的酶切回收纯化过程
在1.5毫升的离心管d中依次加入真核表达载体pcDNA3.1(+) 10微升、限制性内切酶KpnⅠ3微升、限制性内切酶BamHⅠ3微升、限制性内切酶缓冲液5微升和水29微升，将加入有上述载体和试剂的离心管d充分混匀后放入37ºC的水浴中8小时得到混合物p；然后称取1.0克琼脂糖粉末加入到100毫升的电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充分溶解，将充分溶解的琼脂糖溶液倒入制胶板中，凝固后的固体称为凝胶c；将所述凝胶c放入电泳缓冲液中，将所述混合物p加入到所述凝胶c中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪得到凝胶d；然后重复上述Ⅱ中的第二步并将其中的：离心管b替换成离心管e、凝胶b替换成凝胶d、混合物H替换成混合物p、DNA纯化柱a替换成DNA纯化柱b、收集管a替换成收集管b、离心管c替换成离心管f即可得到离心管f中的30微升液体，该液体就是酶切回收纯化后的真核表达载体pcDNA3.1(+)；
Ⅳ、酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白H基因与酶切回收纯化的真核表达载体pcDNA3.1(+)的连接和转化
连接：在1.5毫升的离心管g中加入酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白H基因10微升、酶切回收纯化的真核表达载体pcDNA3.1(+) 2微升、DNA连接酶1微升、DNA连接酶缓冲液2微升和水5微升，将加入有上述H基因、载体和试剂的离心管g放入16ºC水浴中12小时；
转化：从16ºC水浴中取出离心管g并加入200微升的大肠杆菌感受态JM83，再将离心管g先放置在冰浴中30分钟，再在42ºC的水浴中放置90秒，最后在冰浴中放置3分钟，然后向离心管g中加入0.5毫升LB液体培养基，将离心管g放置在37ºC的摇床内以200转/分钟的速度振荡培养1.5小时，振荡培养结束后从离心管g中取出100微升的液体并涂布于含有浓度为50微克/毫升氨苄青霉素的LB培养平板上，将涂布后的LB培养平板放置在
取出培养16小时后的LB培养平板，挑取LB培养平板上生长的其中一个菌落，将该菌落放入含有浓度为50微克/毫升氨苄青霉素的5毫升LB液体培养基中，然后将所述的LB液体培养基放置在37ºC摇床内以200转/分钟的速度振荡培养16小时，振荡培养结束后从所述的LB液体培养基中取出1毫升的液体并加入到1.5毫升的离心管h中，再将离心管h在12000转/分钟的转速下离心5分钟，弃掉离心管h中的上清液，然后往离心管h中的沉淀物中加入100微升预先放置在4℃冰箱内冷却的溶液Ⅳ，将离心管h充分振荡混匀后加入200微升的溶液Ⅴ，反复颠倒离心管h数次，将离心管h放置于冰浴中3分钟，再向离心管h中加入150微升预先放置在4℃冰箱内冷却的溶液Ⅵ，然后将离心管h放在冰浴中5分钟，从冰浴中取出离心管h后在12000转/分钟的转速下和4℃的条件下离心10分钟，吸取离心后离心管h中的上清液，将所述上清液加入到1.5毫升的离心管i中，再向离心管i中加入等量的苯酚和氯仿的混合液，将离心管i振荡后在12000转/分钟的转速下和4℃的条件下离心10分钟，离心结束后将离心管i中的上层液体移入到1.5毫升的离心管j中，再向离心管j中加入上层液体2倍的无水乙醇，将离心管j放置于-20℃冰箱内冷藏20分钟，然后取出离心管j放在13000 转/分钟的转速下和4℃的条件下离心10分钟，将离心管j中的上清液弃掉，再向离心管j中的沉淀物中加入0.5毫升浓度为70％的乙醇，在12000 转/分钟的转速下和4℃的条件下对离心管j离心5分钟，倒掉离心管j中的上清液，离心管j中的沉淀物自定义为pcM质粒，待pcM质粒干燥后，向离心管j中加入30微升的水进行充分溶解得到自定义为pcM质粒溶液；
在1.5毫升的离心管k中依次加入pcM质粒溶液10微升、限制性内切酶BamHⅠ3微升、限制性内切酶EcoRⅠ3微升、限制性内切酶缓冲液5微升和水29微升，将加入有上述pcM质粒和试剂的离心管k充分混匀后放入37ºC的水浴中8小时得到混合物M；然后称取
1.0克琼脂糖粉末加入到100毫升的电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充分溶解，将充分溶解的琼脂糖溶液倒入制胶板中，凝固后的固体称为凝胶e；将所述凝胶e放入电泳缓冲液中，将所述混合物M加入到所述凝胶e中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪得到凝胶f；然后重复上述Ⅱ中的第二步并将其中的：离心管b替换成离心管m、凝胶b替换成凝胶f、混合物H替换成混合物M、DNA纯化柱a替换成DNA纯化柱c、收集管a替换成收集管c、离心管c替换成离心管n即可得到离心管n中的30微升液体，该液体就是酶切回收纯化后的pcM质粒溶液；
Ⅶ、未经酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白A基因的酶切回收纯化过程
取1.5毫升的离心管o，在离心管o中依次加入未经酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白A基因20微升、限制性内切酶BamHⅠ3微升、限制性内切酶EcoRⅠ3微升、限制性内切酶缓冲液5微升和水19微升，将加入有上述A基因和试剂的离心管o充分混匀后放入37ºC的水浴中3小时得到混合物A；然后称取1.0克琼脂糖粉末加入到100毫升的电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充分溶解，将充分溶解的琼脂糖溶液倒入制胶板中，凝固后的固体称为凝胶g；将所述凝胶g放入电泳缓冲液中，将所述混合物A加入到所述凝胶g中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪得到凝胶h；然后重复上述Ⅱ中的第二步并将其中的：离心管b替换成离心管p、凝胶b替换成凝胶h、混合物H替换成混合物A、DNA纯化柱a替换成DNA纯化柱d、收集管a替换成收集管d、离心管c替换成离心管q即可得到离心管q中的30微升液体，该液体就是酶切回收纯化后的禽霍乱外膜蛋白A基因；
Ⅷ、酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白A基因与酶切回收纯化的pcM质粒溶液的连接和转化
连接：在1.5毫升的离心管r中加入酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白A基因10微升、酶切回收纯化的pcM质粒溶液2微升、DNA连接酶1微升、DNA连接酶缓冲液2微升和水5微升，将加入有上述A基因、质粒和试剂的离心管r放入16ºC水浴中12小时完成连接；
转化：重复上述Ⅳ并将离心管g替换成离心管r即完成酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白A基因与酶切回收纯化的pcM质粒溶液的转化；
Ⅸ、禽霍乱外膜蛋白H基因和禽霍乱外膜蛋白A基因制备融合DNA疫苗
ⅰ) 取出上述Ⅷ中经转化培养16小时的LB培养平板，重复上述Ⅴ的内容并将其中的：
离心管h替换成离心管s、离心管i替换成离心管t、离心管j替换成离心管u，离心管u中的沉淀物自定义为pcDNA-MA质粒，待pcDNA-MA质粒干燥后，向离心管u中加入30微升的水进行充分溶解得到自定义为pcDNA-MA质粒溶液；
ⅱ)在1.5毫升的离心管v中依次加入pcDNA-MA质粒溶液2微升、限制性内切酶KpnⅠ1微升、限制性内切酶EcoRⅠ1微升、限制性内切酶缓冲液1微升和水5微升，将加入有上述pcDNA-MA质粒和试剂的离心管v充分混匀后放入37ºC的水浴中2小时得到混合物D；然后称取1.0克琼脂糖粉末加入到100毫升的电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充分溶解，将充分溶解的琼脂糖溶液倒入制胶板中，凝固后的固体称为凝胶i；将所述凝胶i放入电泳缓冲液中，将所述混合物D加入到所述凝胶i中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪得到含有混合物D的凝胶j；
将所述凝胶j放在凝胶成像系统中进行检测，若检测出凝胶j含有大小为2082个碱基对的基因时，则证明该pcDNA-MA质粒是由禽霍乱外膜蛋白H基因和禽霍乱外膜蛋白A基因所制备出的融合DNA疫苗；
上述所述溶液Ⅳ包含有50毫摩尔的葡萄糖、25毫摩尔的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、10毫摩尔的乙二胺四乙酸和水；
上述所述溶液Ⅴ包含有10毫摩尔/升的氢氧化钠和10%的十二烷基磺酸钠；
上述所述溶液Ⅵ包含有60%的5 摩尔/升的乙酸钾、11.5%的冰醋酸和水。
2、如权利要求1所述制备禽霍乱外膜蛋白H和A基因及融合DNA疫苗的方法，其特征是：LB液体培养基包含有1%的胰蛋白胨、0.5%的酵母提取物、1%的氯化钠和水。
3、如权利要求1所述制备禽霍乱外膜蛋白H和A基因及融合DNA疫苗的方法，其特征是：LB培养平板上包含有1%的胰蛋白胨、0.5%的酵母提取物、1%的氯化钠、1.5%的琼脂粉和水。
制备禽霍乱外膜蛋白H和A基因及融合DNA疫苗的方法
技术领域
[0001] 本发明属于动物疫苗技术领域，尤其是一种制备禽霍乱外膜蛋白H和A基因及融合DNA疫苗的方法。
[0002] 上述发明名称由于受标题字数的限制，其中的禽霍乱外膜蛋白H和A基因全称应为：禽霍乱外膜蛋白H基因和禽霍乱外膜蛋白A基因，故制备禽霍乱外膜蛋白H和A基因及融合DNA疫苗的方法应为：制备禽霍乱外膜蛋白H基因和禽霍乱外膜蛋白A基因及融合DNA疫苗的方法。
背景技术
[0003] 禽霍乱是由禽多杀性巴氏杆菌引起的家禽接触性传染病，呈世界分布，在我国也是常见的多发性传染病，几乎所有的家禽都能感染禽霍乱，其传染流行严重影响家禽业的健康发展，也给家禽业带来了巨大的经济损失，据不完全统计，我国家禽感染上呼吸道带菌率可高达37.5~57.5%，成为禽霍乱爆发的主要原因之一。
[0004] 对于禽霍乱的控制措施主要采用药物治疗，如磺胺嘧啶或链霉素等抗生素的效果较好，但存在停药后容易复发的缺点，且长期服用易导致致病菌产生耐药性，还可能会对禽体产生明显的毒害作用，如蛋鸡用后产蛋率会明显下降，肉鸡用后则存在药物残留的危害从而降低了其商业价值。因此，要想从根本上控制禽霍乱的流行，需要有效的疫苗进行免疫预防。
[0005] 禽霍乱疫苗常用的有弱毒活疫苗和灭活疫苗两种，其中弱毒活疫苗的免疫期偏短、免疫保护力偏低、局部及全身的反应偏大，不仅造成家禽的减食和严重产蛋下降，还会造成一些死亡。此外，弱毒活疫苗的菌株遗传不够稳定，应用不当甚至会引起禽霍乱的爆发。
[0006] 而灭活疫苗存在保护率低和免疫期短的问题，较弱毒活疫苗更为严重。
[0007] 由于禽多杀性巴氏杆菌血清型众多，各血清型之间缺乏有效的交叉保护，因此给禽霍乱的免疫预防带来了一定的困难。
[0008] 自20世纪制备氯霉素乙酰转移酶、荧光(素)酶或β-半乳糖苷酶DNA疫苗以来，该类疫苗因具有制备方便、成本低廉、易保存、可诱导全面免疫应答等优点而广泛受到人们的关注，被誉为疫苗发展史上的第三次革命。
[0009] 截止目前，通过制备禽霍乱外膜蛋白H基因和禽霍乱外膜蛋白A基因来获得融合DNA疫苗的方法还未见相关报道。
发明内容
[0010] 为解决上述问题，本发明提供了一种制备禽霍乱外膜蛋白H和A基因及融合DNA疫苗的方法，该方法利用聚合酶链式反应法获得禽霍乱外膜蛋白H基因和禽霍乱外膜蛋白A基因，然后将制备的禽霍乱外膜蛋白H基因和禽霍乱外膜蛋白A基因与真核表达载体pcDNA3.1(+)制备出融合DNA疫苗，经动物实验验证表明本方法制备出的禽霍乱外膜蛋白H和A基因融合DNA疫苗可有效地为被免疫的鸡提供抵抗禽多杀性巴氏杆菌攻击的能力，保护率可达75%，能够有效预防禽多杀性巴氏杆菌引起的禽霍乱。
[0011] 本发明涉及到以下菌种和试剂：
[0012] 禽霍乱菌[或称禽多杀性巴氏杆菌（Avian Pasteurella muhocida CVCC474）]由中国兽医微生物菌种保藏管理中心提供，其中的“CVCC474”为保藏编号；
[0013] 大肠杆菌感受态JM83[Escherichia.coli JM83 1.1100]由河南科技大学实验中心提供，该菌种已经在美国罗歇分子生物学研究所和中国科学院微生物研究所注册保藏，其中的“1.1100”为保藏编号；
[0014] DNA凝胶回收试剂盒由[碧云天生物技术研究所（江苏省海门市解放东路602号）]提供，该试剂盒中自配有成品的溶液I、溶液II和溶液III。
[0015] 为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
[0016] 所述制备禽霍乱外膜蛋白H和A基因及融合DNA疫苗的方法，该方法中将：
[0017] 基因序列5’-CGGGATCCAaaaaaacagcaattgc-3’ 自定义为引物①；
[0018] 基因序列5’-TAATGGATCCGAAGTGTACGCGTAAAC-3’自定义为引物②；
[0019] 基因序列5’-TGAGGTACCATGAAAAAGACAATCGTAG-3’ 自定义为引物③；
[0020] 基因序列5’-CGCGCGAATTCTTATTTGTTACCTTTAACAGCG-3’ 自定义为引物④；
[0021] 本发明的方法包含如下内容：
[0022] Ⅰ、利用聚合酶链式反应法获得未经酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白H基因和禽霍乱外膜蛋白A基因
[0023] ⅰ)在聚合酶链式反应管a中同时加入引物①和引物②各1微升，再依次加入DNA聚合酶0.5微升、聚合酶缓冲液2.5微升、四种双脱氧核糖核苷酸混合物3微升、禽霍乱菌基因组模板1微升和水16微升，再将聚合酶链式反应管a放入聚合酶链式反应扩增仪中，设定反应温度94ºC时的预变性时间为5分钟，然后再将在94ºC时变性1分钟到降至55ºC时的复性1分钟以及再升温至72ºC的延伸2分钟称为一个循环，将所述一个循环重复30次，30次循环结束后在72ºC时再延伸10分钟制备出未经酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白H基因；
[0024] ⅱ)在聚合酶链式反应管b中同时加入引物③和引物④各1微升，其余过程同ⅰ)，在该过程中将所述一个循环中的“55ºC”变为“53ºC”，将“聚合酶链式反应管a”替换为“聚合酶链式反应管b”即可制备出未经酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白A基因；
[0025] Ⅱ、未经酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白H基因的酶切回收纯化过程
[0026] 该酶切回收纯化过程分为如下两步：
[0027] 第一步，取1.5毫升的离心管a，在离心管a中依次加入未经酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白H基因20微升、限制性内切酶KpnⅠ3微升、限制性内切酶BamHⅠ3微升、限制性内切酶缓冲液5微升和水19微升，将加入有上述H基因和试剂的离心管a充分混匀后放入37ºC的水浴中3小时得到混合物H；然后称取1.0克琼脂糖粉末加入到100毫升的电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充分溶解，将充分溶解的琼脂糖溶液倒入制胶板中，凝固后的固体称为凝胶a；将所述凝胶a放入电泳缓冲液中，将所述混合物H加入到所述凝胶a中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪得到凝胶b；
[0028] 第二步，取1.5毫升的离心管b并称其重量，然后在紫外灯下将凝胶b上的混合物H切下来，将切下来的混合物H放在已称重的1.5毫升的离心管b中，称取离心管b的总重并计算出切下来的混合物H的重量，然后将离心管b中切下来的混合物H捣碎，在离心管b中加入等体积的溶液I，颠倒离心管b混匀，将离心管b放置在50℃水浴中加热10分钟至混合物H完全融解，融解过程需颠倒离心管b数次以加速混合物H的融解，将融解后的混合物H倒入DNA纯化柱a上，该DNA纯化柱a已事先放置在收集管a中，在室温下将收集管a放置1分钟，然后将收集管a放在离心机中离心1分钟，设定离心机的转速为12000转/分钟，离心后倒掉收集管a内的液体，再向收集管a内的DNA纯化柱a上加入700微升的溶液II，在室温下将收集管a放置1分钟，再将收集管a在12000转/分钟的转速下离心1分钟，离心后倒掉收集管a内的液体，随后再向DNA纯化柱a上加入500微升的溶液II，将收集管a在12000转/分钟的转速下离心1分钟，再次倒掉收集管a内的液体并在13000转/分钟的转速下离心1分钟，取出4次离心后的DNA纯化柱a并放置于1.5毫升的离心管c中，在离心管c的DNA纯化柱a上加入30微升溶液III，将离心管c室温下放置1分钟，再将离心管c在13000转/分钟的转速下离心1分钟，取出DNA纯化柱a得到离心管c中的30微升液体，该液体就是酶切回收纯化后的禽霍乱外膜蛋白H基因；
[0029] Ⅲ、真核表达载体pcDNA3.1(+)的酶切回收纯化过程
[0030] 在1.5毫升的离心管d中依次加入真核表达载体pcDNA3.1(+) 10微升、限制性内切酶KpnⅠ3微升、限制性内切酶BamHⅠ3微升、限制性内切酶缓冲液5微升和水29微升，将加入有上述载体和试剂的离心管d充分混匀后放入37ºC的水浴中8小时得到混合物p；然后称取1.0克琼脂糖粉末加入到100毫升的电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充分溶解，将充分溶解的琼脂糖溶液倒入制胶板中，凝固后的固体称为凝胶c；将所述凝胶c放入电泳缓冲液中，将所述混合物p加入到所述凝胶c中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪得到凝胶d；然后重复上述Ⅱ中的第二步并将其中的：离心管b替换成离心管e、凝胶b替换成凝胶d、混合物H替换成混合物p、DNA纯化柱a替换成DNA纯化柱b、收集管a替换成收集管b、离心管c替换成离心管f即可得到离心管f中的30微升液体，该液体就是酶切回收纯化后的真核表达载体pcDNA3.1(+)；
[0031] Ⅳ、酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白H基因与酶切回收纯化的真核表达载体pcDNA3.1(+)的连接和转化
[0032] 连接：在1.5毫升的离心管g中加入酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白H基因10微升、酶切回收纯化的真核表达载体pcDNA3.1(+) 2微升、DNA连接酶1微升、DNA连接酶缓冲液2微升和水5微升，将加入有上述H基因、载体和试剂的离心管g放入16ºC水浴中12小时；
[0033] 转化：从16ºC水浴中取出离心管g并加入200微升的大肠杆菌感受态JM83，再将离心管g先放置在冰浴中30分钟，再在42ºC的水浴中放置90秒，最后在冰浴中放置3分钟，然后向离心管g中加入0.5毫升LB液体培养基，将离心管g放置在37ºC的摇床内以200转/分钟的速度振荡培养1.5小时，振荡培养结束后从离心管g中取出100微升的液体并涂布于含有浓度为50微克/毫升氨苄青霉素的LB培养平板上，将涂布后的LB培养平板放置在37ºC的培养箱内倒置培养16小时；
[0034] Ⅴ、pcM质粒溶液的提取
[0035] 取出培养16小时后的LB培养平板，挑取LB培养平板上生长的其中一个菌落，将该菌落放入含有浓度为50微克/毫升氨苄青霉素的5毫升LB液体培养基中，然后将所述的LB液体培养基放置在37ºC摇床内以200转/分钟的速度振荡培养16小时，振荡培养结束后从所述的LB液体培养基中取出1毫升的液体并加入到1.5毫升的离心管h中，再将离心管h在12000转/分钟的转速下离心5分钟，弃掉离心管h中的上清液，然后往离心管h中的沉淀物中加入100微升预先放置在4℃冰箱内冷却的溶液Ⅳ，将离心管h充分振荡混匀后加入200微升的溶液Ⅴ，反复颠倒离心管h数次，将离心管h放置于冰浴中3分钟，再向离心管h中加入150微升预先放置在4℃冰箱内冷却的溶液Ⅵ，然后将离心管h放在冰浴中5分钟，从冰浴中取出离心管h后在12000转/分钟的转速下和4℃的条件下离心10分钟，吸取离心后离心管h中的上清液，将所述上清液加入到1.5毫升的离心管i中，再向离心管i中加入等量的苯酚和氯仿的混合液，将离心管i振荡后在12000转/分钟的转速下和4℃的条件下离心10分钟，离心结束后将离心管i中的上层液体移入到1.5毫升的离心管j中，再向离心管j中加入上层液体2倍的无水乙醇，将离心管j放置于-20℃冰箱内冷藏20分钟，然后取出离心管j放在13000 转/分钟的转速下和4℃的条件下离心10分钟，将离心管j中的上清液弃掉，再向离心管j中的沉淀物中加入0.5毫升浓度为70％的乙醇，在12000 转/分钟的转速下和4℃的条件下对离心管j离心5分钟，倒掉离心管j中的上清液，离心管j中的沉淀物自定义为pcM质粒，待pcM质粒干燥后，向离心管j中加入30微升的水进行充分溶解得到自定义为pcM质粒溶液；
[0036] Ⅵ、pcM质粒溶液的酶切回收纯化过程
[0037] 在1.5毫升的离心管k中依次加入pcM质粒溶液10微升、限制性内切酶BamHⅠ3微升、限制性内切酶EcoRⅠ3微升、限制性内切酶缓冲液5微升和水29微升，将加入有上述pcM质粒和试剂的离心管k充分混匀后放入37ºC的水浴中8小时得到混合物M；然后称取1.0克琼脂糖粉末加入到100毫升的电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充分溶解，将充分溶解的琼脂糖溶液倒入制胶板中，凝固后的固体称为凝胶e；将所述凝胶e放入电泳缓冲液中，将所述混合物M加入到所述凝胶e中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪得到凝胶f；然后重复上述Ⅱ中的第二步并将其中的：离心管b替换成离心管m、凝胶b替换成凝胶f、混合物H替换成混合物M、DNA纯化柱a替换成DNA纯化柱c、收集管a替换成收集管c、离心管c替换成离心管n即可得到离心管n中的30微升液体，该液体就是酶切回收纯化后的pcM质粒溶液；
[0038] Ⅶ、未经酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白A基因的酶切回收纯化过程
[0039] 取1.5毫升的离心管o，在离心管o中依次加入未经酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白A基因20微升、限制性内切酶BamHⅠ3微升、限制性内切酶EcoRⅠ3微升、限制性内切酶缓冲液5微升和水19微升，将加入有上述A基因和试剂的离心管o充分混匀后放入37ºC的水浴中3小时得到混合物A；然后称取1.0克琼脂糖粉末加入到100毫升的电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充分溶解，将充分溶解的琼脂糖溶液倒入制胶板中，凝固后的固体称为凝胶g；将所述凝胶g放入电泳缓冲液中，将所述混合物A加入到所述凝胶g中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪得到凝胶h；然后重复上述Ⅱ中的第二步并将其中的：离心管b替换成离心管p、凝胶b替换成凝胶h、混合物H替换成混合物A、DNA纯化柱a替换成DNA纯化柱d、收集管a替换成收集管d、离心管c替换成离心管q即可得到离心管q中的30微升液体，该液体就是酶切回收纯化后的禽霍乱外膜蛋白A基因；
[0040] Ⅷ、酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白A基因与酶切回收纯化的pcM质粒溶液的连接和转化
[0041] 连接：在1.5毫升的离心管r中加入酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白A基因10微升、酶切回收纯化的pcM质粒溶液2微升、DNA连接酶1微升、DNA连接酶缓冲液2微升和水5微升，将加入有上述A基因、质粒和试剂的离心管r放入16ºC水浴中12小时完成连接；
[0042] 转化：重复上述Ⅳ并将离心管g替换成离心管r即完成酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白A基因与酶切回收纯化的pcM质粒溶液的转化；
[0043] Ⅸ、禽霍乱外膜蛋白H基因和禽霍乱外膜蛋白A基因制备融合DNA疫苗
[0044] ⅰ) 取出上述Ⅷ中经转化培养16小时的LB培养平板，重复上述Ⅴ的内容并将其中的：离心管h替换成离心管s、离心管i替换成离心管t、离心管j替换成离心管u，离心管u中的沉淀物自定义为pcDNA-MA质粒，待pcDNA-MA质粒干燥后，向离心管u中加入30微升的水进行充分溶解得到自定义为pcDNA-MA质粒溶液；
[0045] ⅱ)在1.5毫升的离心管v中依次加入pcDNA-MA质粒溶液2微升、限制性内切酶KpnⅠ1微升、限制性内切酶EcoRⅠ1微升、限制性内切酶缓冲液1微升和水5微升，将加入有上述pcDNA-MA质粒和试剂的离心管v充分混匀后放入37ºC的水浴中2小时得到混合物D；然后称取1.0克琼脂糖粉末加入到100毫升的电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充分溶解，将充分溶解的琼脂糖溶液倒入制胶板中，凝固后的固体称为凝胶i；将所述凝胶i放入电泳缓冲液中，将所述混合物D加入到所述凝胶i中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪得到含有混合物D的凝胶j；将所述凝胶j放在凝胶成像系统中进行检测，若检测出凝胶j含有大小为2082个碱基对的基因时，则证明该pcDNA-MA质粒是由禽霍乱外膜蛋白H基因和禽霍乱外膜蛋白A基因所制备出的融合DNA疫苗。
[0046] 所述制备禽霍乱外膜蛋白H和A基因及融合DNA疫苗的方法，LB液体培养基包含有1%的胰蛋白胨、0.5%的酵母提取物、1%的氯化钠和水。
[0047] 所述制备禽霍乱外膜蛋白H和A基因及融合DNA疫苗的方法，LB培养平板上包含有1%的胰蛋白胨、0.5%的酵母提取物、1%的氯化钠、1.5%的琼脂粉和水。
[0048] 所述制备禽霍乱外膜蛋白H和A基因及融合DNA疫苗的方法，溶液Ⅳ包含有50毫摩尔的葡萄糖、25毫摩尔的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、10毫摩尔的乙二胺四乙酸和水。
[0049] 所述制备禽霍乱外膜蛋白H和A基因及融合DNA疫苗的方法，溶液Ⅴ包含有10毫摩尔/升的氢氧化钠和10%的十二烷基磺酸钠。
[0050] 所述制备禽霍乱外膜蛋白H和A基因及融合DNA疫苗的方法，溶液Ⅵ包含有60%的5 摩尔/升的乙酸钾、11.5%的冰醋酸和水。
[0051] 由于采用如上所述的技术方案，本发明具有如下优越性：
[0052] 1、本发明所用的真核载体为pcDNA3.1(+)，该载体具有合适的多克隆位点，有高效能稳定和瞬时转染哺乳动物及人类细胞的能力，具有高效率巨细胞病毒（CMV）立即早期启动子和增强子、T7启动子、牛生长激素（BGH）多腺苷酸信号、猿猴空泡病毒40（SV40）早期启动子、猿猴空泡病毒40（SV40）复制起点和pUC载体复制起点，特别是具有在转染细胞中以载体附加体这一染色体外形式复制的能力，可以随宿主细胞的分裂传递给新生的子代细r胞，保证目的基因稳定表达，同时，该载体含有氨苄青霉素抗性基因（Amp），该基因中含有免疫增强CpG DNA序列，可增强疫苗的免疫效果。
[0053] 2、本发明将禽霍乱外膜蛋白H基因和禽霍乱外膜蛋白A基因融合在一起，放在同一个起始密码子之下，同一个开放阅读框（ORF）之中，所表达的蛋白为融合蛋白，所含抗原表位多于单基因DNA疫苗所含的抗原表位，而且在应用的时侯可以不必考虑抗原之间的配比问题。
具体实施方式
[0054] 为书写方便，将禽霍乱外膜蛋白H基因或称禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因，简称为omph基因。
[0055] 禽霍乱外膜蛋白A基因或称禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白A基因，简称为ompa基因。
[0056] 本发明所使用的基因序列5’-CGGGATCCAaaaaaacagcaattgc-3’ 即引物①，基因序列5’-TAATGGATCCGAAGTGTACGCGTAAAC-3’即引物②，基因序列5’-TGAGGTACCATGAAAAAGACAATCGTAG-3’ 即引物③，基因序列5’-CGCGCGAATTCTTATTTGTTACCTTTAACAGCG-3’ 即引物④由英俊生物技术公司（广州海珠区新港东路2429号）合成提供。
[0057] 本发明所使用的DNA聚合酶、聚合酶缓冲液、四种双脱氧核糖核苷酸混合物、限制性内切酶KpnⅠ、限制性内切酶BamHⅠ、限制性内切酶EcoRⅠ、限制性内切酶缓冲液、琼脂糖粉末、真核表达载体pcDNA3.1(+) 、DNA连接酶、DNA连接酶缓冲液、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、琼脂粉、氨苄青霉素、葡萄糖、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、乙二胺四乙酸、氢氧化钠、十二烷基磺酸钠、乙酸钾、冰醋酸、苯酚、氯仿、无水乙醇、异丙醇、氯化锂、溶菌酶、RNA酶A、聚乙二醇、氯化镁、十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和氯化钾均能在生物工程公司购买到。
[0058] 本发明制备omph基因和ompa基因及融合DNA疫苗的方法包含有利用聚合酶链式反应法获得未经酶切回收纯化的omph基因和ompa基因、未经酶切回收纯化的omph基因的酶切回收纯化过程、真核表达载体pcDNA3.1(+)的酶切回收纯化、酶切回收纯化的omph基因与酶切回收纯化的真核表达载体pcDNA3.1(+)的连接和转化、pcM质粒溶液的提取、pcM质粒溶液的酶切回收纯化过程、未经酶切回收纯化的ompa基因的酶切回收纯化过程、酶切回收纯化的ompa基因与酶切回收纯化的pcM质粒溶液的连接和转化以及omph基因和ompa基因制备融合DNA疫苗共九项内容，各内容分述如下：
[0059] Ⅰ、利用聚合酶链式反应法获得未经酶切回收纯化的omph基因和ompa基因[0060] ⅰ)在聚合酶链式反应管a中同时加入引物①和引物②各1微升，再依次加入DNA聚合酶0.5微升、聚合酶缓冲液2.5微升、四种双脱氧核糖核苷酸混合物3微升、禽霍乱菌基因组模板1微升和水16微升，再将聚合酶链式反应管a放入聚合酶链式反应扩增仪中，设定反应温度94ºC时的预变性时间为5分钟，然后再将在94ºC时变性1分钟到降至55ºC时的复性1分钟以及再升温至72ºC的延伸2分钟称为一个循环，将所述一个循环重复30次，30次循环结束后在72ºC时再延伸10分钟制备出未经酶切回收纯化的omph基因。
[0061] ⅱ)在聚合酶链式反应管b中同时加入引物③和引物④各1微升，再依次加入DNA聚合酶0.5微升、聚合酶缓冲液2.5微升、四种双脱氧核糖核苷酸混合物3微升、禽霍乱菌基因组模板1微升和水16微升，再将聚合酶链式反应管b放入聚合酶链式反应扩增仪中，设定反应温度94ºC时的预变性时间为5分钟，然后再将在94ºC时变性1分钟到降至53ºC时的复性1分钟以及再升温至72ºC的延伸2分钟称为一个循环，将所述一个循环重复30次，30次循环结束后在72ºC时再延伸10分钟制备出未经酶切回收纯化的ompa基因。
[0062] Ⅱ、未经酶切回收纯化的omph基因的酶切回收纯化过程
[0063] 该酶切回收纯化过程分为如下两步：
[0064] 第一步，取1.5毫升的离心管a，在离心管a中依次加入未经酶切回收纯化的omph基因20微升、限制性内切酶KpnⅠ3微升、限制性内切酶BamHⅠ3微升、限制性内切酶缓冲液5微升和水19微升，将加入上述omph基因和试剂的离心管a充分混匀后放入37ºC的水浴中3小时得到混合物H；然后称取1.0克琼脂糖粉末加入到100毫升的电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖溶解，将溶解后的琼脂糖溶液倒入制胶板中，凝固后的固体称为凝胶a；将所述凝胶a放入电泳缓冲液中，将所述混合物H加入所述凝胶a中，打开电泳仪开关，设定电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪得到含有混合物H的凝胶b。
[0065] 第二步用碧云天生物技术研究所提供的DNA凝胶回收试剂盒进行如下操作：
[0066] 取1.5毫升的离心管b并称其重量，然后在紫外灯下将凝胶b上含有的混合物H切下来（只有在紫外灯下才能看到凝胶b上含有的混合物H并便于切割），将切下来的混合物H放在已称重的1.5毫升的离心管b中，称取离心管b的总重并计算出从凝胶b上切下来的混合物H的重量（因为混合物H含有传染性剧毒），然后将离心管b中的混合物H捣碎，加入等体积的溶液I（该溶液I由碧云天生物技术研究所提供，等体积的含义是指：若离心管b中的混合物H为100毫克，则加入100微升的溶液I），颠倒离心管b混匀，将离心管b放置在50℃水浴中加热10分钟至混合物H完全融解，融解过程中颠倒离心管b 3次以加速混合物H的融解，将融解后的混合物H加入到DNA纯化柱a上，该DNA纯化柱a已事先放置在收集管a中，在室温下将收集管a放置1分钟，然后将收集管a放在离心机中离心1分钟，离心机的转速设定为12000转/分钟，离心后倒掉收集管a内的液体，再向收集管a内的DNA纯化柱a上加入700微升的溶液II（该溶液II由碧云天生物技术研究所提供），在室温下将收集管a放置1分钟，再将收集管a在12000转/分钟下离心1分钟，离心后倒掉收集管a内的液体，随后再向DNA纯化柱a上加入500微升的溶液II，将收集管a在12000转/分钟下离心1分钟，离心后倒掉收集管a内的液体，将倒掉液体后的收集管a在13000转/分钟下离心1分钟，取出4次离心后的DNA纯化柱a并放置于1.5毫升的离心管c中，在4次离心后的DNA纯化柱a上加入30微升溶液III（该溶液II由碧云天生物技术研究所提供），将离心管c室温下放置1分钟，再将离心管c在13000转/分钟下离心1分钟，取出DNA纯化柱a得到离心管c中的30微升液体，该液体就是酶切回收纯化后的omph基因，该步骤是为了制备出酶切回收纯化后的omph基因；
[0067] Ⅲ、真核表达载体pcDNA3.1(+)的酶切回收纯化
[0068] 在1.5毫升的离心管d中依次加入真核表达载体pcDNA3.1(+) 10微升、限制性内切酶KpnⅠ3微升、限制性内切酶BamHⅠ3微升、限制性内切酶缓冲液5微升和水29微升，将加入上述载体和试剂的离心管d充分混匀后放入37ºC的水浴中8小时得到混合物p，然后称取1.0克琼脂糖粉末加入到100毫升的电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充分溶解，将充分溶解后的琼脂糖溶液倒入制胶板中，凝固后的固体称为凝胶c，将所述凝胶c放入电泳缓冲液中，将所述混合物p加入所述凝胶c中，打开电泳仪开关，设定电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪得到含有混合物p的凝胶d。
[0069] 用碧云天生物技术研究所提供的DNA凝胶回收试剂盒进行如下操作：
[0070] 取1.5毫升的离心管e并称其重量，在紫外灯下将凝胶d上的混合物p切下来（只有在紫外灯下才能看到凝胶d上含有的混合物p并便于切割），将切下来的混合物p放在已称重的1.5毫升的离心管e中，称取离心管e的总重并计算出从凝胶d上切下来的混合物p的重量（因为混合物p含有传染性剧毒），然后将离心管e中的混合物p捣碎，加入等体积的溶液I（该溶液I由碧云天生物技术研究所提供，等体积的含义是指：若离心管e中的混合物p为100毫克，则加入100微升的溶液I），颠倒离心管e混匀，将离心管e放置在50℃水浴中加热10分钟至混合物p完全融解，融解过程中颠倒离心管e 3次以加速混合物p的融解，将融解后的混合物p加入到DNA纯化柱b上，该DNA纯化柱b已事先放置在收集管b中，在室温下将收集管b放置1分钟，然后将收集管b放在离心机中离心1分钟，离心机的转速设定为12000转/分钟，离心后倒掉收集管b内的液体，再向收集管b内的DNA纯化柱b上加入700微升的溶液II（该溶液II由碧云天生物技术研究所提供），在室温下将收集管b放置1分钟，再将收集管b在12000转/分钟下离心1分钟，离心后倒掉收集管b内的液体，随后再向DNA纯化柱b上加入500微升的溶液II，将收集管b在12000转/分钟下离心1分钟，离心后倒掉收集管b内的液体，将倒掉液体后的收集管b在13000转/分钟下离心
1分钟，取出4次离心后的DNA纯化柱b并放置于1.5毫升的离心管f中，在4次离心后的DNA纯化柱b上加入30微升溶液III（该溶液III由碧云天生物技术研究所提供），将离心管f室温下放置1分钟，再将离心管f在13000转/分钟下离心1分钟，取出DNA纯化柱b得到离心管中f的30微升液体，该液体就是酶切回收纯化后的真核表达载体pcDNA3.1(+)，该步骤是为了制备出经过酶切并纯化后的真核表达载体pcDNA3.1(+)。
[0071] Ⅳ、酶切回收纯化的omph基因与酶切回收纯化的真核表达载体pcDNA3.1(+)的连接和转化
[0072] 在1.5毫升的离心管g中加入酶切回收纯化的omph基因10微升、酶切回收纯化的真核表达载体pcDNA3.1(+) 2微升、DNA连接酶1微升、DNA连接酶缓冲液2微升和水5微升，将加入上述omph基因、载体和试剂的离心管g放入16ºC水浴中12小时，然后从16ºC水浴中取出离心管g并加入200微升的大肠杆菌感受态JM83，再将离心管g先放置在冰浴中30分钟，再在42ºC的水浴中放置90秒，最后在冰浴中放置3分钟，然后向离心管g中加入0.5毫升LB液体培养基，该LB液体培养基包含有1%的胰蛋白胨、0.5%的酵母提取物、1%的氯化钠和水。将离心管g放置在37ºC的摇床内以200转/分钟的速度振荡培养1.5小时，振荡培养结束后从离心管g中取出100微升液体涂布于含有浓度为50微克/毫升氨苄青霉素的LB培养平板上，该LB培养平板上包含有1%的胰蛋白胨、0.5%的酵母提取物、
1%的氯化钠、1.5%的琼脂粉和水。将涂布后的LB培养平板放置在37ºC的培养箱内倒置培养16小时，本步骤是为了将酶切回收纯化的omph基因与酶切回收纯化的真核表达载体pcDNA3.1(+)连接后导入到大肠杆菌感受态JM83中，并通过培养让其大量生长繁殖。
[0073] Ⅴ、pcM质粒溶液的提取
[0074] 取出培养16小时后的LB培养平板，挑取LB培养平板上生长的一个菌落，将菌落放入含有浓度为50微克/毫升氨苄青霉素的5毫升LB液体培养基中，该LB液体培养基包含有1%的胰蛋白胨、0.5%的酵母提取物、1%的氯化钠和水。然后将所述的LB液体培养基放置在37ºC摇床内以200转/分钟的速度振荡培养16小时，振荡培养结束后从所述的LB液体培养基中取出1毫升的液体并加入到1.5毫升的离心管h中，再将离心管h在12000转/分钟下离心5分钟，弃掉离心管h中的上清液，然后往离心管h中的沉淀物中加入100微升预先放置在4℃冰箱内冷却的溶液Ⅳ，该溶液Ⅳ包含有50毫摩尔的葡萄糖、25毫摩尔的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、10毫摩尔的乙二胺四乙酸和水。将离心管h充分振荡混匀后加入200微升的溶液Ⅴ，该溶液Ⅴ包含有10毫摩尔/升的氢氧化钠和10%的十二烷基磺酸钠；反复颠倒离心管h 5次，将离心管h放置于冰浴中3分钟，再向离心管h中加入150微升预先放置在4℃冰箱内冷却的溶液Ⅵ，该溶液Ⅵ包含有60%的5 摩尔/升的乙酸钾、11.5%的冰醋酸和水。然后将离心管h放在冰浴中5分钟，从冰浴中取出离心管h后在12000转/分钟和4℃的条件下离心10分钟，吸取离心后离心管h中的上清液，将所述上清液加入到1.5毫升的离心管i中，再向离心管i中加入与等量的苯酚和氯仿的混合液（该混合液中的苯酚和氯仿也是等量的），将离心管i振荡后在12000转/分钟和4℃的条件下离心10分钟，离心结束后将离心管i中的上层液体移入到1.5毫升的离心管j中，再向离心管j中加入上层液体2倍的无水乙醇，将离心管j放置于-20℃冰箱内冷藏20分钟，然后取出离心管j放在13000 转/分钟和4℃的条件下离心10分钟，将离心管j中的上清液弃掉，再向离心管j中的沉淀物中加入0.5毫升浓度为70％的乙醇，在12000 转/分钟和4℃的条件下对离心管j离心5分钟，倒掉离心管j中的上清液，离心管j中的沉淀物自定义为pcM质粒，等pcM质粒干燥后，向离心管j中加入30微升水进行溶解得到自定义为pcM质粒溶液，本步骤是将pcM质粒从大肠杆菌感受态JM83中提取出来并溶解，为下一步实验做准备。
[0075] Ⅵ、pcM质粒溶液的酶切回收纯化过程
[0076] 在1.5毫升的离心管k中依次加入pcM质粒溶液10微升、限制性内切酶BamHⅠ3微升、限制性内切酶EcoRⅠ3微升、限制性内切酶缓冲液5微升和水29微升，将加入上述物质的离心管k充分混匀后放入37ºC的水浴中8小时得到混合物M；然后称取1.0克琼脂糖粉末加入到100毫升的电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖溶解，将溶解后的琼脂糖溶液倒入制胶板中，凝固后的固体称为凝胶e，将所述凝胶e放入电泳缓冲液中，将所述混合物M加入所述凝胶e中，打开电泳仪开关，设定电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪得到含有混合物M的凝胶f。
[0077] 用碧云天生物技术研究所提供的DNA凝胶回收试剂盒进行如下操作：
[0078] 取1.5毫升的离心管m并称其重量，在紫外灯下将凝胶f上的混合物M切下来，将切下来的混合物M放在已称重的1.5毫升的离心管m中，称取离心管m的总重并计算出从凝胶f上切下来的混合物M的重量，然后将离心管m中的混合物M捣碎，加入等体积的溶液I，颠倒离心管m混匀，将离心管m放置在50℃水浴中加热10分钟至混合物M完全融解，融解过程中颠倒离心管m 3次以加速混合物M的融解，将融解后的混合物M加入到DNA纯化柱c上，该DNA纯化柱c已事先放置在收集管c中，在室温下将收集管c放置1分钟，然后将收集管c放在离心机中离心1分钟，离心机的转速设定为12000转/分钟，离心后倒掉收集管c内的液体，再向收集管c内的DNA纯化柱c上加入700微升的溶液II，在室温下将收集管c放置1分钟，再将收集管c在12000转/分钟下离心1分钟，离心后倒掉收集管c内的液体，随后再向DNA纯化柱c上加入500微升的溶液II，将收集管c在12000转/分钟下离心1分钟，离心后倒掉收集管c内的液体，将倒掉液体后的收集管c在13000转/分钟下离心1分钟，取出4次离心后的DNA纯化柱c并放置于1.5毫升的离心管n中，在4次离心后的DNA纯化柱c上加入30微升溶液III，将离心管n室温下放置1分钟，再将离心管n在13000转/分钟下离心1分钟，取出DNA纯化柱c得到离心管中n的30微升液体，该液体就是酶切回收纯化的pcM质粒溶液，本步骤是为了获得经过酶切后的纯化的pcM质粒溶液，为后续的连接实验做准备。
[0079] Ⅶ、未经酶切回收纯化的ompa基因的酶切回收纯化过程
[0080] 取1.5毫升的离心管o，在离心管o中依次加Ⅰ中的ⅱ)制备出的未经酶切回收纯化的ompa基因20微升、限制性内切酶BamHⅠ3微升、限制性内切酶EcoRⅠ3微升、限制性内切酶缓冲液5微升和水19微升，将加入有ompa基因和试剂的离心管o充分混匀后放入37ºC的水浴中3小时得到混合物A；然后称取1.0克琼脂糖粉末加入到100毫升的电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充分溶解，将充分溶解后的琼脂糖溶液倒入制胶板中，凝固后的固体称为凝胶g，将所述凝胶g放入电泳缓冲液中，取离心管o中的混合物A加入所述凝胶g中，打开电泳仪开关，设定电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪得到含有混合物A的凝胶h。
[0081] 用碧云天生物技术研究所提供的DNA凝胶回收试剂盒进行如下操作：
[0082] 取1.5毫升的离心管p并称其重量，在紫外灯下将凝胶h上的混合物A切下来，将切下来的物质放在已称重的1.5毫升的离心管p中，称取离心管p的总重并计算出从凝胶h上切下来的混合物A的重量，然后将离心管p中的混合物A捣碎，加入等体积的溶液I，颠倒离心管p混匀，将离心管p放置在50℃水浴中加热10分钟至混合物A完全融解，融解过程需颠倒离心管p 3次以加速混合物A的融解，将融解后混合物A加入到DNA纯化柱d上，该DNA纯化柱d已事先放置在收集管d中，在室温下将收集管d放置1分钟，然后将收集管d放在离心机中离心1分钟，离心机的转速设定为12000转/分钟，离心后倒掉收集管d内的液体，再向收集管d内的DNA纯化柱d上加入700微升的溶液II，在室温下将收集管d放置1分钟，再将收集管d在12000转/分钟下离心1分钟，离心后倒掉收集管d内的液体，随后再向DNA纯化柱d上加入500微升的溶液II，将收集管d在12000转/分钟下离心1分钟，离心后倒掉收集管d内的液体，将倒掉液体后的收集管d在13000转/分钟下离心1分钟，取出4次离心后的DNA纯化柱d并放置于1.5毫升的离心管q中，在4次离心后的DNA纯化柱d上加入30微升溶液III，将离心管q室温下放置1分钟，再将离心管q在13000转/分钟下离心1分钟，取出DNA纯化柱d得到离心管中q的30微升液体，该液体就是酶切回收纯化的ompa基因，本步骤是为了获得经过酶切后的纯化的ompa基因，为后续的连接实验做准备。
[0083] Ⅷ、酶切回收纯化的ompa基因与酶切回收纯化的pcM质粒溶液的连接和转化[0084] 在1.5毫升的离心管r中加入酶切回收纯化的ompa基因10微升、酶切回收纯化的pcM质粒溶液2微升、DNA连接酶1微升、DNA连接酶缓冲液2微升和水5微升，将加入有上述ompa基因、质粒和试剂的离心管r放入16ºC水浴中12小时，然后从16ºC水浴中取出离心管r并加入200微升的大肠杆菌感受态JM83，再将离心管r先放置在冰水混合液中30分钟，再在42ºC的水浴中放置90秒，最后在冰水混合液中放置3分钟，然后向离心管r中加入0.5毫升LB液体培养基，将离心管r放置在37ºC的摇床内以200转/分钟的速度振荡培养1.5小时，振荡培养结束后从离心管r中取出100微升液体涂布于含有浓度为50微克/毫升氨苄青霉素的LB培养平板上，将涂布后的LB培养平板放置在37ºC的培养箱内倒置培养16小时，本步骤是为了将酶切回收纯化的ompa基因与酶切回收纯化的pcM质粒溶液连接后导入到大肠杆菌感受态JM83中并通过培养让其大量生长繁殖。
[0085] Ⅸ、omph基因和ompa基因制备融合DNA疫苗
[0086] ⅰ) 从Ⅷ中培养16小时后的LB培养平板上挑取一个菌落，将菌落放入含有浓度为50微克/毫升氨苄青霉素的5毫升LB液体培养基中，然后将所述的LB液体培养基放置在37ºC摇床内以200转/分钟的速度振荡培养16小时，振荡培养结束后从所述的LB液体培养基中取出1毫升的液体并加入到1.5毫升的离心管s中，再将离心管s在12000转/分钟下离心5分钟，弃掉离心管s中的上清液，然后往离心管s中的沉淀物中加入100微升预先放置在4℃冰箱内冷却的溶液Ⅳ，将离心管s充分振荡混匀后加入200微升的溶液Ⅴ（溶液Ⅴ包含10毫摩尔/升的氢氧化钠和10%的十二烷基磺酸钠），反复颠倒离心管s 5次，将离心管s放置于冰浴中3分钟，再向离心管s中加入150微升预先放置在4℃冰箱内冷却的溶液Ⅵ，然后将离心管s放在冰浴中5分钟，从冰浴中取出离心管s后在12000转/分钟和4℃的条件下离心10分钟，吸取离心后离心管s中的上清液，将所述上清液加入到1.5毫升的离心管t中，再向离心管t中加入与等量的苯酚和氯仿的混合液（该混合液中的苯酚和氯仿也是等量的），将离心管t振荡后在12000转/分钟和4℃的条件下离心10分钟，离心结束后将离心管t中的上层液体移入到1.5毫升的离心管u中，再向离心管u中加入上层液体2倍的无水乙醇，将离心管u放置于-20℃冰箱内冷藏20分钟，然后取出离心管u放在
13000 转/分钟和4℃的条件下离心10分钟，将离心管u中的上清液弃掉，再向离心管u中的沉淀物中加入0.5毫升浓度为70％的乙醇，在12000 转/分钟和4℃的条件下对离心管u离心5分钟，倒掉离心管u中的上清液，离心管u中的沉淀物自定义为pcDNA-MA质粒，等pcDNA-MA质粒干燥后，向离心管u中加入30微升水进行溶解得到自定义为pcDNA-MA质粒溶液，本步骤是将pcDNA-MA质粒从大肠杆菌感受态JM83中提取出来并溶解，为下一步实验做准备。
[0087] ⅱ)在1.5毫升的离心管v中依次加入pcDNA-MA质粒溶液2微升、限制性内切酶KpnⅠ1微升、限制性内切酶EcoRⅠ1微升、限制性内切酶缓冲液1微升和水5微升，将加入有上述pcDNA-MA质粒和试剂的离心管v充分混匀后放入37ºC的水浴中2小时得到混合物D；然后称取1.0克琼脂糖粉末加入到100毫升的电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充分溶解，将充分溶解后的琼脂糖溶液倒入制胶板中，凝固后的固体称为凝胶i，将所述凝胶i放入电泳缓冲液中，取离心管v中的混合物D加入所述凝胶i中，打开电泳仪开关，设定电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪，将电泳后得到的含有混合物D的凝胶j放置在凝胶成像系统中进行检测，若在含有混合物D的凝胶j中检测出大小为2082个碱基对的基因，则证明该pcDNA-MA质粒是omph基因和ompa基因制备出的融合DNA疫苗。
[0088] 有关omph基因和ompa基因制备出的融合DNA疫苗的免疫预防效果或检测等内容参见如下：
[0089] 含有2082个碱基对基因的pcDNA-MA质粒或称omph基因和ompa基因制备出的融合DNA疫苗可简称为pOMPHA。
[0090] 关于pOMPHA的大量制备问题：
[0091] 本内容所挑取的菌落为上述Ⅸ中ⅱ)获得的含有pOMPHA的大肠杆菌感受态JM83。
[0092] 挑取菌落接种于25毫升含有浓度为50微克/毫升氨苄青霉素的LB液体培养基中，然后将所述的LB液体培养基放置在37℃的摇床中以200转/分钟的速度振荡培养至液体在600纳米处的吸光度（OD600值）为0.6时，将所述的LB液体培养基中的液体全部倒入500毫升含有浓度为50微克/毫升氨苄青霉素的新鲜的LB液体培养基中后放置于37℃的摇床中以300转/分钟的速度振荡培养15小时，振荡培养结束后将培养所得的液体倒入1000毫升的离心管中，再将该1000毫升的离心管在6000转/分钟和4℃的条件下离心15分钟，弃掉1000毫升的离心管中的上清液，向1000毫升的离心管中的沉淀物中加入18毫升的溶液Ⅳ将沉淀物悬浮起来，然后再向1000毫升的离心管中加入2毫升浓度为10毫克/毫升的溶菌酶混匀后再加入40毫升的溶液Ⅴ，反复颠倒1000毫升的离心管5次，将
1000毫升的离心管室温下放置5分钟，随后再向其中加入20毫升冰预冷的溶液Ⅵ，轻轻振荡所述1000毫升的离心管后放置在冰浴中10分钟，从冰浴中取出1000毫升的离心管后在
12000转/分钟和4℃的条件下离心20分钟，离心结束后将1000毫升的离心管中的上清液移入到一个200毫升的离心管中，再向所述的200毫升的离心管中加入体积为所述上清液
0.6倍的异丙醇，混匀后将200毫升的离心管在室温下放置10分钟，然后对200毫升的离心管在12000转/分钟的条件下离心20分钟，弃掉上清液后再向200毫升的离心管中加入
50毫升浓度为70％的乙醇，再将200毫升的离心管在12000转/分钟和4℃的条件下离心
5分钟，倒掉200毫升的离心管中的液体，等200毫升的离心管中的沉淀物干燥后向200毫升的离心管中加入3毫升pH值为8.0的三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（TE）溶液溶解沉淀物，沉淀物溶解后将溶液移至一个15毫升的离心管中，将15毫升的离心管放置在冰浴中静置10分钟，随后向15毫升的离心管中加入3毫升的浓度为5摩尔/升的氯化锂溶液，将15毫升的离心管混匀后在10000转/分钟和4℃的条件下离心10分钟，吸取15毫升的离心管中的上清液并加入到10毫升的离心管中，向10毫升的离心管中加入等量的异丙醇，将10毫升的离心管室温放置10分钟后在12000转/分钟的条件下离心10分钟，把10毫升的离心管中的上清液倒掉，再向10毫升的离心管中加入5毫升浓度为70％的乙醇，将10毫升的离心管在12000 转/分钟和4℃的条件下离心5分钟，倒掉10毫升的离心管中的上清液，等10毫升的离心管中的沉淀物干燥后，向10毫升的离心管中加入0.5毫升含有浓度为100微克/毫升的RNA酶A的三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（TE）溶液溶解沉淀物，等10毫升的离心管中的沉淀物溶解后向其中加入等量的苯酚和氯仿混合液，将10毫升的离心管振荡后在12000转/分钟和4℃的条件下离心10分钟，离心结束后将10毫升的离心管中的上层溶液移入到5毫升的离心管中，然后向5毫升的离心管中加入所述上层液体
2倍的无水乙醇，将5毫升的离心管放置于-20℃冰箱内20分钟，然后取出5毫升的离心管放在13000 转/分钟和4℃的条件下离心10分钟，将5毫升的离心管中的上清液弃掉，等5毫升的离心管中的沉淀物干燥后向5毫升的离心管中加入1毫升水进行溶解，然后向溶解后的溶液中加入0.5ml聚乙二醇-氯化镁（PEG-MgCl2）溶液，将5毫升的离心管室温放置30
