黄连提取物及其在制备治疗呼吸道疾病的试剂中的新用途

摘要

本发明提供了一种包含黄连提取物或者黄连和常春藤叶的组合提取物作为活性成分的用于止咳、祛痰、预防和/或治疗呼吸道疾病的组合物，和一种使用所述组合物来止咳、祛痰，和/或预防和/或治疗呼吸道疾病的方法。

权利要求

1.包含黄连提取物作为活性成分的止咳或祛痰组合物，其中所述黄连提取物选自：通过在用水或v/v比为10至70%的乙醇提取的黄连的粗提取物中加入水饱和丁醇而得到的溶剂可溶的提取物；

用水饱和丁醇提取的黄连的粗提取物；和

用v/v混合比例为30:1至7:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂获得的溶剂可溶的提取物的级分，其中所述级分通过用二氯甲烷和甲醇的混合溶剂对所述溶剂可溶的提取物进行硅胶柱层析而得到。

2.权利要求1的组合物，其中所述组合物由黄连提取物和常春藤叶提取物的结合作为活性成分组成，并且所述组合物是黄连和常春藤叶的结合提取物的形式，其中所述常春藤叶提取物和所述黄连提取物的重量比为1:1至4:1，其中所述常春藤叶提取物是使用一种或多种选自水和具有1-4个碳原子的直链或支链醇的溶剂作为提取溶剂而获取的粗提取物，或者是通过向所述粗提取物加入一种具有

1-6个碳原子的直链或支链醇的水溶液而得到的一种溶剂可溶的提取物。

3.一种用于预防或治疗呼吸道疾病的组合物，所述组合物由黄连提取物和常春藤叶提取物的结合作为活性成分组成，并且所述组合物为黄连和常春藤叶的结合提取物的形式，其中所述黄连提取物选自：通过在用水或v/v比为10至70%的乙醇提取的黄连的粗提取物中加入水饱和丁醇而得到的溶剂可溶的提取物；

用水饱和丁醇提取的黄连的粗提取物；和

用v/v混合比例为30:1至7:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂获得的溶剂可溶的提取物的级分，并且所述常春藤叶提取物和所述黄连提取物的重量比为1:1至4:1，其中所述级分通过用二氯甲烷和甲醇的混合溶剂对所述溶剂可溶的提取物进行硅胶柱层析而得到，所述常春藤叶提取物是使用一种或多种选自水和具有1-4个碳原子的直链或支链醇的溶剂作为提取溶剂而获取的粗提取物，或者是通过向所述粗提取物加入一种具有1-6个碳原子的直链或支链醇的水溶液而得到的一种溶剂可溶的提取物，并且所述呼吸道疾病选自支气管炎、哮喘、慢性或急性支气管收缩、喘鸣性婴儿综合征、慢性阻塞性肺病、普通感冒、流行性感冒和肺组织细胞增多病。

4.权利要求1至3中任一项的组合物，其中所述组合物被配制为粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮剂、乳剂、糖浆、气雾剂、经皮给药剂、栓剂或灭菌的注射溶液。

5.包含权利要求1至3中任一项的组合物的用于预防或改善呼吸道疾病的健康功能性食物，其中所述呼吸道疾病选自支气管炎、哮喘、慢性或急性支气管收缩、喘鸣性婴儿综合征、慢性阻塞性肺病、普通感冒、流行性感冒和肺组织细胞增多病。

6.含有黄连提取物作为活性成分的组合物在制备止咳或祛痰试剂中的用途，其中所述黄连提取物选自：通过在用水或v/v比为10至70%的乙醇提取的黄连的粗提取物中加入水饱和丁醇而得到的溶剂可溶的提取物；

用水饱和丁醇提取的黄连的粗提取物；和

用v/v混合比例为30:1至7:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂获得的溶剂可溶的提取物的级分，其中所述级分通过用二氯甲烷和甲醇的混合溶剂对所述溶剂可溶的提取物进行硅胶柱层析而得到。

7.权利要求6的用途，其中所述组合物由黄连提取物和常春藤叶提取物的结合作为活性成分组成，并且所述组合物是以黄连和常春藤叶的结合提取物的形式给药，其中所述常春藤叶提取物和所述黄连提取物的重量比为1:1至4:1，其中所述常春藤叶提取物是使用一种或多种选自水和具有1-4个碳原子的直链或支链醇的溶剂作为提取溶剂而获取的粗提取物，或者是通过向所述粗提取物加入一种具有

1-6个碳原子的直链或支链醇的水溶液而得到的一种溶剂可溶的提取物。

8.权利要求6或7的用途，其中所述组合物的每日剂量基于活性成分的量计为0.5至

500mg/kg。

9.由黄连提取物和常春藤叶提取物组成的组合物作为活性成分在制备预防或治疗呼吸道疾病的组合物中的用途，其中所述黄连提取物选自：通过在用水或v/v比为10至70%的乙醇提取的黄连的粗提取物中加入水饱和丁醇而得到的溶剂可溶的提取物；

用水饱和丁醇提取的黄连的粗提取物；和

用v/v混合比例为30:1至7:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂获得的溶剂可溶的提取物的级分，并且所述常春藤叶提取物和所述黄连提取物的重量比为1:1至4:1，其中所述级分通过用二氯甲烷和甲醇的混合溶剂对所述溶剂可溶的提取物进行硅胶柱层析而得到，所述常春藤叶提取物是使用一种或多种选自水和具有1-4个碳原子的直链或支链醇的溶剂作为提取溶剂而获取的粗提取物，或者是通过向所述粗提取物加入一种具有1-6个碳原子的直链或支链醇的水溶液而得到的一种溶剂可溶的提取物，并且所述呼吸道疾病选自支气管炎、哮喘、慢性或急性支气管收缩、喘鸣性婴儿综合征、慢性阻塞性肺病、普通感冒、流行性感冒和肺组织细胞增多病。

10.权利要求9的用途，其中所述组合物的每日剂量基于活性成分的量计为0.5至

500mg/kg。

说明书

黄连提取物及其在制备治疗呼吸道疾病的试剂中的新用途

技术领域

[0001] 本发明提供一种用于祛痰、止咳和/或具有抗组胺活性的黄连(Coptidis rhizoma)提取物或黄连和常春藤(ivy)的结合提取物。具体地，本发明提供一种含有黄连提取物或黄连和常春藤叶的结合提取物作为活性成分的止咳和/或祛痰组合物并且/或者用于预防和治疗呼吸道疾病的组合物，及其制备方法。

[0002] 背景技术

[0003] 已知咳嗽和痰是由物理或化学因素——例如冷空气，外来物质包括致病微生物、空气污染物、变应原等——引起的，并且可根据原因分类如下：

[0004] 第一，如果喉(arynx)、气管、支气管、咽、鼻旁窦和膈等中的咳嗽受体被物理化学因素刺激，所述刺激将被传至脑髓质的咳嗽中心，由此产生咳嗽反射。

[0005] 第二，如果副交感神经系统被物理或化学因素激活，支气管的平滑肌收缩，由此可能出现诸如支气管痉挛和支气管收缩的症状。

[0006] 第三，由物理或化学因素将炎性介质等从肥大细胞中释放。

[0007] 因此，去除上述因素可抑制咳嗽和痰。但是，至今为止开发的大部分药物主要是合成的化学物质，因此可引起各种副作用。开发的用于补偿这些缺陷的天然药物不能表现出对咳嗽和痰很好的抑制作用。

[0008] 同时，哮喘——一种代表性呼吸道疾病——反复而间歇性地表现为诸如呼吸困难、咳嗽和喘鸣性呼吸(stridulous breathing)等的症状。哮喘可分作心源性哮喘和支气管哮喘。尽管哮喘的发生率根据国家、人种和年龄等而变化，报道称2007年在英国7.9％的成人、13.7％的儿童和9.4％的老人患有哮喘。在韩国，由于生活方式的改变、环境污染和压力增大等原因，哮喘的发生率已经升高。近来，由于环境 污染变得严重，哮喘的严重程度已最大化，发生哮喘的年龄变小并且症状持续时间变长。

[0009] 呼吸道阻塞是哮喘的特征，其通过三步发生。具体地，支气管的平滑肌收缩，肺部粘膜变厚，支气管和细支气管中的粘液聚积，从而成阻塞呼吸道。在这几步中，只有支气管平滑肌的收缩可容易地恢复。

[0010] 在外因性(过敏性)哮喘的发生机制中，IgE非常重要，IgG部分地与之相关。IgE释放激活肥大细胞而引起超敏反应的介质，例如组胺、SRS-A、ECF-A、NCF、PAF、激肽(Kinin)和PGs等。内因性(非过敏性)哮喘——尽管其机制还不清楚——看起来是由自主神经介导的。对内因性哮喘患者的胆碱刺激引起一种介质(如组胺)直接通过终末器官(end organs)从肥大细胞中分离，杯状细胞分泌增加，肺部血管扩张，气管、支气管和细支气管收缩，从而增加支气管痉挛和粘液分泌。

[0011] 尚未开发出根本性治疗哮喘的方法，但研制了预防痉挛和并发症的各种方法和药物；然而，它们仅仅是改善症状而不能从根本上治疗疾病，而且它们可能引起严重的副作用。

[0012] 为了克服已有药物的局限性，需要开发能够从根本上治疗病因并有效地改善疾病症状的新药。但是，呼吸道疾病涉及从中分离的各种白细胞、细胞因子和炎性介质，因此仅凭单一组分化合物很难实现有效治疗。因此，具有各种成分和作用机制的天然提取物可成为有效的药物，因此，需要开发一种基于天然提取物的药物。

[0013] 发明内容

[0014] 技术问题

[0015] 对止咳药和祛痰药的研究结果使本发明人发现了黄连提取物或黄连和常春藤叶的结合提取物有极好的止咳、祛痰和抗组胺活性，从而完成本发明。

[0016] 一个实施方案提供了黄连提取物或黄连和常春藤叶的结合提取物用于祛痰、止咳并且/或者治疗和/或预防呼吸道疾病的新用途。

[0017] 另一个实施方案提供了含有黄连提取物或黄连和常春藤叶的结合提取物作为活性成分的止咳或祛痰组合物并且/或者用于预防和/或 治疗呼吸道疾病的组合物，和制备所述组合物的方法。

[0018] 另一个实施方案还提供了用来止咳、祛痰并且/或者治疗和/或预防呼吸道疾病的方法，包括将含有黄连提取物或黄连和常春藤叶的结合提取物作为活性成分的组合物给予需要止咳、祛痰并且/或者治疗和/或预防呼吸道疾病的患者的步骤。

[0019] 技术方案

[0020] 一个实施方案涉及黄连提取物或黄连和常春藤叶的结合提取物用于祛痰、止咳并且/或者治疗和/或预防呼吸道疾病的新用途。

[0021] 另一个实施方案涉及含有黄连提取物或黄连和常春藤叶的结合提取物作为活性成分的止咳或祛痰组合物并且/或者用于预防和/或治疗呼吸道疾病的组合物。 [0022] 黄连是一种属于毛茛科(Ranunculaceae family)的多年生草本植物，主要用其根茎部分。已知黄连包含生物碱黄连素(berberine)、非洲防己碱(palmatine)、黄连碱(coptisine)、5-羟(基)小檗碱(berberastine)和兰花碱(magnoflorine)等作为主要药物成分。

[0023] 但是，尚未研究黄连提取物和含有黄连提取物的组合物的止咳、祛痰和抗组胺活性。

[0024] 本发明人发现黄连的提取物有止咳、祛痰和抗组胺活性，并且对治疗和/或预防呼吸道疾病有效，从而完成本发明。

[0025] 常春藤属于五加科(Araliaceae family)，其含义是属于常春藤属(Hedera spp.)的植物。例如，它可包括但不局限于阿尔及利亚常春藤(Hedera algeriensis)、亚速尔群岛常春藤(Hedera azorica)、坎那利岛常春藤(Hedera canariensis)、波斯常春藤(Hedera colchica)、洋常春藤(Hedera helix)、大西洋常春藤(Hedera hibernica)、马德拉岛常春藤(Hedera maderensis)、尼泊尔常春藤(Hedera nepalensis)、Hedera pastuchowii和菱叶常春藤(Hedera rhombea)等。干燥常春藤叶的提取物的止咳和祛痰作用已被公布；但是仍无报道称当常春藤叶与其他草药提取物一起施用时可获得显著的协同用作，而同时无副作用。

[0026] 本发明人发现与每种提取物单独使用相比，黄连提取物和常春藤 提取物的结合显著地增强止咳效果、祛痰效果、抗组胺效果、抑制支气管收缩的效果、抑制气道超敏的效果、抑制肺组织支气管阻塞的效果和抑制炎症细胞浸润的效果。此外，在本发明中，提供了药理活性表现出最佳协同效果的黄连提取物和常春藤叶提取物的最佳混合比例。 [0027] 为了通过混合黄连提取物和常春藤叶提取物来使止咳、祛痰、抗组胺、抑制支气管收缩、抑制气道超敏、抑制肺组织的支气管阻塞和抑制炎症细胞浸润的活性协同效果最大化，常春藤叶提取物和黄连提取物的混合比例基于固体内容物(solid content)重量计(常春藤叶提取物重量：黄连提取物重量)为0.1∶1至10∶1，优选0.2∶1至5∶1，更优选1∶1至4∶1，更优选1.5∶1至3.5∶1，最优选2.5∶1至3.5∶1。术语“固体内容物”是指用来制备提取物的溶剂被移除后的那些物质。

[0028] 本文中的术语“提取物”是指黄连和/或常春藤叶的粗提取物并且/或者所述粗提取物的特定溶剂-可溶提取物(solvent-soluble extract)或级分，其可以是以溶液、浓缩物和粉末的形式。术语“黄连和常春藤叶的结合提取物”既指分别通过提取常春藤叶和提取黄连得到的常春藤叶提取物和黄连提取物的混合物，又指通过提取常春藤叶和黄连的混合物而得到的提取物。

[0029] 所述黄连提取物可以是通过用一种或多种选自水、具有1-4个碳原子的直链或支链醇的溶剂提取黄连、特别是黄连的根茎部分而得到的粗提取物，或者是通过所述向粗提取物加入一种或多种溶剂而得到的一种溶剂可溶的提取物，其中所述溶剂选自具有1-6个碳原子的直连或支链醇的水溶液，优选丙醇水溶液、异丙醇水溶液和水饱和丁醇。 [0030] 所述常春藤叶提取物可以是通过用一种或多种选自水、具有1-4个碳原子的直链或支链醇的溶剂提取干燥常春藤叶而得到的一种粗提取物，或者是通过向所述粗提取物加入一种或多种溶剂而得到的一种溶剂可溶的提取物，其中所述溶剂选自具有1-6个碳原子的直连或支链醇的水溶液，优选丙醇水溶液、异丙醇水溶液和水饱和丁醇。用于制备常春藤叶提取物的常春藤可以是常春藤属，例如，其可以是一种或多种选自以下的常春藤：阿尔及利亚常春藤、亚速尔群岛常春藤、坎那利岛常春藤、波斯常春藤、洋常春藤、大西洋常春藤、马德拉岛 常春藤、尼泊尔常春藤、Hedera pastuchowii和菱叶常春藤等，但不限于此。 [0031] 在一个优选实施方案中，用于制备黄连或常春藤叶粗提取物的溶剂可以是一种或多种选自以下物质的溶剂：水；10至70％(v/v)、优选20至60％(v/v)、更优选25至55％(v/v)的具有1-4个碳原子的直链或支链醇，优选甲醇水溶液和乙醇水溶液，还有水饱和丁醇。

[0032] 用于制备黄连或常春藤叶的溶剂可溶的提取物的溶剂可以是一种或多种选自以下物质的溶剂：10至70％(v/v)、优选20至60％(v/v)、更优选25至55％(v/v)的具有1-6个碳原子的直链或支链醇，优选丙醇水溶液和异丙醇水溶液，还有水饱和丁醇。 [0033] 黄连和常春藤叶的结合提取物可以是黄连提取物和常春藤叶提取物的混合物，或者是黄连和常春藤叶混合物的提取物。例如，所述结合提取物可以是通过将黄连和常春藤叶混合，然后用一种或多种选自水和具有1-4个碳原子的直链或支链醇的溶剂提取混合物而得到的一种粗提取物；或者是通过向所述粗提取物加入一种或多种选自具有1-6个碳原子的低级醇的水溶液的溶剂(优选丙醇水溶液和异丙醇水溶液还有水饱和丁醇)而得到的一种溶剂可溶的提取物。

[0034] 优选地，用于制备黄连和常春藤叶的粗提取物的溶剂可以是水；10至70％(v/v)、优选20至60％(v/v)、更优选约25至55％(v/v)的甲醇水溶液或乙醇水溶液，或水饱和丁醇。用于制备所述溶剂可溶的提取物的溶剂可以是一种或多种选自以下物质的溶剂：10至70％(v/v)、优选20至60％(v/v)、更优选约25至55％(v/v)的具有1-6个碳原子的低级醇的水溶液，优选丙醇水溶液和异丙醇水溶液，还有水饱和丁醇。

[0035] “级分”可以是通过用二氯甲烷和甲醇(30∶1至7∶1(v/v))的混合溶剂对所述溶剂可溶的提取物进行硅胶柱层析而得到。

[0036] 所述黄连提取物、溶剂可溶提取物或级分包含黄连素、非洲防己碱、黄连碱、非洲防己胺(columbamine)和药根碱(jatrorrhizine)，优选黄连素(0.5至47.0重量份)∶非洲防己碱(0.2至21.4重量份)∶黄连碱(0.1至18.0重量份)∶非洲防己胺(0.1至3.2重量份)∶药根碱(0.1至2.6重量份)。

[0037] 在另一方面，本发明涉及一种制备有止咳、祛痰、抗组胺、抑制支气管收缩、抑制气道超敏、抑制肺组织的支气管阻塞和抑制炎症细胞浸润活性的黄连和常春藤叶的结合提取物的方法。

[0038] 所述方法包括用一种或多种溶剂提取黄连、优选黄连的根茎部分的步骤，所述溶剂选自水和有1-4个碳原子的直链或支链醇，例如水，10至70％(v/v)、优选20至60％(v/v)、更优选约25至55％(v/v)的甲醇水溶液或乙醇水溶液，或水饱和丁醇。

[0039] 所述制备黄连和常春藤叶的结合提取物的方法可包括以下步骤：

[0040] 用一种或多种溶剂提取干燥的常春藤叶来获取常春藤叶提取物，其中所述溶剂选自水和有1-4个碳原子的直链或支链醇，例如水，10至70％(v/v)、优选20至60％(v/v)、更优选25至55％(v/v)的甲醇水溶液或乙醇水溶液，或水饱和丁醇；

[0041] 用一种或多种溶剂提取黄连、优选黄连的根茎部分来获取黄连提取物，其中所述溶剂选自水和有1-4个碳原子的直链或支链醇，例如水，10至70％(v/v)、优选20至60％(v/v)、更优选25至55％(v/v)的甲醇水溶液或乙醇水溶液，或水饱和丁醇；和 [0042] 将所得常春藤叶提取物和黄连提取物以基于固体内容物计以0.1∶1至10∶1(常春藤叶提取物的重量∶黄连提取物的重量)、优选0.2∶1至5∶1、更优选1∶1至4∶1、更优选1.5∶1至3.5∶1、最优选2.5∶1至3.5∶1的比例混合。

[0043] 制备常春藤叶提取物的步骤和制备黄连提取物的步骤还可以包括向所得提取物加入一种或多种选自有1-6个碳原子的直链或支链醇的溶剂(优选水饱和丁醇、丙醇和异丙醇)来获取溶剂可溶的提取物的步骤。

[0044] 将详细解释制备常春藤叶提取物的步骤：切下常春藤叶并用水清洗来除去杂质，将叶片干燥，然后用一种或多种选自水和有1-4个碳原子的直链或支链醇(例如水、10至70％(v/v)、优选20至60％(v/v)、更优选25至55％(v/v)的甲醇水溶液或乙醇水溶液，或水饱和丁醇)的溶剂以约5至20倍、优选7至15倍于所述干燥常春藤叶体积的量对叶片进行回流提取。提取温度是40至110℃，优选55至90℃。

[0045] 提取后，将所得提取物过滤，收集滤液，然后用一种或多种选自水和有1-4个碳原子的直链或支链醇(例如水，10至70％(v/v)、优选20至60％(v/v)、更优选25至55％(v/v)的甲醇水溶液或乙醇水溶液，或水饱和丁醇)的溶剂以约5至15倍，优选8至12倍的体积量回流提取所得残渣。提取温度是——但并不具体地限定于——40至110℃，优选55至90℃。提取后，将所得提取物过滤，将滤液与先前获得的滤液合并，在真空下将其浓缩来制备常春藤叶提取物。两次提取和每次提取后合并获取的滤液可提高提取效率，但是提取次数不局限于此。

[0046] 将详细解释制备黄连提取物的步骤：将黄连的根茎部分切成小块，然后以约3至20倍、优选5至15倍于原材料体积的量向其加入一种或多种选自水和有1-4个碳原子的直链或支链醇的溶剂(例如水，10至70％(v/v)、优选20至60％(v/v)、更优选25至55％(v/v)的甲醇水溶液或乙醇水溶液，或水饱和丁醇)来提取0.5至20小时，优选1至10小时，更优选2至5小时。提取温度是——但不局限于——40至110℃，优选55至90℃。优选地，将所得提取物过滤，收集滤液，以约5至15倍、优选8至12倍体积的量向残渣加入一种或多种选自水和有1-4个碳原子的直链或支链醇(例如水，10至70％(v/v)、优选20至
60％(v/v)、更优选25至55％(v/v)的甲醇水溶液或乙醇水溶液，或水饱和丁醇)的溶剂，然后提高温度再提取1至10小时、优选2至5小时，然后将所得提取物过滤并在真空下浓缩以获取黄连提取物。将所得提取物和先前得到的滤液合并可提高提取效率。 [0047] 两次提取和将每次提取后获得的滤液合并可提高提取效率，但提取次数不局限于此。

[0048] 如果用来制备黄连提取物和/或常春藤提取物的溶剂的量太少，会很难搅拌并且提取物的溶解性降低导致提取效率下降。如果用来制备黄连提取物和/或常春藤提取物的溶剂的量太多，用于接下来纯化步骤的低级醇的量会增加而引起经济问题和处理问题。因此，优选在上述范围内调整溶剂的量。

[0049] 根据本发明的一个优选实施方案，再提取可在初次提取后进行，这可以防止由仅进行初次提取而带来的提取效率下降，因为在大量制取草药提取物的情况下，即使进行有效地过滤，由于草药提取物的量很大从而产生损失，因此当仅进行初次提取时提取效率会降低。因此，根据本发明的一个优选实施方案，初次提取后可进行再提取。此外，在每个步骤中检测提取效率发现总提取量的约80％至90％是通过二次提取得到的，从而表明两步提取与多于三次提取的多次提取相比可有显著的经济效益。

[0050] 溶剂可溶的提取物可通过将所获粗提取物悬浮于2至10倍、优选3至7倍体积的水中，并且向其中以0.5至3倍、优选2倍当量于悬浮液的量分1次到5次，优选2到3次加入一种或多种选自有1-6个碳原子的直链或支链醇的水溶液的溶剂(优选丙醇水溶液或异丙醇水溶液，还有水饱和丁醇)来提取溶剂可溶层，然后在真空下浓缩。

[0051] 使用低级醇的溶剂可溶的提取步骤是为了去除不必要的杂质例如蛋白质、多糖和脂肪酸等。因此如果使用的低级醇的量比滤液少，不必要的成分例如脂肪酸就形成微粒，从而使分层不光滑并且减少活性成分的提取量。因此，优选在上述范围内调整低级醇的量。 [0052] 将分层后获得的低级醇级分于50至60℃在真空下浓缩以除去样本中残留的溶剂。

[0053] 为了控制所得浓缩物中残留的低级醇的含量以便于使其适用作药物原材料，可所得浓缩物与基于所得浓缩物的总量计10至30倍、优选15至25倍、更优选约20倍重量的水共沸浓缩1到5次，优选2到3次，并且向其加入等量水对其进行均匀悬浮，然后将所得悬浮液冻干来制备粉末形式的黄连提取物和/或常春藤叶提取物。

[0054] 优选地，为了均匀地合并结合提取物中的每种提取物，向所得结合提取物加入2至3倍重量的水，然后于50至60℃在真空下浓缩，向所得浓缩物中加入等量水来对其进行均匀悬浮，然后将所得悬浮液冻干来制备粉末形式的组合物。

[0055] 根据另一个实施方案，制备黄连和常春藤叶的结合提取物的方法可包括以下步骤：

[0056] 将干燥的常春藤叶和黄连(优选黄连的根茎部分)以1∶4至7∶1(常春藤叶的重量∶黄连的重量)、优选1∶1至6∶1、更优选2∶1至5∶1的重量比混合来制备常春藤叶和黄连的混合物；和

[0057] 用一种或多种选自水和有1-4个碳原子的直链或支链醇的溶剂 (例如水，10至70％(v/v)、优选20至60％(v/v)、更优选约25至55％(v/v)的甲醇水溶液或乙醇水溶液，或水饱和丁醇)提取所得混合物。

[0058] 上述方法还可包括在制取常春藤叶和黄连的混合物的提取物步骤后加入一种或多种溶剂来获取溶剂可溶的提取物的步骤，其中所述溶剂选自有1-6个碳原子的直链或支链低级醇，优选丙醇和异丙醇和水饱和丁醇。

[0059] 制备粗提取物和溶剂可溶的提取物步骤的细节和在制备每种草药提取物中描述的一样。

[0060] 作为本发明中使用的提取方法，可使用任何常规使用的方法。例如，可通过在室温下提取、热水提取、超声波提取、回流提取或冷却提取来进行所述提取，但不限于此。 [0061] 在另一方面，本发明提供一种包含黄连提取物或黄连和常春藤叶的结合提取物作为一种活性成分的止咳组合物。另一方面，本发明还提供一种包含黄连提取物或黄连和常春藤叶的结合提取物作为一种活性成分的祛痰组合物。在另一方面，本发明还提供一种包含黄连提取物或黄连和常春藤叶的结合提取物作为一种活性成分的用于预防和/或治疗呼吸道疾病的组合物。

[0062] 在另一方面，本发明提供一种止咳的方法，包含向患者施用治疗有效量的黄连提取物或黄连和常春藤叶的结合提取物这一步骤。在另一方面，本发明还提供一种祛痰的方法，包括向患者施用治疗有效量的黄连提取物或黄连和常春藤叶的结合提取物这一步骤。在另一方面，本发明还提供一种预防和/或治疗呼吸道疾病的方法，包括向患者施用治疗有效量的黄连提取物或黄连和常春藤叶的结合提取物这一步骤。所述患者可以是需要止咳、祛痰或治疗和/或预防呼吸道疾病的哺乳动物，优选人类。

[0063] 所述治疗有效量是为得到所需疗效确定的剂量。其可根据年龄、体重、性别、剂型、健康状况和疾病严重程度而不同，其还可根据医师或药剂师的判断而不同。例如，每日剂量基于活性成分含量计可以是0.5至500mg/kg，优选1至300mg/kg，但不局限于此。所述剂量可一日一次或一日多次地施用。所述剂量说明一般情况，其可以依个 别情况而更高或更低。如果含有本发明结合提取物的组合物的每日剂量比上述范围低，不能获得显著的效果；而如果其超出了上述范围，经济功效下降，并且剂量超出了常规剂量因而引起不良副作用。
因此，每日剂量优选在上述范围内。

[0064] 所述黄连提取物或黄连和常春藤叶的结合提取物表现出止咳、祛痰、抗组胺、抑制支气管收缩、抑制气道超敏、抑制肺组织支气管阻塞和抑制炎症细胞浸润活性，因此它们可用于治疗、预防或减轻相关的呼吸道疾病。并且，优选所述黄连和常春藤叶的结合提取物，因为与每种单独提取物相比可获得协同作用。

[0065] 所述呼吸道疾病可以是有关咳嗽和痰的全部疾病，例如选自：普通咳嗽或痰；带有咳嗽和痰的肺气肿(pulmonary emphysema)；支气管炎例如慢性支气管炎、急性支气管炎、卡他性支气管炎(catarrhal bronchitis)、阻塞性支气管疾病或炎性支气管疾病(obstructive or inflammatory bronchial disease)等；哮喘例如支气管哮喘、变应性气喘(atopic asthma)、IgE介导的支气管变应性哮喘(atopic bronchial IgE-mediated asthma)、非变应性哮喘(non-atopic asthma)、过敏性哮喘(allergic asthma)和非过敏性哮喘(non-allergic asthma)等；慢性或急性支气管收缩；喘鸣性婴儿综合征(stridulus infant syndrome)；慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease)；支气管腺瘤(bronchial adenoma)；孤立性肺结节(solitary pulmonary nodule)；肺结核(pulmonary tuberculosis)；脓胸(pyothorax)；肺脓肿(pulmonary abscess)；普通感冒；流行性感冒和肺组织细胞增多病(pulmonary histiocytosis)。

[0066] 可以以多种途径将本发明的组合物施用于哺乳动物，包括人。本发明的组合物可以通过通常使用的方法施用，例如，其可通过口服、直肠内给药或通过静脉、肌肉、皮下、子宫内或脑室内注射给药。本发明的组合物可被配制为口服剂型例如粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮剂、乳剂、糖浆、气雾剂等，或肠胃外剂型例如经皮给药剂(transdermal agent)、栓剂和灭菌的注射溶液等。

[0067] 本发明的组合物还可以包括制药学适用且生理可耐受的佐剂例如载体、赋形剂和稀释剂。

[0068] 本发明的组合物可单独施用；但是，一般考虑到给药路线和标准药学实践(standard pharmaceutical practice)，所述组合物可与选择的药用载体一同施用。例如，可以以口服、直肠内或舌下方式将所述组合物以含有乳糖或淀粉的片剂形式、单独地以胶囊剂的形式或含有赋形剂的胶囊剂的形式、含有调味剂或着色剂的酏剂的形式或悬浮剂的形式给药。液体剂型可与药用添加剂例如悬浮剂(例如：甲基纤维素；半合成的甘油酯例如witepsol；或甘油酯混合物例如杏仁油和PEG-6酯的混合物，或PEG-8和辛酸甘油酯/癸酸甘油酯的混合物)一起配制。

[0069] 在另一方面，本发明提供了一种含有黄连提取物或黄连和常春藤叶的组合物提取物的用于止咳、祛痰或预防或改善呼吸道疾病例如哮喘的健康功能性食物。所述健康功能性食物可以是食物、饮料或食品添加剂等。

[0070] 在健康功能性食物中作为活性成分的提取物的含量可以根据食物形式和所需用途等适当改变，没有特定的限制。例如，其可以以总食物的0.01至15重量％的量加入，对于健康饮料组合物，其可以基于100ml组合物计以0.02至10g、优选0.3至1g的量加入。 [0071] 在将本发明的草药组合物施用于人体的情况下，考虑到天然提取物的一般性质，认为与其他合成药物相比不必担心副作用，并且实际毒性试验结果证明其对活体没有影响。

附图说明

[0072] 图1在小鼠模型中通过酚红排泌法(phenol red secretion method)示出了黄连提取物及其活性级分和代表成分的祛痰活性。

[0073] 图2示出了在实施例2中制备的提取物的祛痰活性，示出了通过用小鼠进行酚红排泌法所测量的结果。

[0074] 图3示出了在实施例2中制备的提取物的止咳活性，示出了用豚鼠进行止咳试验的结果。

[0075] 图4示出了在实施例2中制备的提取物的抑制支气管收缩活性，示出了使用豚鼠的离体支气管时对收缩诱导物(constriction inducer)的松弛程度(％)。

[0076] 图5示出了在实施例2-7的提取物对肺组织中支气管阻塞的作用， 以及对卵白蛋白致敏(OVA-sensitized)的试验小鼠的肺组织中炎症细胞浸润的抑制活性((a)正常组，(b)诱发组，(c)阳性对照，(d)实施例2-7)。

具体实施方式

[0077] 实施例

[0078] 将参照以下实施例和实验详细地解释本发明。

[0079] 但是，以下实施例和实验只是示例性地说明本发明，本发明的范围并不限于此。 [0080] 实施例1.制备黄连提取物

[0081] 1-1.用水制备黄连提取物

[0082] 1-1-1.制备黄连粗提取物(CR-GA)

[0083] 用水清洗从京东市场(Kyungdong market)购买的黄连以除去杂质，用1.5L水在80℃下对250g干燥黄连进行两次热水提取，每次持续3小时，然后对所得提取物进行过滤并在真空下浓缩得到62.5g粗提取物(相对于原料草药的产率为25％)，将其命名为“CR-GA”，并用于下面的实施例1-2。

[0084] 1-1-2.制备黄连的溶剂可溶提取物(CR-GA-1)

[0085] 向实施例1-1-1获取的62.5g CR-GA加入0.5L水以使其悬浮，并向其中加入1L水饱和丁醇以进行两次分层，然后只收集水饱和丁醇级分并将其在真空下浓缩直至干燥。当大部分丁醇和水蒸发后，加入0.4L水对其进行共沸浓缩，重复两次。最后，加入0.1L蒸馏水来悬浮所得浓缩物，然后冻干所得悬浮液得到19.8g粉末形式的黄连提取物(相对于原料草药的产率为7.92％)，将其命名为“CR-GA-1”在以下实验中用作样本。 [0086] 1-2.用50％(v/v)乙醇制备黄连提取物

[0087] 1-2-1.制备粗黄连提取物(CR-GB)

[0088] 用水清洗从京东市场购买的黄连以除去杂质，用2.0L 50％(v/v)的乙醇水溶液在80℃下对250g干燥黄连进行两次回流提取，每次持续3小时，然后将所得提取物过滤并在真空下浓缩得到57.5g粗提取物(相对于原料草药的产率为23％)，将其命名为“CR-GB”，并用于以下实施例2-2。

[0089] 1-2-2.制备黄连的溶剂可溶提取物(CR-GB-1)

[0090] 向实施例1-2-1获取的57.5g CR-GB中加入0.3L水以使其悬浮，向其中加入0.6L水饱和丁醇以进行两次分层，然后只收集丁醇级分并将其在真空下浓缩直至干燥。当大部分丁醇和水蒸发后，向其中加入0.2L水来对其进行共沸浓缩，重复两次。最后加入0.2L蒸馏水来悬浮所得浓缩物，然后将所得悬浮液冻干得到31.8g粉末形式的黄连提取物(相对于原料草药的产率为12.7％)，将其并命为“CR-GB-1”，并在以下实验中用作样本。 [0091] 1-3.用水饱和丁醇制备黄连提取物

[0092] 1-3-1.制备黄连提取物(CR-GC)

[0093] 用水清洗从京东市场购买的黄连以除去杂质，用2.5L水饱和正丁醇在85℃下对250g干燥黄连进行两次回流提取，每次持续3小时，然后将所得提取物过滤并在真空下浓缩。当大部分丁醇蒸发后，向其中加入0.2L水对其进行共沸浓缩，重复两次。最后向其中加入0.2L蒸馏水以使其悬浮，然后将所得悬浮液冻干得到32.8g粉末形式的提取物(相对于原料草药的产率为13.1％)，将其命名为“CR-GC”，并用于以下实验。

[0094] 1-4.分离黄连提取物

[0095] 用二氯甲烷和甲醇(30∶1-7∶1(v/v))的混合溶剂通过硅胶柱色谱将实施例1-2-2中获取的20g CR-GB-1分为5个级分。Fr.1为0.8g(在下文中称作“Fr.1”)，Fr.2为2.6g(在下文中称作“Fr.2”)，Fr.3为5.5g(在下文中称作“Fr.3”)，Fr.4为2.8g(在下文中称作“Fr.4”)，Fr.5为6.5g(在下文中称作“Fr.5”)，其在以下实验中均用为样本。 [0096] 实施例2制备黄连和常春藤叶的结合提取物

[0097] 制备常春藤叶提取物

[0098] 用水清洗常春藤(洋常春藤(Hedera helix))叶以除去杂质，并将其完全干燥。将3L 30％(v/v)乙醇水溶液加入到250g所制备的常春藤叶中，并回流提取6小时，然后将所得提取物过滤，收集滤 液。将2.5L 30％(v/v)乙醇水溶液加入到残渣中，在80℃下回流提取3小时，然后将所得滤液与先前所得滤液合并，在真空下浓缩。当大部分溶剂蒸发后，加入0.2L水对其进行共沸浓缩，重复两次。然后加入等量水将其均匀悬浮，然后将所得悬浮液冻干得到42.4g粉末形式的常春藤叶提取物。所得常春藤叶提取物被用来制备下面的实施例2-1至2-11的结合提取物。

[0099] 制备黄连提取物

[0100] 用水清黄连以除去杂质，并将其完全干燥。将2.0L 50％(v/v)乙醇水溶液加入到250g所制备的黄连中，并在80℃下回流提取3小时。然后将所得提取物过滤并在真空下浓缩得到57.5g粗提取物。向其中加入0.3L水将其悬浮，然后加入0.6L水饱和丁醇以进行两次分层。然后，只收集丁醇级分并在真空下将其浓缩直至干燥。当大部分丁醇和水蒸发后，加入0.2L水对其进行共沸浓缩，重复两次。最后，向其中加入等量水将其悬浮，将所得悬浮液冻干得到31.8g黄连，所得黄连在下面的实施例2-1至2-11中被用来制备结合提取物。

[0101] 2-1.制备结合提取物(0.2∶1)

[0102] 将以上制备的常春藤叶提取物和黄连提取物以重量比例0.2∶1(常春藤叶提取物的重量∶黄连提取物的重量)混合。为了均匀混合，向合并的提取物中加入约2至3倍重量的水，然后将其于50-60℃在真空下浓缩。然后，向所得浓缩物中再次加入等量水对其进行均匀悬浮，将所得悬浮液冻干来制备粉末形式的结合提取物。

[0103] 2-2.制备结合提取物(0.4∶1)

[0104] 用与上述制备实施例1相同的方法制备结合提取物，除了将所制备的常春藤叶提取物和黄连提取物的比例改变为0.4∶1(常春藤叶提取物的重量∶黄连提取物的重量)。 [0105] 2-3.制备结合提取物(1∶1)

[0106] 用与上述制备实施例1相同的方法制备结合提取物，除了将所制备的常春藤叶提取物和黄连提取物的比例改变为1∶1(常春藤叶提取物的重量∶黄连提取物的重量)。 [0107] 2-4.制备结合提取物(1.5∶1)

[0108] 用与上述制备实施例1相同的方法制备结合提取物，除了将所制 备的常春藤叶提取物和黄连提取物的比例改变为1.5∶1(常春藤叶提取物的重量∶黄连提取物的重量)。

[0109] 2-5.制备结合提取物(2∶1)

[0110] 用与上述制备实施例1相同的方法制备结合提取物，除了将所制备的常春藤叶提取物和黄连提取物的比例改变为2∶1(常春藤叶提取物的重量∶黄连提取物的重量)。 [0111] 2-6.制备结合提取物(2.5∶1)

[0112] 用与上述制备实施例1相同的方法制备结合提取物，除了将所制备的常春藤叶提取物和黄连提取物的比例改变为2.5∶1(常春藤叶提取物的重量∶黄连提取物的重量)。 [0113] 2-7.制备结合提取物(3∶1)

[0114] 用与上述制备实施例1相同的方法制备结合提取物，除了将所制备的常春藤叶提取物和黄连提取物的比例改变为3∶1(常春藤叶提取物的重量∶黄连提取物的重量)。 [0115] 2-8.制备结合提取物(3.5∶1)

[0116] 用与上述制备实施例1相同的方法制备结合提取物，除了将所制备的常春藤叶提取物和黄连提取物的比例改变为3.5∶1(常春藤叶提取物的重量∶黄连提取物的重量)。 [0117] 2-9.制备结合提取物(4∶1)

[0118] 用与上述制备实施例1相同的方法制备结合提取物，除了将所制备的常春藤叶提取物和黄连提取物的比例改变为4∶1(常春藤叶提取物的重量∶黄连提取物的重量)。 [0119] 2-10.制备结合提取物(4.5∶1)

[0120] 用与上述制备实施例1相同的方法制备结合提取物，除了将所制备的常春藤叶提取物和黄连提取物的比例改变为4.5∶1(常春藤叶提取物的重量∶黄连提取物的重量)。 [0121] 2-11.制备结合提取物(5∶1)

[0122] 用与上述制备实施例1相同的方法制备结合提取物，除了将所制备的常春藤叶提取物和黄连提取物的比例改变为5∶1(常春藤叶提取物的重量∶黄连提取物的重量)。 [0123] 实施例3.黄连提取物活性实验

[0124] 3-1.黄连提取物祛痰活性测定

[0125] [实验方法]

[0126] 为了测定实施例1-1至1-3的黄连提取物的祛痰活性，在以下步骤中使用Engler等人的方法(Engler H，Szelenyi I，J.Pharmacol.Moth.11，151-157，1984，，；Bao-quin Lin et.，Pulmonary Pharmacology&Therapeutics 21，259-263，2008.)来进行实验。 [0127] 对雄性小鼠(8周龄，Sam tako BioKorea)经口服给予阳性对照药(氨溴素(ambroxol)，Sigma)和测试药(实施例1-1到1-3的黄连提取物)，30分钟后，经腹膜内注射500mg/kg酚红(酚红溶解在盐水中)。30分钟后，用二乙醚麻醉鼠，切断腹部大动脉取血，然后切下整个气管。将离体的气管置于1ml盐水中清洗30分钟，在室温下以10,000rpm离心5分钟，向上清液加入1N氢氧化钠(NaOH)(每1ml上清液加入0.1ml的1N NaOH)，然后测量在546nm下的吸光度来测定酚红浓度作为祛痰活性。

[0128] [实验结果]

[0129] 所获结果在下表1中示出。

[0130] [表1]

[0131]

[0132] 如上表1所示，实验结果为所述提取物整体上具有极好的活性，特别是实施例2的CR-GB-1显示出最佳痰液分泌活性。

[0133] 并且，测定了实施例2的CR-GC-1各种剂量(50、100、150、200、500mg/kg)的活性，其结果在下表2中示出。

[0134] [表2]

[0135]

[0136] 如上表2所示，实验结果为实施例1-2的CR-GB-1在剂量为500mg/kg时显示最佳痰液分泌活性。

[0137] 3-2.黄连提取物的止咳活性测定

[0138] [实验方法]

[0139] 为测定实施例1-1至1-3的黄连提取物的止咳活性，在以下步骤中用Tanaka等人的方法(Motomu Tanaka and Kei Maruyama.，J.Pharmacol.Sci.93，465-470，2003.，Daoui，Cognon，Naline et.，Am.J.Respir.Crit.Care.Med.158，42-48，1998)进行实验。 [0140] 对雄性豚鼠(6周龄，Sam tako BioKorea)经口服给予测试药物，一小时后，将所述豚鼠置于体积描记器室(plethysmograph chamber，Buxco，U.S.A.)中，然后，将咳嗽诱导物柠檬酸(Sigma)喷雾以引起咳嗽。使用用作止咳药的可可碱(Sigma)作为阳性对照。并且，将所述豚鼠暴露于0.2M柠檬酸10分钟，记录15分钟内的咳嗽次数。

[0141] [实验结果]

[0142] 结果在下表3中示出。

[0143] [表3]

[0144]

[0145]

[0146] 如上表3所示，实验结果为所述提取物整体上具有极好的活性，

[0147] 特别是实施例1-2的CT-GB-1显示最佳止咳活性。

[0148] 并且，测定了实施例1-2的CR-GB-1各种剂量(50、100、150、5200mg/kg)的活性，其结果在下表4中示出。

[0149] [表4]

[0150]

[0151] 如上表4所示，实验结果为实施例1-2的GR-GB-1在剂量为200mg/kg时显示了最佳止咳活性。

[0152] 3-3.黄连提取物抗组胺活性测定

[0153] [实验方法]

[0154] 为测定实施例1-1至1-3的黄连提取物的抗组胺活性，在以下步骤中用Honuchi等人的方法(Masako Honuchi and Yoshiyuki Seyama，J.Health Sci.，52(6)，711-717，2006.，Naoki Inagaki et al.Biol.Pharm.Bull.24(7)，829-834，2001.)进行实验。 [0155] 用卵白蛋白致敏的雄性大鼠(7周龄，Sam tako BioKorea)的腹 膜肥大细胞测定抗组胺活性。使用酮替芬(Ketotifen，Sigma)作为阳性对照。对卵白蛋白致敏的大鼠分别经口服给予浓度为5mg/kg的酮替芬，经口服给予浓度为200mg/kg的测试药4天，然后分离腹膜肥大细胞。用浓度为0.01mg/ml、0.1mg/ml和1.0mg/ml的酮替芬和浓度为0.1mg/ml、
5
1.0mg/ml和10mg/ml的测试药物处理分离的腹膜肥大细胞(2×10 个细胞/ml)。最后，用浓度为10μg/ml的可激发非免疫组胺释放的化合物48/80(Sigma)处理所述肥大细胞。这时，对从肥大细胞释放的组胺进行定量来检测所述测试材料是否抑制组胺从所述肥大细胞中释放。测量从未给予药物的大鼠肥大细胞中释放的组胺的相对量，其结果在下表5示出。 [0156] [表5]

[0157]

[0158]

[0159] 如上表5所示，实验结果为所述提取物整体上具有极好的活性，特别是实施例1-2的CR-GB-1显示最佳抗组胺活性。

[0160] 并且，测定了实施例1-2的CR-GB-1各种剂量(100、200、400mg/kg)的活性，其结果在下表6中示出。

[0161] [表6]

[0162]

[0163] 如上表6所示，实验结果为实施例1-2的GR-GB-1在剂量为400mg/kg时显示最佳抗组胺活性。

[0164] 3-4.活性亚级分的止咳活性的测定

[0165] 为测定在上述实施例1-4中制备的5种亚级分的止咳活性，用与实验3-2相同的方法进行止咳活性实验，其结果在下表7示出。

[0166] [表7]

[0167]

[0168] 如表7所示，实验结果为各提取物整体上具有极好的活性，特别地是Fr.3显示最佳止咳活性。

[0169] 3-5.活性亚级分的抗组胺活性的测定

[0170] 为测定在上述实施例1-4中的5种亚级分的抗组胺活性，按照上述实施例3-3进行相同的实验，其结果在下表8示出。

[0171] [表8]

[0172]

[0173]

[0174] 如表8所示，实验结果为各级分整体上具有极好的活性，特别是Fr.3显示了最佳抗组胺活性。

[0175] 3-6.黄连提取物的化合物的分析

[0176] 为分析以上实施例的黄连提取物及其各级分中的化合物，用物理化学分析例如HPLC、LC/MS、紫外分光光度计和FT-NMR进行实验。

[0177] 结果发现黄连提取物中含有黄连素(berberine)、非洲防己碱(palmatine)、黄连碱(coptisine)、非洲防己胺(columbamine)和药根碱(jarorrhizine)。分析了实施例1-1至1-4的黄连提取物的化合物含量，其结果在下表9示出。

[0178] 通过利用Waters PDA 2996的Waters Alliance2695型测量高效液相色谱。使用色谱柱YMC Hydrosphere C18(S-5μm，120nm，4.6×250mm I.D)，并且样本温度保持在25℃±1，柱温度保持在30℃±1。样品浓度为1mg/ml，进样量为10μl，流速为1.0ml/min。
对于作为标准物质的黄连素、非洲防己碱和黄连碱，从Sigma公司购买市售商品并使用，对于作为标准物质的非洲防己胺和药根碱，使用从黄连中纯 化的物质。流动相为0.2％磷酸溶液(溶剂A)和甲醇(溶剂B)梯度条件：0～60分钟(A∶B＝9∶1～6∶4)，60～
70分钟(A∶B＝6∶4～5∶5)，70～90分钟(A∶B＝5∶5～0∶10)。提取物中
的化合物的含量通过每种标准物质重量百分比的面积比来表示。

[0179] [表9]

[0180]

[0181] 如上表9所示，比较各提取物和各级分的主要化合物的含量的结果为发现含有0.5至47.0重量份数的黄连素、0.2至21.4重量份数的非洲防己碱、0.1至18.0重量份数的黄连碱、0.1至3.2重量份数的非洲防己胺和0.1至2.6重量份数的药根碱。 [0182] 3-7.对黄连素的祛痰活性的测定

[0183] 为测定实施例1-2和1-3及实施例1-4制备的5种亚级分的祛痰活性，按照上述实验1进行相同的测定祛痰活性实验，其结果在下表10示出，并在图1中示出活性柱状图。 [0184] [表10]

[0185]

[0186]

[0187] 实施例4：黄连和常春藤叶的结合提取物的活性测试

[0188] 4.1.祛痰活性的测定

[0189] 为评价实施例2(2-1至2-11)中制备的结合提取物和单个提取物的祛痰活性，用与实验3-1的[实验方法]中描述的相同方法(使用Engler等人的方法(Engler H，Szelenyi I，J.Pharmacol.Moth.l1，151-157，1984.，Bao-quin Lin et.，Pulmonary Pharmacology&Therapeutics 21，259-263，2008.))进行实验，其实验结果在图2中显示。在图2中，将氨溴素以250mg/kg的剂量经口服给药作为阳性对照，其余的测试药物以500mg/kg的剂量经口服给药。并且，对显示最佳活性的实施例2-7的提取物测定其根据剂量的祛痰活性，其结果在下表11示出。

[0190] [表11]

[0191]

[0192] 如图2所示，实施例2-1至2-11的所有结合提取物与单独的常春藤叶提取物相比表现出改善的祛痰效果，从中可以确定将黄连提取物和常春藤叶提取物结合存在药理活性的协同作用。

[0193] 特别地，实施例2-3至2-9显示出比现有祛痰剂氨溴素更好的祛痰效果，从中显示如果将黄连提取物和常春藤叶提取物以重量比1∶1至1∶4组合，可获得更高的祛痰效果。

[0194] 上表11示出了对具有最高的活性的实施例2-7根据剂量的活性的评估结果，确定实施例2-7的材料具有比阳性对照药物更好的分泌痰液的能力。具体地，实施例2-7的材料在剂量为100mg/kg或更大时显示出与阳性对照相似的效果，而在剂量为150mg/kg或更大时显示出比阳性对照更好的效果。

[0195] 4-2.止咳活性测定

[0196] 为测定常春藤叶提取物与在实施例2中制备的黄连和常春藤叶的结合提取物(实施例2-1至2-11)的止咳活性，用与实验3-2中[实验方法]描述的相同方法——使用Tanaka等人的方法(Motomu Tanaka and KeiMaruyama.，J.Pharmacol.Sci.93，465-470，2003.，Daoui，Cognon，Naline et.，Am.J.Respir.Crit.Care.Med.158，42-48，1998.)——进行实验，其结果在图3示出。

[0197] 在图3中，将可可碱以50mg/kg的浓度经口服给药以作为阳性对照，而其余测试药物以200mg/kg的浓度经口服给药。并且，对于显示最佳活性的实施例2-7，根据剂量评估止咳活性，其结果在下表12示出。

[0198] [表12]

[0199]

[0200] 如图3所示，实施例2-1至2-11的所有结合提取物与单独的常春藤叶提取物相比均表现出提高的止咳活性，从中确定将黄连提取物和常春藤叶提取物结合存在药理活性的协同作用。特别地，实施例2-3至2-9显示出比现有的止咳药可可碱更好的止咳效果，从中显示如果将常春藤叶提取物和黄连提取物以1∶1至4∶1的重量比组合，可获得更好的止咳效果。

[0201] 并且，上表12示出对具有最高活性的实施例2-7根据剂量的活性的评估结果，从中显示实施例2-7的材料在剂量为100mg/kg或更大时表现出与阳性对照相似的效果，在剂量为150mg/kg时则表现出比阳性对照更好的效果。

[0202] 4-3.抗组胺作用测定

[0203] 为测定常春藤叶提取物与在实施例2中制备的黄连和常春藤叶的结合提取物(实施例2-1至2-11)在肥大细胞中的抗组胺作用，用与实验3-3中[实验方法]描述的相同方法——使用Honuchi等人的方法(Masako Honuchi and Yoshiyuki Seyama，J.Health Sci.，52(6)，711-717，2006.，Naoki Inagaki et.Biol.Pharm.Bull.24(7)，829-834，2001.)——进行实验，其结果在下表13示出。并且，对于显示最佳活性的实施例2-7，测定其根据剂量的抗组胺作用，其结果在下表14示出。

[0204] [表13]

[0205]

[0206]

[0207]

[0208] [表14]

[0209]

[0210]

[0211] 如表13所示，确定常春藤叶提取物和实施例2-1至2-11的结合提取物均具有抗组胺作用。具体地，其表明如果将分别具有抗组胺活性的常春藤叶提取物和黄连提取物组合，会存在协同作用。并且，上表14示出对具有最佳活性的实施例2-7根据剂量的评估结果，显示实施例2-7的材料表现出极好的抗组胺活性。

[0212] 4-4.抑制支气管收缩的实验(体外)

[0213] 为了测定常春藤叶提取物与实施例2中制备的黄连和常春藤叶的结合提取物(实施例2-1至2-11)的抑制支气管收缩的作用，在以下步骤中用Casoni GL等人的方法(Clin Exp Allergy.，33，999-1004，2003，Anesth Analg.，89，191-196，1999，Br J Pharmacol.，128，577-584，1999)进行实验。

[0214] 用戊巴比妥钠(Pentobarbital sodium)(75/mg/kg)向雄性哈特利豚鼠(Hartely guinea pig)(350～400g，Daehan Biolink)腹膜内给药来使其麻醉，然后切取气管。将离体气管在克雷伯-亨泽莱特溶液(Krebs-Henseleit solution)中切为约3～5mm的片段，-4然后将其固定在器官浴槽中并且灌注10 M组胺来使离体气管收缩。然后，向 其中加入实-5
验材料(0.50mg/ml)来测定所述离体气管的张力度变化。使用浓度为2.6×10 mg/ml的硝-4
普酸钠二水合物(sodium nitroprusside dihydrate)作为阳性对照药物。假设由10 M组胺引起的收缩是100％，通过用在相同条件下得到的实验材料给药组和阳性对照药物给药组的松弛率(％)减去赋形剂对照组的松弛率(％)计算实验材料给药组和阳性对照药物给药组的松弛率(％)。计算所得支气管松弛率(抑制支气管收缩活性)在图4中示出，并且对于表现出最佳活性的实施例2-7，测量根据剂量的气管松弛率，结果在下表15中示出。 [0215] [表15]

[0216]

[0217] 如图4所示，确定常春藤叶提取物和实施例2-1至2-11的结合提取物有抑制气管收缩作用。并且，其表明实施例2-1至2-11的所有结合提取物均表现出比单独的常春藤叶提取物更高的对气管收缩的抑制作用。上表15示出了对具有最佳活性的实施例2-7根据剂量的活性的评估结果，从中显示实施例2-7的材料表现出极好的对气管收缩的抑制作用。 [0218] 4-5.用鼠哮喘模型进行的抗哮喘作用实验

[0219] 为利用鼠哮喘模型来确定在实验4-1至4-4中显示最佳效果的实施例2-7的结合提取物的抗哮喘作用，用Tang M.L.K.等 人的方法(Pulmonary
Pharmacology&Therapeutics，14，203-210，2001，Immunology and Cell Biology 79，
141-144，2001，Journal of Experimental Medicine 189(10)，1621-1629，1999)进行实验。并进行乙酰甲胆碱(methacholine)的气道高反应性(airway

[0220] [实验方法]

[0221] 在0天和第7天将为进行腹膜内注射制备的卵白蛋白(OVA，Sigma)溶液以每只小鼠500μl(相当于20μgOVA)的剂量对Balb/c小鼠(18～21g，Orientbio Inc.)腹膜内给药，并且用为进行OVA吸入——借助nubulizer(NE-U17，OMRON Co.Ltd，Japan)——制备的溶液将其致敏，然后从第14天至第20天每日吸入所制备的5％OVA30分钟。使用30mg/kg的孟鲁司特钠(montelukast sodium)作为阳性对照，并且所有实验材料以200mg/kg的量使用。并且，在致敏后从第14天至第20天的7天内每天将阳性对照药物和实验材料口服给药，1小时后进行OVA吸入，然后根据以下评价项目来进行实验。

[0222] 1)对乙酰甲胆碱的气道高反应性(AHR)的检测

[0223] 最后一次OVA吸入24小时后(第21天)，将小鼠置于全身体积描记器中(BUXCO，USA)，将浓度为0、10和20mg/ml的乙酰甲胆碱溶液每种0.4ml以气雾剂的形式引入，使小鼠分别吸入3分钟。并且从吸入时起测量Penh 4分钟，并且平均值被设置为乙酰甲胆碱相应剂量的Penh(呼气间歇(enhanced pause))。

[0224] 2)血浆中IgE值的检测(第21天)

[0225] 对根据1)检测过的动物，通过眶血取样收集约0.05ml血并且离心，将所获血浆分为2份，并以1∶10的比例稀释以通过IgE酶联免疫实验(ELISA；小鼠IgE ELISA试剂盒，ME-151，SHIBAYAGI Co.，Ltd.，JAPAN)检测血浆中免疫球蛋白E(IgE)值。

[0226] 3)支气管肺泡灌洗液(BALF)中的细胞数量和白细胞分布的检测(第22天)[0227] 对根据2)取过血样的动物腹膜内注射硫喷妥钠(sodiumpentothal)(50mg/kg)将其麻醉。然后，用镊子固定左肺，将0.4mlPBS溶液注射入支气管和肺，然后回吸(extracted)并将其灌洗液收集，重复3次。然后以1500g离心所述灌洗液，丢弃上清液，然后向 所得沉淀加入0.2ml PBS以使其再次悬浮。用自动血细胞分析仪(Advia 120coulter counter，BAYER，Germany)检测所述悬浮液的白细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞总数。

[0228] 4)肺组织观察

[0229] 将镊子固定的左肺取下，用10％的甲醛溶液固定1天，然后用切片机将用组织处理器浸蜡的组织切为3-4μm厚的组织切片。用曙红将制备的载玻片染色，然后用香脂覆盖盖玻片，在显微镜下观察来检测支气管的堵塞程度和炎症细胞的浸润程度。 [0230] 5)RT-PCR

[0231] 实验前迅速取下右肺组织并于-80℃贮存。用RNA-Bee(Tel-TestInc.USA)从所述组织中分离RNA，用分光计在260nm下将分离的RNA定量，然后加入4μg RNA和2μl Oligo dT(Promega)，加入DEPC水使总体积达10μl，并使所得混合物于65℃反应5分钟。然后加入5×反应缓冲液5μl+RNA酶2μl+dNTP 5μl+RNA酶抑制剂1μl+DEPC水2μl，使总体积25μl混合物在42℃下反应1小时，然后在100℃反应5分钟制备cDNA。所有试剂均购自Promega。用制备的引物(IL-1β，IL-4，IL-13r2a)进行PCR。使用的引物如下： [0232] IL-1β正向：5′-TCATGGGATGATGATGATAACCTGCT-3′(序列1)，

[0233] IL-1β反向：5′-CCCATACTTTAGGAAGACACGGATT-3′(序列2)；

[0234] IL-4正向：5′-TCATCGGCATTTTGAACGAG-3′(序列3)，

[0235] IL-4反向：5′-GAATCCAGGCATCGAAAAGC-3′(序列4)；

[0236] IL-13r2a正向：5′-GGTTATGCCAAATGCACTTGAG-3′(序列5)

[0237] IL-13r2a反向：5′-ATGGCTTTTTGTGCATATCAGAT-3′(序列6)。

[0238] PCR条件为94℃下30秒、56℃下30秒和72℃下1分钟的32个循环。将PCR得到的反应物在2％琼脂糖凝胶中进行电泳并用EtBR染色，然后紫外照射并且比对所得密度，将其除以肌动蛋白密度(actin density)来分析该值。

[0239] [实验结果]

[0240] 1)对乙酰甲胆碱的气道高反应性(AHR)的检测

[0241] 用作阳性对照药物的孟鲁司特(DR.REDDY’S)、常春藤叶提取物和实施例2-7的结合提取物对乙酰甲胆碱的气道高反应性在下表16示出。

[0242] [表16]

[0243]

[0244] 如上表16所示，实施例2-7的结合提取物比单独的常春藤叶提取物表现出更好的抑制气道高反应性的作用。

[0245] 2)血浆中IgE值的检测

[0246] 作为阳性对照药物的孟鲁司特(DR.REDDY’S)、常春藤叶提取物和实施例2-7的结合提取物根据浓度的血浆IgE值在下表17示出。

[0247] [表17]

[0248]

[0249] 如表17所示，与接受单独的常春藤叶提取物组和接受阳性对照药物组相比，接受本发明实施例2-7材料组具有较低的IgE值，所述 IgE介导炎症。

[0250] 3)支气管肺泡灌洗液(BALF)中的细胞数量

[0251] 作为阳性对照药物的孟鲁司特(DR.REDDY’S)、常春藤叶提取物和实施例2-7的结合提取物根据浓度的支气管肺泡灌洗液中中性粒细胞数和嗜酸性粒细胞数在下表18示出。

[0252] [表18]

[0253]

[0254] NEU；中性粒细胞，EOS；嗜酸性粒细胞

[0255] 如上表18所示，与接受单独的常春藤叶提取物组和接受阳性对照药物组相比，接受本发明实施例2-7材料组具有较低的与炎症有关的白细胞(中性粒细胞，嗜酸性粒细胞)计数。

[0256] 4)肺组织观察

[0257] 作为阳性对照药物的孟鲁司特、常春藤叶提取物和实施例2-7的结合提取物根据浓度的支气管阻塞程度和炎症细胞浸润程度在下表19中示出，并且在图5中示出了通过H&E着色染色的肺组织照片((a)正常组，(b)诱导组，(c)阳性对照组，(d)实施例2-7)。在下表19中，根据支气管阻塞程度和炎症细胞浸润程度，1＝无、2＝轻微、3＝微弱(thin)、4＝中度、5＝高度(thick)。

[0258] [表19]

[0259]

[0260]

[0261] 如上表19所示，实施例2-7的结合提取物表现出比常春藤叶提取物和阳性对照药物更好的抑制支气管阻塞和炎症细胞浸润的作用。

[0262] 5)RT-PCR

[0263] 作为阳性对照药物的孟鲁司特、常春藤叶提取物和实施例2-7的结合提取物根据浓度的炎症介导细胞因子(IL-1β，IL-4，IL-13r2a)表达率在下表20示出。在表20中，每个值都是通过用根据紫外照射的每个细胞因子的密度除以肌动蛋白密度而得到的。 [0264]

[0265] 如上表20所示，与接受单独的常春藤叶提取物组和接受阳性对照药物组相比，接受实施例2-7材料组中炎症介导细胞因子(IL-1β，IL-4，IL-13r2a)的表达被更强地抑制。 [0266] 实施例5.配制黄连提取物

[0267] 5-1.制备粉末

[0268] 黄连提取物(实施例1-1) 20mg

[0269] 乳糖 100mg

[0270] 滑石 10mg

[0271] 将上述成分混合并装在密封袋中来制备粉末。

[0272] 5-2.制备片剂

[0273] 黄连提取物(实施例1-2) 10mg

[0274] 玉米淀粉 100mg

[0275] 乳糖 100mg

[0276] 硬脂酸镁 2mg

[0277] 将上述成分混合，用常规片剂制备方法来压缩以制备片剂。

[0278] 5-3.制备胶囊剂

[0279] 黄连提取物(实施例1-3) 10mg

[0280] 微晶纤维素 3mg

[0281] 乳糖 14.8mg

[0282] 硬脂酸镁 0.2mg

[0283] 用常规胶囊制备方法将上述成分混合并填充于凝胶胶囊中来制备胶囊剂。 [0284] 5-4.制备注射剂

[0285] 黄连提取物(实施例1-4) 10mg

[0286] 甘露醇 180mg

[0287] 注射用无菌水 2974mg

[0288] Na2HPO4，12H2O 26mg

[0289] 通过常规的注射剂制备方法用上述含量的成分制备1安瓿(ample)(2ml)。 [0290] 5-5.制备溶液剂

[0291] 黄连提取物(实施例1-1) 20mg

[0292] 高果糖玉米糖浆(high fructose corn syrup)10g

[0293] 甘露醇 5g

[0294] 纯化水 适量

[0295] 根据常规的溶液剂制备方法，将每种成分加入纯化水并溶解于其中，向其中加入适量柠檬。然后将上述成分混合，向其中加入纯化水至总量为100ml，然后将其装入棕色瓶中并灭菌来制备溶液剂。

[0296] 5-6.制备健康食物

[0297] 黄连提取物(实施例1-2) 1000mg

[0298] 维生素A 乙酸酯 70μg

[0299] 维生素E 1.0mg

[0300] 维生素B1 0.13mg

[0301] 维生素B2 0.15mg

[0302] 维生素B6 0.5mg

[0303] 维生素B12 0.2μg

[0304] 维生素C 10mg

[0305] 生物素 10μg

[0306] 烟酰胺 1.7mg

[0307] 叶酸 50μg

[0308] 泛酸钙 0.5mg

[0309] 矿物质混合物(mineral mixture)适量

[0310] 硫酸亚铁 1.75mg

[0311] 氧化锌 0.82mg

[0312] 碳酸镁 25.3mg

[0313] 磷酸二氢钾 15mg

[0314] 磷酸氢钙 55mg

[0315] 柠檬酸钾 90mg

[0316] 碳酸钙 100mg

[0317] 氯化镁 24.8mg

[0318] 上述维生素和矿物质混合物的比例示例性地说明一个相对适合健康食物的混合成分的优选实施例；但是，所述比例可被改进。并且，可根据常规的健康食物制备方法将上述成分混合，然后制成颗粒，用于通过常规方法制备健康食物。

[0319] 5-7.制备健康饮料

[0320] 黄连提取物(实施例1-3) 1000mg

[0321] 柠檬酸 1000mg

[0322] 低聚糖 100g

[0323] 梅浓缩物(Japanese apricot concentrate)2g

[0324] 牛磺酸 1g

[0325] 纯化水 加至总量为900ml

[0326] 根据常规的健康饮料制备方法将上述成分混合，在搅拌下于85℃加热1小时，然后将所得溶液过滤收集在一个灭菌的2L容器中，密封灭菌并冷却储藏。

[0327] 上述比例示例性地说明一个相对适合受欢迎饮料的混合成分的优选实施例；但是，所述比例可根据地域和种族口味(例如需求阶层、需求国家、用途等)而被改进。 [0328] 实施例6.配制黄连和常春藤叶的结合提取物

[0329] 6-1.制备片剂

[0330] 将200mg实施例2-7的结合提取物、10mg轻质无水硅酸、2mg硬脂酸镁、50mg微晶纤维素、25mg淀粉羟基乙酸钠、113mg玉米淀粉和适量无水乙醇混合并用常规方法压制为片剂。

[0331] 6-2.制备健康食品

[0332]

[0333]

[0334] 上述维生素和矿物质混合物的比例示例性地说明一个相对适合健康食物的混合成分的优选实施例；但是，所述比例可被改进。并且，可根据常规的健康食物制备方法将上述成分混合，制成颗粒，用于通过常规方法制备健康食物。

[0335] 6-3.制备健康饮料

[0336]

[0337] 根据常规的健康饮料制备方法将上述成分混合，在搅拌下于85℃加热1小时，然后将所得溶液过滤并收集在一个灭菌的2L容器中，密封灭菌并冷却储藏。

[0338] 上述比例示例性地说明一个相对适合健康饮料的混合成分的优选实施例；但是，所述比例可根据地域和种族口味(例如需求阶层、需求国家、用途等)而被改进。