人参有效部位及其制备方法和应用转让专利
申请号 : CN201010620363.7
文献号 : CN102068477B
文献日 : 2012-07-25
发明人 : 高瑞兰 , 苗青 , 林筱洁 , 肖鲁伟 , 许家鸾 , 尹利明 , 陈华 , 王潇 , 余潇苓
申请人 : 浙江省中医院
摘要 :
本发明公开了一种人参有效部位及其制备方法和应用，所述的人参有效部位的制备包括如下步骤：(1)提取：取人参切制成小段，以含水乙醇或含乙醇水进行提取，所得提取液浓缩至80℃时相对密度为0.8～1.3，记为A液；(2)A液通过醇沉或水沉处理，分离得到的上清液浓缩至浓缩液生药比达1∶0.25～2.5，记为B液；(3)层析：通过两次大孔吸附树脂柱层析分离得到所述的人参有效部位。本发明所述的人参有效部位对于抗白血病和实体肿瘤有效而无明显毒副作用。
权利要求 :
1.一种人参有效部位，其特征在于所述的人参有效部位主要含有下列重量份的化合物：所述的人参有效部位的制备包括如下步骤：
(1)提取：取人参切制成小段，以含水乙醇或含乙醇水进行提取，所得提取液浓缩至
80℃时相对密度为0.8～1.3，记为A液；
(2)A液通过醇沉或水沉处理，分离得到的上清液浓缩至浓缩液生药比达1∶0.25～
2.5，记为B液；
(3)层析
3.1第一次分离：取B液，将其配制成生药含量为25％～150％的药液，加入氢氧化钠，使药液中的氢氧化钠浓度达0.1～2.0mol·L-1，充分搅拌，静置0.5～3.0小时，离心或滤过，得透明液，记为C液；取C液，上大孔吸附树脂柱，所述的大孔吸附树脂为弱极性或非极性，依次用碱液、水、5％～45％乙醇洗涤，然后用45％～80％乙醇洗脱，收集过柱液，记为D液；取D液，减压回收乙醇，残液浓缩至流浸膏状，干燥，获一次分离干燥物，记为甲；
3.2第二次分离：取甲，将其按0.01～0.1g/ml的浓度溶解到5％～35％的乙醇中，充分搅拌溶解，离心或过滤，得透明液，记为E液；取E液，上大孔吸附树脂柱，所述的大孔吸附树脂为弱极性或非极性，然后用10％～50％的乙醇洗涤，再用50％～80％乙醇洗脱，收集过柱液，记为F液；取F液，减压回收乙醇，残液浓缩至流浸膏状，干燥，获二次分离干燥物，即人参有效部位。
2.一种如权利要求1所述的人参有效部位的制备方法，包括如下步骤：(1)提取：取人参切制成小段，以含水乙醇或含醇水进行提取，充分提取后离心或静置，得离心液或上清液，浓缩至80℃时相对密度为0.8～1.3，记为A液；
(2)A液采用2.1或者2.2所述的方法进行处理：
2.1醇沉：取A液，加入适量乙醇，使其含醇量达40％～80％，静置醇沉，然后吸取醇沉上清液；残渣用适量40％～80％的乙醇洗涤，洗液离心后与上清液合并，减压回收乙醇后继续浓缩至浓缩液生药比达1∶0.25～2.5，记为B液；
2.2水沉：取A液，加入相当于A液体积1～5倍的水，静置水沉，然后吸取水沉上清液；
残渣用适量水洗涤，洗液离心后与上清液合并，浓缩至浓缩液生药比达1∶0.25～2.5，记为B液；
(3)层析
3.1第一次分离
3.1.1配制上柱液：取B液，将其配制成生药含量为25％～150％的药液，加入氢氧化-1钠，使药液中的氢氧化钠浓度达0.1～2.0mol·L ，充分搅拌，静置，离心或滤过，得透明液，记为C液；
3.1.2上柱：取C液，上大孔吸附树脂柱，直至C液全部进入大孔树脂柱内；
-1
3.1.3碱洗涤：用0.1～1.25mol·L 氢氧化钠溶液洗涤，过柱液弃去；
3.1.4水洗涤：用水洗涤至过柱液呈中性止，过柱液弃去；
3.1.5醇洗涤：用5％～45％的乙醇洗涤，过柱液弃去；
3.1.6洗脱：用45％～80％乙醇洗脱，收集过柱液，记为D液，待用；
3.1.7浓缩：取D液，减压回收乙醇，残液浓缩至流浸膏状，干燥，获一次分离干燥物，记为甲；
3.2第二次分离
3.2.1配制上柱液：取甲，将其按0.01～0.1g/ml的浓度溶解到5％～35％的乙醇中，充分搅拌溶解，离心或过滤，得透明液，记为E液；
3.2.2上柱：取E液，上大孔吸附树脂柱，直至E液全部进入大孔吸附树脂柱内；
3.2.3醇洗涤：用10％～50％的乙醇洗涤，过柱液弃去；
3.2.4洗脱：用50％～80％乙醇洗脱，收集过柱液，记为F液；
3.2.5浓缩：取F液，减压回收乙醇，残液浓缩至流浸膏状，干燥，获二次分离干燥物，即人参有效部位。
3.如权利要求2所述的人参有效部位的制备方法，其特征在于所述的大孔吸附树脂柱选自下列之一：D101、DA201、D101+DA201、PHD-100、PHD-200。
4.如权利要求2所述的人参有效部位的制备方法，其特征在于所述的步骤(2)中，A液采用2.1或者2.2所述的方法进行处理后，使得浓缩液生药比达1∶0.5～2.5。
5.如权利要求2所述的人参有效部位的制备方法，其特征在于步骤3.1.2或3.2.2所述的大孔吸附树脂柱的径高比各自独立为1∶1～10，C液和E液的流量各自独立为
0.25～2.5SV；所述步骤3.1.3、3.1.4、3.1.5、3.1.6、3.2.3或3.3.4中，洗涤或者洗脱流量各自独立为0.25～2.5SV。
6.如权利要求2所述的人参有效部位的制备方法，其特征在于所述制备方法按照如下步骤进行：(1)提取：取人参切制成小段，以含水乙醇或含醇水进行煎煮、热回流或渗漉提取，充分提取后离心或静置，得离心液或上清液，浓缩至80℃时相对密度为0.8～1.3，记为A液；
(2)A液采用2.1或者2.2所述的方法进行处理：
2.1醇沉：取A液，加入适量乙醇，使其含醇量达40％～80％，静置醇沉，然后吸取醇沉上清液；残渣用适量40％～80％的乙醇洗涤，洗液离心后与上清液合并，减压回收乙醇后继续浓缩至浓缩液生药比达1∶0.25～2.5，记为B液；
2.2水沉：取A液，加入相当于A液体积1～5倍的冷水或热水，静置水沉，然后吸取水沉上清液；残渣用适量水洗涤，洗液离心后与上清液合并，浓缩至浓缩液生药比达
1∶0.25～2.5，记为B液；
(3)层析
3.1第一次分离
3.1.1配制上柱液：取B液，将其配制成生药含量为25％～150％的药液，加入氢氧化-1钠，使药液中的氢氧化钠浓度达0.1～2.0mol·L ，充分搅拌，静置0.5～3.0小时，离心或滤过，得透明液，记为C液；
3.1.2上柱：取C液，上径高比为1∶1～10的大孔吸附树脂柱，流量0.25～2.5SV，直至C液全部进入大孔树脂柱内，静置1～60分钟或不静置；所述大孔吸附树脂柱为弱极性或非极性；
-1
3.1.3碱洗涤：用0.1～1.25mol·L 氢氧化钠溶液洗涤，流量均为0.25～2.5SV，过柱液弃去；
3.1.4水洗涤：用水洗涤至过柱液呈中性止，流量0.25～2.5SV，过柱液弃去；
3.1.5醇洗涤：用5％～45％的乙醇洗涤，流量均为0.25～2.5SV，过柱液弃去；
3.1.6洗脱：用45％～80％乙醇洗脱，流量均为0.25～2.5SV，收集过柱液，记为D液，待用；
3.1.7浓缩：取D液，减压回收乙醇，残液浓缩至流浸膏状，干燥，获一次分离干燥物，记为甲；
3.2第二次分离
3.2.1配制上柱液：取甲，将其按0.01～0.1g/ml的浓度溶解到5％～35％的乙醇中，充分搅拌溶解，离心或过滤，得透明液，记为E液；
3.2.2上柱：取E液，上径高比为1∶1～10的大孔吸附树脂柱，流量0.25～2.5SV，直至E液全部进入大孔树脂柱内，静置1～60分钟或不静置，待用；所述大孔吸附树脂柱为弱极性或非极性；
3.2.3醇洗涤：用10％～50％的乙醇洗涤，流量均为0.25～2.5SV，过柱液弃去；
3.2.4洗脱：用50％～80％乙醇洗脱，流量均为0.25～2.5SV，收集过柱液，记为F液；
3.2.5浓缩：取F液，减压回收乙醇，残液浓缩至流浸膏状，干燥，获二次分离干燥物，即人参有效部位。
7.如权利要求1所述的人参有效部位在制备抗白血病药物中的应用。
8.如权利要求1所述的人参有效部位在制备抑制实体肿瘤细胞药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的实体肿瘤细胞为L929成纤维肿瘤细胞或ECV-304肿瘤内皮细胞。
说明书 :
人参有效部位及其制备方法和应用
(一)技术领域
[0001] 本发明涉及一种中药人参有效部位及其提取分离的制备工艺和在制备治疗白血病和肿瘤药物中的应用。(二)背景技术
[0002] 白血病属造血系统常见的恶性肿瘤，国内十大高发恶性肿瘤之一，是严重威胁人类生命的凶险性疾病，居35岁以下人群肿瘤发病的首位，并呈逐年上升的趋势。其特征是造血干/祖细胞恶性克隆性增生并广泛浸润骨髓、肝、脾和淋巴结，最终破坏全身器官组织，导致贫血、出血、感染等症状。虽然治疗方法有造血干细胞移植、诱导分化、免疫治疗等，还有新开辟的针对性靶向治疗正在研究中，但化疗仍是治疗的主要手段。在杀灭癌细胞的同时，化疗药物因其毒副作用很大而使患者难以承受，同时易产生耐药性而导致治疗失败和复发，均是迫切需要解决的难题。当前国内外肿瘤学专家特别强调研制抗癌药的新策略是减毒增效，及提高患者生活质量，而不同于传统化疗药，即抑制恶性细胞增殖、诱导分化、促进凋亡、增强化疗药敏，及阻断癌细胞的恶性信号传递，但对正常细胞毒性低。
[0003] 第42届美国临床肿瘤学会参会的专家们充分强调提高肿瘤患者的生活质量，特别指出治疗须放弃以往“以毒攻毒”的战斗模式，改变传统化疗放疗杀灭肿瘤细胞的疗法，而用分子靶向药物来控制癌细胞，成为治疗白血病的新策略。国外研究抗白血病新药的重点是诱导白血病细胞分化，促进凋亡，以减小抗肿瘤药物对人体的毒副作用。瑞士诺华公司推出治疗慢性粒细胞白血病(CML)的新药格列卫，就是直接针对染色体易位的Bcr-Abl融合基因产物-酪氨酸激酶“靶点”，阻断癌细胞的信号传递途径，治疗CML慢性期可以达到血液学缓解。但缺点是停药后会复发，并出现耐药性，且对生存期的影响还需要更长期用药才能评价。还有目前格列卫尚需依赖进口，其价格昂贵，治疗一年需20余万元。中药是开发天然药物与前导化合药物的重要资源，已受到国内外高度重视，由于某些中药具有抗白血病作用，而对正常细胞损伤小的优点，很多国内外研究者致力于研制抗白血病有效且低毒中药新药。
[0004] 国内从三尖杉植物提取分离的三尖杉酯碱，是中国人自行研制成功的第一个抗肿瘤药物(已化学合成)，成为治疗急性髓细胞白血病的一线药物；从砒霜提取分离的三氧化二砷成为治疗急性早幼粒细胞白血病有效的药物，但上述两药仍属于化疗药。来自人参的“参一胶囊”(Rg3单体)与化疗药物合用，有助于原发性肺癌、肝癌的疗效，但该药体内抗肿瘤的作用较弱。其它的研究如冬虫夏草、苦参、白花蛇舌草、冬凌草、葛根、白藜芦、大黄、雷公藤、天花粉等，均报道具有抗白血病作用，但多数尚停留在实验阶段，并且其作用机制及途径均未明确。因此，提取和分离出中药中起治疗作用的有效部位或有效成分，用现代医学的方法研究其作用和机制，并推向国际医学界是当前迫切需要解决的难题。
[0005] 虽然，中药直接杀灭肿瘤细胞的功效有限，但具有多靶点的作用，对于抑制肿瘤细胞，提高患者生活质量等具有重要价值。中药治疗白血病主要作用点是促进白血病细胞凋亡，诱导分化和成熟，协同化疗和减轻化疗药的毒副反应，促进正常造血功能的恢复，增强机体免疫力，及延长生存期。研究发现某些中药具有双向调节的独特优势，人参就是扶正固本药，增加机体的非特异性抵抗力，对各种有害应激皆有保护作用，一方面通过补益人体正气，促进正常造血，另一方面抑制白血病细胞增殖，并诱导其凋亡而起到治疗白血病的作用。在白血病中医辨证治疗中人参是不可缺的药物，具有扶助正气，提高机体免疫力，调整脏腑功能，减轻化疗药物对机体的损害，增强和巩固疗效等功效。
[0006] 人参的主要有效成分为人参总皂苷，已确定结构的有四十余个皂苷单体，按皂苷元所含羟基数量不同分为人参二醇组皂苷(Panaxadiol)、人参三醇组皂苷(Panaxatriol)和齐墩果酸三类。其中二醇、三醇组皂苷占大多数，是人参中最主要的活性成分。二醇组皂苷主要为Ra、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、F4、Rg3、Rg5、Rh2、Rh4、Rk1、Rk3和Rs等单体；三醇组皂苷主要为Re、Rf、Rg1、Rg2和Rh1等单体。
[0007] 发明人已报道自行提取的人参总皂苷抗白血病的论文6篇，应用白血病克隆增殖试验显示人参总皂苷50～100mg/L显著地抑制白血病粒系HL-60、巨核系Meg-01细胞集落的增殖。增强化疗药敏作用，使高三尖杉、阿糖胞苷、阿霉素和足叶乙苷对急性髓系白血病患者原代祖细胞集落的杀伤作用增强1.84～2.23倍，并对耐药的白血病细胞也有抑制和增强化疗药敏的作用。人参总皂苷还具有诱导HL-60细胞凋亡作用，出现Annexin V阳性细胞和DNA降解梯形条带，流式细胞术分析DNA含量可见G0/G1期细胞减少，S期和G2/M期细胞增多，同时直方图上呈现特征性的亚二倍体凋亡峰。
[0008] 其他作者对人参提取物抗肿瘤的研究较多，但均停留在实验阶段。有报道人参总皂苷处理K562细胞后癌基因产物Bcl-2、c-myc蛋白表达明显降低，Fas表达增高，与诱导白血病细胞凋亡有关。MTT法观察到人参皂苷单体Rb1抑制HL-60细胞增殖，Rb1、Rb2和Rc可使细胞色素C从线粒体内释放，通过激活凋亡效应酶Caspase-3而诱导HL-60细胞凋亡。P-糖蛋白(P-gp，ATP结合膜糖蛋白)能将白血病细胞内的化学药物泵出胞外而使得细胞耐药，有报道Rb1能够抑制P-gp的表达，而提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。还有报道Rh2抑制慢粒K562细胞、早幼粒HL-60细胞、T淋巴Jurkat细胞等白血病细胞的增殖，诱导其凋亡，并呈浓度和时间依赖效应等。综上所述，中药提取物已成为当前抗肿瘤新药研究的一个重要方向。
[0009] 发明人采用生物学活性筛选与制备工艺相结合的先进方法，首先从多种中药提取物中筛选出人参总皂苷，再进一步从人参总皂苷分离出多个提取物，经反复生物学活性研究，从多个人参提取物中筛选出抑制白血病细胞作用最佳，且对正常造血祖细胞损害小的有效部位。采用液相色谱-质谱联用分析方法，该人参有效部位主含人参皂苷Rd、Rg6、F4、Rk3、Rh4、F2、Rg3、Rk1、Rg5。这些单体本身在人参原料中含量不高，是提取分离制备后大量富集。与传统的化疗药作用机制不同，具有抗白血病有效而无明显毒副作用的优势。设想在白血病化疗期，与细胞毒药物联合应用，发挥其协同化疗作用而提高疗效；化疗间歇期，单用而发挥其抑制白血病细胞增殖、促进凋亡和诱导分化的功效，以维持和巩固疗效等。(三)发明内容
[0010] 本发明要解决的第一个技术问题是提供一种抗白血病和实体肿瘤有效而无明显毒副作用的人参有效部位。
[0011] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0012] 一种人参有效部位，所述的人参有效部位的制备包括如下步骤：
[0013] (1)提取：取人参切制成小段，以含水乙醇或含乙醇水进行提取，所得提取液浓缩至80℃时相对密度为0.8～1.3，记为A液；
[0014] (2)A液通过醇沉或水沉处理，分离得到的上清液浓缩至浓缩液生药比达1∶0.25～2.5(即每公斤浓缩液中约含相当于人参药材0.25～2.5kg)，记为B液；
[0015] (3)层析
[0016] 3.1第一次分离：取B液，将其配制成生药含量为25％～150％的药液，加入氢氧-1化钠，使药液中的氢氧化钠浓度达0.1～2.0mol·L ，充分搅拌，静置0.5～3.0小时，离心或过滤，得透明液，记为C液；取C液，上大孔吸附树脂柱，所述的大孔吸附树脂为弱极性或非极性，依次用碱液、水、5％～45％的乙醇洗涤，然后用45％～80％乙醇洗脱，收集过柱液，记为D液；取D液，减压回收乙醇，残液浓缩至流浸膏状，干燥，获一次分离干燥物，记为甲；
[0017] 3.2第二次分离：取甲，将其按0.01～0.1g/ml的浓度溶解到5％～35％的乙醇中，充分搅拌溶解，离心或过滤，得透明液，记为E液；取E液，上大孔吸附树脂柱，所述的大孔吸附树脂为弱极性或非极性，然后用10％～50％的乙醇洗涤，再用50％～80％乙醇洗脱，收集过柱液，记为F液；取F液，减压回收乙醇，残液浓缩至流浸膏状，干燥，获二次分离干燥物，即人参有效部位。
[0018] 本发明制得的人参有效部位主要含有下列重量份的化合物：
[0019] 原人参二醇型皂苷Rd 3～43份
[0020] 原人参二醇型皂苷Rg6 4～11份
[0021] 原人参二醇型皂苷F4 6～17份
[0022] 人参三醇型皂苷Rk3 2～9份
[0023] 人参三醇型皂苷Rh4 5～16份
[0024] 人参三醇型皂苷F2 13～18份
[0025] 人参三醇型皂苷Rg3 0.5～4份
[0026] 人参二醇型皂苷RK1 2～20份
[0027] 人参二醇型皂苷Rg5 1～30份
[0028] 本发明要解决的第二个技术问题是提供一种具体的制备上述人参有效部位的方法，采用的技术方案如下：
[0029] 一种所述的人参有效部位的制备方法，包括如下步骤：
[0030] (1)提取：取人参切制成小段(如切成3～5mm小段)，以含水乙醇或含乙醇水进行提取(煎煮、热回流或渗漉)，充分提取后离心或静置，得离心液或上清液，浓缩至80℃时相对密度为0.8～1.3，记为A液；
[0031] (2)A液采用2.1或者2.2所述的方法进行处理：
[0032] 2.1醇沉：取A液，加入适量乙醇，使其含醇量达40％～80％，静置醇沉，然后吸取醇沉上清液；残渣用适量40％～80％的乙醇洗涤，洗液离心后与上清液合并，减压回收乙醇后继续浓缩至浓缩液生药比达1∶0.25～2.5(即每公斤浓缩液中约含相当于人参药材0.25～2.5kg)，记为B液；
[0033] 2.2水沉：取A液，加入相当于A液体积1～5倍的水(冷水或热水均可)，静置水沉，然后吸取水沉上清液；残渣用适量水洗涤，洗液离心后与上清液合并，浓缩至浓缩液生药比达1∶0.25～2.5，记为B液；
[0034] (3)层析
[0035] 3.1第一次分离
[0036] 3.1.1配制上柱液：取B液，将其配制成生药含量为25％～150％的药液，加入氢-1氧化钠，使药液中的氢氧化钠浓度达0.1～2.0mol·L ，充分搅拌，静置，离心或滤过，得透明液，记为C液；
[0037] 3.1.2上柱：取C液，上大孔吸附树脂柱，所述的大孔吸附树脂为弱极性或非极性，直至C液全部进入大孔树脂柱内；
[0038] 3.1.3碱洗涤：用0.1～1.25mol·L-1氢氧化钠溶液洗涤，过柱液弃去；
[0039] 3.1.4水洗涤：用水洗涤至过柱液呈中性止，过柱液弃去；
[0040] 3.1.5醇洗涤：用5％～45％的乙醇洗涤，过柱液弃去；
[0041] 3.1.6洗脱：用45％～80％乙醇洗脱，收集过柱液，记为D液，待用；
[0042] 3.1.7浓缩：取D液，减压回收乙醇，残液浓缩至流浸膏状，干燥，获一次分离干燥物，记为甲；
[0043] 3.2第二次分离
[0044] 3.2.1配制上柱液：取甲，将其按0.01～0.1g/ml的浓度溶解到5％～35％的乙醇中，充分搅拌溶解，离心或过滤，得透明液，记为E液；
[0045] 3.2.2上柱：取E液，上大孔吸附树脂柱，所述的大孔吸附树脂为弱极性或非极性，直至E液全部进入大孔吸附树脂柱内；
[0046] 3.2.3醇洗涤：用10％～50％的乙醇洗涤，过柱液弃去；
[0047] 3.2.4洗脱：用50％～80％乙醇洗脱，收集过柱液，记为F液；
[0048] 3.2.5浓缩：取F液，减压回收乙醇，残液浓缩(常压或减压浓缩均可)至流浸膏状，干燥(常压、减压、喷雾或冷冻干燥均可)，获二次分离干燥物，即人参有效部位。
[0049] 进一步，所述步骤(2)中，A液优选采用如下2.1或者2.2所述的方法进行处理：
[0050] 2.1醇沉：取A液，加入适量乙醇，使其含醇量达40％～80％，充分搅拌，密闭，室温或冷藏静置12小时以上，然后取醇沉上清液，残渣用75％以上的乙醇洗涤，洗液离心或过滤后与上清液合并，减压回收乙醇后继续减压或常压浓缩至浓缩液生药比达1∶0.25～2.5，记为B液；
[0051] 2.2水沉：取A液，加入相当于A液体积1～5倍的冷水或热水，充分搅拌，密闭，室温或冷藏静置12小时以上，然后取水沉上清液，残渣用水洗涤，洗液离心或过滤，合并上清液，减压或常压浓缩至浓缩液生药比达1∶0.25～2.5，记为B液。
[0052] 进一步，所述的步骤(2)中，优选A液采用2.1或者2.2所述的方法进行处理后，使得浓缩液生药比达1∶0.5～2.5，更优选使得浓缩液生药比达1∶1～2.5。
[0053] 进一步，所述的大孔吸附树脂柱优选自下列之一：D101、DA201、D101+DA201、PHD-100、PHD-200等非极性或弱极性大孔吸附树脂。
[0054] 进一步，步骤3.1.2或3.2.2所述的大孔吸附树脂柱的径高比各自独立为1∶2～10，C液和E液的流量各自独立为0.25～2.5SV(即每小时液体的流出量为树脂体积的
0.25～2.5倍量)。
0.25～2.5倍量)。
[0055] 进一步，所述步骤3.1.3、3.1.4、3.1.5、3.1.6、3.2.3或3.3.4中，洗涤或者洗脱流量各自独立为0.25～2.5SV。
[0056] 本发明具体推荐所述制备方法按照如下步骤进行：
[0057] (1)提取：取人参切制成小段，以含水乙醇或含醇水进行煎煮、热回流或渗漉提取，充分提取后离心或静置，得离心液或上清液，浓缩至80℃时相对密度为0.8～1.3，记为A液；
[0058] (2)A液采用2.1或者2.2所述的方法进行处理：
[0059] 2.1醇沉：取A液，加入适量乙醇，使其含醇量达40％～80％，静置醇沉，然后吸取醇沉上清液；残渣用适量40％～80％的乙醇洗涤，洗液离心后与上清液合并，减压回收乙醇后继续浓缩至浓缩液生药比达1∶0.25～2.5，记为B液；
[0060] 2.2水沉：取A液，加入相当于A液体积1～5倍的冷水或热水，静置水沉，然后吸取水沉上清液；残渣用适量水洗涤，洗液离心后与上清液合并，浓缩至浓缩液生药比达1∶0.25～2.5，记为B液；
[0061] (3)层析
[0062] 3.1第一次分离
[0063] 3.1.1配制上柱液：取B液，将其配制成生药含量为25％～150％的药液，加入氢-1氧化钠，使药液中的氢氧化钠浓度达0.1～2.0mol·L ，充分搅拌，静置0.5～3.0小时，离心或滤过，得透明液，记为C液；
[0064] 3.1.2上柱：取C液，上径高比为1∶1～10的大孔吸附树脂柱，流量0.25～2.5SV，直至C液全部进入大孔树脂柱内，静置1～60分钟或不静置；所述大孔吸附树脂柱为弱极性或非极性；
[0065] 3.1.3碱洗涤：用0.1～1.25mol·L-1氢氧化钠溶液洗涤，流量均为0.25～2.5SV，过柱液弃去；
[0066] 3.1.4水洗涤：用水洗涤至过柱液呈中性止，流量0.25～2.5SV，过柱液弃去；
[0067] 3.1.5醇洗涤：用5％～45％的乙醇洗涤，流量均为0.25～2.5SV，过柱液弃去；
[0068] 3.1.6洗脱：用45％～80％乙醇洗脱，流量均为0.25～2.5SV，收集过柱液，记为D液，待用；
[0069] 3.1.7浓缩：取D液，减压回收乙醇，残液浓缩至流浸膏状，干燥，获一次分离干燥物，记为甲；
[0070] 3.2第二次分离
[0071] 3.2.1配制上柱液：取甲，将其按0.01～0.1g/ml的浓度溶解到5％～35％的乙醇中，充分搅拌溶解，离心或过滤，得透明液，记为E液；
[0072] 3.2.2上柱：取E液，上径高比为1∶1～10的大孔吸附树脂柱，流量0.25～2.5SV，直至E液全部进入大孔树脂柱内，静置1～60分钟或不静置，待用；所述大孔吸附树脂柱为弱极性或非极性；
[0073] 3.2.3醇洗涤：用10％～50％的乙醇洗涤，流量均为0.25～2.5SV，过柱液弃去；
[0074] 3.2.4洗脱：用50％～80％乙醇洗脱，流量均为0.25～2.5SV，收集过柱液，记为F液；
[0075] 3.2.5浓缩：取F液，减压回收乙醇，残液浓缩至流浸膏状，干燥，获二次分离干燥物，即人参有效部位。
[0076] 上述技术方案中，乙醇浓度均为体积浓度。
[0077] 本发明要解决的第三个技术问题是所述的人参有效部位的应用，具体的是在制备抗白血病药物中的应用；在制备抑制实体肿瘤细胞药物中的应用，具体的，所述的实体肿瘤细胞为L929成纤维肿瘤细胞或ECV-304肿瘤内皮细胞。
[0078] 本发明采用动物模型、细胞学和分子生物学技术研究，证明本发明所述的人参有效部位治疗白血病动物模型皮下荷瘤裸小鼠，及单核白血病浸润裸小鼠的疗效显著，抑制白血病祖细胞增殖、促进凋亡、诱导分化、协同化疗药，及阻滞白血病细胞增殖的恶性信号传导而达到抗白血病的功效，具有抗白血病有效而无明显毒副作用的优势。因此，本发明所述的人参有效部位可用于制备抗白血病药物。
[0079] 本发明所述的人参有效部位对其它实体肿瘤细胞也具有显著的抑制作用，包括L929成纤维肿瘤细胞、ECV-304肿瘤内皮细胞等，故其可用于制备抑制实体肿瘤细胞的药物。
[0080] 与现有技术相比，本发明所述的人参有效部位的有益效果在于：
[0081] 1.研究证明人参有效部位治疗2种白血病动物模型的体内疗效显著，能够明显地延长生存期，显著地抑制K562白血病细胞皮下荷瘤裸小鼠体内瘤体的生长，瘤组织病理检查有不同程度地变性坏死。治疗单核SHI-1白血病细胞浸润裸小鼠模型，能够有效地抑制骨髓的白血病细胞生长，并显著减少白血病细胞在脑组织及多个脏器的浸润。
[0082] 2.抑制急性髓系白血病患者原代白血病造血祖细胞的增殖，集落形成数均明显下降，20～100mg/L的集落抑制率达到25.6～68.6％。同时抑制红系K562、粒系HL-60和单核系SHI-1白血病细胞株的增殖，使集落形成数均明显下降，20～100mg/L的集落抑制率达到26.7～83.5％。抑制增殖作用呈剂量依赖性，其作用机制之一是下调白血病K562细胞增殖特异性BCR/ABL融合蛋白的表达。
[0083] 3.小剂量能够增强白血病细胞对化疗药物的敏感性，显示其与化疗药物的协同性。增加K562、HL-60白血病细胞对化疗药高三尖杉酯碱和阿糖胞苷的敏感性，使小剂量化疗药物对白血病细胞的抑制作用明显增强。
[0084] 4.诱导白血病细胞凋亡的作用明显，人参有效部位诱导红系K562、粒系HL-60和单核系SHI-1等白血病细胞凋亡，Annexin V阳性的凋亡细胞率明显增加，并可见凋亡典型的DNA降解特异性梯形条带。
[0085] 5.诱导白血病原始细胞分化的作用显著，流式细胞术显示白血病细胞分化特异性标记的阳性细胞率明显增加。同时，通过激光共聚焦显微技术、Western免疫印迹法和细胞免疫组化染色等多种方法证实促进分化的作用机制是通过上调多种白血病细胞分化相关蛋白的表达。
[0086] 6.下调白血病细胞增殖相关MAPK信号途径多种蛋白激酶的表达，Western免疫印迹分析显示能够不同程度地抑制人白血病干细胞KG-1a细胞、红系K562细胞内AKT-1、AKT-2、ERK-2、MEK-1和MEK-2等增殖相关蛋白激酶的表达水平，说明其通过下调增殖相关信号途径蛋白激酶的表达，阻滞恶性信号的传导，而抑制白血病细胞的异常增殖。
[0087] 7.对其它实体肿瘤细胞也具有显著的抑制作用，包括L929成纤维肿瘤细胞、ECV-304肿瘤内皮细胞等。鉴于成纤维肿瘤细胞为肿瘤细胞的生长提供支架，内皮细胞则通过形成血管提供肿瘤生长所需的营养，因此提示人参有效部位除了抗白血病的功效外，同时也具有抗实体肿瘤的作用。(四)附图说明
[0088] 图1：实施例4中人参有效部位治疗后裸鼠体内瘤组织有不同程度的变性和坏死(HE染色，200倍)，其中，A：模型对照组，B：50mg/Kg组，C：100mg/Kg组，D：200mg/Kg组。100、200mg/Kg治疗后，病理检查瘤组织细胞有肿胀、破裂，细胞核溶解等现象，说明在荷白血病瘤裸鼠体内具有较强的抗白血病作用。
[0089] 图2：实施例5中人参有效部位治疗后裸鼠脑组织HCD45+白血病细胞的浸润明显减少(200倍)，其中：A：模型对照组，B：50mg/Kg组，C：100mg/Kg组，D：200mg/Kg组。免疫+组化染色显示模型对照组的脑实质内大量人CD45 白血病细胞堆积，而100mg/Kg组脑实质+
和硬膜外人CD45 细胞浸润的数量明显减少，并且未见到脑实质内有浸润，仅脑外膜覆盖有+
人CD45 细胞；200mg/Kg组脑组织的白血病细胞浸润更少，未发现有脑实质的浸润，仅少量覆盖于大脑、小脑和脑间裂隙表面。
和硬膜外人CD45 细胞浸润的数量明显减少，并且未见到脑实质内有浸润，仅脑外膜覆盖有+
人CD45 细胞；200mg/Kg组脑组织的白血病细胞浸润更少，未发现有脑实质的浸润，仅少量覆盖于大脑、小脑和脑间裂隙表面。
[0090] 图3：实施例6中人参有效部位下调白血病细胞增殖特异性BCR/ABL融合蛋白的表达，其中，A：对照K562细胞，B：20mg/L，C：50mg/L，D：100mg/L。激光共聚焦显微术显示20、50mg/L组K562细胞内呈绿色荧光反应的BCR/ABL融合蛋白表达逐渐减弱，100mg/L组的绿色荧光最弱，提示能够有效地通过下调BCR/ABL融合蛋白的表达而抑制白血病的增殖。
[0091] 图4：实施例7中人参有效部位增加白血病细胞对化疗药物的敏感性，图4a：增加白血病细胞对高三尖杉酯碱(Hom)的敏感性，半固体集落培养小剂量10、20、50mg/L与小剂量Hom联合应用时，K562、HL-60细胞的集落生成数明显低于单用Hom对照组。图4b：增加白血病细胞对阿糖胞苷(Ara-c)的敏感性，10、20和50mg/L与小剂量Ara-c联合应用时，K562、HL-60细胞的集落生成数明显低于单用Ara-c对照组。
[0092] 图5：实施例8中人参有效部位诱导白血病细胞凋亡DNA降解梯形条带，其中：1.Mark、2.HL-60对照细胞、3.10mg/L、4.25mg/L、5.50mg/L、6.75mg/L、7.100mg/L。25、50、
75、100mg/L作用36小时，琼脂糖凝胶电泳分析出现细胞凋亡DNA降解的特异性梯形条带。
75、100mg/L作用36小时，琼脂糖凝胶电泳分析出现细胞凋亡DNA降解的特异性梯形条带。
[0093] 图6：实施例9中人参有效部位上调白血病细胞分化相关γ-珠蛋白的表达，其中：A：对照K562细胞，B：10mg/L，C：20mg/L，D：40mg/L。10、20mg/L作用K562细胞3周，免疫组化法显示表达γ-珠蛋白“+++”强阳性的细胞率明显高于不加药的对照细胞。
[0094] 图7：实施例9中人参有效部位诱导白血病细胞分化相关CD11b表型阳性细胞率增高，其中：7a：对照SHI-1细胞，7b：5mg/L，7c：10mg/L，7d：20mg/L，7e：40mg/L。10、20、40mg/L诱导SHI-1细胞3周，分化相关CD11b阳性细胞率明显高于不加药的对照细胞。
[0095] 图8：实施例10中人参有效部位下调MAPK信号途径主要蛋白激酶的表达，50、100mg/L作用KG-1a细胞7天后，增殖相关5种蛋白激酶AKT-1、AKT-2、ERK-2、MEK-1和MEK-2的条带密度不同程度地低于对照细胞。50、100mg/L作用K562细胞后，5种蛋白激酶AKT-1、AKT-2、ERK-2、MEK-1和MEK-2的条带密度也不同程度地低于对照细胞。
[0096] 图9：实施例11中人参有效部位抑制L929肿瘤细胞集落生成的作用，A.对照细胞；B.5mg/L；C.10mg/L；D.20mg/L；E.50mg/L；F.100mg/L。10、20、50mg/L时集落数明显减少，细胞丛增加，并且集落形态由紧密型向疏散型转变，当药物浓度增加到100mg/L时，基本上无集落生成。(五)具体实施方式
[0097] 下面以具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此：
[0098] 实施例1人参有效部位制备
[0099] 1.提取取人参原料25kg，切制成3～5mm小段，以30％的乙醇热回流提取三次，合并各次提取液，静置，滤过得虑液，减压或常压浓缩至相对密度1.1(80℃)，编号：A液，待用。
[0100] 2A液处理
[0101] 2.1醇沉取A液，加入3倍体积量的95％乙醇，充分搅拌，密闭，室温静置12小时以上。次日取醇沉上清液，残渣用71％的乙醇洗涤三次，洗液离心后与上清液合并，减压回收乙醇后继续常压浓缩至浓缩液生药比达1∶1.0(即每公斤浓缩液中约含相当于人参药材1.0kg)，编号：B液，待用。
[0102] 3.层析
[0103] 3.1第一次分离
[0104] 3.1.1配制上柱液取B液，加水至50L，加入适量氢氧化钠，使药液中的氢氧化钠浓-1度达1.0mol·L ，充分搅拌，静置0.5小时，300目筛滤过，得透明液，编号：C液，待用。
[0105] 3.1.2上柱取C液，上径高比为1∶5的D101大孔吸附树脂柱，流量1.0SV，直至C液全部进入大孔树脂柱内，静置30分钟，待用。
[0106] 3.1.3碱洗涤用0.1mol·L-1氢氧化钠液洗涤，流量均为1.0SV，过柱液弃去。
[0107] 3.1.4水洗涤用水洗涤至过柱液呈中性止，流量1.0SV，过柱液弃去。
[0108] 3.1.5醇洗涤用30％乙醇洗涤，流量均为0.1SV，过柱液弃去。
[0109] 3.1.6洗脱用80％乙醇洗脱，流量均为1.0SV，收集过柱液，编号：D液，待用。
[0110] 3.1.7浓缩取D液，减压回收乙醇，残液常压浓缩至流浸膏状，真空干燥，获一次分离干燥物，编号：甲，待用。
[0111] 3.2第二次分离
[0112] 3.2.1配制上柱液取甲，将其按0.02g/ml)的浓度溶解到20％的乙醇中配，充分搅拌溶解，离心或滤过，得透明液，编号：E液，待用。
[0113] 3.2.2上柱取E液，上径高比为1∶5的D101大孔树脂柱，流量1.0SV，直至E液全部进入大孔树脂柱内，静置30分钟，待用。
[0114] 3.2.3醇洗涤用45％的乙醇洗涤，流量均为1.0SV，过柱液弃去。
[0115] 3.2.4洗脱用80％乙醇洗脱，流量均为1.0SV，收集过柱液，编号：F液，待用。
[0116] 3.2.5浓缩取F液，减压回收乙醇，残液常压浓缩至流浸膏状，真空干燥，获二次分离干燥物，即人参有效部位。
[0117] 4.人参有效部位化学成分的鉴定
[0118] 4.1仪器与色谱条件液-质联用检测仪采用Agilent 1200系列高效液相色谱-TOFQ 125联用仪，离子源为ESI源。
[0119] 色谱柱：Agilent ZORBAX 80AExtend-C18(4.6x250mm，5μm)；
[0120] 柱温：30℃；流速：1ml/min；检测波长：205nm；
[0121] 流动相梯度见表1。
[0122] 4.2样品处理取数批人参有效部位中试样品各10mg，分别以1ml甲醇超声溶解2min，3000rmp离心10min，取澄清溶液供测试用，进样量2μl。
[0123] 4.3分析结果与结论
[0124] 4.3.1经分析发现人参有效部位中含量较高的有9个化合物，根据这9个化合物的质谱裂解情况，同时结合人参皂苷类成分的质谱裂解规律，推测它们分别为：原人参二醇型皂苷：Rd、F2与Rg3，人参三醇型皂苷：Rg6、F4，Rk3，Rh4；及人参二醇型皂苷：RK1，Rg5。
[0125] 4.3.2经分析发现：9个主要化合物在人参有效部位总人参皂苷中的含量比例如表2所示。
[0126] 表1流动相梯度表
[0127]
[0128] 注A：0.1％甲酸水溶液；B：0.1％甲酸乙腈溶液
[0129] 表2实施例1人参有效部位中9个主要人参皂苷的含量比例
[0130]
[0131] 实施例2人参有效部位制备
[0132] 1.提取取人参原料37.5kg，切制成3～5mm小段，以50％的乙醇热回流提取三次，合并各次提取液，静置，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.1(80℃)，编号：A液，待用。
[0133] 2.浓缩液处理
[0134] 2.1水沉取A液，加入相当于A液体积4倍的冷水，充分搅拌，密闭，冷藏静置12小时以上。次日取水沉上清液，残渣用水洗涤三次，洗液离心后与上清液合并，减压浓缩至浓缩液生药比达1∶1.0(即每公斤浓缩液中约含相当于人参药材1.0kg)，编号：B液，待用。
[0135] 3.层析
[0136] 3.1第一次分离
[0137] 3.1.1配制上柱液取B液，加水至50L，加入适量氢氧化钠，使药液中的氢氧化钠浓-1度达1.0mol·L ，充分搅拌，静置0.5小时，滤过，得透明液，编号：C液，待用。
[0138] 3.1.2上柱取C液，上径高比为1∶5的D101+DA201大孔树脂柱，流量0.5SV，直至C液全部进入大孔树脂柱内，静置30分钟或不静置，待用。
[0139] 3.1.3碱洗涤用1.0mol·L-1氢氧化钠液洗涤，流量均为1.0SV，过柱液弃去。
[0140] 3.1.4水洗涤用水洗涤至过柱液呈中性止，流量1.0SV，过柱液弃去。
[0141] 3.1.5醇洗涤用20％的乙醇洗涤，流量均为1.0SV，过柱液弃去。
[0142] 3.1.6洗脱用70％乙醇洗脱，流量均为1.0SV，收集过柱液，编号：D液，待用。
[0143] 3.1.7浓缩取D液，减压回收乙醇，残液常压浓缩至流浸膏状，真空干燥，获一次分离干燥物，编号：甲，待用。
[0144] 3.2第二次分离
[0145] 3.2.1配制上柱液取甲，将其按0.04g/ml的浓度溶解到20％的乙醇中，充分搅拌溶解，离心，得透明液，编号：E液，待用。
[0146] 3.2.2上柱取E液，上径高比为1∶5的D101+DA201大孔树脂柱，流量1.0SV，直至E液全部进入大孔树脂柱内，静置30分钟，待用。
[0147] 3.2.3醇洗涤用40％的乙醇洗涤，流量均为1.0SV，过柱液弃去。
[0148] 3.2.4洗脱用70％乙醇洗脱，流量均为1.0SV，收集过柱液，编号：F液，待用。
[0149] 3.2.7浓缩取F液，减压回收乙醇，残液常压浓缩至流浸膏状，真空干燥，获二次分离干燥物，即人参有效部位。
[0150] 4.人参有效部位化学成分的鉴定
[0151] 检测方法同实施例1，检测结果表明：人参有效部位样品所含化学成分同实施例1，9个主要化合物在人参有效部位总人参皂苷中的含量比例如表3所示：
[0152] 表3实施例2人参有效部位中9个主要人参皂苷的含量比例
[0153]
[0154] 实施例3人参有效部位制备
[0155] 1.提取取人参原料50kg，切制成3～5mm小段，以30％的乙醇热回流提取三次，合并各次提取液，离心，得离心液，减压浓缩至相对密度1.1(80℃)，编号：A液，待用。
[0156] 2.浓缩液处理
[0157] 2.1醇沉取A液，加入4倍量的95％乙醇，充分搅拌，密闭，冷藏静置12小时以上。次日取醇沉上清液，残渣用76％的乙醇洗涤三次，洗液离心后与上清液合并，减压回收乙醇后继续常压浓缩至浓缩液生药比达1∶2.0(即每公斤浓缩液中约含相当于人参药材2.0kg)，编号：B液，待用。
[0158] 3.层析
[0159] 3.1第一次分离
[0160] 3.1.1配制上柱液取B液，加水至50kg，加入适量氢氧化钠，使药液中的氢氧化钠-1浓度达1.0mol·L ，充分搅拌，静置0.5小时，离心，得透明液，编号：C液，待用。
[0161] 3.1.2上柱取C液，上径高比为1∶5的D101大孔树脂柱，流量1.0SV，直至C液全部进入大孔树脂柱内，静置30分钟或不静置，待用。
[0162] 3.1.3碱洗涤用0.5mol·L-1氢氧化钠液洗涤，流量均为1.0SV，过柱液弃去。
[0163] 3.1.4水洗涤用水洗涤至过柱液呈中性止，流量1.0SV，过柱液弃去。
[0164] 3.1.5醇洗涤用30％的乙醇洗涤，流量均为1.0SV，过柱液弃去。
[0165] 3.1.6洗脱用60％乙醇洗脱，流量均为1.0SV，收集过柱液，编号：D液，待用。
[0166] 3.1.7浓缩取D液，减压回收乙醇，残液常压浓缩至流浸膏状，真空干燥，获一次分离干燥物，编号：甲，待用。
[0167] 3.2第二次分离
[0168] 3.2.1配制上柱液取甲，将其按0.06g/ml的浓度溶解到20％的乙醇中，充分搅拌溶解，离心，得透明液，编号：E液，待用。
[0169] 3.2.2上柱取E液，上径高比为1∶5的D101大孔树脂柱，流量1.0SV，直至E液全部进入大孔树脂柱内，静置30分钟或不静置，待用。
[0170] 3.2.3醇洗涤用35％的乙醇梯度洗涤，流量均为1.0SV，过柱液弃去。
[0171] 3.2.4洗脱用60％乙醇洗脱，流量均为1.0SV，收集过柱液，编号：F液，待用。
[0172] 3.2.7浓缩取F液，减压回收乙醇，残液常压浓缩至流浸膏状，真空干燥，获二次分离干燥物，即人参有效部位。
[0173] 4.人参有效部位化学成分的鉴定
[0174] 检测方法同实施例1，检测结果表明：人参有效部位样品所含化学成分同实施例1，9个主要化合物在人参有效部位总人参皂苷中的含量比例如表4所示：
[0175] 表4实施例3人参有效部位中9个主要人参皂苷的含量比例
[0176]
[0177] 实施例4治疗红系K562白血病细胞皮下荷瘤裸小鼠模型的疗效显著
[0178] 1.材料和方法
[0179] 1.1制备模型：4～5周龄免疫缺陷(Nude)裸鼠由上海斯莱克实验动物公司生产，7
将对数生长期的高致瘤K562细胞1×10/0.2ml接种于裸鼠前肢腋下外侧皮下，接种后1周内即可成瘤，肿瘤生长特性稳定，接种3周后最大的瘤体重量可达2.0g。
将对数生长期的高致瘤K562细胞1×10/0.2ml接种于裸鼠前肢腋下外侧皮下，接种后1周内即可成瘤，肿瘤生长特性稳定，接种3周后最大的瘤体重量可达2.0g。
[0180] 1.2实验分组和治疗方法：将接种K562细胞的裸鼠随机分成5组，每组10只，模型组、人参有效部位(实施例3制得)低剂量50mg/Kg/d、中剂量组100mg/Kg/d、高剂量组200mg/Kg/d，均灌胃治疗连21天。模型组每日生理盐水灌胃，阳性药物对照组高三尖杉酯碱(Hom)1mg/Kg/d腹腔注射。
[0181] 2.结果
[0182] 2.1人参有效部位显著地抑制裸鼠体内肿瘤的生长：低、中和高剂量治疗组的瘤3 3 3
体积测定分别为4.88±3.91cm、2.89±1.49cm、2.03±1.71cm，均明显小于未治疗模型组
3
的7.52±4.05cm(P分别＜0.05，0.01)，按抑瘤率公式计算，抑瘤率分别为35.1±28.1％、
61.6±19.8％和72.9±22.8％。说明在荷白血病瘤裸鼠体内具有较强的抑制白血病细胞生长的作用。
体积测定分别为4.88±3.91cm、2.89±1.49cm、2.03±1.71cm，均明显小于未治疗模型组
3
的7.52±4.05cm(P分别＜0.05，0.01)，按抑瘤率公式计算，抑瘤率分别为35.1±28.1％、
61.6±19.8％和72.9±22.8％。说明在荷白血病瘤裸鼠体内具有较强的抑制白血病细胞生长的作用。
[0183] 2.2人参有效部位治疗后裸鼠体内瘤组织有不同程度的变性和坏死：图1显示治疗后瘤组织有不同程度的变性和坏死，100、200mg/Kg治疗组病理检查显示瘤组织细胞有肿胀、破裂，细胞核溶解等现象，说明在荷白血病瘤裸鼠体内具有较强的抗白血病作用。
[0184] 3.小结
[0185] 研究证明人参有效部位治疗红白血病荷瘤裸鼠的疗效显著，不但在体外抑制K562白血病细胞的增殖，而且在体内也能够有效地抑制瘤体的生长，并使白血病瘤组织有不同程度的变性和坏死，从而发挥其抗白血病的功效。
[0186] 实施例5治疗单核SHI-1白血病细胞浸润裸小鼠模型的疗效显著
[0187] 1.材料和方法
[0188] 1.1制备模型：4～5周龄免疫缺陷(Nude)裸鼠由上海斯莱克实验动物公司生产，7 +
将筛选过的高致瘤性人急性单核SHI-1白血病细胞(1×10 细胞，人CD45 细胞)经尾静脉注射到裸鼠体内。制模后病理检查显示SHI-1细胞可浸润多种脏器，在肝、肺、肾、脾、骨髓、+
肿块和脑等组织中均可见到不同程度表达人CD45 白血病细胞，表明该模型制备是成功的。
将筛选过的高致瘤性人急性单核SHI-1白血病细胞(1×10 细胞，人CD45 细胞)经尾静脉注射到裸鼠体内。制模后病理检查显示SHI-1细胞可浸润多种脏器，在肝、肺、肾、脾、骨髓、+
肿块和脑等组织中均可见到不同程度表达人CD45 白血病细胞，表明该模型制备是成功的。
[0189] 1.2实验分组和治疗方法：实验分6组，每组12只，包括未接种白血病细胞的裸鼠对照组，将接种白血病细胞的模型裸鼠随机分成5组，人参有效部位(实施例3制得)低剂量组50mg/Kg/d、中剂量组100mg/Kg/d、高剂量组200mg/Kg/d，均灌胃治疗30天。未接种裸鼠对照组与未治疗模型组每日生理盐水灌胃，阳性药物对照组高三尖杉酯碱(Hom)1mg/Kg/d腹腔注射。
[0190] 2.结果和分析
[0191] 2.1人参有效部位明显延长单核白血病浸润裸鼠模型的生存期：中、高剂量治疗后，白血病裸鼠的生存期为50.92±10.42天、54.75±9.11天，均明显长于未治疗模型组的43.83±7.17天(P均＜0.01)，说明其在体内具有抗白血病的作用。
[0192] 2.2降低骨髓和外周血人CD45+白血病细胞数量：流式细胞术检测中、高剂量治疗+组骨髓表达CD45 细胞率分别为2.98±1.02％和2.37±0.89％，明显低于未治疗模型组的+
3.94±1.35(P＜0.05和0.01)；而高剂量组外周血表达CD45 细胞率24.44±6.22％，也明显低于未治疗模型组的33.19±5.35％(P＜0.01)。提示人参有效部位在体内能够显著地抑制白血病细胞的增殖。
3.94±1.35(P＜0.05和0.01)；而高剂量组外周血表达CD45 细胞率24.44±6.22％，也明显低于未治疗模型组的33.19±5.35％(P＜0.01)。提示人参有效部位在体内能够显著地抑制白血病细胞的增殖。
[0193] 2.3明显减少人CD45+白血病细胞在中枢系统的浸润：图2显示人参有效部位治疗+后裸鼠脑组织人CD45 白血病细胞的浸润明显减少，免疫组化染色显示未治疗模型对照组+ +
的脑实质内大量白血病CD45 细胞堆积，而中剂量100mg/Kg/d治疗组脑实质和硬膜外CD45+
细胞浸润的数量明显减少，并且未见到脑实质内有浸润，仅脑外膜覆盖有CD45 细胞；高剂量200mg/Kg/d治疗组脑组织的白血病细胞浸润减则更少，未发现有脑实质的浸润，仅覆少量盖于大脑，小脑，脑间裂隙表面。
的脑实质内大量白血病CD45 细胞堆积，而中剂量100mg/Kg/d治疗组脑实质和硬膜外CD45+
细胞浸润的数量明显减少，并且未见到脑实质内有浸润，仅脑外膜覆盖有CD45 细胞；高剂量200mg/Kg/d治疗组脑组织的白血病细胞浸润减则更少，未发现有脑实质的浸润，仅覆少量盖于大脑，小脑，脑间裂隙表面。
[0194] 3.小结
[0195] 研究证明人参有效部位在急性单核细胞浸润裸鼠模型体内显示出较强的抗白血病作用，能够有效地延长白血病裸鼠的生存期，抑制SHI-1白血病细胞在体内增殖，降低骨+髓和外周血人CD45 白血病细胞的数量，并有效地抑制该白血病细胞在脑组织的转移和浸润。
[0196] 实施例6体外抑制多种白血病造血祖细胞增殖的作用
[0197] 1.材料和方法
[0198] 1.1急性髓系白血病患者骨髓原代白血病造血祖细胞的增殖试验：急性髓系白血病患者10例(n＝10)，初治3例，复发7例，经细胞形态学和组织化学染色确诊为急性粒细胞白血病。取患者的骨髓标本，分离出单个核细胞，采用植物血凝素-白细胞条件培养液二步法培养体系，将白血病细胞接种于半固体培养体系，均作3复孔，以琼脂作为白血病祖细胞集落形成的支架。实验组加入人参有效部位分别为5、10、20、50和100mg/L，以不加药物的为对照组。培养7天，倒置显微镜下观察和计数白血病祖细胞集落(≥40个细胞)，集落数取3复孔的均数。
[0199] 1.2白血病细胞株半固体和液体2种培养法的增殖试验：选择红系K562、单核系SHI-1、粒系HL-60细胞作为靶细胞，将白血病细胞接种于半固体培养体系，均作3复孔，以琼脂作为白血病祖细胞集落形成的支架，培养7天，倒置显微镜下观察和计数白血病祖细胞集落(≥40个细胞)。液体培养体系中，将白血病细胞与不同浓度的药物孵育3天，均作3复孔，然后采用MTT方法测定结果。2种培养法分别加入人参有效部位(实施例3制得)5、10、20、50和100mg/L，以不加药物的为对照组。计算药物的抑制率，相同的实验重复6次(n＝6)。
[0200] 1.3激光共聚焦显微镜观察BCR/ABL蛋白表达的荧光强度：人参有效部位20、50和100mg/L孵育K562细胞7天，取细胞用离心沉淀涂片机制片，采用BCR/ABL融合蛋白抗体进行结合反应，再用荧光标记，然后观察结果。
[0201] 2.结果
[0202] 2.1抑制急性髓系白血病患者原代白血病造血祖细胞增殖的作用：人参有效部位体外抑制增殖的作用呈剂量依赖性，20mg/L抑制集落生成的作用明显，集落数明显减少，集落抑制率为25.6±14.5％(P＜0.01)；50和100mg/L对白血病集落的抑制作用更为显著，集落抑制率分别为54.3±21.8％和68.6±22.3％(P均＜0.01)。
[0203] 2.2抑制红系K562白血病细胞增殖的作用
[0204] 2.2.1有效地抑制K562白血病细胞增殖呈剂量依赖性：液体和半固体培养均显示人参有效部位能够有效地抑制白血病细胞增殖，低浓度20mg/L起效。液体培养MTT法检测显示人参有效部位20、50和100mg/L的抑制率分别为25.5±17.7％、38.4±26.1％和66.1±13.3％(P均＜0.01)。同样，半固体培养增殖试验也显示20、50和100mg/L的集落抑制率分别为23.7±2.8％、51.6±3.8％和88.6±4.6％(P均＜0.01)。
[0205] 2.2.2抑制K562白血病细胞增殖相关特异性BCR/ABL融合蛋白的表达：图3显示人参有效部位下调K562细胞增殖特异性BCR/ABL融合蛋白的表达，荧光标记激光共聚焦显微镜观察到随着人参有效部位剂量的增高，白血病细胞内呈绿色荧光反应的BCR/ABL融合蛋白表达逐渐减弱，20、50mg/L组细胞内绿色荧光反应低于对照细胞，100mg/L组的绿色荧光最弱，提示能够有效地通过下调BCR/ABL融合蛋白的表达而抑制白血病细胞的增殖。
[0206] 2.3有效地抑制单核系SHI-1白血病细胞增殖的作用
[0207] 2.3.1抑制单核白血病细胞的增殖呈剂量依赖性：液体培养MTT检测显示人参有效部位20、50mg/L组，对白血病细胞的抑制率分别为16.2±1.8％和38.6±5.5％(P＜0.05和0.01)，100mg/L抑制率达到72.6±9.8％(P＜0.01)。
[0208] 2.3.2抑制单核SHI-1白血病祖细胞集落生成呈剂量依赖性：半固体培养集落生成试验显示人参有效部位低浓度10mg/L起效，集落生成的抑制率为15.6±2.5％(P＜0.05)；20、50和100mg/L的抑制率分别为36.6±3.5％、56.1±12.4％和82.3±10.6％(P均＜0.01)。
[0209] 2.4有效地抑制粒系HL-60白血病细胞增殖的作用
[0210] 2.4.1抑制粒系白血病细胞的增殖呈剂量依赖性：液体培养MTT法分析人参有效部位20、50和100mg/L组对HL-60白血病细胞的抑制率分别24.6±2.1％、45.6±2.5％和61.4±2.4％(P均＜0.01)。
[0211] 2.4.2抑制粒系白血病祖细胞集落生成呈剂量依赖性：体外半固体集落培养体系中，人参有效部位使白血病祖细胞集落的形成明显减少，20、50和100mg/L组对HL-60白血病集落的抑制率分别19.9±2.2％、42.2±2.1％和79.5±3.4％(P均＜0.01)。
[0212] 3.小结
[0213] 半固体和液体2种培养法均证明人参有效部位不但能够抑制急性髓系白血病患者原代白血病造血祖细胞的增殖，而且对红系K562、单核系SHI-1、粒系HL-60等多种白血病细胞株均有显著地抑制增殖作用，其抑制效应呈剂量依赖性。相关作用机制的研究表明通过下调白血病K562细胞增殖特异性BCR/ABL融合蛋白的表达水平，而发挥其抗白血病的功效。
[0214] 实施例7体外培养中增加白血病细胞对化疗药物的敏感性
[0215] 1.材料和方法
[0216] 1.1靶细胞：红系K562、粒系HL-60白血病细胞。
[0217] 1.2与化疗药物高三尖杉酯碱(Hom)和阿糖胞苷(Ara-c)的协同性试验：人参有效部位(实施例3制得)与小剂量Hom或Ara-c联合应用。细胞培养加入Hom终浓度为5μg/L、Ara-c终浓度为2μg/L，37℃孵育1小时，用培养液洗去化疗药物，计数细胞，接种至琼脂半固体集落培养体系中，加入人参有效部位分别为0、10、20、50mg/L，均作三复孔，培养7天，计数白血病集落数(≥40个细胞)，分别取三复孔的均数，并计算药物抑制率，相同的实验重复6次(n＝6)。药物敏感性标准按照本实验室以前报道的结果，以药物抑制率≥30％作为对该药敏感的标准。
[0218] 2.结果
[0219] 2.1半固体集落培养显示增加白血病细胞对高三尖杉酯碱的敏感性：图4a显示人参有效部位增加Hom对白血病细胞集落的抑制作用，小剂量人参有效部位10、20、50mg/L与小剂量Hom联合应用时，对K562细胞集落生成的抑制率分别为40.7±5.6％、75.3±5.7％、92.8±5.0％，明显高于单用Hom对照组的20.3±6.5％(P均＜0.01)。
[0220] 2.2半固体集落培养显示增加白血病细胞对阿糖胞苷的敏感性：图4b显示人参有效部位增加Ara-c对白血病细胞集落的抑制作用，小剂量人参有效部位10、20和50mg/L与小剂量Ara-c联合应用时，对HL-60细胞集落的抑制率分别为42.0±3.6％、51.6±4.4％和94.7±12.4％，明显高于单用Ara-c对照组的18.5±5.6％(P均＜0.01)。
[0221] 2.3液体培养MTT检测法显示增加白血病细胞对高三尖杉酯碱的敏感性：小剂量人参有效部位20mg/L与小剂量Hom联合应用时，对K562、HL-60细胞增殖的抑制率分别为58.7±7.6％、55.5±6.7％，明显高于单用Hom对照组的19.5±8.4％、19.2±7.4％(P均＜0.01)。
[0222] 2.4液体培养MTT检测法显示增加白血病细胞对阿糖胞苷的敏感性：小剂量人参有效部位20mg/L与小剂量Ara-c联合应用时，对K562、HL-60细胞增殖的抑制率分别为58.5±8.5％、62.7±10.0％，明显高于单用Ara-c对照组的19.5±6.2％、18.4±8.5％(P均＜0.01)。
[0223] 3.小结
[0224] 人参有效部位不但能够抑制急性髓系白血病患者的原代白血病造血祖细胞的增殖，而且对红系K562、单核系SHI-1、粒系HL-60等多种白血病细胞株均有显著的抑制增殖作用。同时，小剂量人参有效部位与小剂量化疗药物联合应用，能够通过增强白血病细胞对化疗药物的敏感性而显示其抗白血病的协同性。
[0225] 实施例8诱导白血病细胞凋亡的作用
[0226] 1.材料和方法
[0227] 1.1白血病靶细胞：选择红系K562、粒系HL-60、单核系SHI-1白血病细胞。
[0228] 1.2方法：Annexin V检测早期的凋亡细胞，采用液体培养，人参有效部位(实施例3制得)处理白血病细胞36小时，进行荧光标记的Annexin染色，同时加PI作双标记(鉴别凋亡和死亡细胞)，流式细胞仪检测Annexin V阳性的凋亡细胞百分比，相同的实验重复
5次(n＝5)。晚期凋亡细胞的检测则采用琼脂糖凝胶电泳分析凋亡特异性DNA降解梯形条带的方法，同样方法药物处理细胞后，裂解细胞，提取DNA，于1.2％琼脂糖凝胶上电泳，紫外光成像系统拍摄凋亡特异性DNA降解梯形条带。
5次(n＝5)。晚期凋亡细胞的检测则采用琼脂糖凝胶电泳分析凋亡特异性DNA降解梯形条带的方法，同样方法药物处理细胞后，裂解细胞，提取DNA，于1.2％琼脂糖凝胶上电泳，紫外光成像系统拍摄凋亡特异性DNA降解梯形条带。
[0229] 2.结果
[0230] 2.1诱导红系K562白血病细胞凋亡的作用：人参有效部位50、75和100mg/L处理细胞36小时，Annexin V阳性的凋亡细胞率明显增加，分别为5.27±0.44％、9.42±0.70％和15.72±1.87％，显著高于未加药对照组的3.23±0.47％(P均＜0.01)。75和100mg/L处理细胞后，琼脂糖凝胶电泳可见典型的DNA降解的特异性梯形条带。
[0231] 2.2诱导粒系HL-60白血病细胞凋亡的作用：人参有效部位50、75和100mg/L处理细胞36小时，Annexin V阳性的凋亡细胞率明显增加，分别为13.72±1.44％、21.6±2.14％和29.5±3.01％，显著高于未加药对照组的1.23±0.40％(P均＜0.01)。同时，显微镜下形态学观察可见凋亡细胞的典型特征，图5显示人参有效部位诱导白血病细胞凋亡DNA降解梯形条带，25、50、75和100mg/L处理细胞后，琼脂糖凝胶电泳可见典型的DNA降解的特异性梯形条带。
[0232] 2.3诱导单核系SHI-1白血病细胞凋亡的作用：人参有效部位50、75和100mg/L处理SHI-1细胞36小时，Annexin V阳性的凋亡细胞率明显增加，分别为8.61±0.45％、12.60±1.08％和18.40±0.56％，均明显高于未加药对照组的3.24±0.82％(P均
＜0.01)。
＜0.01)。
[0233] 3.小结
[0234] 人参有效部位体外能够有效地诱导红系K562细胞、粒系HL-60和单核系SHI-1白血病原始细胞的凋亡，流式细胞术显示Annexin V阳性的凋亡细胞率明显增加，琼脂糖凝胶电泳出现凋亡典型的DNA降解特异性梯形条带，均证明人参有效部位诱导白血病细胞凋亡是发挥其抗白血病的重要功效之一。
[0235] 实施例9诱导白血病原始细胞分化的作用
[0236] 1.材料和方法
[0237] 1.1靶细胞：选择红系K562、单核系SHI-1白血病细胞。
[0238] 1.2细胞培养及药物处理：液体培养加入不同浓度的人参有效部位(实施例3制得)10、20和40mg/L孵育细胞3周，以不加药的细胞为对照。培养后流式细胞术检测SHI-1细胞分化表型的变化(n＝6)。取培养后细胞用离心沉淀涂片机制片，免疫细胞化学染色和荧光标记激光共聚焦显微术观察分化相关γ-珠蛋白和β-catenin蛋白，以及PU.1和GATA-1转录因子的表达水平。相同实验重复3遍。
[0239] 1.3免疫细胞化学染色细胞阳性程度的判断标准：以胞浆出现棕褐色颗粒状物为阳性细胞，“-”为无阳性反应物；“+”呈浅淡棕色云雾状为弱阳性；“+++”呈深褐色凝块状为强阳性；“++”介于“+”与“+++”之间。相同实验重复3遍，阳性细胞百分率取均值。
[0240] 2.结果
[0241] 2.1诱导红系K562白血病细胞分化的作用
[0242] 2.1.1诱导分化相关γ-珠蛋白的表达水平增高：图6显示人参有效部位上调分化相关γ-珠蛋白的表达，低浓度10、20mg/L作用细胞3周，免疫组化染色显示分化相关γ-珠蛋白表达“+++”强阳性细胞为41.1±3.7％，62.0±5.6％，明显高于未加药对照组的21.3±7.3％(P均＜0.01)。同时，激光共聚焦显微术也获得同样结果，K562细胞本身表达γ-珠蛋白，但荧光度弱，而经药物作用后，绿色荧光反应出现不同程度地增强，与未加药对照细胞相比，10、20和40mg/L组的荧光反应明显增强。
[0243] 2.1.2诱导分化相关GATA-1转录因子的表达水平增高：小剂量人参有效部位10、20mg/L处理细胞3周后，免疫组化染色显示分化相关GATA-1转录因子表达“+++”强阳性细胞为42.5±4.7％、40.8±10.5％，明显高于对照组的23.6±3.2％(P均＜0.01)。同时，激光共聚焦显微术也获得同样结果，K562细胞本身表达GATA-1转录因子蛋白，但荧光度弱，而经药物作用后，红色荧光反应出现不同程度地增强，与未加药对照细胞相比，10、20mg/L组的红色荧光反应明显增强。
[0244] 2.2诱导单核SHI-1白血病细胞分化的作用
[0245] 2.2.1体外诱导单核细胞分化相关表型CD11b阳性细胞率增加：图7显示人参有效部位诱导SHI-1细胞分化相关CD11b表型阳性细胞率增高，低浓度药物10、20mg/L作用细胞3周，流式细胞术显示单核细胞分化相关表型CD11b阳性细胞率分别为8.1±0.6％和11.1±2.9％，明显高于未加药对照组的3.4±0.5％(P＜0.05和0.01)。40mg/L组的阳性细胞率为14.6±3.7％，也明显高于对照组(P＜0.01)。
[0246] 2.2.2体外诱导分化相关PU.1和β-catenin蛋白表达增高：免疫细胞化学染色显示10、20mg/L作用细胞3周，分化相关PU.1蛋白表达“+++”强阳性的细胞率为44.2±5.6％、60.8±8.5％，明显高于未加药对照组的21.6±3.5％(P均＜0.01)；同时分化相关β-catenin蛋白表达“+++”强阳性的细胞率为41.9±8.6％、56.0±4.5％，也明显高于未加药对照组的20.2±6.3％(P均＜0.01)。
[0247] 3.小结
[0248] 人参有效部位能够诱导红系K562细胞、单核系SHI-1白血病原始细胞分化，流式细胞术检测分化表型阳性细胞率均明显升高；免疫细胞化学染色和激光共聚焦显微术表明分化相关γ-珠蛋白和β-catenin蛋白表达水平增高，同样GATA-1和PU.1转录因子的表达水平也增高，均证明人参有效部位可通过诱导白血病原始细胞分化而发挥其抗白血病的功效。
[0249] 实施例10下调白血病细胞增殖相关MAPK信号途径多种蛋白激酶的表达
[0250] 1.材料和方法
[0251] 1.1靶细胞：取红系K562细胞及KG-1a白血病干细胞，KG-1a细胞由澳大利亚B.H.Chong教授惠赠，该细胞本身非常原始，99.4％细胞呈CD34阳性，对造血生长因子GM-CSF不敏感，并对强诱导分化剂TPA的作用也不敏感。
[0252] 1.2药物处理细胞和提取胞浆蛋白：选择白血病细胞本身高表达的5种蛋白激酶AKT-1、AKT-2、ERK-2、MEK-1和MEK-2，观察人参有效部位对这些增殖相关蛋白激酶的抑制作用，经人参有效部位(实施例3制得)20、50、100mg/L处理细胞7天，分别收获药物处理组与对照组的细胞，提取胞浆蛋白，采用Western免疫印迹法分析上述5种蛋白激酶的表达水平，相同的实验重复3遍。
[0253] 2.结果
[0254] 2.1不同程度地降低KG-1a细胞增殖相关AKT-1、AKT-2、ERK-2、MEK-1和MEK-2蛋白激酶的表达水平：图8显示人参有效部位下调MAPK信号途径主要蛋白激酶的表达水平，50、100mg/L作用细胞后，AKT-1蛋白条带密度1429.3±136.5、1425.3±136.1，低于对照组的2692.3±216.3；AKT-2蛋白条带密度329.9±31.4、307.7±30.2，低于对照组的838.0±81.3；ERK-2蛋白条带密度610.9±61.3、563.8±51.2，低于对照组的1985.5±189.9；MEK-1蛋白条带密度1013.1±102.1、997.4±92.7，低于对照组的2815.5±282.6；MEK-2蛋白条带密度1363.5±125.8、1272.5±124.5，低于对照组的
2594.5±244.3。
2594.5±244.3。
[0255] 2.2不同程度地降低K562细胞增殖相关AKT-1、AKT-2、ERK-2、MEK-1和MEK-2蛋白激酶的表达水平：图8显示人参有效部位下调MAPK信号途径主要蛋白激酶的表达水平，50、100mg/L药物处理后，AKT-1蛋白条带密度2050.4±206.5、217.7±26.4，低于对照组的2323.2±226.3；AKT-2蛋白条带密度409.2±41.4、12.24±1.5，低于对照组的652.6±61.8；ERK-2蛋白条带密度3015.2±331.3、681.1±67.3，低于对
照组的3478.8±309.3；MEK-1蛋白条带密度350.3±34.1、35.0±3.4，低于对照组
的770.0±72.5；MEK-2蛋白条带密度2383.4±225.6、676.0±64.3，低于对照组的
2356.8±235.2。
照组的3478.8±309.3；MEK-1蛋白条带密度350.3±34.1、35.0±3.4，低于对照组
的770.0±72.5；MEK-2蛋白条带密度2383.4±225.6、676.0±64.3，低于对照组的
2356.8±235.2。
[0256] 3.小结
[0257] 人参有效部位能够显著地抑制白血病细胞内增殖相关MAPK信号途径多种蛋白激酶AKT-1、AKT-2、ERK-2、MEK-1和MEK-2的表达水平，证明其抗白血病的作用机制之一是通过下调增殖相关信号途径多种蛋白激酶的表达，来阻滞恶性信号的传导，从而抑制白血病细胞的异常增殖。
[0258] 实施例11人参有效部位对其它非造血系统肿瘤细胞的抑制作用
[0259] 1.材料和方法
[0260] 1.1靶细胞：L929成纤维肿瘤细胞、ECV-304肿瘤内皮细胞。
[0261] 1.2实验方法：体外液体培养MTT检测法，集落生成试验法观察人参有效部位(实施例3制得)对实体肿瘤细胞的抑制作用，实验组加入人参有效部位分别为5、10、20、50和100mg/L，以不加药物为对照组，均作3复孔。培养7天，倒置显微镜下观察和计数实体肿瘤细胞集落(≥40个细胞)。相同的实验重复5次(n＝5)。
[0262] 2.结果
[0263] 2.1抑制L929成纤维肿瘤细胞集落生成的作用：图9显示人参有效部位抑制L929细胞集落生成的作用，未加药L929对照细胞集落形态以紧密型为主，而人参有效部位10、20、50、100mg/L作用后集落数明显减少，细胞丛增加，且集落形态由紧密型向疏散型转变，集落抑制率分别为25.0±5.3％、41.7±1.0％、76.6±3.1％(P均＜0.01)。当药物浓度增加到100mg/L时，基本上无集落形成。说明人参有效部位对L929细胞具有显著的抑制增殖作用，呈剂量依赖性。
[0264] 2.2抑制L929成纤维肿瘤细胞增殖的作用：液体培养MTT检测显示随着人参有效部位药物浓度的增加，OD值逐渐减小，不同药物浓度10、20、50和100mg/L的抑制率分别为14.1±5.0％、21.4±8.1％、37.6±3.1％和57.2±3.5％(P＜0.05或0.01)。提示MTT比色测定与集落形成试验的结果相一致，均证明人参有效部位具有抑制L929细胞增殖的作用，呈剂量依赖性。鉴于成纤维L929细胞为肿瘤细胞生长提供支架，上述结果提示人参有效部位通过抑制成纤维肿瘤细胞的生长，而具有抗肿瘤的作用。
[0265] 2.3抑制ECV-304肿瘤内皮细胞增殖的作用：液体培养MTT检测显示随着人参有效部位药物浓度的增加，OD值逐渐减小，抑制作用明显增强，呈剂量依赖性。10、20、50、100mg/L的抑制率分别为26.7±7.1％、36.7±2.6％、43.7±5.0％、68.6±2.8％(P均＜0.01)。鉴于内皮细胞通过形成血管，而提供肿瘤细胞生长所需的营养，上述结果提示人参有效部位通过抑制肿瘤内皮细胞的生长，从而具有抗肿瘤的作用。
[0266] 3.小结
[0267] 人参有效部位对其它实体肿瘤细胞也具有显著的抑制作用，包括L929成纤维肿瘤细胞、ECV-304肿瘤内皮细胞等。鉴于成纤维肿瘤细胞为肿瘤细胞的生长提供支架，内皮细胞通过形成血管而提供肿瘤细胞生长所需的营养，因此提示人参有效部位除了上述抗白血病的功效外，同时也具有抗实体肿瘤的作用。