淋巴管的稳定剂

摘要

本发明提供包含Tie2活化剂的淋巴管的稳定剂。Tie2活化剂优选为选自血管生成素1(Ang-1)、樟(Cinnamomum)属植物的提取物、刺五加(Siberian Ginseng)提取物和丁香树脂醇中的至少1种。

权利要求

1.来源于桂枝或桂皮的水提取物在制备通过Tie2活化的淋巴管的稳定剂中的用途。

说明书

淋巴管的稳定剂

技术领域

[0001] 本发明提供包含Tie2活化(磷酸化)剂的淋巴管的稳定剂。

背景技术

[0002] 血液从心脏被送入经过毛细血管和/或静脉回到心脏。淋巴管与该血管系统分开地形成组织液的排水途径。淋巴管通过在末梢组织中使从血管渗漏出的间质液、蛋白质、脂肪、细胞等向血管系统回流来保持一定的血液量，从而维持封闭循环系统。在存在于皮肤的毛细血管中，内皮细胞的外侧被基底膜包围、进而附着有周皮细胞。另一方面，在毛细淋巴管中，内皮细胞的外侧几乎没有基底膜，也没有附着周皮细胞。该结构对于有效地从间质摄取体液和/或细胞是有用的(非专利文献1)。迄今为止，已显示出酪氨酸酶型受体VEGFR(血管内皮细胞生长因子受体，vascularendothelial growth factor receptor)-3在淋巴管内皮细胞中特异性表达，并显示出作为其配基的VEGF-C和VEGF-D诱导淋巴管新生。此外明确了，VEGF-A是介由在淋巴管内皮细胞中表达的VEGFR2来诱导淋巴管新生(非专利文献2)。此外，关于淋巴管的功能，有以下报导。在感染了表达VEGF-A的腺病毒的小鼠耳部观察到了显著的淋巴管新生，但是结构异常，并且由在耳部注入了胶态炭的实验明确了，淋巴管的回收功能也被显著抑制(非专利文献3)。即，认为对淋巴管的功能而言，淋巴管内皮细胞适当地配置并被支撑是必要的。我们将这定义为“淋巴管的稳定化”。

[0003] 对皮肤的物理或化学刺激会诱导血管新生和/或VEGF-A等引起的血管渗透性，结果发生组织液的蓄积和浮肿。另一方面，还已知这些刺激直接诱导淋巴管的新生和/或扩张。迄今为止，可观测到紫外线炎症引起的淋巴管扩张，由注入了染料的实验明确了淋巴管的功能发生障碍。认为随着血管扩张，水分向真皮内渗漏出，从而淋巴管扩张而要回收间质液。然而，认为过量的淋巴管扩张反而会降低其回收功能并延迟浮肿(非专利文献4)。即，认为为了迅速回收组织间液，避免诱导淋巴管的过量扩张的“淋巴管的稳定化”是必要的。

[0004] 迄今为止，作为与淋巴管的功能不全相关的病态，已知先天性淋巴浮肿，以及伴随丝虫病、手术、恶性肿瘤、炎症所产生的继发性淋巴浮肿。作为先天性淋巴浮肿，有米耳罗伊病(Milroy病，原发性淋巴水肿)、梅杰病(Meige病)、淋巴水肿-重睫(lymphedema-distichiasis)综合征。报告了在米耳罗伊病中淋巴管不发育和/或发育不全，另一方面，报告了在淋巴水肿-重睫综合征中淋巴管增生。由此也可认为，保持回收功能不仅需要通过淋巴管的新生，还要通过淋巴管的稳定化(非专利文献5)。

[0005] 非专利文献1：実験医学Vol.24，No.18(2006)，pp.133-138

[0006] 非专利文献2：Jussila L and Alitalo K，(2006)Vascular growth factorsand lymphangiogenesis(血管生长因子和淋巴管生成).Phisiol Rev82：673-700

[0007] 非专利文献3：Nagy et al.，(2002)Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor induces lymphangiogenesis as well asangiogenesis(血管通透因子/血管内皮生长因子诱导淋巴管生成以及血管生成).J Exp Med 196：1497-1506

[0008] 非专利文献4：Kajiya K.，Hirakawa S.，and Detmar M.，(2006)VEGF-A mediates UVB-induced impairment of lymphatic vessel function(VEGF-A介导UVB-诱导的淋巴管功能的损伤).Am J Pathol 169：1496-1503

[0009] 非专利文献5：実験医学Vol.24，No.18(2006)，pp.139-143

[0010] 非专利文献6：Kajiya K.，et al.，(2005)Hepatocyte growth factorpromotes lymphatic vessel formation and function(肝细胞生长因子促进淋巴管形成和功能).EMBO J 24：2885-95

[0011] 非专利文献7：実験医学Vol.20，No.8(2002)，pp.52-57

发明内容

[0012] 本发明的课题是提供在实现淋巴管的稳定化、维持和/或增强淋巴管的回收功能方面有效的药剂。

[0013] 以VEGF被分子克隆为开端，作为特异性地在血管形成中发挥作用的因子，已经相继鉴定出VEGF家族和血管生成素(angiopoietin；Ang)家族的分子。VEGF及其受体与从被称为脉管形成的血管早期发生至随后的血管新生的非常宽范围的血管形成相关。另一方面，Ang在脉管形成后，在伴有血管内皮细胞的芽生、分枝、嵌入、萎缩等细胞现象的管腔形成中发挥作用。可以理解，Ang介由在血管内皮细胞中表达的受体型酪氨酸激酶Tie(含Ig和EGF同源结构域的酪氨酸激酶，tyrosine kinase with Ig andEGF homology domain)-2来控制血管内皮细胞与周皮细胞(周细胞)和/或血管平滑肌细胞这样的血管壁细胞的粘着，在血管的结构稳定化中发挥作用(非专利文献7)，但是Tie2与淋巴管的关系还未充分阐明。

[0014] 本发明者着眼于Ang-1与在淋巴管内皮细胞中表达的Tie2的关系而进行了研究，结果发现，Ang-1介由Tie2的活化来促进淋巴管的回收功能，从而完成以下发明：

[0015] (1)一种淋巴管的稳定剂，包含Tie2活化剂。

[0016] (2)根据(1)所述的淋巴管的稳定剂，所述Tie2活化剂是选自血管生成素1(Ang-1)、樟(Cinnamomum)属植物的提取物、刺五加(Siberian Ginseng)提取物和丁香树脂醇中的至少1种。

[0017] (3)根据(2)所述的淋巴管的稳定剂，所述提取物来源于肉桂种植物(Cinnamomum cassia Blume)。

[0018] (4)根据(2)所述的淋巴管的稳定剂，所述提取物来源于桂枝或桂皮。

[0019] (5)根据(2)～(4)的任一项所述的淋巴管的稳定剂，所述提取物是水提取物。

[0020] (6)一种用于改善或预防水肿的美容学方法，其中，应用(1)～(5)的任一项所述的淋巴管的稳定剂。

[0021] 通过使用本发明涉及的淋巴管的稳定剂，能够改善和/或预防水肿等。

附图说明

[0022] 图1是将Ang-1引起的淋巴管的回收功能的变化通过视觉判定评分来数值化而得的图。

[0023] 图2显示桂皮提取物产生的Tie2磷酸化的结果。

[0024] 图3显示刺五加提取物产生的Tie2磷酸化的结果。

具体实施方式

[0025] 对Tie2的活化剂没有特别的限制，可列举血管生成素1等众所周知具有活化Tie2的活性的活化剂，和/或来源于樟(Cinnamomum)属植物的提取物、刺五加(Siberian Ginseng)提取物或丁香树脂醇等本发明者新发现的具有该活性的活化剂。另外，此处所谓的Tie2的活化是指可以通过将Tie2磷酸化而转换成其活性体(磷酸化Tie2)的能力。

[0026] 樟属是樟目(Lauraceae)、樟科(Lauraceae)的植物，存在300以上的种，已知例如肉桂(Cinnamomum cassia Blume)、樟(C.camphora)、圆叶肉桂(C.daphnoides)、柴肉桂(C.doederleinii)、天竺桂(C.japonicum)、圆叶薮肉桂(C.pseudo-pedunculatum)、日本肉桂(C.sieboldii)、锡兰肉桂(C.verum)、锡兰肉桂(C.zeylanicum)。作为本发明中的Tie2活化剂，优选使用肉桂(Cinnamomum cassia Blume)、特别是来源于作为肉桂的嫩枝的桂枝(肉桂枝)或桂皮(肉桂皮)的提取物。已知来源于作为肉桂的树皮的桂皮的提取物例如作为生发剂的有效成分是有用的(特开平10-265350号公报)，但是完全不知道其具有淋巴管的稳定化活性。

[0027] 刺五加(Siberian Ginseng)提取物在传统上被认为对滋养强壮有效。在虚弱、极度疲劳、注意力降低等精神和/或身体能力的降低、病后的恢复方面显示优异的效力。在美国，作为膳食补充剂(diet supplement)被使用。

[0028] 上述提取物可以通过常规方法获得，例如可以将作为其来源的植物与提取溶剂一起在常温或加热下浸渍或加热回流，然后过滤、浓缩而获得。作为提取溶剂，只要是通常提取所使用的溶剂就可以任意使用，可以单独使用或组合使用下述溶剂：例如，水性溶剂，例如水、生理盐水、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液；或者有机溶剂，例如乙醇、丙二醇、1，3-丁二醇、甘油等醇类，含水醇类，氯仿，二氯乙烷，四氯化碳，丙酮，乙酸乙酯，己烷等。优选使用水作为溶剂。用上述溶剂提取得到的提取物可以直接使用，或使用通过例如冻干等使其浓缩后的提取物，还可以根据需要使用采用吸附法、例如离子交换树脂除去杂质后的提取物，和/或用多孔聚合物(例如アンバ一ライトXAD-2)的柱进行吸附、然后用所需溶剂溶出、再浓缩后的提取物。

[0029] 丁香树脂醇是植物所特有的抗氧化物质木酚素类化合物，由于具有改善高血压症的效果和/或抑制幽门螺旋杆菌(H.pylori)的效果，因此可用于食品、饮料和/或药品(例如，特开平8-268887号公报、特开2004-352652号公报等)。丁香树脂醇具有以下化学结构：

[0030]

[0031] 丁香树脂醇是公知的化合物，在樟目(Laurales)、樟科(Lauraceae)的肉桂(Cinnamomum cassia Blume)、特别是在其嫩枝(桂枝)或者树皮(桂皮)中含有。完全不知道其具有淋巴管的稳定化和/或Tie2活化等效果等。丁香树脂醇可以是从桂枝或桂皮等天然来源提取的，或者也可以是合成的。

[0032] 丁香树脂醇可以是无机盐或有机盐。作为盐，没有特别的限制，例如，作为无机盐，可列举盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、氢溴酸盐、钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、铵盐等。作为有机盐，可列举乙酸盐、乳酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、三乙醇胺盐、二乙醇胺盐、氨基酸盐等。

[0033] 本发明涉及的淋巴管稳定剂可以用作对淋巴管结构的不稳定化造成的淋巴液渗漏所导致的各种皮肤疾病、例如浮肿(水肿)的治疗和/或预防有效的药品或化妆品。浮肿包括例如伴随紫外线照射、丝虫病、手术、恶性肿瘤、炎症产生的继发性淋巴浮肿，和/或先天性淋巴浮肿，例如米耳罗伊病、梅杰病、淋巴水肿-重睫综合征。

[0034] 本发明涉及的淋巴管稳定剂还可在用于减少和/或预防水肿和/或眼袋的美容学方法中利用。该美容学方法可以如下进行：例如将本发明涉及的淋巴管稳定剂应用于有水肿等的部位，直接放置或按照例如淋巴管的流动方向实施按摩等，以促进淋巴管液的流动等。该方法的应用部位可列举面部、颈部、手脚等全身所有部位。

[0035] 本发明涉及的淋巴管稳定剂可以根据其使用目的来适当决定用量、用法、剂型。例如，对本发明的淋巴管稳定剂的给药方式没有特别的限制，可以是口服、非口服、外用等。优选为外用剂。作为剂型，可以列举例如，软膏、霜、乳液、洗剂、面膜、浴用剂等外用剂，注射剂、点滴剂或栓剂等非口服给药剂，或片剂、粉剂、胶囊剂、颗粒剂、浸膏剂、糖浆剂等口服给药剂。此外，关于本发明涉及的淋巴管稳定剂，还可以列举作为功能性食品等用途。

[0036] 本发明的淋巴管稳定剂中的Tie2活化剂的配合量可以根据用途来适当决定，一般在试剂总量中为0.0001～20.0摩尔％，优选为0.0001～10.0摩尔％。

[0037] 此外，本发明的淋巴管稳定剂中除了可配合Tie2活化剂以外，还可以根据需要适当配合例如，通常的食品和/或药品中使用的赋形剂、防潮剂、防腐剂、增强剂、增稠剂、乳化剂、抗氧化剂、甜味料、酸味料、调味料、着色剂、香料等，化妆品等中通常使用的美白剂、保湿剂、油性成分、紫外线吸收剂、表面活性剂、增稠剂、醇类、粉末成分、着色剂、水性成分、水、各种皮肤营养剂等。

[0038] 另外，在将本发明的淋巴管稳定剂作为皮肤外用剂使用的情况下，还可以适当配合皮肤外用剂中常用的助剂，例如乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸三钠、柠檬酸钠、多聚磷酸钠、偏磷酸钠、葡糖酸等金属螯合剂，咖啡因、单宁、维拉帕米(Verapamil)、凝血酸(Tranexamic Acid)及其衍生物、甘草提取物、光甘草定(Glabridin)、木瓜果实的热水提取物、各种生药、乙酸生育酚、甘草酸及其衍生物或其盐等药剂，维生素C、抗坏血酸磷酸镁、抗坏血酸葡糖苷、熊果苷、曲酸等美白剂，葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖等糖类，视黄酸、视黄醇、视黄醇乙酸酯、视黄醇棕榈酸酯等维生素A类等。实施例

[0039] 接下来，通过实施例更详细地说明本发明。另外，本发明不限于此。配合量为质量％。

[0040] 实验方法

[0041] 淋巴引流测定法

[0042] 用Hamilton注射器(Hamilton，Reno，NV)，使8周龄的小鼠的耳廓感染将来源于9
小鼠的血管生成素-1(Ang-1)基因插入AdenoX载体中而得的腺病毒(1x10ifu/小鼠)。
作为对照，感染仅含有AdenoX载体的腺病毒。感染4周后，从耳廓末端用Hamilton注射器注入1ul胶体炭溶液(Kamei Co.，Ltd，Japan)，分析淋巴流动随时间的变化。其结果是，在Ang1高表达小鼠耳部，观察到了淋巴管的回收功能被促进(数据未显示)。此外，对淋巴管的回收功能的变化进行视觉判定，以5阶段进行数值化(5：油墨全部留在淋巴管中的状态，
1：油墨全部被回收而从淋巴管消失的状态)来比较，其结果示于图2。由该图观察到，通过作为Tie2活化剂的Ang-1的表达，淋巴管的回收功能比对照显著增强，可知通过Tie2的活化可实现淋巴管的稳定化。

[0043] 此外，通过麻醉进行安乐死后，同时回收耳部，在液氮中粉碎，用Phosphosafe Extraction Reagent(Novagen，Madison，WI)提取蛋白质。总蛋白量使用RC DC Protein Assay Kit(BIO-RAD，Hercules，CA)定量，如下进行蛋白质印迹(Western blotting)来检测。将等量的总蛋白量用15％丙烯酰胺凝胶(NPU-7.5L，ATTO，Japan)进行SDS-PAGE，Ang-1的蛋白质表达使用Ang-1抗体(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)通过ECLKit使其显色来确认。

[0044] 淋巴管内皮细胞的蛋白质印迹(Western blotting)

[0045] 淋巴管内皮细胞从人新生儿包皮中作为CD31阳性CD34阴性CD45阴性细胞而分离出来(非专利文献6)。淋巴管内皮细胞用加入了添加因子的EBM-2(Cambrex；Verviers，Belgium)进行培养，在各种药剂(Ang-1、桂皮提取物、刺五加提取物和丁香树脂醇)存在下用Phosphosafe ExtractionReagent(Novagen，Madison，WI)提取蛋白质。还调制了添加了DMSO的细胞作为对照。

[0046] 另外，桂皮提取物和丁香树脂醇如下调制。刺五加提取物(アスク药品)使用将刺五加的根用30％乙醇提取而得的提取物。用HPLC确认了该提取物中含有1.01质量％的丁香树脂醇。将该提取物用DMSO溶解，作为各试验样品。将总蛋白量使用RC DC Protein Assay Kit(BIO-RAD，Hercules，CA)定量，如下进行蛋白质印迹(Western blotting)来检测。将等量的总蛋白量用7.5％丙烯酰胺凝胶(NPU-7.5L，ATTO，Japan)进行SDS-PAGE，Tie2和磷酸化Tie2的蛋白质表达使用Ang-1抗体(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)通过ECL Kit来显色。图2显示桂皮提取物与Ang-1同样地将Tie2磷酸化，即活化。图3显示刺五加提取物与Ang-1同样地将Tie2磷酸化，即活化。另外，对于丁香树脂醇，虽然未显示数据，但是确认了与Ang-1同样地活化Tie2。

[0047] 桂枝热水提取干燥残余成分的调制

[0048] 在400.7g桂枝(Cinnamomum cassia Blume)中加入2L水，进行3小时加热提取，然后过滤。在所得的残渣中加入2L水，重复同样的操作，再进行2次加热提取。将所得的滤液冻干，从而获得了39.7g热水提取干燥残余成分。

[0049] 热水提取干燥残余成分的分级和分离

[0050] 将31.0g热水提取干燥残余成分使用Sephadex LH-20(AmershamPharmacia Biotech AB)进行粗分级。获得了水溶出流分(2.7g)、50％甲醇溶出流分(8.5g)、甲醇溶出流分(4.9g)、丙酮溶出流分(0.5g)和未溶出流分(7.4g)。对于甲醇溶出流分，通过アンバ一ライトXAD2(オルガノ(株))柱来分级，然后通过HPLC分离(柱：Capcell Pak C18 AQ(株)资生堂制，检测：UV210nm，流动相：CH3CN/H2O混合体系)，从而分离出丁香树脂醇(2.08mg)。