4-(环己基)-胺基喹唑啉类化合物的应用

摘要

本发明涉及医学免疫学领域，公开一种式I所示化合物在制备诱导T细胞分化为FoxP3+CD4+调节性T细胞和抑制T细胞增殖的药物中的应用，本发明所述式I所示化合物为4-(环己基)-胺基喹唑啉类化合物。本发明所述式I化合物在抑制T细胞增殖以及诱导T细胞分化为FoxP3+CD4+调节性T细胞中的作用显著，用其制备的诱导T细胞分化为FoxP3+CD4+调节性T细胞和抑制T细胞增殖的药物能够用于自身免疫疾病和移植排斥反应。

权利要求

+ +

1.4-(环己基)-胺基喹唑啉在制备诱导T细胞分化为FoxP3CD4 调节性T细胞和抑制T细胞增殖的药物中的应用。

+ +

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述诱导T细胞分化为FoxP3CD4 调节性T细胞和抑制T细胞增殖的药物用于自身免疫疾病或移植排斥反应。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述移植排斥反应为组织移植排斥反应或器官移植排斥反应。

4.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述自身免疫疾病为I型糖尿病、系统性红斑狼疮、多发性硬化症或类风湿关节炎。

说明书

4-(环己基)-胺基喹唑啉类化合物的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及医学免疫学领域，具体涉及4-(环己基)-胺基喹唑啉类化合物在制备+ +诱导T细胞分化为FoxP3CD4 调节性T细胞和抑制T细胞增殖的药物中的应用。 背景技术

[0002] 免疫应答是指机体免疫系统接受抗原刺激后，淋巴细胞特异性识别抗原，发生活化、增殖、分化或失能、凋亡，进而发挥生物学效应的全过程。免疫应答分为T细胞介导的细胞免疫和B细胞介导的体液免疫。虽然体液免疫是由B细胞介导，但是在T细胞辅助下才能产生。由此可见，T细胞在整个免疫应答中是比较关键的一类淋巴细胞。 [0003] 免疫应答最基本的生物学意义是识别“自己”和“非己”，并清除“非己”抗原性物质，以保护机体免受抗原异物的侵袭。但在某种情况下，免疫应答也可能对机体造成损伤，如自身免疫疾病和移植排斥反应。自身免疫疾病，指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病，它是由于机体自身免疫耐受遭到破坏，导致T细胞过度活化、增殖引起的免疫功能异常；而移植排斥反应是指在组织移植或器官移植中，受者接受供者的移植物后，引起受者的免疫系统与供者的移植物发生免疫反应，损害受者机体正常机能。 [0004] 为了能有效治疗自身免疫疾病和避免移植排斥反应，目前在临床上普遍使用免疫调节剂，如CsA、FK506、MMF等。但是这些物质在抑制T细胞活化和增殖的同时，也抑制了调节性T细胞，而调节性T细胞对于诱导自身免疫耐受是至关重要的。调节性T细胞是T细胞的一个亚群，它通过抑制效应性T细胞和效应性B细胞的活性，诱导自身免疫耐受，保护组织器官不受自身免疫攻击而受到损伤。同时，调节性T细胞还限制针对病原性抗原免疫应答过度所致的免疫损伤，对维持机体免疫动态平衡具有至关重要的作用。 [0005] FoxP3+CD4+调节性T细胞是调节性T细胞中的一种，在自身免疫 耐受和移植免疫+ +耐受的诱导和维持中具有重要作用。其中，FoxP3是FoxP3CD4 调节性T细胞的标志性分+ + + +
子，属foxhead家族成员，组成性表达于FoxP3CD4 调节性T细胞，介导FoxP3CD4 调节性T细胞在胸腺的发育、外周表达及功能维持，并通过影响Th细胞的功能来调节机体免疫应+ +
答和免疫耐受。FoxP3CD4 调节性T细胞的数量下降，将导致免疫调节功能缺陷，诱发严重的自身免疫疾病。

[0006] 因此，一种既能抑制T细胞增殖又能诱导FoxP3+CD4+调节性T细胞分化的药物，对治疗自身免疫疾病和避免移植排斥反应具有重要意义。

发明内容

[0007] 本发明提供了式I所示化合物在制备诱导T细胞分化为FoxP3+CD4+调节性T细胞和抑制T细胞增殖的药物中的应用。

[0008] 本发明所述式I化合物为4-(环己基)-胺基喹唑啉类化合物，结构如下： [0009]

[0010] 其中，式I中R为H、Cl、F、羧基、硝基、三氟甲基或C1-C4的烷基。目前，相关文献已经报道了4-(环己基)-胺基喹唑啉类化合物在炎症、肿瘤及病毒感染等疾病的预防和治疗方面的应用，但是还未见4-(环己基)-胺基喹唑啉类化合物在抑制T细胞增殖和诱导T+ +细胞分化为FoxP3CD4 调节性T细胞的相关报道。

[0011] 本发明所述式I化合物在人和小鼠T细胞增殖抑制试验中效果极其显著；同时，在+ + + +FoxP3CD4 调节性T细胞的流式检测试验中也能够 显著提高FoxP3CD4 调节性T细胞的数+ +
量。以上试验结果充分表明式I化合物既能抑制T细胞增殖又能诱导FoxP3CD4 调节性T+ +
细胞分化，可用于制备诱导T细胞分化为FoxP3CD4 调节性T细胞和抑制T细胞增殖的药物。

[0012] 在正常情况下，机体免疫系统将自身组织的抗原成分识别为“自我”，一般不对其产生免疫应答，或仅产生微弱的免疫应答，此为自身免疫耐受。但在免疫功能异常的情况下，自身免疫耐受遭到破坏，机体免疫系统针对自身抗原产生免疫应答，此为自身免疫应答。如果自身免疫应答过强、持续时间过长，以致破坏自身正常组织结构并引起相应临床症状，就会引发自身免疫疾病，例如I型糖尿病、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、类风湿关+ +节炎等。从发生机理上讲，由于调节性T细胞特别是FoxP3CD4 调节性T细胞的数量下降，使得非自身耐受的反应性T细胞不受抑制，从胸腺内进入血液循环与自身抗原相遇，过度活化、增殖并发生免疫应答，导致自身组织损害。依据上述试验结果，本发明所述式I+ +
化合物能够抑制过度增殖的T细胞，同时诱导T细胞分化为FoxP3CD4 调节性T细胞，使+ +
FoxP3CD4 调节性T细胞的比例上升，恢复自身免疫耐受，有效治疗自身免疫疾病。 [0013] 在移植排斥反应中，移植物大都是非己抗原，受者的免疫系统无法建立移植物抗原成分的免疫耐受，因此会将移植物视为“入侵者”并与之发生免疫应答，进而损害受者的机体组织。虽然这种现象属于正常的免疫反应，但对于器官或组织移植来说是不利的。本发明所述式I化合物通过抑制与移植物发生免疫反应的T细胞，确保机体结构不受损伤，同+ +
时诱导FoxP3CD4 调节性T细胞分化，调节受者免疫机能，建立移植物与受者免疫系统之间的免疫耐受，避免移植排斥反应的发生。

[0014] 综上所述，本发明所述式I化合物能够抑制T细胞活化增殖，从而能抑制由非己或自身抗原诱发的免疫应答，保护机体不受损伤；同时，式I化合物还能够诱导T细胞分化为+ + + +FoxP3CD4 调节性T细胞，从而提高自身免疫疾病患者体内FoxP3CD4 调节性T细胞的数+ +
量，使 自身免疫耐受恢复正常。对于移植排斥反应，分化出的FoxP3CD4 调节性T细胞抑制与移植物发生免疫应答的反应性T细胞，使反应性T细胞不能进入血液循环，进而避免与移植物抗原发生免疫应答，最终建立起新的自身免疫耐受。

[0015] 本发明所述式I化合物在抑制T细胞增殖以及诱导T细胞分化为FoxP3+CD4+调节+ +性T细胞中的作用显著，用其制备的诱导T细胞分化为FoxP3CD4 调节性T细胞和抑制T细胞增殖的药物能够用于自身免疫疾病和移植排斥反应。

附图说明

[0016] 图1所示为本发明所述4-(环己基)-胺基喹唑啉对小鼠T细胞增殖抑制试验的β液闪仪统计结果图；

[0017] 其中，柱形1为对照组，即体外刺激后未加4-(环己基)-胺基喹唑啉；柱形2为试验组，即外刺激后添加4-(环己基)-胺基喹唑啉；柱形3为空白组，即未经体外刺激和未添加4-(环己基)-胺基喹唑啉；纵坐标为CPM值，即每分钟放射性计数；

[0018] 图2所示为本发明所述4-(环己基)-胺基喹唑啉对人T细胞增殖抑制试验的β液闪仪统计结果图；

[0019] 其中，柱形1为对照组，即体外刺激后未加4-(环己基)-胺基喹唑啉；柱形2为试验组，即外刺激后添加4-(环己基)-胺基喹唑啉；柱形3为空白组，即未经体外刺激和未添加4-(环己基)-胺基喹唑啉；纵坐标为CPM值，即每分钟放射性计数；

[0020] 图3所示为流式检测小鼠脾细胞FoxP3+CD4+调节性T细胞分化的对照组FoxP3+/+CD4 散点图，对照组即体外刺激后未加4-(环己基)-胺基喹唑啉；

[0021] 其中，右上角区域表示被FoxP3抗体标记多、被CD4抗体标记多的细胞；左上角区域表示被FoxP3抗体标记多、被CD4抗体标记少的细胞；右下角区域表示被FoxP3抗体标记少、被CD4抗体标记多的细胞；左下角区域表示被FoxP3抗体标记少、被CD4抗体标记少的细胞；

[0022] 图4所示为流式检测小鼠脾细胞FoxP3+CD4+调节性T细胞分化的试验组FoxP3+/+CD4 散点图，试验组即外刺激后添加4-(环己基)-胺基喹唑啉；

[0023] 其中，右上角区域表示被FoxP3抗体标记多、被CD4抗体标记多的细胞；左上角区域表示被FoxP3抗体标记多、被CD4抗体标记少的细胞；右下角区域表示被FoxP3抗体标记少、被CD4抗体标记多的细胞；左下角区域表示被FoxP3抗体标记少、被CD4抗体标记少的细胞；

[0024] 图5所示为流式检测小鼠脾细胞FoxP3+CD4+调节性T细胞分化的空白组FoxP3+/+CD4 散点图，空白组即未经体外刺激和未添加4-(环己基)-胺基喹唑啉； [0025] 其中，右上角区域表示被FoxP3抗体标记多、被CD4抗体标记多的细胞；左上角区域表示被FoxP3抗体标记多、被CD4抗体标记少的细胞；右下角区域表示被FoxP3抗体标记少、被CD4抗体标记多的细胞；左下角区域表示被FoxP3抗体标记少、被CD4抗体标记少的细胞；

[0026] 图6所示为流式检测人外周血细胞FoxP3+CD4+调节性T细胞分化的对照组+ +FoxP3/CD4 散点图，对照组即体外刺激后未加4-(环己基)-胺基喹唑啉； [0027] 其中，右上角区域表示被FoxP3抗体标记多、被CD4抗体标记多的细胞；左上角区域表示被FoxP3抗体标记多、被CD4抗体标记少的细胞；右下角区域表示被FoxP3抗体标记少、被CD4抗体标记多的细胞；左下角区域表示被FoxP3抗体标记少、被CD4抗体标记少的细胞；

[0028] 图7所示为流式检测人外周血细胞FoxP3+CD4+调节性T细胞分化的试验组+ +FoxP3/CD4 散点图，试验组即外刺激后添加4-(环己基)-胺基喹唑啉；

[0029] 其中，右上角区域表示被FoxP3抗体标记多、被CD4抗体标记多的细胞；左上角区域表示被FoxP3抗体标记多、被CD4抗体标记少的细胞；右下角区域表示被FoxP3抗体标记少、被CD4抗体标记多的细胞；左下角区域表示被FoxP3抗体标记少、被CD4抗体标记少的细胞；

[0030] 图8所示为流式检测人外周血细胞FoxP3+CD4+调节性T细胞分化 的空白组+ +FoxP3/CD4 散点图，空白组即未经体外刺激和未添加4-(环己基)-胺基喹唑啉； [0031] 其中，右上角区域表示被FoxP3抗体标记多、被CD4抗体标记多的细胞；左上角区域表示被FoxP3抗体标记多、被CD4抗体标记少的细胞；右下角区域表示被FoxP3抗体标记少、被CD4抗体标记多的细胞；左下角区域表示被FoxP3抗体标记少、被CD4抗体标记少的细胞。

具体实施方式

[0032] 本发明公开了式I所示化合物在制备诱导T细胞分化为FoxP3+CD4+调节性T细胞和抑制T细胞增殖的药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0033] 本发明提供了式I所示化合物在制备诱导T细胞分化为FoxP3+CD4+调节性T细胞和抑制T细胞增殖的药物中的应用。

[0034] 其中，所述诱导T细胞分化为FoxP3+CD4+调节性T细胞和抑制T细胞增殖的药物用于自身免疫疾病和移植排斥反应。所述自身免疫疾病包括但不限于I型糖尿病、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、类风湿关节炎；所述移植排斥反应为器官移植排斥反应或组织排斥反应。

[0035] 本发明所述式I化合物是4-(环己基)-胺基喹唑啉类化合物，结构如下： [0036] 其中，式I中R为H、Cl、F、羧基、硝基、三氟甲基或C1-C4的烷基。 [0037] 本发明通过对小鼠脾细胞和人外周血细胞体外刺激，用3H-TdR检测小鼠以及人T细胞的增值，结果显示对照组CPM值明显高于试验组CPM值(P＜0.001)，效果极显著。表明本发明所述式I化合物能够抑制T细胞的增殖。

[0038] 本发明还对分离的小鼠脾细胞以及正常人外周血细胞体外刺激，FACS检测+ + + +FoxP3CD4 调节性T细胞的分化，结果显示，试验组中FoxP3CD4 调节性T细胞比例比对照+ +
组分别升高了12和25倍。表明本发明所述式I化合物能有效诱导T细胞分化为FoxP3CD4调节性T细胞。

[0039] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明所述式I化合物在抑制T细胞+ +增殖以及诱导T细胞分化为FoxP3CD4 调节性T细胞中的应用进行详细描述。 [0040] 实施例1：小鼠T细胞增殖抑制试验

[0041] 无菌分离小鼠的脾细胞并裂解红细胞后，加入96孔培养板中，1-2×105细胞/100μL/孔。加入抗CD3(终浓度1μg/mL)、抗CD28单抗(终浓度1μg/mL)、重组IL-2(终浓度10Unit/mL)体外刺激，100μL/孔，设加入4-(环己基)-胺基喹唑啉的为试验组，3孔/组；未加4-(环己基)-胺基喹唑啉的为对照组，3孔/组。同时，设不经上述体外刺激，也不添加4-(环己基)-胺基喹唑啉的为空白组，3孔/组。

[0042] 将三组样品，于37℃、5％CO2条件下孵育66h，每孔加入0.5-1μci3H-TdR 50μL，继续培养12h。用DYQ-II型多头细胞收集仪收集各组样品于9999型玻璃纤维滤纸上，烤干后β液闪仪计数，结果参见图1。

[0043] 结果显示，对照组T细胞增殖非常迅速，其CPM值在22000左右，而加入4-(环己基)-胺基喹唑啉的试验组，T细胞的增殖显著受到抑制，没有经体外刺激的空白组没有检测到T细胞增殖(P＜0.001)。其他式I所示化合物如6-氟-4-(环己基)-胺基喹唑啉、7-三氟甲基-4-(环己基)- 胺基喹唑啉、8-乙基-4-(环己基)-胺基喹唑啉等同样具有上述显著效果。表明本发明所述式I化合物能够显著抑制小鼠T细胞的增殖。 [0044] 实施例2：人T细胞增殖抑制试验

[0045] 无菌条件下，从肝素抗凝血中分离外周血单个核细胞(PBMC)，洗涤后用10％FCS6 5
RPMI1640调整细胞数为1-2×10/mL，加入96孔培养板中，1-2×10 细胞/100μL/孔。加入T细胞丝裂原PHA，100μL/孔，设加入4-(环己基)-胺基喹唑啉的为试验组，3孔/组；
未加4-(环己基)-胺基喹唑啉的为对照组，3孔/组。同时，设不经上述体外刺激，也不添加4-(环己基)-胺基喹唑啉的为空白组，3孔/组。

[0046] 将三组样品，于37℃、5％CO2条件下孵育66h，每孔加入0.5-1μci 3H-TdR 50μL，继续培养12h。用DYQ-II型多头细胞收集仪收集各组样品于9999型玻璃纤维滤纸上，烤干后β液闪仪计数，结果参见图2。

[0047] 结果显示，对照组T细胞增殖非常迅速，其CPM值在60000左右，而加入4-(环己基)-胺基喹唑啉的试验组，T细胞的增殖显著受到抑制，没有经体外刺激的空白组没有检测到T细胞增殖(P＜0.001)。其他式I所示化合物如6-氟-4-(环己基)-胺基喹唑啉、7-三氟甲基-4-(环己基)-胺基喹唑啉、8-乙基-4-(环己基)-胺基喹唑啉等同样具有上述显著效果。表明本发明所述式I化合物不仅能够显著抑制小鼠T细胞的增殖，也能够显著抑制人T细胞的增殖。

[0048] 实施例3：小鼠FoxP3+CD4+调节性T细胞诱导试验

[0049] FoxP3+CD4+调节性T细胞是一类具有免疫抑制作用的T细胞。该类细胞以“主动”的方式参与免疫应答/免疫耐受的调控，不仅参与自身免疫耐受调节，而且在移植免疫中也具有重要的作用。为了证明本发明所述式I化合物是否可以诱导初始的T细胞分化为+ +FoxP3CD4 调节性T细胞，本发明分离小鼠脾细胞并体外刺激后，流式细胞仪(FACS)检测+ +
了FoxP3CD4 调节性T细胞的分化。具体步骤如下：

[0050] 按照实施例1的方法分为对照组、试验组和空白组，然后用24孔 板培养，6
1-2×10/mL，2mL/孔。于37℃、5％CO2条件下孵育66h后，在每个流式上样管中加入
6
100uL准备好的细胞悬液，细胞数约为1×10 个。按照细胞表面抗原染色方法标记表面抗原CD4、CD25。用预冷的PBS洗涤细胞。旋涡震荡重悬细胞后加入1mL的固定/破膜工作液(Fixation/Permeabilization)，并再次旋涡混匀。避光、4℃孵育30-60min。加入2mL Permeabilization Buffer(ebioscience Cat.No00-8333)工作液离心洗涤细胞并弃去上清液，重复此步操作洗涤细胞。直接加入稀释好的荧光标记FoxP3抗体(用Permeabilization Buffer工作液进行稀释)20ul，避光、4℃孵育至少30min。加入
2mLPermeabilization Buffer(Cat.No 00-8333)工作液离心洗涤细胞并弃去上清液，重复此步洗涤细胞。用适量体积的Flow Cytometry Staining Buffer重悬细胞，上流式细胞仪检测并分析，结果参见图3-5。

[0051] 结果显示，试验组中FoxP3+CD4+调节性T细胞的比例明显上升，是对照组的12倍。其他式I所示化合物如6-氟-4-(环己基)-胺基喹唑啉、7-三氟甲基-4-(环己基)-胺基+ +
喹唑啉、8-乙基-4-(环己基)-胺基喹唑啉等中的FoxP3CD4 调节性T细胞的比例也显著+ +
上升。表明本发明所述式I化合物能够诱导小鼠T细胞分化为FoxP3CD4 调节性T细胞。 [0052] 实施例4：人FoxP3+CD4+调节性T细胞诱导试验

[0053] 本发明所述式I化合物能够诱导小鼠T细胞分化为FoxP3+CD4+调节性T细胞，为+ +了证明其同样能够诱导人T细胞分化为FoxP3CD4 调节性T细胞，本发明按照实施例2和
3的方法，分离、刺激正常人外周血细胞，流式细胞仪检测，结果参见图6-8。 [0054] 结果显示，试验组中FoxP3+CD4+调节性T细胞的比例明显上升，是对照组的25倍。
其他式I所示化合物如6-氟-4-(环己基)-胺基喹唑啉、7-三氟甲基-4-(环己基)-胺基+ +
喹唑啉、8-乙基-4-(环己基)-胺基喹唑啉等中的FoxP3CD4 调节性T细胞的比例也显著+ +
上升。表明本发明所述式I化合物能够诱导人T细胞分化为FoxP3CD4 调节性T细胞。 [0055] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。