一种多ShRNA高效协同沉默基因方法及载体

摘要

本发明公开了一种多ShRNA高效协同沉默基因方法及载体，提供了一项可诱导性的多ShRNA协同干扰基因表达的ShRNA载体，ShRNA经药物诱导表达后，在靶基因的表达量降至检查不到水平，而且本发明还具有广泛的适用性，可取代传统的基因敲除技术来实现基因打靶。

权利要求

1.一种用于多ShRNA介导协同基因沉默的ShRNA载体，其特征在于，ShRNA载体上装载有一段含有三个不同的ShRNA沉默盒的DNA序列，所述三个不同的ShRNA沉默盒所包含的ShRNA互不相同；

三个不同的ShRNA沉默盒上游各设置有一个强力霉素应答的启动子元件PDRE；所述强力霉素应答的启动子元件PDRE序列依次如SEQ ID NO.1-3所示；

所述装载有三个不同的ShRNA沉默盒的DNA序列上游还设置有一受强力霉素控制的沉默子tTS、一强启动子，所述强启动子用于组成型表达沉默子tTS，设置在沉默子tTS的上游。

2.根据权利要求1所述的ShRNA载体，其特征在于，所述强启动子为CMV启动子。

3.根据权利要求1所述的ShRNA载体，其特征在于，所述强启动子为CAG启动子或UBC启动子。

4.根据权利要求2所述的ShRNA载体，其特征在于，所述CMV启动子的上游和受强力霉素控制的沉默子tTS的下游还分别设置有多聚PolyA加尾信号；所述多聚PolyA加尾信号分别用TKpA和bglobpA，TKpA设置在CMV强启动子的上游，bglobpA设置在受强力霉素控制的沉默子tTS与第一个ShRNA沉默盒的启动子元件之间。

5.根据权利要求4所述的ShRNA载体，其特征在于，所述ShRNA载体为质粒载体，还含有E.coli的复制子和ColE1和氨苄抗性基因Ampr。

6.根据权利要求5所述的ShRNA载体，其特征在于，还含有G418抗性基因和强启动子SV40；强启动子SV40设置在G418抗性基因的上游，控制G418抗性基因的表达。

7.根据权利要求1-5任一项所述的ShRNA载体，其特征在于，所述ShRNA载体适用于人类细胞或组织、各种非人哺乳类动物细胞或组织以及转基因动物。

8.一种使用权利要求1所述的ShRNA载体高效协同基因沉默的方法，其特征在于，根据需要沉默的靶基因设计三个不同的ShRNA，构建装载有所述三个不同ShRNA的如权利要求1所述的ShRNA载体，将所述ShRNA载体转染到受体细胞后，由三个不同的ShRNA协同沉默靶基因。

说明书

一种多ShRNA高效协同沉默基因方法及载体

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种多ShRNA高效协同沉默基因方法及载体。

[0002] 背景技术

[0003] 基因打靶是揭示基因功能分析和病理机制的强有力的工具，然而通过同源重组的基因打靶正确交换的频率比DNA的随机整合效率低1000倍以上，因此在很多情况下甚至需要筛选成千上万个克隆才能鉴定出一个发生正确交换的重组子。尽管近年来，发展出了很多改良的基因打靶方法，包括正负标志物的选择、启动子捕获、病毒转运，但这些方法不总能高效地获得重组子最近也有人发现用小鼠的精原干细胞来替代胚胎干细胞来做基因打靶，通过同源重组获得敲除occludin基因重组子能达到1.7％。另外，设计特异性识别某一特定基因的锌指核酸酶(ZFN)采用体外特异有时能达到25-50％以上的频率，但这些改良的方法是否设用于其他基因、其他细胞以及其他种属还有待于进一步证实。 [0004] 通过ShRNA的方法来实现基因沉默是另一个选择，然而常规的ShRNA的基因沉默效率与传统的基因敲除相比效率往往不高。

[0005] 因此，现有技术还有待于改进和发展。

[0006] 发明内容

[0007] 鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种多ShRNA高效协同沉默基因方法及载体，旨在解决现有技术中存在的问题。

[0008] 本发明的技术方案如下：

[0009] 一种用于多ShRNA介导协同基因沉默的ShRNA载体，其中，ShRNA载体上装载有一段含有多个ShRNA沉默盒的DNA序列；所述ShRNA沉默盒是从多种不同的ShRNA中选择。

[0010] 所述的ShRNA载体，其中，所述ShRNA载体上装载有一段含有三个不同的ShRNA沉默盒的DNA序列。

[0011] 所述的ShRNA载体，其中，每个ShRNA沉默盒上游设置有一个强力霉素应答的启动子元件PDRE；所述强力霉素应答的启动子元件PDRE包括一启动子序列、一强力霉素应答元件；所述启动子序列与强力霉素应答元件、ShRNA沉默盒依次相连。

[0012] 所述的ShRNA载体，其中，所述启动子元件还包括一间隔序列，设置在一强力霉素应答元件与ShRNA沉默盒之间。

[0013] 所述的ShRNA载体，其中，所述三个不同的ShRNA沉默盒的强力霉素应答的启动 子元件PDRE序列如SEQ ID NO.1-3所示。

[0014] 所述的ShRNA载体，其中，所述装载有ShRNA沉默盒的DNA序列上游还设置有一受强力霉素控制的沉默子tTS、一强启动子，所述强启动子用于组成型表达沉默子tTS，设置在沉默子tTS的上游。

[0015] 所述的ShRNA载体，其中，所述强启动子为CMV启动子。

[0016] 所述的ShRNA载体，其中，所述强启动子为CAG启动子或UBC启动子。 [0017] 所述的ShRNA载体，其中，所述CMV启动子的上游和受强力霉素控制的沉默子tTS的下游还分别设置有多聚PolyA加尾信号；所述多聚PolyA加尾信号分别用TKpA和bglobpA，TKpA设置在CMV强启动子的上游，bglobpA设置在受强力霉素控制的沉默子tTS与第一个ShRNA沉默盒的启动子元件之间。

[0018] 所述的ShRNA载体，其中，所述ShRNA载体为质粒载体，还含有E.coli的复制子和rColE1和氨苄抗性基因Amp。

[0019] 所述的ShRNA载体，其中，还含有G418抗性基因和强启动子SV40；强启动子SV40设置在G418抗性基因的上游，控制G418抗性基因的表达。

[0020] 所述的ShRNA载体，其中，所述ShRNA载体适用于人类细胞或组织、各种哺乳类动物细胞或组织以及转基因动物。

[0021] 一种使用上述的ShRNA载体高效协同基因沉默的方法，其中，根据需要沉默的靶基因设计多个不同的ShRNA，从中选择不同的ShRNA，构建一个装载有一段含有多个ShRNA沉默盒的DNA序列的ShRNA载体，将所述ShRNA载体转染到受体细胞后，多个ShRNA协同沉默靶基因。

[0022] 有益效果：本发明提供了一项可诱导性的多ShRNA协同干扰基因表达的ShRNA载体，ShRNA经药物诱导表达后，在靶基因的表达量降至检查不到水平，而且本发明还具有广泛的适用性，可取代传统的基因敲除技术来实现基因打靶。

[0023] 附图说明

[0024] 图1为本发明实施例1中多个ShRNA高效协同基因沉默的质粒pPolyShRNA的调控元件排列。

[0025] 图2为本发明实施例3中HEK293转基因细胞株中沉默hSIRT1基因的构建体的结构示意图。

[0026] 图3为本发明实施例3中加与不加强力霉素(Dox)处理后，HEK293细胞或其转基 因细胞株(HEK-hSIRT1-ShRNA123，HEK-hSIRT1-ShRNA1，HEK-hSIRT1-ShRNA2，HEK-hSIRT1-ShRNA3)中hSIRT1 mRNA水平(平均值±SEM)。

[0027] 图4为本发明实施例3中加与不加强力霉素(Dox)处理后HEK293细胞或其转 基 因 细 胞株 (HEK-hSIRT1-ShRNA123，HEK-hSIRT1-ShRNA1，HEK-hSIRT1-ShRNA2，HEK-hSIRT1-ShRNA3)中检测hSIRT1蛋白水平的免疫印迹试验结果图。

[0028] 图5为本发明实施例3中HEK293转基因细胞株中沉默hSIRT1基因的构建体的结构示意图。

[0029] 图6为本发明实施例3中加与不加强力霉素(Dox)处理后，HEK293细胞或其转基因细胞株(HEK-hSIRT1-3ShRNA1，HEK-hSIRT1-3ShRNA2，HEK-hSIRT1-ShRNA3)中hSIRT1 mRNA水平(平均值±SEM)。

[0030] 图7为本发明实施例3中加与不加强力霉素(Dox)处理后HEK293细胞或其转基因细胞株(HEK-hSIRT1-3ShRNA1，HEK-hSIRT1-3ShRNA2，HEK-hSIRT1-3ShRNA3)中检测hSIRT1蛋白水平的免疫印迹试验结果图。

[0031] [0030]图8本发明实施例5中mESC细胞转基因细胞株中沉默mSirt1基因的构建体的结构示意图。

[0032] 图9本发明实施例5中加与不加强力霉素(Dox)处理后，mESC细胞或其转基因细胞株(mESC-S1，mESC-S2，mESC-S3)中hSIRT1 mRNA水平(平均值±SEM)。

[0033] 图10本发明实施例5中加与不加强力霉素(Dox)处理后mESC细胞或其转基因细胞株(mESC-S1，mESC-S2，mESC-S3)中检测mSirt1蛋白水平的免疫印迹试验结果图。 [0034] 图11本发明实施例5中mESC细胞或其转基因细胞株(mESC-S1，mESC-S2，mESC-S3)中检测mSirt1蛋白分布的免疫荧光试验结果图；

[0035] 图12本发明实施例7中小鼠胚胎细胞分化而来的感光细胞转基因细胞株沉默hRHO基因的构建体的结构示意图。

[0036] 图13本发明实施例6中小鼠胚胎干细胞向感光细胞分化的流程示意图。 [0037] 图14本发明实施例7中加与不加强力霉素(Dox)处理后，由小鼠胚胎细胞分化而来的感光细胞(mESC-RC)或其转基因细胞株(mESC-RC1，mESC-RC2，mESC-RC3)中mRhomRNA水平(平均值±SEM)。

[0038] 图15本发明实施例7中加与不加强力霉素(Dox)处理后，由小鼠胚胎细胞分化而来的感光细胞(mESC-RC)或其转基因细胞株(mESC-RC1，mESC-RC2，mESC-RC3)中检测 hRHO蛋白水平的免疫印迹试验结果图。

[0039] 图16本发明实施例7中加与不加强力霉素(Dox)处理后，由小鼠胚胎细胞分化而来的感光细胞(mESC-RC)或其转基因细胞株(mESC-RC1，mESC-RC2，mESC-RC3)中检测hRHO蛋白分布的免疫染色试验结果图。

[0040] 图17本发明实施例9中转基因动物视网膜特异蛋白的免疫印迹检测试验结果图，样品为强力霉素(dox)处理2周后的视网膜蛋白抽提物。

[0041] 图18本发明实施例9中免疫荧光法检测rhodopsin的分布图，样品为强力霉素(dox)处理2周后的视网膜冰冻切片。

[0042] 图19本发明实施例9中强力霉素(Dox)处理2周(2w)、一个月(1m)、2个月(2m)后的视网膜形态学分析(HE染色)。

具体实施方式

[0043] 本发明提供一种多ShRNA高效协同沉默基因方法及载体，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0044] 本发明用装载有三个或多个ShRNA沉默盒的DNA序列(如：PDRE1-XhoI-Cistron1-AgeI-PDRE2-SalI-Cistron2-MluI-PDRE3-PstI-Cistron3-HindIII) 替 换pSingle-tTS-ShRNA载体(Clontech)中的Tet-U6-MCS区段，获得的构建体pPolyShRNA在强力霉素存在的情况下可以同时启动多个ShRNA的协同表达。强力霉素应答启动子元件(PDRE1，PDRE2，PDRE3)以及用于构建载体的各种寡聚多核苷酸见SEQ ID NO.1-44。强力霉素应答启动子元件(PDRE1，PDRE2，PDRE3)中依次包括了启动子序列、强力霉素应答元件DRE和间隔序列，序列如SEQ ID NO.1-3所示。SEQ ID NO.4-44为实施例中各种用于沉默靶基因所设计的ShRNA序列。

[0045] 四环素应答元件(Tetracycline-responsible elements，TREs)或其修饰的强力霉素应答元件(Doxycycline-responsive elements，DREs)广泛用于基因表达可控性的诱导系统的构建。受四环素控制的沉默子(Tetracycline-controlled silencer，tTS)是一个融合了转录阻遏因子kid-1的KRAB-AB结构域的蛋白，在强力霉素不存在的情况下tTS能紧密结合RNA多聚酶的结合位点，抑制基因的表达，因此本底的表达很低。从强力霉素(Doxycyline，Dox)存在的情况下，在tTS从RNA多聚酶的结合位点上解离下来，启动下游基因的表达。本发明利用这些调控元件，构建了一个多ShRNA高效协同沉默基因表达的质粒pPolyShRNA【Zhu，Z.et al.，Use of the tetracycline-controlled transcriptional silencer(tTS)to eliminate transgene leak in inducible overexpression transgenic mice.J Biol Chem 276(27)，25222(2001)】。在本发明中用CMV强启动子组成型表达tTS，为克服单个ShRNA可能效率低下的问题，将多个ShRNA的诱导沉默盒串联在一个载体上，每个ShRNA诱导沉默盒均由自己的强力霉素应答元件(Doxycycline-responsive element，DRE)控制。为排除每个启动子相互干扰影响RNA多聚酶的结合，DRE与DRE之间插入了100-200nt的间隔子(spacer)。在这个表达系统中，强力霉素的添加能同时启动多个ShRNA的表达。

[0046] 本发明实施例中使用强力霉素诱导系统用于本发明的ShRNA的表达，其他类似的诱导系统也能用于本发明的ShRNA的表达，不仅可以是强力霉素应答元件，也可以是其他应答元件。

[0047] 本发明实施例中使用的ShRNA含有69个左右的核苷酸，所用的ShRNA种子序列长度为21个nt，所用的linker序列是TTCAAGAGA。常用的ShRNA种子序列长度有19个、21个、23个、29个nt，ShRNA会根据种子的不同，linker的不同其序列的长度也会不同，但是其他序列长度的ShRNA也能用于高效协同沉默靶基因。

[0048] 本发明实施例中的ShRNA载体上用于表达ShRNA的强启动子为CMV启动子，用于表达ShRNA的强启动子还可以为CAG，UBC等，或其修饰的启动子。

[0049] 本发明ShRNA载体的构建操作按标准的克隆方法进行。质粒的制备采用QIAprepSpin Miniprep试剂盒(Qiagen)。HEK293细胞、小鼠胚胎干细胞(mESC)(129/SV系)用于构建转基因的稳定表达细胞株。培养小鼠胚胎干细胞、DNA转染以及逐步分化试验是参考发表的文献进行【Thomson，J.A.et al.，Embryonic stem cell lines derived from humanblastocysts.Science 282(5391)，1145(1998)；Wu，H.et al.，Integrative genomic and functionalanalyses reveal neuronal subtype differentiation bias in human embryonic stem cell lines.Proc NatlAcad Sci USA 104(34)，13821(2007)；Wernig，M.et al.，In vitro reprogramming of fibroblastsinto a pluripotent ES-cell-like state.Nature 448(7151)，318(2007)；Zwaka，T.P.and Thomson，J.A.，Homologous recombination in human embryonic stem cells.Nat Biotechnol 21(3)，319(2003)；Watanabe，K.et al.，Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonicstem cells.Nat Neurosci 8(3)，288(2005)；Ikeda，H.et al.，Generation of Rx+/Pax6+neural retinalprecursors from embryonic stem cells.Proc Natl Acad Sci USA 102(32)，11331(2005)】。。按文献所述提取总RNA的分离并逆转录成cDNA，并用qRT-PCR对mRNA的丰度(mRNAaboundance)进行定量【Gazin，C.et al.，An elaborate pathway required for Ras-mediatedepigenetic silencing.Nature 449(7165)，
1073(2007)】，用免疫印迹和免疫荧光测定蛋白水平和其在细胞内的分布。冰冻的组织切片用4％福尔马林于室温固定10分钟。为对转基因小鼠的 视网膜的形态进行评估，我们制备石蜡组织切片并进行HE染色。

[0050] 以下实施例中，定量实时PCR (qRT-PCR)用的试剂为Platinum SYBR Green qPCRSuperMix UDG with Rox(Invitrogen)。同时检测人肌动蛋白(hActin)和小鼠肌动蛋白(mActin)作为内参。用于检测hSIRT1，mSirt1，hRHO，mRho的引物参见SEQ ID NO.45-57。 [0051] 免疫荧光染色用于检测细胞或组织中蛋白的分布，免疫印迹用于蛋白的定量。用到的一抗及其工作稀释度如下：rabbit anti-hSIRT1(1∶500-2000，#1104-1，Epitomics)，rabbit anti-Sirt1(1 ∶ 500-1000，#09-845，Millipore)，mouse anti-rhodopsin(1 ∶ 500-2000，#sc-57433，Santa Cruz)，rabbit anti-GNAT1(1 ∶ 200-1000，#sc-389，Santa Cruz)，goat anti-hCNGA1(1 ∶ 100-1000，#sc-13690，Santa Cruz)，goat anti-mCNGA1(1∶500-1000，#sc-13694，Santa Cruz)，goat anti-PDC(1∶500-1000，#sc-18413，Santa Cruz)，anti-PDE6b(1∶200-1000，#sc-30717，Santa Cruz)，mouse anti-actin(1∶2,000-10,000，#A5228，Sigma-Aldrich)。 二 抗？？为偶联有荧光标记或那根过氧化物酶的抗体，分别为：Alexa Fluor dyes(594or 488)(1 ∶ 500，Invitrogen)；Anti-mouse IgG peroxidaseconjugate(1 ∶ 50,000，#a2304，Sigma-Aldrich)，goat anti-rabbit IgG peroxidase conjugate(1∶50,000，#a9169，Sigma-Aldrich)及rabbit anti-goat IgG peroxidase conjugate(1∶80,000，#a5420，Sigma-Aldrich)。

[0052] 实施例1：多ShRNA基因沉默DNA构建体的制备。

[0053] 用装载有三个或多个ShRNA沉默盒的DNA序列(PDRE1-XhoI-ShRNA1-AgeI-PDRE2-SalI-ShRNA 2-MluI-PDRE3-PstI-ShRNA 3-HindIII)替 换pSingle-tTS-ShRNA 载 体(Clontech)中的Tet-U6-MCS区段，获得的构建体pPolyShRNA。如图1所示，多个ShRNA高效协同基因沉默的质粒pPolyShRNA的调控元件排列。多个ShRNA沉默盒放在同一载体上，其表达受强力霉素应答元件(DRE)调控。在有强力霉素(Doxycycline，Dox)时，才启动ShRNA的表达。G418抗性基因受强启动子SV40(PSV40)控制。tTS受CMV启动子(PCMV)调节，多聚PolyA分别用TKpA和bglobpA，为在E.coli中制备质粒，质粒还含有E.coli的复r制子ColE1和氨苄抗性基因(Amp)。

[0054] 实施例2：HEK293细胞的培养及其转基因细胞系的构建。

[0055] 本实施例培养HEK293细胞用的是在添加有10％胎牛血清(FBS)的培养基。另外，为制备沉默hSIRT1基因的转基因细胞系，本实施例将打靶质粒经BsaI酶处理线性化后，用磷酸钙的方法做瞬时转染。为了选择沉默hSIRT1基因表达的转基因细胞系，在培养基中添加G418，使其终浓度为400mg/ml。随机挑选数个G418抗性的转基因细胞，经强力霉素处理后进行进一步的qRT-PCR、免疫印迹以及免疫荧光试验。

[0056] 实施例3：在HEK293细胞中干扰hSIRT1基因表达的沉默效率。

[0057] 为检测该系统的基因沉默效率，本发明利用HEK293细胞系研究了三个不同ShRNA沉默盒(hSIRT1-ShRNA1，hSIRT1-ShRNA2，hSIRT1-ShRNA3)装载在同一载体上针对hSIRT1基因(GenBank accession#，NM_001142498)的沉默效应。为研究每个ShRNA的沉默效率，同时也构建了将每个ShRNA沉默盒单独只放一个拷贝在一个载体的质粒。质粒线性化后转染HEK293细胞，G418选择整合有ShRNA沉默盒的阳性细胞，具体步骤参见实施例2。 [0058] 如图2所示，HEK293转基因细胞株HEK-hSIRT1-ShRNA123中含有在同一载体上装有三个不同ShRNA(hSIRT1-ShRNA1，hSIRT1-ShRNA2，hSIRT1-ShRNA3)的沉默hSIRT1基因的构建体a1，每个ShRNA一个拷贝；HEK293转基因细胞株HEK-hSIRT1-ShRNA1中为装有一个hSIRT1-ShRNA1拷贝的沉默hSIRT1基因的构建体b1；HEK293转基因细胞株HEK-hSIRT1-ShRNA2中为装有一个hSIRT1-ShRNA2拷贝的沉默hSIRT1基因的构建体c1；HEK293转基因细胞株HEK-hSIRT1-ShRNA3中含有装有一个hSIRT1-ShRNA3拷贝的沉默hSIRT1基因的构建体d1。

[0059] 如图3所示，实时定量PCR(qRT-PCR)的结果表明，强力霉素诱导后，每个ShRNA沉默盒的基因沉默效率能达到88％-93％。当这三个不同ShRNA沉默盒放在同一载体上时，沉默效率高达98％以上，表达不同的沉默盒有明显的叠加效应。如图4所示(Control：正常HEK293细胞对照)，免疫印迹实验结果表明，当使用三个相同的ShRNA沉默盒时仍有残余的hSIRT1蛋白，其表达仍然有10-30％，但当三个不同的ShRNA沉默盒在同一载体上时，hSIRT1蛋白水平则降到检测不到的程度，说明这些ShRNA分子不仅可以降解hSIRT1 mRNA，也可以通过结合残余的mRNA分子来阻断其继续作为翻译模板的作用。

[0060] 本实施例中也构建了将在同一载体上将同一ShRNA放三个拷贝的质粒，检测多个相同ShRNA拷贝在HEK293细胞中对hSIRT1基因的沉默效率。如图5所示，HEK293转基因细胞株HEK-hSIRT1-3ShRNA1中含有在同一载体上装有三个相同hSIRT1-ShRNA1拷贝的沉默hSIRT1基因的构建体a2；HEK293转基因细胞株HEK-hSIRT1-3ShRNA2中含有在同一载体上装有三个相同hSIRT1-ShRNA2拷贝的沉默hSIRT1基因的构建体b2；HEK293转基因细胞株HEK-hSIRT1-ShRNA3中含有在同一载体上装有三个相同hSIRT1-ShRNA3拷贝的沉默hSIRT1基因的构建体c2。

[0061] 如图6和图7所示，qRT-PCR和免疫印迹实验表明，简单地增加单个ShRNA的拷贝数不能明显地进一步线性提升靶基因的沉默效率，提示既增加ShRNA的拷贝数又增加ShRNA的多样性比单独只增加每个ShRNA的拷贝数更有效。图7中，Control：正常 HEK293细胞对照。

[0062] [0069]实施例4：小鼠胚胎干细胞及其转基因细胞系的构建的培养。 [0063] 本发明采用小鼠胚胎干细胞(mESC)属129/SV系。培养小鼠胚胎干细胞时用到的饲养细胞是经辐射处理过的来源于SNL小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)。用的DMEM培养基添加有15％FBS，10ng/ml LIF，1mM Glutamine，1％nonessential amino acids(NEAA)，1％penicillin/streptomycin，0.1mM 2-mercaptoenthanol。培养基每两天更换一次，而LIF则需每天添加。为建立整合有沉默盒的细胞系，用蛋白酶将细胞克隆消化单细胞(0.25％胰蛋白酶，1mM EDTA，37℃，7分钟)。用电穿孔法将线性化的DNA构建体导入细胞。在用电穿孔导入DNA构建体之前，细胞用培养基淋洗一遍并重新悬浮在新的培养基中，0.5ml中的细胞数量约为1.5-3.0x107，然后再接种到铺有新的饲养细胞培养皿中。电穿孔是在室温下进行，线性化DNA用量约40mg，脉冲电压为250V，电容为500mF。导入DNA构建体培养48小时后，再添加G418(400mg/ml)选择整合有沉默盒的转基因细胞。7-10天后选择G418抗性的克隆经强力霉素处理后进行qRT-PCR、免疫印迹、免疫荧光和/或建立转基因小鼠的试验。 [0064] 实施例5：在小鼠胚胎干细胞中干扰mSirt1基因表达的沉默效率。 [0065] 为验证这种基因沉默策略是否适用于其他类型的细胞，本发明构建了类似的沉默小鼠Sirt1(mSirt1)基因(GenBank accession#，NM_019812)的载体，是在同一载体上装有三个不同ShRNA(mSirt1-ShRNA1，mSirt1-ShRNA2，mSirt1-ShRNA3)沉默mSirt1基因的构建体，每个ShRNA一个拷贝，如图8所示。质粒线性化后转染mESC细胞，G418选择整合有ShRNA沉默盒的阳性细胞，具体步骤参见实施例4。随机挑选三组整合有ShRNA沉默盒的转基因细胞株mESC-S1，mESC-S2，mESC-S3进行检测。

[0066] 加与不加强力霉素(Dox)处理后，mESC细胞或其转基因细胞株(mESC-S1，mESC-S2，mESC-S3)中hSIRT1 mRNA水平(平均值±SEM)、检测mSirt1蛋白水平的免疫印迹试验、检测mSirt1蛋白分布的免疫荧光试验的结果如图9、图10和图11所示，qRT-PCR、免疫印迹及免疫荧光实验均表明mSirt1的表达在这些转基因细胞系中均有效被抑制。图11中Control：正常小鼠胚胎干细胞(mESC)对照。

[0067] 实施例6：小鼠胚胎干细胞向感光受体细胞的分化。

[0068] 小鼠胚胎干细胞的分化按文献所述逐步进行，分化过程是按Oskada等人的方法分步进行【Osakada，F.et al.，Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse， monkey and human embryonic stem cells.Nat Biotechnol26(2)，215(2008)】。在图13所示的时间于分化培养基(G-MEM，5％KSR (GIBCO)，0.1mM NEAA，
1mM pyruvate，0.1mM 2-mercaptoethanol)中加入DKK1(100ng/ml，R&D systems)，Lefty A(500ng/ml，R&Dsystems)，5％FBS(GIBCO)和Activin-A(10ng/ml，R&D systems)。细胞用胰蛋白酶消化后重新悬浮于含有10％FBS的经过包被的培养基的培养皿中。包被用液为poly-D-lysine(BD)/laminin(BD)/fibronectin。10天后换成无FBS的培养基并添加
10mM g-secretase抑制物(N-[N-(3，5-difluorophenacetyl)-Lalanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester)。为将其分化成感光细胞，在如图13所示的时间点换成视网膜细胞培养基(66％-E-MEM-HEPES(Sigma)，33％HBSS(GIBCO)，1％FBS，N2(GIBCO)，5.75mg/ml glucose，200mM L-glutamine，50ng/ml aFGF(R&D systems)，10ng/ml bFGF(R&D Systems)，
1mM taurine(Sigma)，3nM Shh(R&D systems)，500nM retinoic acid(RA)(Sigma)。在整个过程中，细胞分成两组，一组一直添加2mg/ml的强力霉素，另一组不加强力霉素。qRT-PCR、免疫印迹以及免疫荧光试验用于分析rhodopsin的表达和分布。

[0069] 实施例7：在小鼠胚胎干细胞分化而来的光受体细胞中干扰rhodopsin基因表达的沉默效率。

[0070] 为进一步验证这种基因沉默策略适用的普遍性，本发明也测定了由小鼠胚胎干细胞分化过来的子代细胞中对特定基因表达的沉默效率。本实施例中构建了类似的沉默小鼠rhodopsin基因(mRho)(GenBank accession#，NM 145383)的ShRNA载体，是在同一载体上装有三个不同ShRNA(mRho-ShRNA1，mRho-ShRNA2，mRho-ShRNA3)沉默mRho基因的构建体，每个ShRNA一个拷贝，其构成如图12所示。

[0071] 将上述构建体线性化后转染细胞小鼠胚胎干细胞(mESC)，G418选择整合有ShRNA沉默盒的阳性细胞做体外分化成视网膜杆状细胞的试验，具体步骤如实施例6所示。随机挑选含有ShRNA沉默盒的三组转基因细胞株mESC-RC1，mESC-RC2，mESC-RC3进行检测。 [0072] 在加与不加强力霉素(Dox)处理后，由小鼠胚胎细胞分化而来的感光细胞(mESC-RC)或其转基因细胞株(mESC-RC1，mESC-RC2，mESC-RC3)中mRho mRNA水平、检测hRHO蛋白水平的免疫印迹试验、检测hRHO蛋白分布的免疫染色试验结果分别如图14、图15和图16所示，qRT-PCR结果表明经强力霉素处理后rhodopsin的mRNA丰度水平降低了
91％以上；免疫印迹和免疫荧光试验均证明rhodopsin蛋白降低到检测不到的水平。图15中，Control：正常视网膜对照。

[0073] 实施例8：转基因小鼠的构建。

[0074] 转基因雄性小鼠胚胎干细胞注射到C57BL/6的囊胚后产生的嵌合体小鼠与雌性C57BL/6小鼠交配获得的子代小鼠用PCR方法进行基因型分析。基因型分析中用于检查整合有沉默盒的引物N5和N3与G418抗性基因的部分学列匹配(N5：5’-gctgctctgatgccgccgtgttc；N3：5’-gatgtttcgc ttggtggtcgaatg)。注射小鼠时强力霉素的剂量为2mg/g体重。qRT-PCR、免疫印迹以及免疫荧光试验用于分析rhodopsin的表达和分布。石蜡切片经HE染色后用于评估视网膜的感光细胞数量已经视网膜的形态结构。 [0075] 实施例9：在转基因小鼠视网膜中干扰rhodopsin基因表达的沉默效率。 [0076] 为进一步验证该基因沉默策略是否也适用于转基因动物，本发明利用以上获得的一个整合有rhodopsin基因沉默盒的小鼠胚胎干细胞建立了转基因小鼠模型(具体步骤参见实施例8)。实验中结果表明，在没有强力霉素的情况下，转基因小鼠的rhodopsin能正常表达，其视网膜也能正常发育。在强力霉素存在的情况下，rhodopsin的表达显著性地受到抑制并导致视网膜退化。免疫印迹表明，经强力霉素处理两周后，rhodopsin蛋白降低到检测不到的水平而其他多个视网膜特异的标志蛋白(GNAT1、PDC、PDE6b、CNGA1、GRK1及RD12)在视网膜杆状细胞中没有明显退化前基本不受影响，而rhodopsin蛋白两周后降低检测不到的水平，如图17和图18所示。图17中，Control：正视网膜对照。图18和图19中，WT：
正常视网膜；RhoKD：rhodopsin基因沉默的转基因视网膜。随着强力霉素处理继续，感光受体细胞退化越来越明显。免疫荧光试验表明，在没有经强力霉素处理的情况下，rhodopsin蛋白特异性地高度富集在外节视盘。如图19所示，组织形态学分析表明，对正常小鼠强力霉素本身不会影响感光受体细胞的数量和结构；而对于转基因小鼠，若不经强力霉素处理，其光受体细胞的数量和结构与正常小鼠相似，无明显的缺陷；在强力霉素处理两周之后只是视网膜的外节(OS)长度有些轻微变短；在强力霉素处理1个月后，尽管光受体细胞在数量上能有3/4以上的细胞还存活，但视网膜的外节明显变短；在强力霉素处理2个月后，只有不到两排光受体细胞还存活，而视网膜外节则短得近乎可以忽略。这些表型变化，与传统的方法构建的rhodopsin基因敲除动物或其突变体的转基因动物相一致。

[0077] 从上述实施例中可以看到，就靶蛋白的表达而言，本发明设计的强力霉素控制下的多ShRNA协同沉默基因表达系统在小鼠、人等多种哺乳类细胞或器官中均能实现接近100％沉默效率，表明本发明ShRNA表达载体具有广泛的适用性，适用于人类细胞或组织、各种哺乳类动物细胞或组织、其他潜在种属的细胞或组织以及转基因动物。 [0078] 应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可 以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。