一种固定化酸性脲酶酶膜的制备方法及应用转让专利
申请号 : CN201010572018.0
文献号 : CN102051355B
文献日 : 2012-08-22
发明人 : 田亚平 , 吕园园
申请人 : 江南大学
摘要 :
一种固定化酸性脲酶酶膜的制备方法及应用，属于酶制剂、酿酒添加剂技术领域。本发明将从肠杆菌9043C12中分离纯化的酸性脲酶，溶于一定量的壳聚糖溶液中，倒入光滑的玻璃板中，37℃下自然脱水干燥成膜，用微量戊二醛交联，得到固定化酸性脲酶酶膜，该固定化酸性脲酶的最适温度为40℃，最适pH为4.5，贮存半衰期为40天，酶活回收率为64.3%；该固定化酸性脲酶酶膜的应用：在黄酒中加入该酶膜后尿素去除率能达到73%，连续使用10次后，尿素去除率依旧可达50%。该固定化酸性脲酶酶膜产品以膜作为固定的载体，接触面积大，可以重复使用；应用于黄酒中，可以不改变原酿造酒的工艺条件，不改变酒的风味，是目前较为理想的去除酒中尿素的方法。
权利要求 :
1.一种固定化酸性脲酶酶膜的制备方法，其特征在于：从肠杆菌9043C12中分离纯化提取得到酸性脲酶；将酸性脲酶溶于一定量的壳聚糖溶液中，倒入光滑的玻璃板中，37℃下自然脱水干燥成膜，用微量戊二醛交联，得固定化酸性脲酶酶膜；其工艺为：A．酸性脲酶的提取：
（1）菌种：采用肠杆菌（Enterobacter sp.）9043C12;（2）种子培养：种子培养基成分g/L：葡萄糖 20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，KH2PO4
2，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，用去离子水定容至1L，pH7.0；
接种量5%，35℃恒温静置培养18~20h；
（3）发酵培养：发酵培养基成分g/L：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏5，酵母膏5，KH2PO4
2，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，四水硫酸锰0.05，六水硫酸镍0.05，用去离子水定容至1L，pH5.5；
接种量5%，35℃恒温静置培养28~32 h；
（4）收集菌体：将发酵液在8000r/min、4℃条件下离心10min后，弃上清，将菌体用去离子水洗涤两次，pH5.5的柠檬酸缓冲液洗涤一次，离心后所得菌体最终溶于pH5.5的柠檬酸缓冲液中，1g菌泥溶于35mL该柠檬酸缓冲液中； （5）高压破碎：850bar条件下，每次处理量25mL，15min处理100mL的菌泥溶液；将破碎液于4℃下14500r/min离心20min，收集上清液，即为所需酸性脲酶酶液；
B．固定化过程：
（1）取0.8g壳聚糖溶于100mL 质量浓度1%的乙酸中，将4 mL酸性脲酶酶液溶于其中，2
置于磁力搅拌器上，搅匀脱泡后，双层纱布过滤，以0.3-0.5mL滤液/cm 的量倾倒在光滑的玻璃板上，37℃自然脱水成膜，用柠檬酸缓冲液浸泡后剥离；
（2）将制好的膜剪成4 cm×4 cm～10 cm×10 cm大小均匀的方块，浸泡在质量浓度
0.02%的戊二醛溶液中，置于磁力搅拌器上磁力搅拌2h，去离子水洗涤，去除游离戊二醛，沥干，所得固定化膜贮存在4℃冰箱内，备用。
2.用权利要求1的方法制备的固定化酸性脲酶酶膜的应用：其特征是该固定化酸性脲酶酶膜的最适温度为40℃，最适pH为4.5，贮存半衰期为40天；
在黄酒中加入该固定化酸性脲酶酶膜后，加酶膜的量：固定化酸性脲酶酶膜面积/黄
2 2
酒体积为16 cm/100mL～100 cm/100mL，在搅拌的条件下，37℃作用24h，首次可去除酒样中73%的尿素，连续使用10次后，尿素去除率达50%。
说明书 :
一种固定化酸性脲酶酶膜的制备方法及应用
技术领域
[0001] 固定化酸性脲酶酶膜的制备方法及应用，具体地说是从肠杆菌9043C12中分离纯化得到酸性脲酶；将酸性脲酶溶于一定量的壳聚糖溶液中，倒入光滑的玻璃板中，37℃下自然干燥脱水成膜，微量戊二醛交联，得固定化酸性脲酶酶膜，属于酶制剂、酿酒添加剂技术领域。
背景技术
[0002] 酸性脲酶（acid urease）是能将尿素（脲）分解为氨和二氧化碳或碳酸铵的酶。该酶广泛分布于植物的种子中，但以大豆、刀豆中含量丰富。也存在于动物血液、尿和微生物体内。能耐受酸性环境，在pH4.0~5.5的体系中仍具有活性。尿素是酒中由微生物代谢过程中所产生的副产物，是形成氨基甲酸乙酯的前体物质。
[0003] 氨基甲酸乙酯（EC）是发酵食品(如面包、酸牛奶、乳酪等)和酒精饮料(如葡萄酒、苹果酒、中国黄酒和日本清酒等)的伴随产物。氨基甲酸乙酯对人的危害主要来自-6酒精饮料的饮用。调查显示，氨基甲酸乙酯含量大于30×10 µg/L的酒，人饮用后易患-9 -9
癌；在麦芽饮料中氨基甲酸乙酯几乎不可测，而果酒白兰地中平均含有10×10 ~73×10-9 -9
µg/L，黄酒及清酒中约20×10 ~300×10 µg/L，多数威士忌酒中氨基甲酸乙酯的量为-9 -9 -9 -9
50×10 ~200×10 µg/L，餐饮葡萄酒中约7×10 ~12×10 µg/L。
癌；在麦芽饮料中氨基甲酸乙酯几乎不可测，而果酒白兰地中平均含有10×10 ~73×10-9 -9
µg/L，黄酒及清酒中约20×10 ~300×10 µg/L，多数威士忌酒中氨基甲酸乙酯的量为-9 -9 -9 -9
50×10 ~200×10 µg/L，餐饮葡萄酒中约7×10 ~12×10 µg/L。
[0004] 经研究，氨基甲酸乙酯是由氨甲酰化合物与乙醇自发反应生成的：
[0005]
[0006] 根据酒中尿素来源和尿素与乙醇反应机理控制酒中EC含量可有三个途径：①适当的控制发酵条件，比如温度、pH值等；②选育低尿素的酵母菌；③在发酵后的酒中添加适量的酒用酸性脲酶，以分解形成的EC前体物质尿素。
[0007] 以上消除EC的三种方法中，尤以第三种方法最为可行。此法不但简易、见效快，且具有以下明显特点：不改变原酒的风味特性；不改变原酿造酒的工艺条件，使生产不受影响；降低酒中EC的含量可达90%左右；而且在成酒中不会检测到活性酸性脲酶的存在。
[0008] 我国的绍兴黄酒在国际上尤其在日本拥有广阔的市场。1987年，日本有关部门提出，绍兴黄酒中有EC超标现象，希望厂家采取措施控制EC的含量。目前，酒用脲酶在我国尚未形成生产能力，酿酒生产中需要的酒用脲酶需花费大
[0009] 量外汇从国外进口。因此，研究酒用脲酶对我国酿酒业的发展，拓展国际市场等均有深远的意义。
[0010] 游离酸性脲酶由于活力不易保持、难于重复利用和难于长期贮存等缺点，其应用受到一定的限制。而固定化酸性脲酶可作为一个良好的反应系统，使自然的酶结合于不溶性的载体材料上．使酸性脲酶稳定性得到加强，且可重复利用。酶膜将酶的催化功能与膜的分离功能交叉融合，在降低成本的同时极大地提高了反应效率。此外天然大分子壳聚糖材料无毒，亲水性好，具有适合酶催化反应的天然微环境，并且价格低廉，来源丰富，可应用于食品行业。故而该固定化酸性脲酶酶膜有良好的应用前景。
发明内容
[0011] 本发明的目的是提供一种固定化酸性脲酶酶膜的制备方法，从肠杆菌9043C12中分离纯化提取得到酸性脲酶，将酸性脲酶溶于一定量的壳聚糖溶液中，倒入光滑的玻璃板中，37℃下自然脱水干燥成膜，用微量戊二醛交联，得固定化酸性脲酶酶膜，该固定化酸性脲酶的最适温度为40℃，最适pH为4.5，贮存半衰期为40天，酶活回收率为64.3%；本发明还涉及这种固定化酸性脲酶酶膜的应用，在黄酒中加入该固定化酸性脲酶酶膜后首次尿素去除率能达到73％，连续使用10次后，尿素去除率仍可达50%。该酸性脲酶酶膜产品以膜作为固定的载体，接触面积大，可以重复使用，具有其他载体不可比拟的优点；应用于黄酒中，可以不改变原酿造酒的工艺条件，不改变酒的风味，是目前较为理想的去除酒中尿素的方法。
[0012] 本发明的技术方案：固定化酸性脲酶酶膜的制备方法，从肠杆菌9043C12中分离纯化得到酸性脲酶，将酸性脲酶溶于一定量的壳聚糖溶液中，倒入光滑的玻璃板中，37℃自然脱水干燥成膜，用微量戊二醛交联，得固定化酸性脲酶酶膜，其工艺为：
[0013] A．酸性脲酶的提取：
[0014] （1）菌种：采用实验室已有肠杆菌（Enterobacter sp.）9043C12，该菌株已在《浙江农业大学学报》22（5）：493~498，1996公开。
[0015] （2）种子培养：
[0016] 种子培养基成分g/L：葡萄糖 20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，KH2PO4 2，NaCl5，NaAc 2，尿素5，用去离子水定容至1L，pH7.0；
[0017] 接种量5%，35℃恒温静置培养18~20h；
[0018] （3）发酵培养：
[0019] 发酵培养基成分g/L：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏5，酵母膏5，KH2PO4 2，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，四水硫酸锰0.05，六水硫酸镍0.05，用去离子水定容至1L，pH5.5；
[0020] 接种量5%，35℃恒温静置培养28~32 h；
[0021] （4）收集菌体：将发酵液在8000r/min、4℃条件下离心10min后，弃上清， [0022] 将菌体用去离子水洗涤两次，pH5.5的柠檬酸缓冲液洗涤一次，离心后所得菌体最终溶于pH5.5的柠檬酸缓冲液中，1g菌泥溶于35mL该柠檬酸缓冲液；
[0023] （5）高压破碎：850Pa条件下，处理量每次25mL，15min处理100mL的[0024] 菌泥溶液，回收率达到80%，适合规模化处理；将破碎液于4℃下14500r/min离心20min，收集上清液，即为所需酸性脲酶酶液；
[0025] B、固定化过程：
[0026] （1）取0.8g壳聚糖溶解于100mL质量浓度1%的乙酸中，将4 mL酸性脲酶酶液溶2
于其中，置于磁力搅拌器上，搅匀脱泡后，过滤，以0.3-0.5mL滤液/cm 的量倾倒在光滑的玻璃板上，37℃下脱水干燥成膜，该膜用缓冲液浸泡后剥离。
于其中，置于磁力搅拌器上，搅匀脱泡后，过滤，以0.3-0.5mL滤液/cm 的量倾倒在光滑的玻璃板上，37℃下脱水干燥成膜，该膜用缓冲液浸泡后剥离。
[0027] （2）将制好的膜剪成4 cm×4 cm～10 cm×10 cm大小均匀的方块，浸泡在质量浓度0.02%的戊二醛溶液中，置于磁力搅拌器上磁力搅拌2h，去离子水洗涤，去除游离戊二醛，沥干，所得固定化膜贮存在4℃冰箱内，备用。
[0028] 制备的固定化酸性脲酶酶膜的应用：该固定化酸性脲酶的最适温度为40℃，最适pH为4.5，贮存半衰期为40天，酶活回收率为64.3%；
[0029] 在黄酒中加入该固定化酸性脲酶酶膜后，加酶膜的量：固定化酶体积/黄酒体积2 2
为16 cm/100mL～100 cm/100mL，在搅拌的条件下，37℃作用24h，首次可去除酒样中73%的尿素，连续使用多次后，尿素去除率达50%。
为16 cm/100mL～100 cm/100mL，在搅拌的条件下，37℃作用24h，首次可去除酒样中73%的尿素，连续使用多次后，尿素去除率达50%。
[0030] 该固定化酒用酸性脲酶的性质：最适温度、最适pH及贮存半衰期的确定：
[0031] 在20-80℃范围内，每隔5℃，分别测定酶活力，以最高酶活力为100%，计[0032] 算相对酶活力，最适温度为40℃。
[0033] 在pH 3.0-7.5范围内，每隔0.5 pH梯度，分别测定酶活，以最高酶活力为100%，计算相对酶活力，最适pH为4.5。
[0034] 将固定化酸性脲酶酶膜放于柠檬酸缓冲液中，4℃冰箱内保存，每隔三天测定固定化酸性脲酶酶膜的酶活，贮存半衰期为40天。
[0035] 该固定化酒用酸性脲酶的应用：
[0036] 将一定面积的固定化酸性脲酶酶膜置于黄酒中，在搅拌条件下，温度37℃，作用24h后，测定其尿素浓度，计算尿素去除率，首次使用后黄酒中的尿素去除率为73%，然后将膜取出用缓冲液洗净，再加入100mL的黄酒重复试验，重复10次后尿素去除率仍然可达
50%。
50%。
[0037] 酶活测定方法
[0038] 游离酶活测定方法：采用靛酚蓝反应（Berthelot reaction）比色法。
[0039] 酶活力定义：在常压，37℃，pH5.5条件下，每分钟分解底物尿素产生1μmol氨为一个酶活力单位。
[0040] 固定化酸性脲酶酶活测定方法：取1cm2膜浸入一定体积的柠檬酸缓冲液配制的pH5.5的3%尿素溶液中，在37℃恒温水浴箱中保温30min后，过滤取其滤液，余下的方法与游离酶活力测定相同。
[0041] 尿素含量的测定方法：二乙酰一肟法。
[0042] 蛋白含量测定方法：考马斯亮蓝G-250法。
[0043] 戊二醛含量的测定：紫外分光光度法。
[0044] 本发明的有益效果：游离酶的提取方法采用易规模化的方法，固定化酸性脲酶酶膜的制作过程可以用机器制作代替，实现工业化生产。该固定化酸性脲酶酶膜能在酒中稳定发挥作用，尿素去除率高，在黄酒中加入固定化酸性脲酶酶膜后尿素去除率能达到73％，且固定化酸性脲酶酶膜便于回收，可重复利用多次。本发明可以不改变原酿造酒的工艺条件，不改变酒的风味，在勾兑，澄清酒的过程中，添加固定化酸性脲酶酶膜，就可以降低尿素含量，是目前较为理想的去除酒中尿素的方法。
附图说明
[0045] 图1 固定化酸性脲酶酶膜制备工艺示意图。
具体实施方式
[0046] 实施例1：将4mL酸性脲酶溶于100mL的0.8%的壳聚糖溶液中，用玻璃棒充分搅2
拌，搅匀后置于4℃冰箱中冷藏至溶液中无气泡为止，以0.3mL/cm 的量
拌，搅匀后置于4℃冰箱中冷藏至溶液中无气泡为止，以0.3mL/cm 的量
[0047] 倒入光滑的玻璃板上，37℃下干燥成膜，用少量柠檬酸缓冲液浸泡后剥离，沥干，将膜裁成均匀大小方块后，置于0.02%戊二醛溶液中，置于磁力搅拌器上磁力搅拌2h（用不透明容器盖住，以防戊二醛见光变色），去离子水洗涤，去除游离戊二醛（紫外分光光度法检测），沥干，冷藏备用，得固定化酸性脲酶酶膜。取10 cm×10 cm大小的膜，放入100mL的黄酒中，37℃下作用24h，测定黄酒中尿素含量，计算尿素去除率，尿素含量从24.8mg/L降至6.7mg/L，尿素去除率达到73%。
[0048] 实施例2：将4mL酸性脲酶溶于100mL的0.8%的壳聚糖溶液中，用玻璃棒充分搅2
拌，搅匀后置于4℃冰箱中冷藏至溶液中无气泡为止，以0.5mL/cm 的量倒入光滑的玻璃板上，37℃下干燥成膜，用少量柠檬酸缓冲液浸泡后剥离，沥干，将膜裁成均匀大小方块后，置于0.02%戊二醛溶液中，置于磁力搅拌器上磁力搅拌2h（用不透明容器盖住，以防戊二醛见光变色），去离子水洗涤，去除游离戊二醛（紫外分光光度法检测），沥干，冷藏备用，得固定化酸性脲酶酶膜。取4 cm×4 cm大小的膜，放入100mL的黄酒中，37℃下作用24h，测定尿素含量，计算尿素去除率。尿素含量从24.8mg/L降至9.6mg/L。取出膜用缓冲液洗净，重新置于100mL的黄酒中，循环测定黄酒中尿素含量，循环10次后，尿素去除率还可达到50%。
拌，搅匀后置于4℃冰箱中冷藏至溶液中无气泡为止，以0.5mL/cm 的量倒入光滑的玻璃板上，37℃下干燥成膜，用少量柠檬酸缓冲液浸泡后剥离，沥干，将膜裁成均匀大小方块后，置于0.02%戊二醛溶液中，置于磁力搅拌器上磁力搅拌2h（用不透明容器盖住，以防戊二醛见光变色），去离子水洗涤，去除游离戊二醛（紫外分光光度法检测），沥干，冷藏备用，得固定化酸性脲酶酶膜。取4 cm×4 cm大小的膜，放入100mL的黄酒中，37℃下作用24h，测定尿素含量，计算尿素去除率。尿素含量从24.8mg/L降至9.6mg/L。取出膜用缓冲液洗净，重新置于100mL的黄酒中，循环测定黄酒中尿素含量，循环10次后，尿素去除率还可达到50%。