青葙皂苷类化合物及其用途

摘要

本发明涉及医药技术领域，是从青葙(Celosia argentea L.)中提取的青葙总皂苷III和青葙皂苷类新化合物青葙苷C1(Celosin C1)、青葙苷D1(Celosin D1)、青葙苷E(Celosin E)、青葙苷F(Celosin F)和青葙苷G(Celosin G)5个青葙皂苷类化合物的化学结构式如下：经动物实验，青葙总皂苷III或青葙皂苷类化合物青葙苷C1、D1、E、F或G均具有防治肝病、心脑血管病、代谢性疾病、痴呆、抑郁或焦虑活性，本发明化合物制备方法简单，成本低廉。本发明为防治肝病、心脑血管病、代谢性疾病、痴呆、抑郁或焦虑提供了新的药物来源。

权利要求

1.青葙皂苷类化合物青葙苷C1(Celosin C1)、青葙苷D1(Celosin D1)、青葙苷E(Celosin E)、青葙苷G(Celosin G)，其特征在于化学结构式如下：

2.权利要求1所述青葙皂苷类化合物青葙苷C1、青葙苷D1、青葙苷E、青葙苷G在制备防治肝病、心脑血管病、代谢性疾病、痴呆、抑郁或焦虑药物中的应用。

说明书

青葙皂苷类化合物及其用途

技术领域

[0001] 本发明涉及医药技术领域，是一种从青葙(Celosia argentea L.)的干燥成熟种子青葙子(Semen Celosiae)中提取的青葙总皂苷III提取物以及青葙皂苷类5个新化合物青葙苷C1(Celosin C1)、青葙苷D1(Celosin D1)、青葙苷E(Celosin E)、青葙苷F(Celosin F)和青葙苷G(Celosin G)及其在制备防治肝病、心脑血管病、代谢性疾病、痴呆、抑郁或焦虑药物中的应用。

背景技术

[0002] 青葙子(Semen Celosiae)为苋科(Amaranthcea)青葙(Celosia argentea L.)的干燥成熟种子。青葙子味苦，性微寒，具有清肝、明目、祛风热、降血压、抗炎之功效。常用于目赤肿痛、角膜炎、角膜云翳、虹膜睫状体炎、眩晕、皮肤风热瘙痒、疥癣的治疗。本发明人已从青葙子中分离得到皂苷类成分青葙苷A、苷B、苷C和苷D，并申请了专利(详见ZL200610026789.3和200910053042.0)，至今未见从青箱子中提取青葙总皂苷III和分离到青葙苷C1、青葙苷D1、青葙苷E、青葙苷F、青葙苷G的报道。

发明内容

[0003] 本发明提供一种从青葙子中提取的青葙总皂苷III和从青葙子提取物中分离到的新的青葙皂苷类化合物青葙苷C1、D1、E、F和G，以及将它们用于制备防治肝病、心脑血管病、代谢性疾病、痴呆、抑郁或焦虑病的用途。5个青葙皂苷类化合物青葙苷C1(Celosin C1)、青葙苷D1(Celosin D1)、青葙苷E(Celosin E)、青葙苷F(Celosin F)和青葙苷G(Celosin G)化学结构式如下：

[0004]

[0005] R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7

[0006] CelosinC1 H OH COOH CH3 H (CH3)2 fuc-rha-glc-xyl[0007] CelosinD1 H OH COOH CH3 H (CH3)2fuc-rha-glc-xyl-ara

[0008] Celosin E OH glcA CH3 CH3 H (CH3)2 CH3

[0009] Celosin F OH xyl CH3 COOH CH3 ＝CH2 COOH

[0010] Celosin G H glc CH3 CH3 H (CH3)2 fuc-rha-glcA[0011] 本发明的青葙总皂苷III提取物及5个新化合物的制备方法如下：

[0012] 1.制备青葙总皂苷：

[0013] 将青葙子粉碎后用水或30％～70％含水乙醇按常规渗漉提取，提取液减压浓缩得浓缩液，浓缩液通过AB-8，D101或NKA-9大孔树脂柱，依次用水、30％乙醇、45％乙醇、60％乙醇和95％乙醇梯度洗脱，分别收集30％、45％和60％的乙醇洗脱液，将洗脱液分别减压浓缩、干燥，依次得青葙总皂苷I、青葙总皂苷II和青葙总皂苷III。

[0014] 2.制备青葙皂苷类化合物青葙苷C1、D1、E、F、G

[0015] (1)将青葙总皂苷I进行硅胶柱层析，以氯仿-甲醇(30∶1～1∶1)溶剂系统梯度洗脱，再将洗脱液通过高速逆流色谱仪进行分离纯化，用二氯甲烷∶甲醇∶正丁醇∶水＝4∶3∶0.3∶2+0.4％冰醋酸溶剂系统，得青葙苷E、青葙苷F和青葙苷G。(2)将青葙总皂苷III进行硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇-水(9∶1∶0.1～7∶3∶0.3)溶剂系统梯度洗脱，再将洗脱液通过高速逆流色谱仪进行分离纯化，使用正丁醇∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝3.5∶3.5∶0.6∶10+0.5％冰醋酸溶剂系统，得青葙苷C1和青葙苷D1；

[0016] 经药理和药效学实验，本发明提取物青葙总皂苷III或化合物青葙苷C1、D1、E、F或G均具有防治肝病、心脑血管病、代谢性疾病、痴呆、抑郁或焦虑活性。这些疾病包括脂肪肝、肝损伤、肝纤维化、肝硬化、冠心病、心肌梗塞、心肌缺血、脑缺血、脑梗塞、脑中风、糖尿病、高胰岛素血症、胰岛素抵抗力症、肥胖症、糖尿病不耐受症、高血脂症。

[0017] 本发明的提取物青葙总皂苷III和化合物青葙苷C1、D1、E、F、G制备方法简单，成本低廉。本发明为防治肝病、心脑血管病、代谢性疾病、痴呆、抑郁或焦虑提供了新的药物来源。

具体实施方式

[0018] 现结合实施例对本发明作详细描述。

[0019] 实施例1.制备青葙总皂苷III和化合物青葙苷C1、D1、E、F、G

[0020] 取安徽亳州的青葙子50kg，粉碎，用50L水室温浸泡24小时后，以20L每小时的速度渗漉提取，再收集250L水渗漉液，提取液减压浓缩得浓缩液，浓缩液通过AB-8大孔树脂柱，依次用水、30％乙醇、45％乙醇、60％乙醇和95％乙醇梯度洗脱，分别收集30％乙醇、45％乙醇和60％的乙醇洗脱液并减压浓缩、干燥，依次得青葙总皂苷I 55g、青葙总皂苷II
25g和青葙总皂苷III 150g。其中，青葙总皂苷II主要成分为青葙苷A、青葙B、青葙C和青葙D，(详见ZL200610026789.3和200910053042.0，下同)。

[0021] 将青葙总皂苷I进行硅胶柱层析，以氯仿-甲醇(30∶1～1∶1)溶剂系统梯度洗脱，再将该洗脱液使用二氯甲烷∶甲醇∶正丁醇∶水＝4∶3∶0.3∶2+0.4％冰醋酸溶剂系统通过高速逆流色谱仪进行分离纯化，分别得到青葙苷E 1.3g、青葙苷F 2.4g和青葙苷G 2.1g。

[0022] 将青葙总皂苷III进行硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇-水(9∶1∶0.1～7∶3∶0.3)溶剂系统洗脱，再将该洗脱液用高速逆流色谱仪分离纯化，采用的溶剂系统为：乙酸乙酯∶正丁醇∶甲醇∶水＝3.5∶3.5∶0.6∶10+0.5％乙酸，分别得到青葙苷C115.3g和青葙苷D17.9g；

[0023] 实施例2.制备青葙总皂苷III和化合物青葙苷C1、D1、E、F、G

[0024] 取安徽亳州的青葙子50kg，粉碎，用50L50％含水乙醇室温浸泡24小时后，以20L每小时的速度渗漉提取，再收集250L水渗漉液，提取液减压浓缩得浓缩液，浓缩液通过D101大孔树脂柱，依次用水、30％乙醇、45％乙醇、60％乙醇和95％乙醇梯度洗脱，分别收集30％乙醇、45％乙醇、和60％的乙醇洗脱液并减压浓缩、干燥，依次得青葙总皂苷I
155g、青葙总皂苷II 125g和青葙总皂苷III270g。

[0025] 由青葙总皂苷I制备青葙苷E、F和G的方法同实施例1，分别得到青葙苷E4.5g、青葙苷F 3.8g和青葙苷G 4.7g。

[0026] 由青葙总皂苷III制备青葙苷C1和D1的方法同实施例1，分别得到青葙苷C125.3g和青葙苷D118.9g；

[0027] 实施例3.制备青葙总皂苷III和化合物青葙苷C1、D1、E、F、G

[0028] 取安徽亳州的青葙子50kg，粉碎，用50L70％含水乙醇室温浸泡24小时后，以20L每小时的速度渗漉提取，再收集250L水渗漉液，提取液减压浓缩得浓缩液，浓缩液通过NKA-9大孔树脂柱，依次用水、30％乙醇、45％乙醇、60％乙醇和95％乙醇梯度洗脱，分别收集30％乙醇、45％乙醇、和60％的乙醇洗脱液并减压浓缩、干燥，依次得青葙总皂苷I 95g、青葙总皂苷II 75g和青葙总皂苷III 150g。

[0029] 由青葙总皂苷I制备青葙苷E、F和G的方法同实施例1，分别得到青葙苷E3.5g、青葙苷F 2.8g和青葙苷G 3.7g。

[0030] 由青葙总皂苷III制备青葙苷C1和D1的方法同实施例1，分别得到青葙苷C121.3g和青葙苷D112.9g；

[0031] 结构鉴定

[0032] 1.青葙苷C1

[0033] 白色粉末，m.p.：240～243℃，分子式为C53H82O24，HR-TOF-MS：m/z1101.5114[M-H-](Calcd.1101.5118)，确定化合物分子量为1102。UV(MeOH)显示化合物无明显紫外吸收。
核磁共振数据见表1。

[0034] 由表1的H谱与C谱可以推断该化合物为五环三萜皂苷类化合物。

[0035] 该化合物用三氟乙酸水解后，采用GC-MS分析，结构显示该皂苷的糖部位中存在D-夫糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖和D-木糖。在HMBC谱中，180.8的羰基碳和53.1的季碳都与2.05(3H，s)的甲基氢耦合，表明该甲基和羰基都连在4位的季碳上；173.5的羰基碳和52.7的叔碳氢有偶合，说明25位为羧基；6.09(d，J＝8.5Hz)的糖端基氢和176.8的羰基碳有相关，表明化合物中的两个糖是连接在苷元的28位上；6.44(1H，s)的糖端基氢和74.3的碳有相关，5.10(d，J＝5.5Hz)的糖端基氢和85.5的碳有相关，5.25(1H，s)的糖端基氢和107.8的碳有相关，通过进一步做GC-MS实验，进一步证实了四种糖的种类，最后的结果表明：该化合物中的四个糖的种类及连接顺序是β-D-吡喃木糖基(1→2)-β-D-吡喃葡
13
萄糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-吡喃夫糖基。对比齐墩果酸的 C-NMR
13
谱数据，化合物的 C-NMR谱和参考文献(陈德昌.碳谱及其在中草药化学中的应用[M].北京：人民卫生出版社，1991：319-320，下同)报道的数据基本一致，故确定化合物的苷元结构为：23，25-二羧基-齐墩果酸。

[0036] 综合以上分析，确定化合物的结构为：23，25-二羧基-28-O-[β-D-吡喃木糖基(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-吡喃夫糖基]-齐墩果酸。为一新化合物，命名为青葙苷C1。

[0037] 2.青葙苷D1

[0038] 白色粉末，m.p.：236～239℃，分子式为C58H90O28，HR-TOF-MS：m/z 1257.5514[M+N+a](Calcd.1257.5516)，确定化合物分子量为1234。UV(MeOH)显示化合物无明显紫外吸收。
核磁共振数据见表1

[0039] 由表1的H谱与C谱可以推断该化合物为五环三萜皂苷类化合物。

[0040] 该化合物用三氟乙酸水解后，采用GC-MS分析，结构显示该皂苷的糖部位存在D-夫糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖、D-木糖和D-阿拉伯糖。

[0041] 通过与苷C1的谱图比较，发现两个皂苷的相应碳的位移相差不多，母核一样，只是该皂苷要多出一个糖，为D-阿拉伯糖。

[0042] 综上所述，确定化合物的结构为：23，25-二羧基-28-O-[β-D-吡喃阿拉伯糖基(1→2)-β-D-吡喃木糖基(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-吡喃夫糖基]-齐墩果酸，为新化合物，命名为青葙苷D1。

[0043] 表1青葙苷C1、D1的1H、13C-NMR数据(C5D5N+D2O，δ，ppm)

[0044]

[0045]

[0046] 3青葙苷E

[0047] 白 色 粉 末，m.p.：235 ～ 237 ℃，分 子 式 为 C36H54O12，HR-TOF-MS：m/z679.3675[M+H]+(Calcd.679.3694)，确定化合物分子量为678。UV(MeOH)显示化合物无明显紫外吸收。核磁共振数据见表2、表3。

[0048] 由表2的H谱与表3的C谱可以推断该化合物为五环三萜皂苷类化合物。

[0049] 该化合物用三氟乙酸水解后，采用GC-MS分析，结构显示该皂苷的糖部位为葡萄糖醛酸。HMBC谱中，182.2，181.76，175.5的羰基碳分别与1.38(s)，2.76(s)，4.27(s)有偶合；糖的连接位置的确定是根据端基碳的相关氢4.44(d，J＝7.5)与母核的3位叔碳有偶合；母核双键位置的确定是根据12，13位的烯碳与2.76(s)和0.96(s)的氢相关。对比齐13 13
墩果酸的 C-NMR谱数据，化合物的 C-NMR谱和参考文献报道的数据基本一致，故确定化合物的苷元结构为：23，25-二羧基-齐墩果烷。

[0050] 综合以上分析，确定化合物的结构为：23，25-二羧基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-齐墩果烷，为一新化合物，命名为青葙苷E。

[0051] 3青葙苷F

[0052] 白 色 粉 末，m.p.：225 ～ 227 ℃，分 子 式 为 C35H50O12，HR-TOF-MS：m/z -661.3255[M-H](Calcd.661.3224)，确定化合物分子量为662。UV(MeOH)显示化合物无明显紫外吸收。核磁共振数据见表2、表3。

[0053] 由表2的H谱与表3的C谱可以推断该化合物为五环三萜皂苷类化合物。

[0054] 该化合物用三氟乙酸水解后，采用GC-MS分析，结构显示该皂苷的糖部位为木糖。HMBC谱中，181.1，181.9，182.1的羰基碳分别与2.75(d，J＝11)，2.03(s)，1.30(s)有偶合；糖的连接位置的确定是根据端基碳的相关氢4.31(d，J＝7.5)与母核的3位叔碳86.7有偶合；母核双键位置的确定是根据12位的烯碳氢5.23(s)与18位的叔碳43.0相关。对
13 13
比乌苏酸的 C-NMR谱数据，化合物的 C-NMR谱和参考文献报道(李开泉.陈武.熊筱娟，等.乌索酸的化学、药理及临床应用进展.中成药，2002，24(9)：709-710.)的数据基本一致，故确定化合物的苷元结构为：20，30-烯-23，26-二羧基-乌苏酸。

[0055] 综合以上分析，确定化合物的结构为：20，30-烯-23，26-二羧基-3-O-β-D-吡喃木糖基-乌苏酸，为一新化合物，命名为青葙苷F。

[0056] 4青葙苷G

[0057] 白色粉末，m.p.：239～241℃，分子式为C53H80O25，HR-TOF-MS：m/z 1139.5248[M+N+a](Calcd.1139.5250)，确定化合物分子量为1116。UV(MeOH)显示化合物无明显紫外吸收。
核磁共振数据见表2、表3。

[0058] 由表2的H谱与表3的C谱可以推断该化合物为五环三萜皂苷类化合物。

[0059] 该化合物用三氟乙酸水解后，采用GC-MS分析，结构显示该皂苷的糖部位为D-夫糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖醛酸和D-葡萄糖。HMBC谱中，180.3，176.8，170.8的羰基碳分别与2.07(s)，2.17(s)，4.13(s)有偶合；糖的连接位置的确定是根据端基碳的相关氢5.28(d，J＝7.5)、6.11(d，J＝8)分别与母核的3位叔碳86.3和28位羰基碳176.8有偶合；6.47(1H，s)的糖端基氢和74.3的碳有相关，5.10(d，J＝7.5Hz)的糖端基氢和85.5的碳有相关，对
13 13
比齐墩果酸的 C-NMR谱数据，化合物的 C-NMR谱和参考文献报道的数据基本一致，故确定化合物的苷元结构为：23-羧基-齐墩果酸。

[0060] 综合以上分析，确定化合物的结构为：23-羧基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-吡喃夫糖基-齐墩果酸，为一新化合物，命名为青葙苷G。

[0061] 表2青葙苷E、F、G的1H-NMR数据(MeOD，δ(ppm)，J(Hz))

[0062]氢谱 E F G
1 1.93(d，J＝13.5) 1.18(d，J＝6.5) 1.35(s)
2 4.27(s) 4.18(S) 2.11(m)
3 4.07(s) 3.98(S) 4.80(d，J＝3.5)
4 - - -
5 1.50(s) 1.48(m) 2.15(m)
6 1.65(s) 1.06(s) 1.86(m)
7 1.07(s) 2.03(m) 1.8
8 - - -
9 2.76(s) 2.43(s) 1.82(m)
10 - - -
11 1.77(m) 1.62(m) 2.17(m)

[0063]12 5.11(s) 5.23(s) 5.5(s)
13 - - -
14 - - -
15 1.52(s) 1.19(d，J＝6.5) 1.35(s)
16 1.50(s) 1.44(m) 2.11(m)
17 - - -
18 - 2.61(d，J＝4) 3.18(d，J＝4)
19 1.17(s) 2.43(s) 1.82(m)
20 - - -
21 1.41(s) 1.18(s) 1.49(d，J＝9)
22 - 2.75(d，J＝11) 2.17(m)
23 - - -
24 1.38(s) 1.30(s) 2.07(s)
25 - 1.18(s) 1.65(s)
26 0.65(s) - 1.07(s)
27 0.96(s) 0.72(s) 1.33(s)
28 1.16(s) - -
29 1.60(s) 1.09(s) 1.00(s)
30 1.50(s) 4.51(s) 2.17(m)
3-O-glcA
1 4.44(d，J＝7.5)
2 3.32(m)
3 3.45(m)
4 4.20(s)
5 3.55(m)
6
3-O-xyl
1 4.31(d，J＝7.5)
2 3.19(m)
3 3.25(m)
4 3.39(m)
5 3.45(m)
3-O-glc
1 5.28(d，J＝7.5)
2 4.01(m)
3 4.24(m)
4 4.02(m)
5 4.26(m)
6 4.32(m)
28-O-Fuc
1 6.11(d，J＝8)
2 4.71(m)
3 4.24(m)
4 4.02(m)
5 4.77(m)

[0064]6 1.65(s)
Fuc-2-Rha
1 6.47(s)
2 4.91(s)
3 4.77(m)
4 4.40(m)
5 4.85(s)
6 1.77(d，J＝6)
Rha-4-glcA
1 5.10(d，J＝7.5)
2 4.13(d，J＝5.5)
3 4.01(m)
4 4.26(m)
5 4.13(d，J＝5.5)
6

[0065] 表3青葙苷E、F、G的13C-NMR数据(MeOD，δ(ppm)，J(Hz))

[0066]碳谱 E F G
1 45.1 44.9 44.6
2 70.9 71.3 32.5
3 86.9 86.7 86.3
4 53.6 53.6 53.1
5 53.3 53.3 52.8
6 28.9 21.9 21.2
7 30.9 31.1 46.4
8 37.6 37.7 40.3
9 42.9 43.0 48.9
10 41.0 41.2 37.0
11 24.8 24.4 23.8
12 123.6 124.3 122.9
13 145.5 144.8 144.9
14 43.2 43.3 42.4
15 21.9 30.7 46.4
16 47.4 39.3 32.5
17 47.7 47.9 47.2
18 49.8 49.1 42.3
19 35.1 43.0 46.5
20 31.8 149.9 31.1
21 33.8 33.8 34.4
22 34.0 42.9 28.4
23 182.2 182.1 180.3
24 14.2 13.9 14.3
25 181.7 17.3 17.0
26 18.0 181.9 17.6
27 26.8 17.8 26.2

[0067]28 17.3 181.1 176.8
29 33.9 26.7 33.4
30 24.3 107.5 23.9
3-O-glcA
1 105.5
2 75.2
3 77.8
4 70.6
5 73.8
6 178.5
3-O-xyl
1 105.5
2 75.0
3 77.5
4 73.5
5 62.9
3-O-glc
1 106.2
2 75.0
3 77.7
4 78.6
5 71.1
6 67.6
28-O-Fuc
1 94.9
2 74.3
3 76.7
4 73.3
5 72.5
6 17.0
Fuc-2-Rha
1 101.5
2 71.9
3 72.5
4 85.5
5 70.9
6 18.7
Rha-4-glcA
1 107.8
2 76.4
3 75.0
4 71.1
5 78.9
6 170.7

[0068] 药理药效试验

[0069] 一、本发明化合物对肝病的防治作用

[0070] (一)对四氯化碳引起的小鼠急性肝损伤的保护作用

[0071] 1.试验动物和方法：

[0072] 昆明种小鼠90只(第二军医大学动物中心提供)，平均随机分为9组，分别为：正常对照组、模型对照组、阳性对照组(阳性对照药为联苯双酯，下同)、青葙苷C1组(1#，下同)、青葙苷D1组(2#，下同)、青葙苷E组(3#，下同)、青葙苷F组(4#，下同)、青葙苷G组(5#，下同)和青葙总皂苷III组(6#，下同)。

[0073] 将药物配成水溶液，按小鼠体重灌胃给药(下同)，阳性对照药联苯双酯给药剂量为200mg/kg，青葙总皂苷III和化合物青葙苷C1、D1、E、F、G给药剂量分别为4mg/Kg，灌胃体积均为0.2ml/10g，正常对照组和模型对照组灌胃等体积的蒸馏水，连续灌胃7天。除正常对照组以外，其余各组在第7天给药后1h腹腔注射0.1％四氯化碳10ml/kg，18小时后各组摘眼球采血，离心，取血清，测定天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)。结果见表4。

[0074] 表4本发明化合物对四氯化碳引起肝损伤的保护作用血液生化指标

[0075]

[0076] 与模型对照组比较：**p＜0.01

[0077] 由表4可见，青葙苷C1、D1、E、F、G或青葙总皂苷III连续给药7天，能明显抑制四氯化碳引起的AST、ALT升高，其作用与正常对照组接近，且明显好于阳性药联苯双酯。

[0078] (二)对脂肪肝的治疗作用

[0079] 1、实验动物及方法：

[0080] Wister大鼠110只，体重180-230g，随机分成两组，第一组10只，为正常对照组组，给予正常饲料；其余100只为第二组，按常规给予高脂饲料60天后，处死其中10只，做肝脏病理切片，确定脂肪肝模型成立后，再随机分为下列9组，模型对照组，继续给予高脂饲料；非处理组，动物改食普通饲料；青葙苷C1组(1#)、青葙苷D1组(2#)、青葙苷E组(3#)、青葙苷F组(4#)、青葙苷G组(5#)和青葙总皂苷III组(6#)，动物均改食普通饲料，给药剂量均为8mg/Kg/d，连续给药30天。

[0081] 2、观察指标：

[0082] a体重：分别在0、30、60、90天时称重；

[0083] b血液生化指标：血清ALT、AST、血清总胆固醇，甘油三酯；

[0084] c病理学检查：石蜡切片、HE染色，观察脂肪肝及炎症坏死程度。

[0085] 结果见表5、表6、表7。

[0086] 表5各实验组动物血清中血脂的变化

[0087]**

[0088] 与模型对照组比较，P＜0.01

[0089] 表6各实验组动物血清转氨酶含量的变化

[0090]

[0091]

[0092] 与模型对照组比较，**P＜0.01

[0093] 表7各实验组动物肝脏脂肪变性的程度(％)

[0094]

[0095] 由表5、6、7可见，给药30天，青葙苷C1、D1、E、F、G或青葙总皂苷III可明显降低血清中的胆固醇及甘油三酯，有效缓解高脂饲料引起的脂肪肝变性，改善因脂肪变性而导致的肝功能损害。

[0096] (三)对四氯化碳(CCl4)诱发的大鼠慢性肝纤维化的治疗作用

[0097] 1、实验动物及方法：

[0098] 雄性Wister大鼠180只，随机分为9组，每组20只，分别为正常对照组，模型对照组，阳性对照组，以及青葙苷C1(1#)、D1(2#)、E(3#)、F(4#)、G(5#)和青葙总皂苷III(6#)组。除正常对照组外，其余各组动物均每周皮下注射10％的CCl4(5ml/Kg)2次，共12周；从开始注射CCl4起，每天按药物剂量给药1次，共12周，给药方式：灌胃给药，给药剂量：阳性药物联苯双酯160mg/Kg/d，本发明提取物及化合物均为8mg/Kg/d。

[0099] 2、观察指标：

[0100] a.给药12周后，按ELSA试剂盒方法测定血清中天冬氨酸氨基转氨酶(AST)、丙氨酸氨基转氨酶(ALT)、血清总蛋白(TP)、微量白蛋白(ALB)的含量；

[0101] b.取肝组织，按ELSA试剂盒方法测定羟脯氨酸(HP)、)、III型胶原前肽(PIIIP)、)、IV型胶原(CIV)的含量；

[0102] c.取肝组织，HE染色，作病理组织学检查，计算胶原容积积分(CVF)。

[0103] 结果见表8、表9、表10。

[0104] 表8本发明化合物对CCl4所致的大鼠慢性肝损伤后肝功能的影响

[0105]

[0106] 与模型对照组比较，**P＜0.01

[0107] 表9本发明化合物对CCl4所致的大鼠慢性肝损伤后肝纤维化的影响

[0108]

[0109]**

[0110] 与模型对照组比较，P＜0.01

[0111] 表10本发明化合物对CCl4所致的大鼠慢性肝损伤后胶原容积积分的影响[0112]

[0113] 与模型对照组比较，**P＜0.01

[0114] 由表8、9、10可见，青葙苷C1、D1、E、F、G或青葙总皂苷III对CCl4所致的大鼠慢性肝纤维化有明显治疗作用。

[0115] 二、本发明化合物的心脑血管活性

[0116] (一)对异丙肾上腺素(ISO)所至大鼠心肌缺血的治疗作用

[0117] 1、实验动物与方法

[0118] 健康雌性SD大鼠64只，随机平均分为8组，分别为正常对照组、模型对照组和本发明药物组。正常对照组和模型对照组分别灌胃等体积生理盐水，药物组分别灌胃青葙苷C1(1#)、D1(2#)、E(3#)、F(4#)、G(5#)和青葙总皂苷III(6#)，剂量均为8mg/Kg/d，连续给药三天。模型对照组和药物组分别于第二天和第三天给药后1h按体重皮下注射ISO 1ml/Kg，正常对照组皮下注射等容量的生理盐水，分别记录第三天给受试药物前和第二次给予ISO后30min的心电图，测量J点值，计算给予ISO后各组大鼠J点位移的绝对值。测完心电图以后对大鼠腹主动脉采血，肝素抗凝后离心分离血浆，分光光度法测定血浆中乳酸脱氢酶(LDH)活性单位。各给药组统计结果和模型组比较进行t-检验。LDH计算公式如下：

[0119]

[0120] 结果见表11、表12。

[0121] 表11本发明化合物对ISO所致大鼠心肌缺血J点位移的影响(n＝8)

[0122]

[0123] 与模型对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，

[0124] 表12本发明化合物对ISO大鼠LDH活性单位的影响(n＝8)

[0125]

[0126]

[0127] 与模型对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，

[0128] 由表11、12可见，青葙苷C1、D1、E、F、G或青葙总皂苷III对ISO引起的大鼠心肌缺血有显著的抑制作用，并可减轻缺血心肌的损伤，因此对心肌缺血有明显的保护作用。

[0129] (二)本发明化合物对大鼠冠状动脉结扎所致急性心肌缺血的保护作用[0130] 1、实验动物与方法

[0131] 取体重200g左右的健康SD大鼠80只，雌雄各半，随机平均分成8组：模型对照组(生理盐水10ml/kg/d)，阳性对照组(普萘洛尔8mg/Kg/d)，本发明药物组(剂量均为8mg/Kg/d)。所有样品经灌胃给药，给药体积为10ml/kg，每天1次，连续2天。

[0132] 于末次给药后1h，腹腔注射12％水合氯醛3ml/kg进行麻醉，记录正常心电图，胸部去毛、消毒，沿左锁骨中线纵行切开皮肤约2cm，在第4或第5肋间钝性分离肌层，打开胸腔，剪开心包，轻压右侧胸廓，挤出心脏，在右侧圆锥与左心耳之间冠状静脉处结扎左冠状动脉后，把心脏放回胸腔，充分排出胸腔内空气，缝合关闭胸腔，呼吸机辅助呼吸，频率20次/分，潮气量5ml。于结扎后即刻，1h，24h，48h分别描记一段心电图，并于24h、48h分别灌胃药物1#至6#及生理盐水，给药剂量8mg/Kg/d。

[0133] 在冠脉结扎50h后，大鼠再次麻醉，迅速取出心脏，用生理盐水冲洗，除去血污，剔除血管、脂肪等非心肌组织，用吸水纸吸去水分，称全心湿重。沿冠状沟切除心房，留下心室，称重，顺房室沟从心尖到心基部平行将心室肌横切成厚约0.1cm的心肌片4片，用生理盐水冲洗干净，将心肌片放在0.1％的N-BT溶液中，在37℃水浴条件下染色15min，染色后立即用水冲洗去多余的染料。梗死区不着色，非梗死区被N-BT溶液染成蓝色。剪去梗死心肌，称湿重，以梗死区湿重占全心湿重的百分比表示心肌梗死范围，结果见表13。

[0134] 表13本发明化合物对冠状动脉结扎致大鼠急性心肌缺血模型缺血范围的影响(n＝10)

[0135]

[0136] 与模型对照组比较，**p＜0.01

[0137] 由表13可见，青葙苷C1、D1、E、F、G或青葙总皂苷III能够非常显著地降低心肌缺血引起的组织坏死，对缺血组织有明显的保护作用，效果与阳性对照药

[0138] 普萘洛尔接近。

[0139] (三)本发明化合物对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用

[0140] 1.试验动物与方法：

[0141] 取雄性SD大鼠共72只，随机分成9组，每组8只，第1组为假手术组，第2组为模型组(注射等体积生理盐水)，第3组为阳性药物尼莫通注射液组(德国拜耳公司生产)，给药剂量8mg/Kg/d，第4至9组为青葙1#至6#组，给药剂量都为8mg/Kg/d。给药时间为脑缺血再灌注损伤模型造模成功以后1小时后尾静脉注射。

[0142] 参照Longa EZ报道的线栓模型制备脑缺血再灌注损伤模型(Longa EZ，et al：Reversable middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rat.Stroke，
1989，20：84)。缺血2小时再灌注24小时后断头取脑，TTC染色，留取样本进行脑梗塞体积测定(详见张均田主编：现代药理实验方法学，第1241页，北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998年10月第1版)。

[0143] 结果见表14。

[0144] 表14本发明化合物对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用

[0145]

[0146] 与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

[0147] 由表14可见，青葙苷C1、D1、E、F、G或青葙总皂苷III对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤有较强保护作用。

[0148] 三、本发明化合物对代谢病的防治作用

[0149] 1、实验动物与方法：

[0150] 取体重为180～240g的大鼠90只，雌雄各半，随机留取10只作为正常对照组，其余为实验组。实验组大鼠禁食12后，以左下腹腔一次性注射链尿佐菌素(STZ，美国公司)65mg/Kg(溶于PH4.5、0.1mmol/L枸橼酸盐缓冲液)，对照组注射等容积的枸橼酸盐缓冲液，注射48小时后，凡血糖浓度＞13mmol/L的尿糖呈强阳性者，并出现多饮、多食、多尿者为糖尿病模型，糖尿病大鼠再随机分为7组，每组10只，糖尿病模型组、本发明化合物青葙1#至6#治疗组，对照组和模型组喂饲普通饲料，除自由饮水外，每天以蒸馏水灌胃(2ml/d)。本发明化合物青葙1#至6#组，每只大鼠按剂量灌胃4周，期间标准饲料和饮水不受限制，4周之后，以戊巴比妥麻醉，心脏取血检测有关生化指标：全血血糖测定：尾部采血20μL，用血糖试纸通过血糖仪测定。

[0151] 结果见表15

[0152] 表15本发明化合物对实验性糖尿病大鼠血糖的影响

[0153]

[0154] 与模型组比较，**P＜0.01

[0155] 由表15可见，青葙苷C1、D1、E、F、G或青葙总皂苷III有明显的降血糖作用。

[0156] 四、本发明化合物对痴呆的治疗作用

[0157] 1.MORRIS水迷宫法

[0158] 1.1动物和方法

[0159] MORRIS水迷宫实验：SD大鼠(由第二军医大学实验动物中心提供)90只，随机分成9组，分别为空白组、模型组、阳性对照组及青葙1#至6#药物组。其中空白组与模型组以0.5％的羧甲基纤维素钠灌胃，阳性对照组灌胃给予Hup A 4mg/kg，本发明药物组按8mg/kg灌胃给药，每天2次，共8天。每天第一次给药后1小时，开始进行MORRIS水迷宫训练。实验前一天让大鼠自由游泳2分钟以适应周围环境，从第一天开始，每天训练4次，每次随机选择一个入水点，将大鼠面向池壁放入水中，观察并记录大鼠寻找并爬上平台的路线图及所需时间(潜伏期)。4次训练大鼠分别从四个不同的入水点入水，如果大鼠在120秒内未找到平台，需将其引至平台。这时潜伏期记为120秒，每次训练间隔60秒，连续7天。第8天末次给药后1小时，空白组大鼠腹腔注射生理盐水1ml/kg，其余各组大鼠腹腔注射氢溴酸东莨菪碱2mg/kg。每只大鼠注射结束后25min由一固定入水点面向池壁被投入水中，观察并记录其寻找平台路线及找到平台的时间(潜伏期)。

[0160] 避暗实验：SD大鼠90只，按前述分组方法随机分成9组，其中空白对照组与模型组以0.5％的羧甲基纤维素钠灌胃，对照组灌胃给予Hup A 4mg/kg，本发明药物组按8mg/kg灌胃给药，每天2次，共8天。第8天末次给药后1小时开始训练，除空白对照组外，每组大鼠于训练前25min腹腔注射氢溴酸东莨菪碱2.0mg/kg，空白组为生理盐水1.0ml/kg。训练时将大鼠先放入箱内适应3min，然后接通电源，将动物背向洞口置于避暗箱明室，观察动物首次进入暗室的时间(潜伏期)和5min内进入暗室的总次数(犯错次数)。第9天重复避暗实验操作并记录潜伏期及犯错误数作为记忆指标，结果见表16和表17。

[0161] 表16各组大鼠寻找平台的潜伏期

[0162]* **

[0163] P＜0.05，P＜0.01与模型组比较

[0164] 表17各组大鼠犯错次数及潜伏期比较

[0165]

[0166]

[0167] 与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

[0168] 由表16、17可见，青葙苷C1、D1、E、F、G或青葙总皂苷III能明显改善痴呆大鼠的学习记忆功能，对痴呆具有一定的预防和治疗作用。

[0169] 五、本发明化合物的抗抑郁或焦虑活性

[0170] 1、实验动物与方法

[0171] 按张均田主编的《现代药理实验方法》(上册)第104页的方法进行。将小鼠(昆