一株中国东北地区高酶活力和高效降解秸秆纤维素能力的土著真菌

摘要

一株中国东北地区高酶活力和高效降解秸秆纤维素能力的土著真菌，它涉及一株降解纤维素的真菌。本发明中国东北地区高酶活力和高效降解秸秆纤维素能力的土著真菌，该菌命名为斜卧青霉(Penicillium decumbens)C5，属于青霉属(Penicillium sp.)，保藏编号为CGMCC No.4203，保藏日期为2010年10月08日。本发明斜卧青霉C5菌株在培养至3d时，FPase高达7085.66U/L，EG/Cen峰值为3856.97U/L，CBH/Cex峰值为2681.59U/L，β-Gase峰值为1487.86U/L，斜卧青霉C5对秸秆具有高效降解作用。

权利要求

1.一株中国东北地区高酶活力和高效降解秸秆纤维素能力的土著真菌，其特征在于该菌命名为斜卧青霉（Penicillium decumbens）C5，属于青霉属(Penicillium sp.)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No. 4203，保藏日期为2010年10月08日；它菌丝有隔膜，分生孢子梗光滑，多呈椭圆形或球形，直径

1.0μm～1.5μm，不对称分支2～5个，排列紧密，呈扫帚状，其顶端着生5～10个短小瓶状小梗，大小为10.0μm～15.0μm，呈不分枝的链状；在培养基上形成圆形菌落，边缘平整有白色菌丝，表面粗糙，布满一层分生孢子粉，呈灰绿色，菌落背面茶棕色。

说明书

一株中国东北地区高酶活力和高效降解秸秆纤维素能力的

土著真菌

技术领域

[0001] 本发明涉及一株降解纤维素的真菌。

背景技术

[0002] 纤维素是地球上最古老、最丰富的天然高分子，是人类最宝贵的天然可再生资源。全世界每年产农作物秸秆近2000亿t，我国每年产超过6亿t，农业方面每年产生的大量残留物，其中大部分没有得到充分利用而作为废弃物被丢弃，不但带来了严重的环境问题，也浪费了宝贵的物资资源。玉米秸秆是纤维素组分含量很高的农业残留物，如何使玉米秸秆无害化、资源化已经成为国内外研究的热点。利用微生物产生的纤维素酶水解秸秆，具有效果稳定及污染少等优点，因而得到了普遍的认可和推崇。因此，筛选和分离出高产纤维素酶的微生物种类，研究其对纤维素物质的降解能力，对减轻农业废弃物给环境的压力和纤维素资源的开发利用有很大的发展前景。

[0003] 可降解纤维素的微生物包括真菌、细菌和放线菌，研究较多的有曲霉(Aspergillus)、木霉(Trichoderma)、青霉(Penicillium)和纤维弧菌属(Cellvibrio)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)等，而青霉属具有生长快和易培养的优势，因此，青霉具有很高的潜力和价值应用于纤维素的降解。

发明内容

[0004] 本发明提供了一株中国东北地区高酶活力和高效降解秸秆纤维素能力的土著真菌。

[0005] 中国东北地区高酶活力和高效降解秸秆纤维素能力的土著真菌，该菌命名为斜卧青霉(Penicillium decumbens)C5，属于青霉属(Penicillium sp.)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.4203，保藏日期为2010年10月08日；它菌丝有隔膜，分生孢子梗光滑，多呈椭圆形或球形，直径1.0μm～1.5μm，不对称分支2～5个，排列紧密，呈扫帚状，其顶端着生5～10个短小瓶状小梗(大小为
10.0μm～15.0μm)，呈不分枝的链状；在培养基上形成圆形菌落，边缘平整有白色菌丝，表面粗糙，布满一层分生孢子粉，呈灰绿色，菌落背面茶棕色。

[0006] 本发明中斜卧青霉C5的生长温度为-4℃～35℃、生长pH值为5.5～7.5之间；斜卧青霉C5的孢子耐热性较强，菌体繁殖温度较低；斜卧青霉C5在东北地区冬季的冻土条件下依然能存活，具有抗寒特性。

[0007] 本发明中斜卧青霉C5，属于青霉属(Penicillium sp.)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.4203，保藏日期为2010年10月08日。

[0008] 本发明斜卧青霉(Penicillium decumbens)C5为中国东北地区土著真菌，具有较高的酶活力，同时对玉米秸秆纤维素也具有高效的降解能力，对探索东北地区微生物产纤维素酶和降解纤维素的能力，及提高玉米秸秆的利用率和开发本土丰富的菌种资源具有重要意义。

[0009] 中国东北地区高酶活力和高效降解秸秆纤维素能力的土著真菌，该菌命名为斜卧青霉C5，是从东北地区自然环境中筛选分离出来(菌种来源：东北农业大学校外玉米秸秆腐殖物)，斜卧青霉C5在最适宜真菌降解秸秆纤维素的条件下，菌株在培养3d时，表示酶系总效率的滤纸酶活(FPase)高达7085.66U/L，内切葡聚糖酶(EG/Cen)峰值为3856.97U/L，外切葡聚糖酶(CBH/Cex)峰值为2681.59U/L，β-葡萄糖苷酶(β-Gase)峰值为1487.86U/L，斜卧青霉C5对秸秆具有高效降解作用，是一株具有研究价值和开发潜力的纤维素降解菌株。

附图说明

[0010] 图1为具体实施方式一中斜卧青霉C5放大3000倍的扫描电镜图；图2为具体实施方式一中斜卧青霉C5放大1000倍的扫描电镜图；图3为具体实施方式一中斜卧青霉C5的18S rDNA序列系统发育树图；图4为具体实施方式一中各菌株最大酶活测定比较图；图5为具体实施方式一中未处理的玉米秸秆表面扫描电镜图；图6为具体实施方式一中经碱预处理后的玉米秸秆表面扫描电镜图；图7为具体实施方式一中斜卧青霉C5发酵利用后的玉米秸秆表面扫描电镜图。

具体实施方式

[0011] 具体实施方式一：本实施方式中国东北地区高酶活力和高效降解秸秆纤维素能力的土著真菌，该菌命名为斜卧青霉(Penicillium decumbens)C5，属于青霉属(Penicillium sp.)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.4203，保藏日期为2010年10月08日；它菌丝有隔膜，分生孢子梗光滑，多呈椭圆形或球形，直径1.0μm～1.5μm，不对称分支2～5个，排列紧密，呈扫帚状(如图1所示)，其顶端着生5～10个短小瓶状小梗(大小为10.0μm～15.0μm)，呈不分枝的链状(如图2所示)；在培养基上形成圆形菌落，边缘平整有白色菌丝，表面粗糙，布满一层分生孢子粉，呈灰绿色，菌落背面茶棕色。

[0012] 本实施方式中斜卧青霉C5的菌种来源：东北农业大学校外玉米秸秆腐殖物；采用平板划线分离法进行分离；分离所用的初筛培养基为改良察氏培养基，改良察氏培养基由3g的硝酸钠、1g的磷酸氢二钾、0.5g的硫酸镁(MgSO4·7H2O)、0.5g的氯化钾、0.01g的硫酸亚铁、30g的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)和20g的琼脂加入蒸馏水并定容至1000mL组成；分离所用的复筛培养基由10g的CMC-Na、10g的蛋白胨、10g的酵母粉、1g的KH2PO4、5g的NaCl和10g的琼脂粉加入蒸馏水并定容至1000mL组成。

[0013] 本实施方式中将(初筛获得菌株)加入1.0g/L的刚果红溶液，浸染1h弃去染液，加入1mol/L的NaCl溶液，洗涤脱色1h，测菌落直径(d，cm)和水解圈直径(D，cm)，用D/d表示水解能力；结果如表1所示，斜卧青霉C5相对于其他菌株具有更大的水解圈，初步证明其具有较好的产纤维素酶的能力。

[0014] 表1

[0015]

[0016] 本实施方式中将(初筛获得菌株)，经DNS法测定菌株滤纸酶活力，各菌株最大酶活测定比较结果如图4所示，斜卧青霉C5和C17的最大酶活高于其他中国东北地区土著真菌菌株，为7405.92U/L和6512.98U/L，这与其具有较大的刚果红水解圈一致，其中斜卧青霉C5产酶速率较C17快4d，说明斜卧青霉C5为高酶活力中国东北地区土著真菌。

[0017] 本实施方式中斜卧青霉C5是根据《真菌鉴定手册》和《中国真菌志》初步判定为青霉属(Penicillium sp.)；本实施方式中斜卧青霉C5，接入摇瓶发酵培养基中(摇瓶发酵培养基由5g的CMC-Na、4g的(NH4)2SO4、5.0g的蛋白胨、0.18mL的吐温80、3.0g的MgSO4、3.0g的CaCl2和0.01g的FeSO4加入蒸馏水并定容至1000mL组成)进行复筛，在28℃、120r/min下培养3d后，取适量发酵液稀释，封装于10mL离心管，进行真菌18S rDNA鉴定，真菌18S rDNA通用引物合成和测序由genscript公司完成。通过PCR扩增获得菌株C5的ITS序列，大小为1769bp；将该序列结果输入GenBank以BLAST进行序列同源性比较，结果显示其18S rDNA序列与青霉属(Penicillium sp.)相似性最高，相似度达到99％。将测定得到的ITS序列与NCBI数据库中的相关菌种的ITS序列进行比对分析，并利用MEGA3.1构建进化树(如图3所示)；结合形态学的鉴定结果，确定该菌为一株新菌。

[0018] 本实施方式中斜卧青霉C5对秸秆降解情况：将斜卧青霉C5接种于玉米秸秆发酵培养基中培养，然后将培养基过滤、风干，进行扫描电镜成像实验，观察秸秆样品物理形变，了解斜卧青霉C5对玉米秸秆的降解能力，其中玉米秸秆发酵培养基由5g经碱预处理的玉米秸秆、4g的(NH4)2SO4、5.0g的蛋白胨、0.18mL的吐温80、3.0g的MgSO4、3.0g的CaCl2和0.01g的FeSO4加入蒸馏水并定容至1000mL组成。结果：未处理的玉米秸秆表面光滑，结构紧密，秸秆分布着气孔，因自然风干作用，表面有龟裂现象(图5)，经碱预处理后，玉米秸秆复杂的表面结构变得较为清晰，表层的木质素被完全剥离，露出纵向排列的纤维素骨架(图6)，根据波尔顿克模型，可以推测纤维素束之间的结构也变得较为疏松，更容易与纤维素酶的活性位点接触；经本实施方式斜卧青霉C57天发酵后，纤维素从中间断裂、破碎，结构和性质普遍发生了明显的变化(图7)，主要是因为接种菌株在培养过程中利用纤维素进行代谢作用，导致玉米秸秆纤维素被降解，说明本实施方式斜卧青霉C5具有高效降解秸秆纤维素的能力。

[0019] 具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是斜卧青霉C5的生长温度为-4℃～35℃、生长pH值为5.5～7.5之间。其它与具体实施方式一相同。

[0020] 本实施方式中用改良察氏培养基培养斜卧青霉(Penicillium decumbens)C5，作为中国东北地区土著真菌其生长温度为-4℃～35℃、生长pH值为5.5～7.5之间。