本发明涉及一种奶及奶制品中β-内酰胺酶的快速检测方法，基本原理是β-内酰胺酶能够分解青霉素，生成的产物青霉噻唑酸与淀粉竞争游离碘，破坏碘与淀粉形成的复合物，使溶液由蓝色变为无色。向经过处理的奶及奶制品中加入青霉素和碘-淀粉显色剂后，与空白进行对照，根据溶液颜色的变化对β-内酰胺酶进行定性、半定量分析。本发明从青霉素的浓度、缓冲液的pH值、显色剂的浓度和比例、实际样品净化条件、反应温度和离心条件等方面着手，建立起一套全新的检测奶及奶制品中β-内酰胺酶的方法。该方法的定性及半定量的最低检出限为1.5U/mL。将该技术进行推广，研发成检测试剂盒，可以实现实时、在线的检测，从而带来很好的社会和经济效益。
1.一种奶及奶制品中的β-内酰胺酶的检测方法，包括步骤如下：(1)样品前处理
向待测奶制品中加入磷酸盐缓冲溶液及氨苄青霉素溶液，混合均匀后置于恒温箱中，加入醋酸盐缓冲溶液，振荡，取上清液，离心，除蛋白、脂肪后备用；
(2)碘-淀粉显色剂制备：将浓度为0.1mol/L的碘标准溶液稀释30倍后与1％的淀粉溶液以1∶2的比例混合制成显色剂；
向步骤1所得溶液中加入显色剂，记录显色剂的褪色时间，同时用水做空白，与空白进行对比，若在空白之前褪色，说明样品中含有β-内酰胺酶，从而实现定性和半定量分析。
2.如权利要求1所述的一种奶及奶制品中的β-内酰胺酶的检测方法，其特征在于步骤(1)样品前处理之前需要配制下列溶液：a.磷酸盐缓冲溶液：取1.36g KH2PO4和1.74gK2HPO4，分别溶于1000mL蒸馏水中，二者按比例混合，配制成pH 6～8的缓冲溶液；
b.氨苄青霉素溶液：称取氨苄青霉素25mg，加水溶解至25mg/mL；
c.醋酸盐缓冲溶液：取11.4mLHAc和16.4gNaAc，分别溶于1000mL水中，二者按比例混合，配制成pH 4.5～5.5的缓冲溶液；
d.1％淀粉溶液：称取1g可溶性淀粉，用少许水调成糊状，缓缓倾入100mL沸水中，随加随搅拌，煮沸，放冷备用；
e.0.1mol/L碘标准溶液：称取6.5g碘及17.5g碘化钾，溶于50mL水中，稀释至500mL，混匀；保存于棕色具塞瓶中。
3.如权利要求1所述的一种奶及奶制品中的β-内酰胺酶的检测方法，其特征在于步骤(1)中恒温箱的温度为37℃-40℃，恒温时间为30分钟。
4.如权利要求1所述的一种奶及奶制品中的β-内酰胺酶的检测方法，其特征在于步骤(1)中加入磷酸盐缓冲溶液的pH值为6～8，体积为样品体积的1～2倍。
5.如权利要求1所述的一种奶及奶制品中的β-内酰胺酶的检测方法，其特征在于步骤(1)中加入稳定性好的氨苄青霉素溶液，其体积为样品体积的1/16～1/32。
6.如权利要求1所述的一种奶及奶制品中的β-内酰胺酶的检测方法，其特征在于步骤(1)中加入醋酸盐缓冲溶液的pH值为4.5～5.5，体积为样品体积的1～2倍。
7.如权利要求1所述的一种奶及奶制品中的β-内酰胺酶的检测方法，其特征在于步骤(2)中将碘的标准液稀释30倍。
碘量法检测奶及奶制品中的β-内酰胺酶
技术领域
[0001] 本发明属于快速检测技术领域，具体是用化学方法即碘量法检测奶及奶制品中添加的β-内酰胺酶。
背景技术
[0002] 随着国家对食品安全问题的关注和部分乳制品企业2010年无抗奶目标的提出，抗生素残留问题成为影响乳制品安全的重要因素之一。目前，青霉素作为β-内酰胺类药物是治疗牛乳腺炎的首选药物，是牛奶中最常见的残留抗生素。由于国内多数乳品企业对抗生素残留超标的牛乳采取降价收购的原则，出于经济利益的驱动，一些不法奶站为了谋求自己的经济利益，人为的使用一些生物制剂去降解牛乳中残留的抗生素，生产人造“无抗奶”。2005年至今，已有数家公司公开宣称出售分解牛乳中残留抗生素的解抗剂。经过前期的调研工作，初步判断市售解抗剂的主要成分是β-内酰胺酶，它是由革兰氏阳性细菌产生和分泌的，可选择性分解牛奶中残留的β-内酰胺类抗生素。β-内酰胺酶为我国不允许使用的非法添加剂，该酶的使用掩盖了牛奶中实际含有的抗生素。其风险也是存在的：第一，β-内酰胺酶的安全性以及是否可以在食品中添加尚未有定论；第二，在分解β-内酰胺药物后，可能引进其他有害物质；第三，这种做法纵容了奶牛饲养过程中抗生素的滥用。
[0003] 当前，牛奶中β-内酰胺酶的检测技术有杯碟法、碘量法、酸度法、高效液相色谱法及酶联免疫法等，但都存在缺陷，特异性和重复性差，背景干扰大，操作步骤复杂，不适合大批量样品的快速筛选。因此迄今为止，国家还没有出台针对这种人造“无抗奶”的相应检测方法、检测标准，从而无法从源头上监测、把控原奶质量。
发明内容
[0004] 本发明提供了一种简单、快速的化学方法检测鲜奶及奶制品中的β-内酰胺酶。该方法的定性及半定量的最低检出限为1.5U/mL，将该技术进行推广，研发成检测试剂盒，可以实现实时、在线的检测，从而带来很好的社会和经济效益。
[0005] 本发明做了如下方面的工作，即根据经典碘量法的原理，同时考虑到鲜奶及奶制品中的复杂基质(如蛋白、游离氨基酸、糖、碳水化合物、细菌等)干扰，经过反复尝试，从青霉素的浓度、缓冲液的pH值、显色剂的浓度和比例、实际样品净化条件、反应温度和离心条件等几个方面着手，改进和优化了前人检测β-内酰胺酶的标准碘量法，建立起一套全新的检测β-内酰胺酶的技术方案，并验证了该方案的可行性。
[0006] 本发明一种奶及奶制品中的β-内酰胺酶的检测方法，包括步骤如下：
[0007] (1)样品前处理
[0008] 向待测奶制品中加入磷酸盐缓冲溶液及青霉素溶液，混合均匀后置于恒温箱中，加入醋酸盐缓冲溶液，振荡，取上清液，离心，除蛋白、脂肪后备用；
[0009] (2)碘-淀粉显色剂制备：将浓度为0.1mol/L的碘标准溶液稀释30倍后与1％的淀粉溶液以1∶2的比例混合制成显色剂；
[0010] (3)显色反应
[0011] 向步骤(1)所得溶液中加入显色剂，记录显色剂的褪色时间，同时用水做空白，与空白进行对比，若在空白之前褪色，说明样品中含有β-内酰胺酶，从而实现定性和半定量分析。
[0012] 上述步骤(1)样品前处理之前需要配制下列溶液：
[0013] a.磷酸盐缓冲溶液：取1.36g KH2PO4和1.74g K2HPO4，分别溶于1000mL蒸馏水中，二者按比例混合，配制成pH 6～8的缓冲溶液；
[0014] b.青霉素溶液：称取氨苄青霉素25mg，加水溶解至25mg/mL；
[0015] c.醋酸盐缓冲溶液：取11.4mLHAc和16.4g NaAc，分别溶于1000mL水中，二者按比例混合，配制成pH 4.5～5.5的缓冲溶液；
[0016] d.1％淀粉溶液：称取1g可溶性淀粉，用少许水调成糊状，缓缓倾入100mL沸水中，随加随搅拌，煮沸，放冷备用；
[0017] e.0.1mol/L碘标准溶液：称取6.5g碘及17.5g碘化钾，溶于50mL水中，稀释至500mL，混匀；保存于棕色具塞瓶中。
[0018] 上述步骤(1)中恒温箱的温度为37℃-40℃，恒温时间为30分钟；加入磷酸盐缓冲溶液的目的是延长反应时间，使不同浓度β-内酰胺酶的褪色时间拉开梯度，加入磷酸盐缓冲溶液的pH值为6～8，体积为样品体积的1～2倍；采用的青霉素溶液为稳定性较好的氨苄青霉素溶液，其体积为样品体积的1/16～1/32；加入适量醋酸盐缓冲溶液的目的是使牛奶中的大量酪蛋白质沉淀，以减小对空白试验的影响，加入醋酸盐缓冲溶液的pH值为4.5～5.5，体积为样品体积的1～2倍。
[0019] 上述步骤(2)中将碘的标准液稀释30倍，既能保证空白不褪色，又能让不同浓度之间褪色时间的梯度更加明显。
[0020] 附图简要说明
[0021] 图1.本发明的检测原理示意图
[0022] 图2.鲜奶中加入不同浓度的β-内酰胺酶后，显色剂的颜色变化示意图(从左到右β-内酰胺酶的浓度分别为：50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0IU/mL)[0023] 图3.显色剂褪色时间与β-内酰胺酶浓度的关系
具体实施方式
[0024] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。
[0025] 配制所需溶液：
[0026] a.pH 6.2磷酸盐缓冲溶液：取1.36g KH2PO4和1.74g K2HPO4，分别溶于1000mL蒸馏水中，二者分别取8mL和2mL后混合。
[0027] b.青霉素溶液：称取氨苄青霉素25mg，加蒸馏水溶解至25mg/mL。
[0028] c.pH 4.7醋酸盐缓冲溶液：取11.4mL HAc和16.4g NaAc，分别溶于1000mL水中，二者分别取6.3mL和3.7mL后混合。
[0029] d.碘-淀粉显色剂：将1克淀粉溶解于100毫升蒸馏水中制成浓度为1％的淀粉溶液；称取6.5g碘及17.5g碘化钾，溶于50mL水中，稀释至500mL，混匀，制成浓度为0.1mol/L的碘标准溶液，稀释30倍后与淀粉溶液以1∶2的比例混合，制成显色剂。
[0030] 样品检测：
[0031] a.取待测鲜奶800μL于4mL试管中；
[0032] b.加入pH 6.2磷酸盐缓冲液1000μL；
[0033] c.加入25mg/mL的青霉素溶液50μL，振荡；
[0034] d.将试管置于37℃恒温箱中30min后取出；
[0035] e.加入pH 4.7的醋酸盐缓冲液800μL，振荡，取上清液倒入2mL离心管；
[0036] f.将离心管置于5000rpm离心机中5min后取出；
[0037] g.取离心管中的上层清液200μL，加入碘与淀粉组成的显色剂50μL，一起加入酶标板中；
[0038] h.记录显色剂的褪色时间，同时做空白对照，与空白进行对比，在8-10min之内观察显色剂颜色的变化，若在空白之前褪色，说明样品中含有β-内酰胺酶。
