一种鉴定芝麻茎点枯病和枯萎病病原菌致病性的方法

摘要

本发明涉及一种鉴定芝麻茎点枯病和枯萎病病原菌致病性的方法，包括以下步骤：(1)接种用菌株的培养；(2)种子预处理：选用健康饱满的芝麻种子，灭菌备用；(3)接种：在培养瓶中加入灭菌培养基，铺放无菌滤纸，添加无菌水，并赶出气泡，然后沿滤纸边缘均匀摆放芝麻无菌种子，再在滤纸中央接种菌饼，密闭黑暗培养；(4)致病性调查：并根据发病程度将发病情况划分为不同的发病等级；(5)致病性评价：致病指数＝∑(发病等级×相应发病芽数)/总芽数。该方法简便易行，所需设备较少，结果可靠，能较为准确地反映不同芝麻茎点枯病病原菌和枯萎病病原菌的致病性。

权利要求

1.一种鉴定芝麻茎点枯病和枯萎病病原菌致病性的方法，其特征在于：包括以下步骤： （1）接种用菌株的培养：在含经过灭菌的PDA培养基的培养皿上接种菜豆壳球孢菌菌丝或尖孢镰刀菌芝麻专化型菌菌丝，密封黑暗培养至形成菌落，然后将其制得菌饼，备用；

（2）种子预处理：选用健康饱满的芝麻种子，灭菌备用；

（3）接种：在培养瓶中加入灭菌培养基，铺放无菌滤纸，添加无菌水，并赶出气泡，然后沿滤纸边缘均匀摆放步骤（2）中经过灭菌处理的芝麻无菌种子，再在滤纸中央接种步骤(1)培养制得的菌饼，密闭黑暗培养；

（4）致病性调查：调查培养瓶中各个发芽种子的发病情况，并根据发病程度将发病情况划分为不同的发病等级：其中，使用菜豆壳球孢菌时，其根据如下分级标准将发病等级划分为6级，其中感染茎点枯病的芝麻芽或根的褐色部位多质地湿润：

0级：无病菌侵染症状；

1级：根系变褐范围≤1/3；

2级：根系变褐范围为1/3～2/3之间；

3级：根系变褐范围为2/3至整个根系变褐；

4级：根系全部变褐，根颈部感病且芽有1/2及1/2以下变褐；

5级：根系全部变褐，根颈部感病且芽有1/2以上变褐，甚至出现腐烂现象；

使用尖孢镰刀菌芝麻专化型菌时，其根据如下分级标准将发病等级划分为6级，其中感染枯萎病的芝麻芽或根的褐色部位多质地干燥：

0级：无病菌侵染症状；

1级：根系变褐范围≤1/3；

2级：根系变褐范围为1/3～2/3之间；

3级：根系变褐范围为2/3至整个根系变褐；

4级：根系全部变褐，根颈部感病且芽有1/2及1/2以下变褐；

5级：根系全部变褐，根颈部感病且芽有1/2以上变褐，甚至出现腐烂现象；

该发病等级数值越大，发病程度越严重；

（5）致病性评价：计算每个菌株的致病指数，致病指数的计算公式如下，该致病指数数值越大表明该病原菌的致病性越强：致病指数=∑（发病等级×相应发病芽数）/总芽数。

2.根据权利要求1所述的鉴定芝麻茎点枯病和枯萎病病原菌致病性的方法，其特征在于：所述步骤（1）的具体步骤为：在含经过灭菌的PDA培养基的培养皿上接种菜豆壳球孢菌菌丝或尖孢镰刀菌芝麻专化型菌菌丝，用Parafilm膜封口，然后于生化培养箱中28～30℃黑暗培养5～7d，所述PDA培养基的组成为：每升培养基中含200g去皮马铃薯滤液、葡萄糖15 g、琼脂12 g，所述PDA培养基的灭菌方式为高温高压灭菌。

3.根据权利要求1所述的鉴定芝麻茎点枯病和枯萎病病原菌致病性的方法，其特征在于：步骤（2）中所述种子灭菌的方式为将种子置于重量百分比浓度为0.1%的升汞水溶液中浸泡4～5min，并在期间摇晃数次。

4.根据权利要求1所述的鉴定芝麻茎点枯病和枯萎病病原菌致病性的方法，其特征在于：所述步骤（3）中的培养基为2%琼脂（w/v），所述培养基的灭菌方式为高温高压灭菌。

5.根据权利要求1所述的鉴定芝麻茎点枯病和枯萎病病原菌致病性的方法，其特征在于：步骤（1）使用菜豆壳球孢菌时，步骤（3）所述的接种培养为28～30℃密封黑暗培养4～

5d；步骤（1）使用尖孢镰刀菌芝麻专化型菌时，步骤（3）所述的接种培养为28～30℃密封黑暗培养8～10d。

6.根据权利要求1所述的鉴定芝麻茎点枯病和枯萎病病原菌致病性的方法，其特征在于：所述步骤（3）的具体步骤为：在直径为60mm～70mm的培养瓶中，加入灭菌培养基，铺放无菌滤纸，添加无菌水，并赶出气泡，然后沿滤纸边缘均匀摆放20～30枚步骤（2）中经过灭菌处理的无菌芝麻种子，再在滤纸中央接种直径为0.5cm～1cm的步骤（1）培养得到的菌饼，密闭黑暗培养。

7.根据权利要求1所述的鉴定芝麻茎点枯病和枯萎病病原菌致病性的方法，其特征在于：在进行步骤（4）之前，将步骤（3）重复进行至少2次。

8.根据权利要求7所述的鉴定芝麻茎点枯病和枯萎病病原菌致病性的方法，其特征在于：所述致病指数由每次实验的致病指数平均而得。

说明书

一种鉴定芝麻茎点枯病和枯萎病病原菌致病性的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种鉴定芝麻茎点枯病和枯萎病病原菌致病性的方法。

背景技术

[0002] 芝麻是我国四大重要的油料作物之一，种植分布广泛，其中黄淮和长江中下游地区的芝麻种植面积较为集中，占全国芝麻面积的70％。芝麻的生育期约90天，属喜温作物，一般生长在6～8月份，此时，芝麻主要产区多处在高温多雨季节，而高温高湿易诱发芝麻茎点枯病和芝麻枯萎病。

[0003] 芝麻茎点枯病又称茎腐病、炭腐病，其病原菌为菜豆壳球孢(Macrophomina phaseoli(Maubl.)Ashby.)，属半知菌亚门真菌(Dinakaran et al.2001；EI-Fiki at al.，2004；Saharan，1989；Solankiet al.，2006)。该病原菌寄主范围广，可侵染75个科的500多种植物(Dhingra和Sinclair，1978)，除芝麻外，其可侵染的植物尚有麻类、豆类、苜蓿类、瓜类、向日葵、烟草、番茄、茄子、辣椒、甘蔗、高粱、玉米、茶、咖啡、椰子和香蕉等。芝麻茎点枯病常年大面积发生，是造成我国芝麻减产的主要病害种类之一。该病病原菌以菌核及分生孢子器在种子、土壤及病株残体上越冬。初次侵染源以菌核为主，田间分生孢子借雨水和气流传播，进行多次再侵染。芝麻苗期及盛花期最易感病。病菌发育最适温度为25～
30℃。苗期染病则幼苗根部变褐，地上部萎蔫枯死，幼茎上密生黑色小点。开花结果期染病则从根部开始发病，后向茎扩展，有时从叶柄基部侵入后蔓延至茎部。根部染病，主根、支根变褐，剥开皮层可见布满黑色小菌核，致根部枯死。茎部染病多发生在中下部，初呈黄褐色水浸状，后扩展很快绕茎一周，中心有银灰色光泽，其上密生黑色小粒点，表皮下及髓部产生大量小菌核，茎秆中空易折断(王国清等，2005；潘正安等，2008)。

[0004] 芝麻枯萎病病原为尖孢镰刀菌芝麻专化型Fusarium oxysporum Schl.f.sp.sesami(Zap.)Cast，异名为F.vasinfectum Atk.var.sesami Zapr.，属半知菌亚门镰孢属真菌。芝麻枯萎病是一种系统侵染的维管束病害，从苗期到成株期均可发病，但以成株期发病为主。幼苗感病常引起根腐，病株猝倒枯死。成株期感病则病株叶片自下而上逐渐变黄萎蔫，最后变褐枯死脱落，拨出病株可见根部、茎基部变褐腐烂，有的病株仅半边枝叶萎蔫枯死，在病株茎秆一侧产生长条形褐色。潮湿时，在枯死病部产生粉红色黏质霉层(病菌分生孢子座和分生孢子)。剖茎检查，可见维管束初为红色，随着病情加重，变为红褐色至褐色。病株蒴果较小，种子瘦瘪，易提前炸裂。

[0005] 不同致病性的同一种病原菌对作物的危害能力不同，在一段时期或一定区域往往有一个该病原菌的优势小种或强致病性小种存在。在作物资源材料抗病性鉴定、抗病育种及病害防治过程中，准确鉴定特定病原菌的致病性，可以使芝麻抗茎点枯病或抗枯萎病育种工作有的放矢。

[0006] 目前，关于鉴定菜豆壳球孢菌致病性的方法并不统一，以田间或盆栽的活体植株或离体组织为接种对象的方法居多，如下胚轴接种法(朱振东等，2000)、切茎法(Pabon和Hartman，2006)、浸根法(Assigbetse et al.1994)、离体法(Prat et al.1998)，这些方法主要以病斑大小或病斑扩展速度评价病原菌的致病性，但植株培养涉及到田间或温室管理，周期较长且易受环境条件影响。另外还有一些方法以萌发种子为接种对象，用种子被侵染的严重程度评价病原菌的致病性，这种方法较为简便，而目前主要在种子比较大的物种上进行应用，如向日葵(Manici et al.，1995)、菜用豆(Reyes-Franco et al.，2006)等。芝麻茎点枯病和芝麻枯萎病致病性鉴定方法一般采用田间自然发病病圃结合人工接种(开花期喷洒孢子或菌核悬浮液，或在土壤里接种病麦粒)，调查不同芝麻材料的病情指数，但这种大田成株期鉴定方法由于需要在接种期间大面积田间保湿等，而田间大面积难以控制条件，且还易受到气候等外界环境因素干扰，而且土壤中除去这两种病原之外还含有其他多种土传病的病原菌，所以这种成株期大田接种鉴定方法不仅繁琐而且可靠性不高，周期长，而且也不可能实现多个病原菌的同时鉴定。因此摸索一套简易、可控、有效的鉴定芝麻茎点枯病和枯萎病原菌致病性的方法对于防治芝麻茎点枯和枯萎病病害、评价芝麻种植材料的抗病性、培育抗病性新品种、进行合理品种布局具有重要意义。

发明内容

[0007] 本发明所要解决的技术问题是提供一种鉴定芝麻茎点枯病和枯萎病病原菌致病性的方法。该方法简便易行，所需设备较少，结果可靠，能较为准确地反映不同芝麻茎点枯病病原菌和枯萎病病原菌的致病性。

[0008] 为解决本发明提出的技术问题，本发明采用的技术方案为：

[0009] 一种鉴定芝麻茎点枯病和枯萎病病原菌致病性的方法，其特征在于包括以下步骤：(除特别说明，下述所用器皿、滤纸等都经过高压灭菌处理)

[0010] (1)接种用菌株的培养：在含经过灭菌的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA(Potato dextroseagar)的培养皿上接种菜豆壳球孢菌菌丝或尖孢镰刀菌芝麻专化型菌菌丝，密封黑暗培养至形成菌落，然后将其制得菌饼，备用；

[0011] (2)种子预处理：选用健康饱满的芝麻种子，灭菌备用；

[0012] (3)接种：在培养瓶中加入灭菌培养基，铺放无菌滤纸，添加无菌水，并赶出气泡，然后沿滤纸边缘均匀摆放步骤(2)中经过灭菌处理的芝麻无菌种子，再在滤纸中央接种步骤(1)培养制得的菌饼，密闭黑暗培养；

[0013] (4)致病性调查：调查培养瓶中各个发芽种子的发病情况，并根据发病程度将发病情况划分为不同的发病等级，该发病等级数值越大，发病程度越严重；

[0014] (5)致病性评价：计算每个菌株的致病指数，致病指数的计算公式如下，该致病指数数值越大表明该病原菌的致病性越强：

[0015] 致病指数＝∑(发病等级×相应发病芽数)/总芽数。

[0016] 按上述方案，所述的步骤(1)的具体步骤为：在含经过灭菌的PDA培养基的培养皿上接种菜豆壳球孢菌菌丝或尖孢镰刀菌芝麻专化型菌菌丝，用Parafilm膜封口，然后于生化培养箱中28～30℃黑暗培养5～7d，所述PDA培养基的组成为：每升培养基中含200g去皮马铃薯滤液、葡萄糖15g、琼脂12g，所述PDA培养基的灭菌方式为高温高压灭菌。

[0017] 按上述方案，步骤(2)中所述种子灭菌的方式为将种子置于重量百分比浓度为0.1％的升汞水溶液中浸泡4～5min，并在期间摇晃数次。

[0018] 按上述方案，所述步骤(3)中的培养基为2％琼脂(w/v)，所述培养基的灭菌方式为高温高压灭菌。

[0019] 按上述方案，步骤(1)使用菜豆壳球孢菌时，步骤(3)所述的接种培养为28-30℃密封黑暗培养4～5d；步骤(1)使用尖孢镰刀菌芝麻专化型菌时，步骤(3)所述的接种培养为28-30℃密封黑暗培养8～10d。

[0020] 按上述方案，所述步骤(3)的具体步骤为：在直径为60mm～70mm的培养瓶中，加入灭菌培养基，铺放无菌滤纸，添加无菌水，并赶出气泡，然后沿滤纸边缘均匀摆放20～30枚步骤(2)中经过灭菌处理的无菌芝麻种子，再在滤纸中央接种直径为0.5cm～1cm的步骤(1)培养得到的菌饼，密闭黑暗培养；

[0021] 按上述方案，在进行步骤(3)之前，将步骤(3)重复进行至少2次。

[0022] 按上述方案，在设置重复实验时，致病指数由多次实验的致病指数平均而得。

[0023] 按上述方案，步骤(1)使用菜豆壳球孢菌时，所述步骤(4)中根据如下分级标准将发病等级划分为6级，其中感染茎点枯病的芝麻芽或根的褐色部位多质地湿润：

[0024] 0级：无病菌侵染症状；

[0025] 1级：根系变褐范围≤1/3；

[0026] 2级：根系变褐范围为1/3～2/3之间，即1/3＜根系变褐范围≤2/3；

[0027] 3级：根系变褐范围为2/3至整个根系变褐，即根系变褐范围＞2/3，至整个根系变褐；

[0028] 4级：根系全部变褐，根颈部感病且芽有1/2及1/2以下变褐；

[0029] 5级：根系全部变褐，根颈部感病且芽有1/2以上变褐，甚至出现腐烂现象。

[0030] 按上述方案，步骤(1)使用尖孢镰刀菌芝麻专化型菌时，所述步骤(4)中根据如下分级标准将发病等级划分为6级，其中感染枯萎病的芝麻芽或根的褐色部位多质地干燥：

[0031] 0级：无病菌侵染症状；

[0032] 1级：根系变褐范围≤1/3；

[0033] 2级：根系变褐范围为1/3～2/3之间，即1/3＜根系变褐范围≤2/3；

[0034] 3级：根系变褐范围为2/3至整个根系变褐，即根系变褐范围＞2/3，至整个根系变褐；

[0035] 4级：根系全部变褐，根颈部感病且芽有1/2及1/2以下变褐；

[0036] 5级：根系全部变褐，根颈部感病且芽有1/2以上变褐，甚至出现腐烂现象。

[0037] 本发明的有益效果：

[0038] 本发明提供的一种鉴定芝麻茎点枯病和枯萎病病原菌致病性的方法，1、可完全在实验室中进行，简便易行，所需设备较少，成本低，重复性好；2、能较为准确地反映不同芝麻茎点枯病和枯萎病病原菌的致病性，结果可靠；3、有助于准确快速地研究芝麻茎点枯病和芝麻枯萎病病原菌的致病性、从而为制定适合的防治对策、进行合理的芝麻品种布局、培育新的抗病性芝麻品种提供技术支撑。

附图说明

[0039] 图1为茎点枯病病原菌致病性在芝麻芽上的差异，其中0、1、2、3、4、5分别代表不同的发病等级；

[0040] 图2为枯萎病病原菌致病性在芝麻芽上的差异，其中0、1、2、3、4、5分别代表不同的发病等级。

具体实施方式

[0041] 本发明结合以下实施例，以便于更好地理解本发明的内容。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。操作过程除特别说明之外，均在超净台上室温进行。所用生化培养箱的品牌为三洋，所用芝麻材料均由中国农业科学院油料作物研究所芝麻资源课题组提供。

[0042] 所述PDA培养基的组成为：每升培养基中含200g去皮马铃薯滤液、葡萄糖15g、琼脂12g，所述PDA培养基的配制：选取去皮马铃薯200g，切块，于蒸馏水中沸腾蒸煮，当马铃薯块煮烂后用干净纱布过滤，获得的滤液即为去皮马铃薯滤液，加入15g葡萄糖和12g琼脂，然后加水至1000mL，并经过高温高压灭菌15～20min而得。

[0043] 实施例1：36个不同来源的芝麻茎点枯病病原菌的致病性鉴定

[0044] (1)芝麻茎点枯病病原菌菌丝的制备：取感染茎点枯病的芝麻植株病健交界处，采用0.1％(重量百分数)升汞水溶液灭菌后接种到PDA培养基上黑暗培养形成菌落后，在菌落边缘挑取菌丝在PDA培养基上继代培养直至菌落均一，然后经过诱孢培养，并获得单胞培养纯化的菜豆壳球孢菌菌丝，进行保存。

[0045] (2)接种用菌株培养：在含经过高温高压15min灭菌的PDA(Potato dextrose agar)培养基的培养皿(直径为90mm)的中央接种已保存好的菜豆壳球孢菌菌丝，Parafilm膜封口，30℃黑暗培养5d，至形成菌落；

[0046] (3)种子预处理：选用健康饱满的鄂芝2号种子，用0.1％(重量百分数)的升汞(HgCl2)水溶液中浸泡灭菌4～5min，期间摇晃数次，然后用无菌水冲洗3次，平铺于铺有无菌滤纸的培养皿中，置于超净台中自然晾干，备用；

[0047] (4)接种：配制2％琼脂(w/v)即琼脂的质量浓度为20g/L的培养基，高压灭菌20min，然后将其倒入60mm(直径)×95mm(高)左右的广口玻璃瓶中，至培养基高度为10mm左右，待琼脂凝固后在培养基表面铺一层无菌滤纸(直径60mm左右)，添加1mL无菌水，用无菌镊子把滤纸铺平，赶出气泡备用；沿滤纸边缘均匀摆上20枚无菌的种子，然后在步骤(2)培养得到的接种用菌落边缘打直径为1cm的菌饼，铺于广口玻璃瓶的滤纸中央，再将广口玻璃瓶封口后置于30℃黑暗培养5d，对每个芝麻茎点枯病病原菌株分别接种3个培养瓶；

[0048] (5)致病性调查与统计：调查每个接种广口玻璃瓶中发芽种子的发病情况，并按以下分级标准统计不同发病等级的株数，其中感染茎点枯病的芝麻芽或根的褐色部位多质地湿润。

[0049] 0级：无病菌侵染症状；

[0050] 1级：根系变褐范围≤1/3；

[0051] 2级：根系变褐范围为1/3～2/3之间，即1/3＜根系变褐范围≤2/3；

[0052] 3级：根系变褐范围为2/3至整个根系变褐，即根系变褐范围＞2/3，至整个根系变褐；

[0053] 4级：根系全部变褐，根颈部感病且芽有1/2及1/2以下变褐；

[0054] 5级：根系全部变褐，根颈部感病且芽有1/2以上变褐，甚至腐烂。

[0055] (6)致病性评价：按以下公式分别计算每个菌株的的致病指数，见表1。致病指数的范围在0～5之间，该数值越大表明致病性越强。

[0056] 致病指数＝∑(发病等级×相应的发病芽数)/总芽数

[0057] 表1 36个芝麻茎点枯病病原菌的致病指数

[0058]

[0059] *菌原来源：除10、33号来源于芝麻苗期发病植株外，其他均来源于芝麻生长中后期发病植株。

[0060] 由表1可以看出，在36个来源不同的芝麻茎点枯病病原菌菌株中，致病性最强的为31号，其次为29号，最弱的为5号。经重复实验表明：该鉴定芝麻茎点枯病病原菌致病性的方法重复性好，结果可靠。

[0061] 实施例2：28个不同来源的芝麻枯萎病病原菌的致病性鉴定

[0062] (1)芝麻枯萎病病原菌菌丝的制备：取感染枯萎病的芝麻植株病健交界处，采用0.1％(重量百分数)升汞水溶液灭菌后接种到PDA培养基上黑暗培养形成菌落后，在菌落边缘挑取菌丝在PDA培养基上继代培养直至菌落均一，然后经过诱孢培养，获得单胞培养纯化的尖孢镰刀菌芝麻专化型菌菌丝，进行保存。

[0063] (2)接种菌株培养：在含PDA(Potato dextrose agar)培养基的培养皿(直径为90mm)中央接种保存好的尖孢镰刀菌芝麻专化型菌菌丝，Parafilm膜封口，30℃黑暗培养
7d，致形成菌落，备用；

[0064] (3)种子预处理：选用健康饱满的鄂芝2号种子，用0.1％(重量百分数)的HgCl2(升汞)水溶液浸泡灭菌4～5min，期间摇晃数次，然后用无菌水冲洗4次，平铺于铺有无菌滤纸的培养皿中，置于超净台中自然晾干备用；

[0065] (4)接种：制备2％琼脂(w/v)培养基，高压灭菌20min，然后将其倒入60mm(直径)×95mm(高)左右的广口玻璃瓶中，至培养基高度为10mm左右，待琼脂凝固后在培养基表面铺一层无菌滤纸(直径60mm左右)，添加1mL无菌水，用无菌镊子把滤纸铺平，赶出气泡备用，沿滤纸边缘均匀摆上20枚无菌的种子，然后在步骤(2)培养得到的接种用菌落边缘打直径1cm的菌饼，铺在广口瓶滤纸中央，再将广口玻璃瓶封口后置于30℃黑暗培养10d，对每个芝麻枯萎病病原菌菌株分别接种3个培养瓶；

[0066] (5)致病性调查与统计：调查每个接种广口玻璃瓶中发芽种子的发病情况，并按以下分级标准统计不同发病等级的株数，其中感染枯萎病的芝麻芽或根的褐色部位多质地干燥；

[0067] 0级：无病菌侵染症状；

[0068] 1级：根系变褐范围≤1/3；

[0069] 2级：根系变褐范围为1/3～2/3之间，即1/3＜根系变褐范围≤2/3；

[0070] 3级：根系变褐范围为2/3至整个根系变褐，即根系变褐范围＞2/3，至整个根系变褐；

[0071] 4级：根系全部变褐，根颈部感病且芽有1/2及1/2以下变褐；

[0072] 5级：根系全部变褐，根颈部感病且芽有1/2以上变褐，甚至腐烂；

[0073] (6)致病性评价：按以下公式分别计算来源不同的各菌株的的致病指数，见表2。致病指数的范围在0～5之间，该数值越大说明致病性越强：

[0074] 致病指数＝∑(发病等级×相应的发病芽数)/总芽数

[0075] 表2 36个芝麻枯萎病病原菌的致病指数

[0076]

[0077] *菌原来源：均来源于芝麻生长中后期发病植株。

[0078] 由表2可以看出，在28个来源不同的芝麻枯萎病病原菌中致病性最强的为18号，其次为21号，最弱的为20号。经重复实验表明：该鉴定芝麻枯萎病病原菌致病性的方法重复性好，结果可靠。