一种植物抗盐蛋白及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一种编码有序列表SEQ ID No：1DNA序列或SEQ ID No：2的氨基酸序列的植物蛋白在调控植物耐盐性的应用。本发明利用该抗盐蛋白的编码基因增强植物抗盐性，如抑制植物中上述植物耐盐性相关蛋白的编码基因的表达，为耐盐性农作物育种提供基因与技术支持。

权利要求

1.一种增强拟南芥抗盐性的调控方法，其特征在于：通过T-DNA插入突变技术抑制植物体内DNA序列如SEQ ID No：1所示的植物蛋白基因的表达。

说明书

一种植物抗盐蛋白及其编码基因与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物工程领域中一个植物抗盐相关蛋白及其编码基因与应用，特别涉及利用该基因增强植物抗盐性的方法。

背景技术

[0002] 粮食问题是当今世界所面临的极大难题之一。通过提高单产或扩大种植面积、增加农业投入改造中低产田等途径来增加粮食产量都会碰到需要克服逆境限制或减轻逆境危害的问题。因此，认识植物对逆境的反应机制，提高植物的抗逆性，已成为农业生产和食品安全进一步研究的重点，倍受世界各国政治界和学术界的关注，也是当前生命科学研究的热点。

[0003] 土壤盐碱化是影响限制作物生长的两个重要逆境因子，也是农作物减产的重要影响因素，因此寻找新的抗盐功能基因并阐明其功能具有重要的理论及实践意义。除了传统的育种方法外，利用基因工程技术来提高作物抗盐能力具有重要的理论和经济意义。

[0004] 拟南芥是一种模式植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学等研究领域。拟南芥的大多数基因在其它植物中都能找到，有关拟南芥的任何发现都能应用于其它植物研究。因此，对拟南芥抗盐分子生物学机制的研究对特定区域提高作物的产量具有重要的理论与经济意义。拟南芥基因组已完全测序，根据拟南芥测序数据库(www.arabidopsis.org)寻找和发现新的具有自主知识产权的功能基因是国际植物学研究领域的热点之一，也是不同国家之间科技竞争的焦点。拟南芥共有约1.3亿个碱基对，2.9万个基因。目前大部分基因的功能还不清楚，利用突变技术研究基因功能已成为一种有效的方法。通过对突变体的研究，发现了一些抗盐基因的功能，如SOS1、SOS2、SOS3、NHX1、HKT1等。

[0005] 根据拟南芥数据库公布的基因组序列，发现盐处理HIS1-3基因敲除植株表现为耐受，这表明该表明HIS1-3基因涉及抗盐性的调控。为此，我们研究了该基因功能，并发现该基因具有调控植物耐盐的作用。

发明内容

[0006] 本发明的目的是发现了一种新的植物抗盐相关蛋白及其编码基因。本发明所提供的植物耐盐及降低植物盐吸收相关蛋白的编码基因，名为HIS1-3(AT2G18050)，来源于哥伦比亚野生型的拟南芥，其蛋白是具有下述氨基酸残基序列的蛋白质：

[0007] 序列表中的SEQ ID No：2，序列表中的序列2由167个氨基酸残基组成。

[0008] HIS1-3的cDNA基因，选自下述核甘酸序列之一；

[0009] (1)序列表中SEQ ID No：1的DNA序列；

[0010] (2)编码序列表中SEQ ID No：2蛋白质序列的多核苷酸；

[0011] (3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列杂交的核甘酸序列；

[0012] (4)与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列具有90％以上同源性、且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

[0013] 序列表中的序列1由763个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5’端第46位至549位碱基，编码序列SEQ ID No：2的蛋白质。

[0014] 含有本发明HIS1-3的表达载体，细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。扩增HIS1-3中任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

[0015] 本发明的第二个目的是提供一种利用该基因增强植物抗盐性的方法。

[0016] 本发明所提供的增强植物抗盐性的方法，是抑制植物中的上述植物抗盐性相关蛋白编码基因的表达。

[0017] 抑制植物中的上述植物抗盐性相关蛋白编码基因HIS1-3的表达可通过多种方法实现，如植物病毒载体介导基因沉默的方法，反义核酸技术沉默基因的方法，siRNA介导的基因沉默方法等。本发明抑制基因表达的方法并不限于上述几种方法，只要能抑制HIS1-3表达均可。

[0018] 利用任何一种植物基因敲除技术，将此基因敲除(或沉默)后，植物表现为抗盐。

[0019] 本发明的HIS1-3基因或其反义核酸在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：水稻、小麦、油菜、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜宿等。携带有本发明HIS1-3基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株。

[0020] 本发明的植物抗盐相关蛋白及其编码基可为农作物抗盐育种提供基因与技术的支持。

[0021] 下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。

附图说明

[0022] 图1-A-1-D为his1-3、野生型植株竖立培养，直接点种于含有或不含有盐(NaCl)的培养基上在正常光照条件下竖直培养20天的比较照片，1-E、1-F为统计的量化指标(1-AMS；1-B 50mM NaCl；1-C 75mM NaCl；1-D 100mM NaCl；1-E根长；1-F鲜重)。

[0023] 图2-A-2-D为his1-3、野生型植株在100mM NaCl条件处理一周，在正常培养条件下回复一周后表型对比照片(2-A、2-B处理前野生型和his1-3植株；2-C、2-D回复后野生型和his1-3植株)。

[0024] 图3-A-3-D为his1-3、野生型植株在用75mM NaCl处理后，植株内钠、钾含量以及钠钾比的比较(3-A地下部分钠含量的比较；3-B地上部分钠含量的比较；3-C地下部分钾含量的比较；3-D地上部分钾含量的比较；3-E地下部分钠-钾比的比较)。

[0025] 图4为his1-3、野生型植株盐胁迫条件下相关基因的表达水平。

具体实施方式

[0026] 下述实施例中的实验方法如无特别说明，均为常规方法。

[0027] 实施例1、HIS1-3及其编码基因的获得

[0028] 以野生型哥伦比亚生态型拟南芥的幼苗约50-100mg为材料，用Trizol提取其总RNA，用紫外分光光度计检测RNA浓度。按RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司)试剂盒说明书，以提取的总RNA为模板，合成cDNA第一条链。以提取出来的第一条链cDNA为模板，进行如下PCR反应：20μl反应体系，内含10×PCR缓冲液2μl，dNTPs(10mM)混合物0.4μl，引物1和引物2各2μl，Tag酶(5U/μl)0.2μl，其余加双蒸水至20μl。其中，引物1：5’-ACCACCACTCATCCTCCATACTTT-3′；引物2：5′-TCTCGCCTTCTTCACTTTCCTCT-3′。在Life Express基因扩增仪上扩增：先94℃预变性
3min，再94℃30sec，54℃30sec，72℃60sec，共计30个循环，最后72℃延伸10min，将获得的PCR产物在1％(m/v)琼脂糖凝胶进行电泳。将PCR得到的cDNA片段连接于pGEM-T载体，得到含有目的片段的载体pT-HIS1-3，进行测序鉴定，结果表明PCR得到的cDNA片段具有序列表中序列SEQ ID No：1的DNA序列，为HIS1-3的cDNA基因，由763个碱基组成，其编码序列为自5’端第46位碱基到第549位碱基，编码具有序列表中序列SEQ ID No：2的氨基酸残基序列的蛋白质。

[0029] 实施例2、培育抗盐性增强的拟南芥

[0030] 1、HIS1-3基因被敲除的纯合突变体his1-3的获得

[0031] 从美国拟南芥种质资源中心获得了T-DNA插入突变体种子(SAIL 799A07；http://www.arabidopsis.org/servlets/TairObj ect ？ type ＝ germplasm&id ＝
1006546836)。为鉴定HIS1-3基因被敲除的纯合突变体，播种SAIL 799A07种子并提取单株植株DNA，以此为模板，用3对引物对其进行PCR扩增。其中，引物1LB1：5’-GCCTTTTCAGAAATGGATAAATAGCCTTGCTTCC-3，引物2：HIS 1-3-LP 5’-GACCGAAAGGAGGAGCTAATG-3’，引物
3：HIS1-3-RP 5’-AAGATGATAACGAGGCAGCAG-3’。根据PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果，获得HIS1-3基因被敲除的纯合突变体his1-3。从表型来看，该突变体与野生型(WT)植株在正常生长条件下没有显著差异(图1-A)，用该基因的cDNA序列构建35S强动子的过表达载体并转化突变体，该转基因植株形态上恢复了野生型表型，在盐胁迫条件下也恢复了野生型植株症状，证实了该基因确实控制抗盐性状。

[0032] 2、his1-3与野生型植株的抗盐性比较

[0033] 将野生型(WT)与his1-3同时播种于直径为90mm的培养皿中，培养基分别为加钠和不加钠的固体培养基，竖立培养或者水平培养置于22℃恒温光照(光周期为16小时光照，8小时黑暗)培养。培养20天后，可以观察到：在正常培养基上生长的WT和his1-3在表型、鲜重、根长方面均无显著差异。在植株直接点种或者移栽后在含有钠的培养基上培养，his1-3都表现出明显的盐耐受的性状。在75mM，100mM NaCl胁迫下，his1-3的鲜重和根长明显比WT高。上述结果表明，his1-3较WT对盐胁迫明显耐受。

[0034] 3、his1-3与野生型植株的钠积累比较

[0035] 对盐处理的WT和his1-3植株体内的钠-钾含量进行测定，发现his1-3植株体+ +内钠积累明显低于WT，而钾含量无显著差异；同时野生型的Na/K 明显高于his1-3，表明+ +
his1-3植株较WT不易积累Na，对Na 有一定的耐受性。

[0036] 4、盐处理条件下his1-3与野生型植株相关基因表达比较

[0037] 对盐处理的WT和his1-3植株体内的相关基因表达水平进行检测，发现his1-3植株体内SOS家族基因及NHX1基因明显高于WT，而HKT1基因表达没有明显差异，表明his1-3植株对盐离子响应可能与SOS家族基因的激活有关。