一种心律失常动物模型建立的方法

摘要

本发明提供了一种心律失常动物模型建立的方法。首先构建pBluescript-miR328质粒，建立miR-328转基因小鼠模型，然后提取与筛选gDNA，进行总RA提取，按逆转录试剂进行逆转录获得cDNA，以miR-328筛选引物对其表达进行分析，建立心律失常的小鼠模型。本发明的有益效果在于建立了一种可稳定遗传的心律失常模型，为后续的心律失常研究及药物筛选提供动物模型。该模型具有可稳定遗传，心率失常出现较早，对机体是长期作用，符合临床心律失常的作用特点。

权利要求

1.一种产生心律失常动物的受精卵的方法，其特征在于它包括以下步骤：

（1）构建pBluescript-miR328质粒：选取Pubmed上C57BL/6J小鼠Pre-miR328序列，以基因组为模板，利用含Sal I和Hind III酶切位点的克隆引物，经PCR扩增获得含有该前体序列及其上下游侧翼序列；Sal I和Hind III酶切上述PCR产物与pBluescript载体，CIP对载体去磷酸化，纯化后，经T4连接酶将二者连接，连接产物转化入感受态细胞DH5α，确定重组质粒pBluescript-miR328；

（2）产生miR-328转基因小鼠的受精卵：以Spe I双酶切上述重组质粒，电泳胶回收获得纯化的显微注射用转基因构件，该构件包括心肌特异启动子α-MHC、pre-miR-328、侧翼序列和转录终止信号；将获得纯化的转基因构件经显微注射导入成活的受精卵中。

2.根据权利要求1所述的一种产生心律失常动物的受精卵的方法，其特征在于所述的构建pBluescript-miR328质粒时Sal I和Hind III酶切上述PCR产物与pBluescript载体3h，CIP对载体去磷酸化1h，纯化后得到5ug产物，经T4连接酶将二者连接，连接产物转化入感受态细胞DH5α50uL，涂板，次日，观察菌落生长情况，挑取7个菌落进行测序，确定重组质粒pBluescript-miR328。

3.根据权利要求2所述的一种产生心律失常动物的受精卵的方法，其特征在于所述的利用含Sal I和Hind III酶切位点的克隆引物，经PCR扩增获得含有该前体序列及其上下游侧翼序列的步骤包括用以下引物：ttGTCgAcATCTTCCTGTGTTGCCC，AGaAGCttAGAGGACAAGCATGAAT以小鼠基因组为模板，PCR扩增目的片段，该目的片段含miR-328前体序列及其上下游侧翼序列。

4.根据权利要求3所述的一种产生心律失常动物的受精卵的方法，其特征在于所述的电泳胶回收获得纯化的显微注射用转基因构件的步骤包括用Spe I酶切构建的质粒

10ug，电泳将显微注射片段与载体片段分开，将凝胶中6000bp的显微注射片段进行回收，用Qiangen胶回收试剂盒对其进行纯化，纯化后的片段浓度为200ng/uL。

5.根据权利要求4所述的一种产生心律失常动物的受精卵的方法，其特征在于调整所述的转基因构件的浓度至1ng～2ng/uL用于显微注射。

说明书

一种心律失常动物模型建立的方法

(一)技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种心律失常动物模型建立的方法。 (二)背景技术

[0002] 随着生活水平的提高，心脑血管的发病呈现上升趋势，其中心律失常是严重影响患者生活和生存质量的重大疾病。对其发病机理和治疗药物筛选的研究将为改善患者生活质量提供帮助。对心律失常的研究通常采用动物模型的方法，主要通过结扎大小鼠心肌冠状动脉的方法，在动物上实现心律失常。再通过对基因表达或病理的检测，研究发病机理或进行抗心律失常药物的筛选。虽然“冠状动脉结扎法”所造成的心律失常效果较好，但其一方面死亡率较高，另一方面无法进行传代，无法进行心律失常对机体长期影响的研究。对心律失常的研究需要一种可满足上述几点的动物模型。

[0003] 近年，发现了一类具有基因表达转录后水平调节作用的小分子非编码RNA，称为“微小RNA(microRNA，miRNA)”。通常，miRNA通过与特定mRNA的3非翻译区(UTR)结合，导致mRNA降解或以mRNA为模版的翻译过程受到抑制，从而达到负向调节某一基因表达的作用。有研究表明在心律失常动物模型的心肌中miR-328含量变化明显，其可能参与了心肌细胞的自律性调节，在对miR-328功能研究的同时，我们建立了一种能够心律失常的小鼠模型，该模型基于miR-328转基因过表达。

[0004] (三)发明目的

[0005] 本发明的目的在于提供一种具有可稳定遗传，心率失常出现较早，对机体是长期作用，符合临床心律失常作用特点的心律失常动物模型建立的方法。

[0006] 本发明的目的是这样实现的：

[0007] 1、构建pBluescript-miR328质粒：选取Pubmed上C57BL/6J小鼠Pre-miR328序列，以基因组为模板，利用含Sal I和Hind III酶切位点的克隆引物，经PCR扩增获得含有该前体序列及其上下游侧翼序列；Sal I和Hind III酶切上述PCR产物与pBluescript载体，CIP对载体去磷酸化，纯化后，经T4连接酶将二者连接，连接产物转化入感受态细胞DH5α，确定重组质粒pBluescript-miR328；

[0008] 2、建立miR-328转基因小鼠模型：以Spe I双酶切上述重组质粒，电泳胶回收获得纯化的显微注射用转基因构件，该构件包括心肌特异启动子α-MHC、pre-miR-328、侧翼序列和转录终止信号；选取雌性B6小鼠将全部输卵管依次置于含透明质酸酶的胚胎培养液中分离受精卵，进行体外培养，将经显微注射后成活的受精卵移植于见栓雌性ICR的输卵管壶腹部，待 雌性ICR小鼠分娩，培养乳鼠；

[0009] 3、提取与筛选gDNA：将乳鼠尾尖置于消化液中，加入PCI、异丙醇，以70％乙醇溶液冲洗沉淀，加入170uL1×TE，震荡混匀，以gDNA为模板，用miR-328筛选引物扩增转基因片段；

[0010] 4、总RNA的提取与RT-PCR：按Trizol试剂说明进行总RA提取，按逆转录试剂说明进行逆转录获得cDNA，以miR-328筛选引物对其表达进行分析；

[0011] 5、建立心律失常的小鼠模型。

[0012] 本发明还有这样一些技术特征：

[0013] 1、所述的构建pBluescript-miR328质粒时Sal I和Hind III酶切上述PCR产物与pBluescript载体3h，CIP对载体去磷酸化1h，纯化后得到5ug产物，经T4连接酶将二者连接，连接产物转化入感受态细胞DH5α50uL，涂板，次日，观察菌落生长情况，挑取7个菌落进行测序，确定重组质粒pBluescript-miR328；

[0014] 2、所述的利用含Sal I和Hind III酶切位点的克隆引物，经PCR扩增获得含有该前体序列及其上下游侧翼序列的步骤包括用以下引物：ttGTCgAcATCTTCCTGTGTTGCCC，AGaAGCttAGAGGACAAGCATGAAT(下划线示改造的酶切位点)以小鼠基因组为模板，PCR扩增目的片段，该目的片段含miR-328前体序列及其上下游侧翼序列；

[0015] 3、所述的电泳胶回收获得纯化的显微注射用转基因构件的步骤包括用Spe I酶切构建的质粒10ug，电泳将显微注射片段与载体片段分开，将凝胶中6000bp的显微注射片段进行回收，用Qiangen胶回收试剂盒对其进行纯化，纯化后的片段浓度为200ng/uL。 [0016] 4、所述的调整显微注射用转基因构件的浓度至1ng～2ng/uL； [0017] 5、所述的首日13时选取雌性B6小鼠，注射PMSG 5IU(国际单位)/只；隔日12时注射HCG 5IU/只，并与雄性B6小鼠合笼，同时将发情雌性ICR小鼠与结扎输精管的雄性ICR小鼠合笼，第四日将见栓雌性B6小鼠颈椎离断处死，仰卧位开腹，剪取输卵管近卵巢端0.5cm置于生理盐水中，将全部输卵管依次置于含透明质酸酶的胚胎培养液中分离受精卵，进行体外培养，13时进行显微注射；(小鼠：B6，全称C57BL/6，在转基因操作中常用来做供卵小鼠；ICR，由于其母性较强，多用于受精卵回输的代孕小鼠)

[0018] 6、所述的将经显微注射后成活的受精卵移植于见栓雌性ICR小鼠的输卵管壶腹部，3周后，ICR小鼠分娩，乳鼠生后3w用耳标为其编号，并剪取0.5cm尾尖进行外源基因在基因组整合的鉴定；

[0019] 7、所述的gDNA的提取与筛选时将乳鼠尾尖置于0.5mL消化液中，55℃消化3h；加4
入等体积PCI，1.5×10rpm离心10min，上清移入新管，加0.4mL异丙醇，翻转，离心5min； 以70％乙醇溶液(V/V)冲洗沉淀，离心后晾干；加入170uL1×TE，震荡混匀； [0020] 8、所述的PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，观察外源转基因是否整合入基因组中。

[0021] 本发明的有益效果在于建立了一种可稳定遗传的心律失常模型，为后续的心律失常研究及药物筛选提供动物模型。该模型具有可稳定遗传，心率失常出现较早，对机体是长期作用，符合临床心律失常的作用特点。(四)附图说明

[0022] 图1为显微注射用转基因构件示意图；

[0023] 图2为转基因小鼠与野生型小鼠心肌组织miR-328含量的比较示意图. [0024] (五)具体实施方式

[0025] 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明：

[0026] 本发明的具体技术方案为：

[0027] 1、pBluescript-miR328质粒的构建

[0028] 选取Pubmed上C57BL/6J小鼠Pre-miR328序列。以基因组为模板，利用含Sal I和HindIII酶切位点的克隆引物，经PCR扩增获得含有该前体序列及其上下游侧翼序列。 [0029] Sal I和Hind III酶切上述PCR产物与pBluescript载体3h，CIP对载体去磷酸化1h，纯化后，经T4连接酶将二者连接，连接产物转化入感受态细胞(DH5α)，涂板。次日，观察菌落生长情况。

[0030] 挑取若干菌落进行测序，确定重组质粒pBluescript-miR328。 [0031] 2、miR-328转基因小鼠的建立

[0032] 以Spe I双酶切上述重组质粒，电泳胶回收获得纯化的显微注射用转基因构件(图1)。该构件包括心肌特异启动子α-MHC、pre-miR-328、侧翼序列和转录终止信号。调整该构件的浓度至1ng～2ng/uL。

[0033] 首日13时选取雌性B6小鼠，注射5IU PMSG；隔日12时注射5IU HCG，并与雄性B6小鼠合笼。同时将发情雌性ICR小鼠与结扎输精管的雄性ICR小鼠合笼。第四日将见栓雌性B6小鼠颈椎离断处死，仰卧位开腹，剪取输卵管近卵巢端0.5cm置于生理盐水中。将全部输卵管依次置于含透明质酸酶的胚胎培养液中分离受精卵，进行体外培养。13时进行显微注射。

[0034] 将经显微注射后成活的受精卵移植于见栓的ICR的输卵管壶腹部，术中注意操作轻柔和保温。3周后，ICR小鼠分娩。乳鼠生后3w用耳标为其编号，并剪取0.5cm左右尾尖进行外源基因在基因组整合的鉴定。

[0035] 3、gDNA的提取与筛选

[0036] 将乳鼠尾尖置于0.5mL消化液中，55℃消化3h。加入等体积PCI，1.5×104rpm离心10min，上清移入新管，加0.4mL异丙醇，翻转，离心5min。以70％乙醇溶液冲洗沉淀，离心后晾干。加入170uL1×TE，震荡混匀。

[0037] 以gDNA为模板，用miR-328筛选引物扩增转基因片段。

[0038] PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，观察外源转基因是否整合入基因组中。 [0039] 4、总RNA的提取与RT-PCR

[0040] 按Trizol试剂说明进行总RNA提取，按逆转录试剂说明进行逆转录获得cDNA。以miR-328筛选引物对其表达进行分析。

[0041] 5、northern blot

[0042] 图2为转基因小鼠与野生型小鼠心肌组织miR-328含量的比较示意图，图中以U6做内参照，转基因小鼠心肌组织内成熟miR-328明显高于野生型心肌miR-328。 [0043] 6、心电图测定

[0044] 心电图测定示意图中表明miR-328转基因小鼠的心电图中出现心律不齐等心律失常现象。