可断裂PEG脂质衍生物在制剂中的应用

摘要

本发明属于医药技术领域，提供可断裂聚乙二醇脂质衍生物在制备减轻或避免加速血液清除PEG化制剂中的应用。本发明是利用可断裂聚乙二醇脂质衍生物如PEG-胆固醇半琥珀酸酯、PEG-胆固醇碳酸甲酯或PEG-α生育酚半琥珀酸酯等修饰脂质体、囊泡、乳剂、微乳、胶束和纳米粒等液体微粒制剂，通过测定重复注射可断裂PEG脂质衍生物修饰药物制剂后动物血浆中以及肝脾等组织中制剂消除的变化，证明重复注射可断裂PEG脂质衍生物修饰的微粒制剂仅引起轻微的或不能引起加速血液清除，即可以减轻或避免加速血液清除产生。本发明开拓了可断裂PEG脂质衍生物的新用途。

权利要求

1.可断裂PEG脂质衍生物在制备减轻或避免加速血液清除PEG化制剂中的应用，其特征在于，所述的可断裂PEG脂质衍生物结构为：其中n=5～500。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述PEG化制剂为脂质体、囊泡、乳剂、胶束或纳米粒制剂。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述PEG化制剂中可断裂PEG脂质衍生物在脂质材料中的质量浓度≥2%。

说明书

可断裂PEG脂质衍生物在制剂中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域，具体地说是涉及可断裂PEG脂质衍生物在制剂中的用途。

背景技术

[0002] 在临床使用中，为达到疗效，PEG化液体微粒制剂往往需要进行重复注射，但是，目前关于体内重复注射PEG化制剂的药动学研究资料较为匮乏。有研究者发现，当向同一动物体内重复注射（间隔几天）PEG化脂质体时，会引起二次注射PEG化脂质体的药动学行为和肝脾组织分布发生异常变化，这一现象被称之为加速血液清除（Accelerated Blood Clearance，简称ABC）（参见Dams ETM, Laverman P, Oyen WJG, et al. Accelerated Blood Clearance and Altered Biodistribution of Repeated Injections of Sterically Stabilized Liposomes [J]. J Pharmacol Exp Ther, 2000, 292: 1071-1079； Laverman P, Carstens MG, Boerman OC, et al. Factors affecting the accelerated blood clearance of polyethylene glycol-liposomes upon repeated injection [J]. J Pharmacol Exp Ther, 2001, 298: 607-612； Ishida T, Atobe K, Wang XY, et al. Accelerated blood clearance of PEGylated liposomes upon repeated injections: Effect of doxorubicin-encapsulation and high-dose first injection [J]. J Control Release, 2006, 115: 251-258.）。也有研究表明重复注射阳离子牛血清白蛋白修饰的PEG与PLA交联形成的纳米粒（CBSA-NP）也产生了ABC现象，并且与前人对PEG化脂质体诱导ABC现象的研究结论基本一致（参见Lu W, Wan J, She ZJ, et al. Brain delivery property and accelerated blood clearance of cationic albumin conjugated pegylated nanoparticle [J]. J Control Release, 2007, 118:38-53.）。因此，PEG化液体微粒制剂都具有产生加速血液清除即ABC现象的可能。

[0003] 可诱导免疫反应的不依赖胸腺的二级抗原（TI-2）是由细菌的细胞壁和荚膜多糖组成的，其具有高度重复结构（参见Ishida T, Masuda K, Ichikawa T, et al. Accelerated clearance of a second injection of PEGylated liposomes in mice [J]. Int J Pharm, 2003, 255: 167-174.）。该抗原有可能通过与B细胞表面的免疫球蛋白广泛交联，而导致B细胞分泌IgM和IgG。当TI-2激活B细胞时，抗原决定簇的密度是非常关键的：密度过低对于激活细胞是不够的；密度过高则细胞反应性反而降低。PEG聚合物也具有高度重复结构，低剂量的PEG化制剂即能够诱导产生ABC现象，表明在此条件下抗原决定簇（PEG）的密度足以激活B细胞。一旦PEG化制剂到达脾脏，就会与被PEG（或PEG化制剂）激活的B细胞表面的抗原结合、交联，导致抗PEG IgM的产生（参见Ishida T, Atobe K, Wang XY, et al. Accelerated blood clearance of PEGylated liposomes upon repeated injections: Effect of doxorubicin-encapsulation and high-dose first injection [J]. J Control Release, 2006, 115: 251-258.）。

[0004] 众所周知，脾在免疫反应中扮演着重要角色。首次注射PEG化脂质体之前将脾切除，则二次注射PEG化脂质体的ABC现象完全消失；未切除脾的对照组中大鼠血清与脂质体结合的IgM量比脾切除组高8倍，这表明PEG化脂质体与IgM的结合是诱导ABC现象的关键因素（参见Ishida T, Ichihara M, Wang XY, et al. Spleen plays an important role in the induction of accelerated blood clearance of PEGylated liposomes [J]. J Control Release, 2006, 115: 243-250.）。PEG化脂质体充当了脾脏中B细胞的活化剂。

[0005] 综合目前的研究结果，认为ABC现象是通过以下假设机理产生的：PEG化制剂的首剂量在脾脏产生抗PEG IgM，该血清因子选择性结合到几天后注射的PEG化制剂表面的PEG上，并随后激活补体系统。而这会依次导致补体C3片段对制剂的调理作用，结果增强了肝脏枯否（Kupffer）细胞对制剂的摄取，于是产生了ABC现象（参见Ishida T, Masuda K, Ichikawa T, et al. Accelerated clearance of a second injection of PEGylated liposomes in mice [J]. Int J Pharm, 2003, 255: 167-174； Ishida T, Harada M, Wang XY, et al. Accelerated blood clearance of PEGylated liposomes following preceding liposome injection: Effects of lipid dose and PEG surface-density and chain length of the first-dose liposomes [J]. J Control Release, 2005, 105:305-317； Ishida T, Ichihara M, Wang XY, et al. Spleen plays an important role in the induction of accelerated blood clearance of PEGylated liposomes [J]. J Control Release, 2006, 115: 243-250.）。

[0006] 药物或药用辅料具有免疫原性是一个非常严重的问题，因为抗体的产生会严重降低药物的安全性和效力，这已经阻碍了一些药物的发展，包括以蛋白质为基础的疗法，如单克隆抗体和带有致免疫成分的病毒载体。随着基因药物治疗的发展，脂质体作为基因药物载体得到了广泛而深入的研究，甚至在美国已经进入Ⅰ期临床试验。ABC现象表明非病毒载体致免疫的潜在危险，特别是当这些载体携带免疫刺激因子—如质粒DNA（pDNA）时，可以充当强的免疫佐剂（参见Judge A, McClintock K, Phelps JR, et al. Hypersensitivity and loss of disease site targeting caused by antibody responses to PEGylated liposomes [J]. Mol Ther, 2006, 13:328-337.）。Semple等的研究表明，重复注射包封寡核苷酸（ODN）、pDNA或RNA核酶的PEG化脂质体会诱导强烈的免疫应答，导致制剂血液循环时间缩短和小鼠死亡率显著增加（参见Semple SC, Harasym TO, Clow KA, et al. Immunogenicity and rapid blood clearance of liposomes containing polyethylene glycol-lipid conjugates and nucleic acid [J]. J Pharmacol Exp Ther, 2005, 312:1020-1026.）。

[0007] 另外，如果PEG化制剂携载的药物毒性较强，ABC现象会引起对非治疗器官（如肝脏）的毒性。尽管从动物实验得出的结论不可能与临床表现完全一致，但是对于液体微粒制剂来说，当需要多次注射或组合给药时，深入研究其体内分布和药代动力学是必要的。对于“细胞穿透肽”、“siRNA”等PEG化载体制剂，ABC现象会极大地降低其临床应用前景与价值。

[0008] 有人研究通过调整药物制剂表面PEG脂质衍生物的性质来避免ABC现象。研究人员采用较小的C14脂质锚定物增加PEG从粒子表面的解离，结果发现这会使ABC现象减弱（参见Judge AD, McClintock K, Shaw JR, et al. Hypersensitivity and loss of disease site targeting caused by antibody responses to pegylated liposomes [J]. Mol. Ther. 2006, 13: 328-337.）。因此，应用可交换的PEG脂质替换牢固结合于脂质体双分子层的PEG脂质可能是一个比较好的策略（参见Heyes J, Hall K, Tailor V, et al. Synthesis and characterization of novel poly(ethylene glycol)-lipid conjugates suitable for use in drug delivery PEG [J]. J Control Release, 2006,112: 280-290.），但脂质交换有可能引起脂质体双分子层膜缺陷。

[0009] 综上所述，本发明的目的是利用可断裂PEG脂质衍生物修饰液体微粒制剂来达到减轻或避免PEG化药物制剂产生ABC。此种技术还未见报道。

发明内容

[0010] 本发明的目的是提供可断裂PEG脂质衍生物在制备减轻或避免加速血液清除（以下简称ABC）PEG化制剂中的应用。

[0011] 在同一动物体内重复注射不可断裂PEG脂质衍生物修饰微粒制剂会产生加速血液清除（即ABC），这对疾病的治疗显然是不利的。本发明人通过大量试验研究发现，利用可断裂PEG脂质衍生物修饰液体微粒制剂（包括脂质体、囊泡、乳剂、微乳、胶束和纳米粒等制剂），重复注射此类PEG化制剂后能够达到减轻或避免ABC产生的目的。

[0012] 本发明提供的可断裂PEG脂质衍生物中PEG与脂质链段之间是通过酯键相连的，优选的方案是，所述可断裂PEG脂质衍生物中PEG与脂质链段之间是通过羧酸酯键、碳酸酯键或磷酸酯键相连的。

[0013] 优选的方案是，本发明的可断裂PEG脂质衍生物具有下列通式所示的结构[0014]

[0015] 其中R选自维生素E、甾体化合物（包括氢化甾体化合物，如胆固醇、豆固醇、谷甾醇、二氢胆固醇、胆甾烷、麦角固醇等）或C6～C36的直链或支链脂肪烷基（包括饱和、不饱和与多不饱和），m=0～6；n=5～500； R1选自甲基、乙基、羧基或氢。

[0016] 优选的方案是，本发明的可断裂PEG脂质衍生物具有下列通式所示的结构[0017]

[0018] 其中R选自维生素E、甾体化合物（如胆固醇、豆固醇、谷甾醇、二氢胆固醇、胆甾烷、麦角固醇等）或C6～C36的直链或支链脂肪烷基（包括饱和、不饱和与多不饱和），n=5～500；R1选自甲基、乙基、羧基或氢。

[0019] 优选的方案是，本发明的可断裂PEG脂质衍生物具有下列通式所示的结构[0020]

[0021] 其中R选自维生素E、甾体化合物（如胆固醇、豆固醇、谷甾醇、二氢胆固醇、胆甾烷、麦角固醇等）或C6～C36的直链或支链脂肪烷基（包括饱和、不饱和与多不饱和），n=5～500；R1选自甲基、乙基、羧基或氢。

[0022] 优选的方案是，本发明的可断裂PEG脂质衍生物具有下列通式所示的结构[0023]

[0024] 其中R选自维生素E、甾体化合物（如胆固醇、豆固醇、谷甾醇、二氢胆固醇、胆甾烷、麦角固醇等）或C6～C36的直链或支链脂肪烷基（包括饱和、不饱和与多不饱和），n=5～500；R1选自甲基、乙基、羧基或氢；所说的衍生物是钠盐、钾盐或铵盐。

[0025] 优选的方案是，本发明的可断裂PEG脂质衍生物具有下列通式所示的结构[0026]

[0027] 其中R、R1选自C6～C36的直链或支链脂肪烷基（包括饱和、不饱和与多不饱和），R与R1相同或不相同；m=0～6；n=5～500；R2选自甲基、乙基、羧基或氢；所说的衍生物是钠盐、钾盐或铵盐。

[0028] 优选的方案是，本发明的可断裂PEG脂质衍生物具有下列通式所示的结构[0029]

[0030] 其中R、R1选自维生素E、甾体化合物（如胆固醇）或C6～C36的直链或支链脂肪烷基（包括饱和、不饱和与多不饱和），R与R1相同或不相同；m=0～6；n=5～500；R2选自甲基、乙基、羧基或氢；所说的衍生物是钠盐、钾盐或铵盐。

[0031] 优选的方案是，本发明的可断裂PEG脂质衍生物具有下列通式所示的结构[0032]

[0033] 其中R、R1选自维生素E、甾体化合物（如胆固醇）、或C6～C36的直链或支链脂肪烷基（包括饱和、不饱和与多不饱和），R与R1相同或不相同；R`、 R`1选自维生素E、甾体化合物（如胆固醇、豆固醇、谷甾醇、二氢胆固醇、胆甾烷、麦角固醇等）或C6～C36的直链或支链脂肪烷基（包括饱和、不饱和与多不饱和），R`与 R`1相同或不相同；m=0～6；n=5～500；R2选自甲基、乙基、羧基或氢；所说的衍生物是钠盐、钾盐或铵盐。

[0034] 本发明人研究发现，要减轻或避免重复注射PEG化制剂产生ABC，较好地是，所述PEG化制剂中可断裂PEG脂质衍生物在脂质材料中的质量浓度应≥2% 。

[0035] 本发明优选实施例中选用结构式如下可断裂PEG脂质衍生物：

[0036] PEG-THS 即PEG-α生育酚半琥珀酸酯

[0037]

[0038] PEG-CHS 即PEG-胆固醇半琥珀酸酯

[0039]

[0040] PEG-CHM 即PEG-胆固醇碳酸甲酯

[0041]

[0042] 其中n=5～500（PEG 分子量为300～30000）。

[0043] 需要指出的是，上面的化合物即PEG-THS、PEG-CHS或 PEG-CHM中连接的PEG可以是非甲醚PEG。

[0044] 本发明对比实施例中选用结构式如下的不可断裂PEG脂质衍生物：

[0045] PEG-DSPE即PEG-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺

[0046]

[0047] PEG-CHOL即PEG-胆固醇

[0048]

[0049] PEG-胆固醇也可以是如下结构的化合物

[0050] 。

[0051] 本发明所述的PEG化制剂为液体微粒制剂，包括脂质体、囊泡、乳剂、微乳、胶束和纳米粒等制剂。在优选实施例中选用可断裂PEG脂质衍生物修饰的脂质体和囊泡制剂对本发明内容做出了进一步的阐释说明。

[0052] 本发明的PEG脂质衍生物修饰的不同制剂可按照如下方法制备：

[0053] 1、不同比例PEG脂质衍生物修饰的酸敏囊泡的制备

[0054] 将脂质类物质（包含有一定量的PEG脂质衍生物）用适宜的溶媒溶解或者不采用溶媒，采用直接水化法制备不同比例的PEG脂质衍生物修饰的酸敏囊泡。其中PEG-THS用于修饰胆固醇半琥珀酸酯三羟基氨基甲烷盐（CHST囊泡）。

[0055] 2、PEG脂质衍生物修饰的脂质体的制备

[0056] 可按照常规方法制备不同比例PEG脂质衍生物的脂质体。

[0057] 如：通过改良乙醇注入法制备脂质体。Epikuron 170，胆固醇和PEG脂质衍生物（4:1:0.15）溶解于适量无水乙醇中，50°C水浴搅拌直至溶解，继续搅拌挥去部分乙醇，加入预热至50°C的10 mM Tris-HCl（pH=7.4）缓冲溶液中孵育5 min，温度下调至40○C继续孵育10 min。样品冷却至室温后，探头超声分散，200 w×2 min；400 w×2 min；600 w×4 min（工作3 s，间歇3 s），得脂质体混悬液。

[0058] 3、乳剂、纳米粒的制备

[0059] 按照常规方法制备乳剂。

[0060] 如乳剂：MCT、磷脂和PEG脂质衍生物混合溶解，加入预热至70°C的5mM PBS（pH=5）缓冲溶液，搅拌制备初乳，微射流/均质机分散处理，得乳剂。

[0061] 脂质纳米粒：单硬脂酸甘油酯、磷脂和PEG脂质衍生物混合溶解，加入预热至70°C的水，搅拌制备初乳，微射流/均质机分散处理，得脂质纳米粒。

[0062] 本发明人对PEG脂质衍生物（包括可断裂和不可断裂）修饰的脂质体和囊泡制剂断裂性质作了考察：

[0063] 在不同浓度小牛血清(FBS)即不同酯酶量中的断裂具有如下特征：可断裂PEG脂质衍生物修饰的PEG脱落量与FBS的浓度成正比。不可断裂或者难以断裂的PEG衍生物，如PEG-CHOL、PEG-DSPE的PEG脱落量极少，且不随FBS浓度的改变而改变；

[0064] 酯键会在血浆中酯酶的作用下逐渐断裂，酯酶含量越高，PEG断裂量越高，如果血浆或血清中的酯酶失活，PEG则不能脱落；

[0065] 药物制剂进入体内后，不仅受血浆中酯酶的作用，进入各个脏器后也会受到脏器中酶的作用，因此，考察制剂在体内不同组织酶作用下的降解情况，更有利于了解制剂进入体内的变化过程。本发明考察了可断裂PEG脂质衍生物修饰的制剂在小鼠组织匀浆液中的断裂情况，选10%的小鼠组织匀浆液作为模型，由结果可知，可断裂PEG脂质衍生物在肝和肾中的断裂量最高，其次分别为脾、肺，而在脑、心组织中的酯酶浓度较低，PEG脂质衍生物在小鼠组织匀浆中的断裂结果与之相符。其中肝、肾、脾中的断裂率比较高，脑和心中最低。PEG-CHOL组在所有组织均无断裂；

[0066] 人的一个血液循环完成时间仅约40秒，只要可断裂PEG脂质衍生物能够确保所修饰的制剂在一定时间内具有一定的稳定性以使其能够到达靶器官,并没有必要过度延长其体内循环时间。尽管不可断裂PEG脂质衍生物修饰的微粒载体血浆稳定性比较好，可以有更长的血液循环时间，但是也由于不可断裂PEG层的存在而缺乏有效释放内容物的能力。对于本发明来说，为了确保PEG层在一定时间内存在一定量，较好地是，需要使脂质体、囊泡、乳剂、微乳、胶束和纳米粒等制剂中PEG脂质衍生物在整个脂质相中的质量浓度≥2%。可断裂PEG脂质衍生物在液体微粒制剂表面有适度的附着力，保证其在血液中有足够的保留时间。

[0067] 本发明通过测定首次注射PEG化制剂前后动物血浆中免疫球蛋白M（IgM）含量的变化，证明首次注射不可断裂PEG脂质衍生物（PEG-DSPE或PEG-CHOL）修饰的制剂能够引起动物血浆中IgM含量显著增加，而首次注射可断裂PEG脂质衍生物修饰的制剂仅引起IgM含量发生微小变化或没有变化。

[0068] 与现有技术现比，本发明具有如下优点：

[0069] 1、开拓了可断裂PEG脂质衍生物新的用途，也因PEG化技术的优势具有良好的应用前景；

[0070] 2、本发明应用于PEG化制剂，其制备方法简单；

[0071] 3、本发明采用水溶性的荧光探针—钙黄绿素对脂质体的内水相进行标记，考察制剂的ABC现象，与研究ABC现象常用的放射免疫法相比，荧光标记法无放射性污染，并且操作简便，便于推广。更为重要的是，钙黄绿素能够反映制剂整体体内经时变化过程，而示踪标记所表示的仅为所标记膜组分的变化规律；

[0072] 4、可断裂PEG脂质衍生物可以减轻或避免重复注射PEG化制剂引起的ABC现象，防止ABC现象引起的药物或基因治疗效率的下降，也可以避免采用较小的C14脂质锚定物修饰脂质体产生的脂质交换引起的脂质体双分子层膜缺陷。

附图说明

[0073] 图1是本发明对比实施例1二次注射PEG-DSPE修饰脂质体后0-4h钙黄绿素的血浆清除曲线图。

[0074] 图2是本发明对比实施例1二次注射PEG-DSPE修饰脂质体4 h后大鼠体内的组织分布图。

[0075] 图3是本发明实施例1-1二次注射PEG-CHM修饰脂质体后0-4 h钙黄绿素的血浆清除曲线图。

[0076] 图4是本发明实施例1-1二次注射PEG-CHM修饰脂质体4 h后大鼠体内的组织分布图。

[0077] 图5是本发明实施例1-2二次注射PEG-CHS修饰脂质体后0-4 h钙黄绿素的血浆清除曲线图。

[0078] 图6是本发明实施例1-2二次注射PEG-CHS修饰脂质体4 h后大鼠体内的组织分布图。

[0079] 图7是本发明对比实施例2二次注射PEG-CHOL修饰CHST囊泡后0-4 h钙黄绿素的血浆清除曲线图。

[0080] 图8是本发明对比实施例2二次注射PEG-CHOL修饰CHST囊泡4 h后大鼠体内的组织分布图。

[0081] 图9是本发明实施例2-1二次注射PEG-CHM修饰CHST囊泡后0-4 h钙黄绿素的血浆清除曲线图。

[0082] 图10是本发明实施例2-1二次注射PEG-CHM修饰CHST囊泡4 h后大鼠体内的组织分布图。

[0083] 图11是本发明实施例2-2二次注射PEG-CHS修饰CHST囊泡后0-4 h钙黄绿素的血浆清除曲线图。

[0084] 图12是本发明实施例2-2二次注射PEG-CHS修饰CHST囊泡4 h后大鼠体内的组织分布图。

[0085] 图13是本发明实施例2-3二次注射PEG-THS修饰THST囊泡后0-4 h钙黄绿素的血浆清除曲线图。

[0086] 图14是本发明实施例2-3二次注射PEG-THS修饰THST囊泡4 h后大鼠体内的组织分布图。

[0087] 图15是本发明实施例3预注射PEG化脂质体后大鼠血浆中IgM含量的变化示意图。

[0088] 图16是本发明实施例4预注射PEG化囊泡后大鼠血浆中IgM含量的变化示意图。

具体实施方式

[0089] 下面参照实施例和对比实施例，更具体地说明本发明。应当理解，下面的实施例用于说明本发明内容而非限定本发明内容，任何形式上的变通或/和改变都将落入本发明的保护范围。

[0090] 本发明中的PEG-CHS 即PEG-胆固醇半琥珀酸酯可采用下述方法制备：

[0091] 将琥珀酸酐和胆固醇共同溶于无水二氯甲烷中，回流反应 8 小时，反应液回收溶媒，所得产物用甲苯重结晶，得胆固醇半琥珀酸酯，将其与二氯亚砜于无水二氯甲烷中回流反应 5 小时后，加入聚乙二醇单甲醚继续回流反应 5 小时，回收溶媒，即得产物。

[0092] 本发明的PEG-THS 即PEG-α生育酚半琥珀酸酯可采用下述方法制备：

[0093] 以PEG平均分子量为2000的聚乙二醇-α-生育酚半琥珀酸酯(PEG2000-THS)为例说明PEG-THS的合成方法。

[0094] 将1 mmol α-生育酚半琥珀酸酯和0.6 mmol单甲醚聚乙二醇（分子量2000）放入圆底烧瓶，以20 mL二氯甲烷为反应溶剂，冰水浴中加入 44mg DMAP，15分钟后加入206mg二环己基碳二亚胺（DCC）为催化剂，室温反应4小时，抽滤，得到粗产物溶液。粗产物以2M盐酸洗3次萃取三次，再以饱和碳酸氢钠洗3次，蒸馏水洗3次，旋转蒸发干燥后经冰乙醚-1沉淀，无水乙醇重结晶得到白色蜡状的聚合物，得到的产物即为PEG-THS，IR（KBr）（cm ）： -1 -1
PEG没有羰基吸收峰，THS的羰基吸收峰在1753 cm 和1714 cm 处有羰基吸收峰，PEG-THS-1 -1
的吸收峰在1758 cm 和1738 cm 处有羰基吸收峰。

[0095] 本发明的PEG-CHM 即PEG-胆固醇碳酸甲酯可采用下述方法制备：

[0096] 以PEG平均分子量为2000的PEG-胆固醇碳酸甲酯(PEG2000- CHM)为例说明PEG- CHM的合成方法。

[0097] 将1.2 mmol胆固醇氯甲酯和 0.8 mmol单甲醚聚乙二醇（分子量2000）放入三颈瓶，氮气条件下加入DMAP即4-二甲氨基吡啶(0.4 mmol)和三乙胺(1.08 mmol)，以20 mL二氯甲烷为溶剂，冰水浴条件下搅拌1小时，撤掉冰浴室温反应24小时，粗产物经减压回收反应溶剂后，加入100mL水，以二氯甲烷萃取三次，再以冰水洗3次，饱和氯化钠洗3次，2M盐酸洗3次，经冰乙醚沉淀，无水乙醇重结晶得到白色蜡状的聚合物，得到的产物即为-1 -1
PEG2000-CHM，IR（KBr）（cm ）: PEG没有羰基吸收峰，CHM的羰基吸收峰在1776 cm 处有-1
羰基吸收峰，PEG-CHM的羰基吸收峰在1743.5 cm 。

[0098] 本发明磷酸酯类型化合物可采用下述方法制备：

[0099] 如：低温下，将1.1mol的十八醇单氯磷酯与0.9mol的聚乙二醇单甲醚（平均分子量300）放入三颈瓶中，氮气环境里加入DMAP (0.1mmol)和三乙胺(1 mmol)，其余步骤按合成PEG-胆固醇碳酸酯的方法进行，即可得到相应的磷酸酯类型衍生物。可以根据需要制备其钠盐、钾盐或者铵盐。

[0100] 本发明涉及到的其它化合物如PEG-DSPE、PEG-CHOL等可按照常规方法制备或市场购买获得。

[0101] 对比实施例1 重复注射PEG-DSPE修饰脂质体大鼠血浆清除的变化

[0102] 脂质体处方：SPC（大豆卵磷脂）:CH（胆固醇）: PEG-DSPE =1.85：1.20：0.125，其中PEG平均分子量为2000（本发明的“实施例1-1”～“实施例4”中所用PEG脂质衍生物的PEG平均分子量均为2000）。采用后插入法即在普通脂质体形成后将其与PEG-DSPE形成的胶束混合，制备PEG-DSPE修饰脂质体。

[0103] 采用薄膜分散法制备空白脂质体，醋酸钙主动载药法制备钙黄绿素脂质体，控制粒径在100 nm左右。

[0104] 取Wista大鼠，体重250～300 g，分2组，每组3只，按表1进行尾静脉注射给药：首次分别注射PBS缓冲溶液或PEG-DSPE修饰的空白长循环脂质体，二次均注射PEG-DSPE修饰的钙黄绿素长循环脂质体。首次注射空白脂质体的磷脂剂量为0.1 µmol /kg，间隔
5天第二次注射钙黄绿素长循环脂质体的磷脂剂量为5 µmol /kg。第二次给药后分别于
0.0167、0.083、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 h经眼眶静脉丛取血，计算血浆中钙黄绿素的含量。
4 h取血后将大鼠脱颈处死，取出肝、脾，生理盐水洗净残留血液后以滤纸吸干水分，组织匀浆后，计算肝、脾中钙黄绿素的含量。结果见图1。结果表明，A组血液循环时间较长，4 h时仍呈现较高的钙黄绿素浓度。B组较A组相比呈现明显的下降趋势。按非隔室模型计算药动学参数，结果见表2。A组的血浆半衰期（t1/2）是B组的2.89倍（P<0.05），B组血浆清除率（Cl）显著增加（P<0.05），说明重复注射PEG-DSPE修饰脂质体会引起明显的加速血液清除现象，即产生ABC现象。

[0105] A、B组大鼠二次尾静脉注射PEG-DSPE修饰脂质体后，4 h组织分布见图2。与A组相比，钙黄绿素在B组的肝聚集量显著增加（P<0.01），两组脾的聚集量没有差别（P>0.1）。

[0106] 表1脂质体注射方案

[0107]组别首次注射（空白脂质体） 二次注射（钙黄绿素脂质体）
A PBS PEG-DSPE-L
B PEG-DSPE-L PEG-DSPE-L

[0108] PBS：磷酸盐缓冲溶液；PEG-DSPE-L:聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺修饰的脂质体

[0109] 表2二次注射PEG-DSPE脂质体在大鼠体内的药动学参数 （n=3）

[0110]

[0111] 注：A与B组比较：* P<0.1, ** P<0.05, *** P<0.01

[0112] 实施例1-1 重复注射PEG-CHM修饰脂质体大鼠血浆清除的变化

[0113] 将脂质体处方中 PEG-DSPE 换为PEG-CHM，PEG-CHM修饰脂质体的制备同“对比实施例1”。

[0114] 取Wista大鼠，体重250～300 g，分2组，每组3只，按表3进行尾静脉注射给药，余下操作同 “实施例1”。结果见图3，结果表明，C组各时间点的钙黄绿素血浆剩余量稍高于D组（P<0.1）。按非隔室模型计算药动学参数，结果见表4。两组Cl有差异（P<0.05），而半衰期和MRT均无显著性差异（P>0.1），说明仅产生了轻微的加速血液清除现象。

[0115] C、D组大鼠二次尾静脉注射PEG-CHM修饰脂质体后，4 h组织分布见图4。与C组相比，D组的肝聚集量增加（P<0.1），脾聚集量没有改变（P>0.1）。

[0116] 表3脂质体注射方案

[0117]组别首次注射（空白脂质体） 二次注射（钙黄绿素脂质体）
C PBS PEG-CHM-L
D PEG-CHM-L PEG-CHM-L

[0118] PEG-CHM-L: 聚乙二醇-胆固醇碳酸甲酯修饰的脂质体

[0119] 表4二次注射PEG-CHM脂质体在大鼠体内的药动学参数 （n=3）

[0120]

[0121] 注：C与D组比较：* P<0.1, ** P<0.05, *** P<0.01

[0122] 实施例1-2 重复注射PEG-CHS修饰脂质体大鼠血浆清除的变化

[0123] 将脂质体处方中 PEG-DSPE 换为PEG-CHS，PEG-CHS修饰脂质体的制备同“对比实施例1”。

[0124] 取Wista大鼠，体重250～300 g，分2组，每组3只，按表5进行尾静脉注射给药，余下操作同 “实施例1”。结果见图5，结果表明，E、F两组的清除曲线几乎一致。按非隔室模型计算药动学参数，结果见表6。各药动学参数均无显著差异（P>0.1）。表明没有产生ABC现象。

[0125] E、F组大鼠二次尾静脉注射PEG-CHS修饰脂质体后，4 h组织分布见图6。统计学检验各脏器的钙黄绿素分布没有显著差异（P>0.1）。

[0126] 表5脂质体注射方案

[0127]组别首次注射（空白脂质体） 二次注射（钙黄绿素脂质体）
E PBS PEG-CHS-L
F PEG-CHS-L PEG-CHS-L

[0128] PEG-CHS-L:聚乙二醇-胆固醇半琥珀酸酯修饰的脂质体

[0129] 表6二次注射PEG-CHM脂质体在大鼠体内的药动学参数 （n=3）

[0130]

[0131] 对比实施例2 重复注射PEG-CHOL修饰囊泡大鼠血浆清除的变化

[0132] 囊泡处方：CHST: PEG-CHOL =100：6，其中PEG-CHOL是同时与CHST混合作为脂质相制备囊泡。

[0133] 采用直接水化法制备胆固醇半琥珀酸酯三羟基氨基甲烷盐（CHST）囊泡，表面活性及去除法制备包封钙黄绿素的CHST囊泡，控制粒径在110 nm左右。

[0134] 取Wista大鼠，体重250～300 g，分2组，每组3只，按表7进行尾静脉注射给药：首次分别注射PBS缓冲溶液或PEG-CHOL修饰的空白长循环囊泡，二次均注射PEG-CHOL修饰的钙黄绿素长循环囊泡。首次注射空白囊泡的剂量为0.1 µmol脂质/kg，间隔5天第二次注射钙黄绿素囊泡（经阴离子交换树脂柱纯化）的剂量为5 µmol脂质/kg。第二次给药后分别于0.0167、0.083、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 h经眼眶静脉丛取血，计算血浆中钙黄绿素的含量。4 h取血后将大鼠脱颈处死，取出肝、脾，生理盐水洗净残留血液后以滤纸吸干水分，组织匀浆后，计算肝、脾中钙黄绿素的含量。结果见图7。结果表明，H组的钙黄绿素血浆水平较G组相比呈现下降趋势，按非隔室模型药计算动学参数见表8，血浆清除率显著增加（P<0.05），G组的血浆半衰期是H组的2.13倍（P<0.05），而H组的血浆清除速率是G组的2.09倍（P<0.05），表明产生了ABC现象。

[0135] G、H组大鼠二次尾静脉注射PEG-CHOL修饰囊泡后，4 h组织分布见图8。与G组相比，H组的肝聚集量显著增加（P<0.05），而脾聚集量没有差别。

[0136] 表7囊泡注射方案

[0137]组别首次注射（空白囊泡） 二次注射（钙黄绿素囊泡）
G PBS PEG-CHOL-V
H PEG-CHOL-V PEG-CHOL-V

[0138] PEG-CHOL-V: 聚乙二醇-胆固醇修饰的胆固醇半琥珀酸酯囊泡

[0139] 表8二次注射PEG-CHOL修饰囊泡在大鼠体内的药动学参数 （n=3）

[0140]* **

[0141] 注：G与H组比较： P<0.1, P<0.05

[0142] 实施例2-1 重复注射PEG-CHM修饰囊泡大鼠血浆清除的变化

[0143] 将囊泡处方中的 PEG-CHOL 换为PEG-CHM，PEG-CHM修饰CHST囊泡的制备同“对比实施例2”。

[0144] 取Wista大鼠，体重250～300 g，分2组，每组3只，按表9进行尾静脉注射给药，余下操作同 “实施例1”。结果见图9，表10。结果表明，I组的曲线开始的几个时间点的钙黄绿素剩余量稍高于J组，通过药动学参数的比较可知，尽管半衰期略有降低，但各药动学参数之间均无统计学差异（P>0.1），表明仅产生轻微的ABC现象。

[0145] I、J组大鼠二次尾静脉注射PEG-CHM修饰囊泡后，4 h组织分布见图9。与I组相比，J组的肝聚集量显著增加（P<0.05），而脾聚集量没有差别。

[0146] 表9 囊泡注射方案

[0147]组别首次注射（空白囊泡） 二次注射（钙黄绿素囊泡）
I PBS PEG-CHM-V
J PEG-CHM-V PEG-CHM-V

[0148] PEG-CHM-V::聚乙二醇-胆固醇甲酯修饰的胆固醇半琥珀酸酯囊泡

[0149] 表10 二次注射PEG-CHM修饰囊泡在大鼠体内的药动学参数 （n=3）

[0150]

[0151] 实施例2-2 重复注射PEG-CHS修饰囊泡大鼠血浆清除的变化

[0152] 将囊泡处方中的 PEG-CHOL 换为PEG-CHS，PEG-CHS修饰CHST囊泡的制备同“对比实施例2”。

[0153] 取Wista大鼠，体重250～300 g，分2组，每组3只，按表11进行尾静脉注射给药，余下操作同 “实施例4”。结果见图11，表12。结果表明，K、L两组的钙黄绿素消除曲线几乎一致，其药动学参数经t检验各组均无显著差异（P>0.1），表明没有产生ABC现象。

[0154] K、L组大鼠二次尾静脉注射PEG-CHS修饰囊泡后，4 h组织分布见图12。经统计学检验各脏器的分布没有显著差异（P>0.1）。

[0155] 表11 囊泡注射方案

[0156]组别首次注射（空白囊泡） 二次注射（钙黄绿素囊泡）
K PBS PEG-CHS-V
L PEG-CHS-V PEG-CHS-V

[0157] PEG-CHS-V:聚乙二醇-胆固醇半琥珀酸酯修饰的胆固醇半琥珀酸酯囊泡[0158] 表12 二次注射PEG-CHS修饰囊泡在大鼠体内的药动学参数 （n=3）

[0159]

[0160] 实施例2-3 重复注射PEG-THS修饰囊泡大鼠血浆清除的变化

[0161] 囊泡处方：THST: PEG-THS =100：6，其中PEG-THS是同时与THST混合作为脂质相制备囊泡。

[0162] 采用直接水化法制备α生育酚半琥珀酸酯三羟甲基氨基甲烷盐（THST）囊泡，表面活性及去除法制备包封钙黄绿素的THST囊泡，控制粒径在110 nm左右。

[0163] 取Wista大鼠，体重250～300 g，分2组，每组3只，按表13进行尾静脉注射给药：首次分别注射PBS缓冲溶液或PEG-THS修饰的空白长循环囊泡，二次均注射PEG-THS修饰的钙黄绿素长循环囊泡。首次注射空白囊泡的剂量为0.1 µmol脂质/kg，间隔5天第二次注射钙黄绿素囊泡（经阴离子交换树脂柱纯化）的剂量为5 µmol脂质/kg。余下操作同 “实施例4”。结果见图13，表14。结果表明，M、N两组的清除曲线几乎一致，药动学参数无显著差异（P>0.1），表明没有产生ABC现象。

[0164] M、N组大鼠二次尾静脉注射PEG-THS修饰囊泡后，4 h组织分布见图14。与M组相比，N组的肝聚集量增加(P<0.1)，脾的聚集量没有差别 (P<0.1)。

[0165] 表13 囊泡注射方案

[0166]组别首次注射（空白囊泡） 二次注射（钙黄绿素囊泡）
M PBS PEG-THS-V
N PEG-THS-V PEG-THS-V

[0167] PEG-THS-V:聚乙二醇-α生育酚半琥珀酸酯修饰的α生育酚半琥珀酸酯囊泡[0168] 表14 二次注射PEG-THS修饰囊泡在大鼠体内的药动学参数 （n=3）

[0169]

[0170] 实施例3 首次注射PEG化脂质体对大鼠血浆IgM含量的影响

[0171] 用肝素作为抗凝剂，未经注射的大鼠或首次注射不包封药物的PEG化脂质体（磷脂剂量为0.1 µmol/kg）5天后的大鼠经眼眶静脉丛取血，30 min内于2-8℃ 5000 rpm离心15 min，取上清液放于-80℃保存，备用。利用酶联免疫法测定大鼠血浆中IgM的含量，结果见图15。由图可知，空白大鼠血浆中IgM的含量基本一致，但首次注射PEG化脂质体5天后的大鼠血清中IgM的含量有所差别，首次注射PEG-DSPE修饰的脂质体能够引起5天后大鼠血浆中IgM的含量显著增加（P<0.01），首次注射PEG-CHM修饰脂质体后导致IgM量轻微增加（P<0.1），而首次注射PEG-CHS修饰脂质体未能引起IgM含量的增加。

[0172] 实施例4 首次注射PEG化囊泡对大鼠血浆IgM含量的影响

[0173] 用肝素作为抗凝剂，未经注射的大鼠或首次注射不包封药物的PEG化囊泡（脂质剂量为0.1 µmol/kg）5天后的大鼠经眼眶静脉丛取血，30 min内于2-8℃ 5000 rpm离心15 min，取上清液放于-80℃保存，备用。利用酶联免疫法测定大鼠血浆中IgM的含量，结果见图16。由图可知，空白大鼠血浆中IgM的含量基本一致，但首次注射PEG化囊泡5天后的大鼠血清中IgM的含量有所差别：首次注射PEG-CHOL修饰的酸敏囊泡能够引起5天后大鼠血浆中IgM的含量增加（P<0.1），而首次注射PEG-CHS、PEG-CHM、PEG-THS修饰的酸敏囊泡能够引起IgM含量的微小增加，但差异不显著（P>0.1）。

[0174] 实施例5-1 胶束的制备及其首次注射对大鼠血浆IgM含量的影响

[0175] 按照常规方法，采用PEG分子量为30000的PEG-CHM制备胶束，参考实施例3的方法，测定首次注射PEG-CHM胶束后大鼠血浆IgM含量，结果未能引起IgM含量的增加。

[0176] 实施例5-2 胶束的制备及其首次注射对大鼠血浆IgM含量的影响

[0177] 按照常规方法，采用PEG分子量为5000的PEG-CHM制备胶束，参考实施例3的方法，测定首次注射PEG-CHM胶束后大鼠血浆IgM含量，结果未能引起IgM含量的增加。

[0178] 实施例5-3 胶束的制备及其首次注射对大鼠血浆IgM含量的影响

[0179] 按照常规方法，联合采用PEG分子量为10000的PEG-CHM与PEG分子量为300的PEG-CHM制备胶束，参考实施例3的方法，测定首次注射胶束后大鼠血浆IgM含量，结果未能引起IgM含量的增加。

[0180] 实施例6-1 微乳的制备及其首次注射对大鼠血浆IgM含量的影响

[0181] 处方组成：硬脂酸PEG酯(PEG分子量为5000):MCT(中链甘油三酯):丙二醇=10:1:1(重量比),按照常规方法，制备微乳，参考实施例3的方法，测定首次注射微乳后大鼠血浆IgM含量，结果未能引起IgM含量的增加。

[0182] 实施例6-2 微乳的制备及其首次注射对大鼠血浆IgM含量的影响

[0183] 处方组成：硬脂酸PEG酯(PEG分子量为5000):MCT(中链甘油三酯):丙二醇=10:0.5:1(重量比),按照常规方法，制备微乳，参考实施例3的方法，测定首次注射微乳后大鼠血浆IgM含量，结果未能引起IgM含量的增加。

[0184] 实施例6-3 微乳的制备及其首次注射对大鼠血浆IgM含量的影响

[0185] 处方组成：磷脂酰甘油PEG酯(PEG分子量为2000): 硬脂酸PEG酯(PEG分子量为30000):油酸乙酯:丙二醇=10:1:1:1(重量比),按照常规方法，制备微乳，参考实施例3的方法，测定首次注射微乳后大鼠血浆IgM含量，结果未能引起IgM含量的增加。

[0186] 本实施例采用结构式如下的磷脂酰甘油PEG酯(PEG分子量为2000)

[0187]

[0188] 其中R、R1为油酰基， m=2；n=45；R2为甲基。

[0189] 实施例6-4 微乳的制备及其首次注射对大鼠血浆IgM含量的影响

[0190] 处方组成：磷脂酰甘油PEG酯(PEG分子量为20000):结构油:丙三醇=10:2:5(重量比),按照常规方法，制备微乳，参考实施例3的方法，测定首次注射微乳后大鼠血浆IgM含量，结果未能引起IgM含量的增加。

[0191] 本实施例采用结构式如下的磷脂酰甘油PEG酯(PEG分子量为2000)

[0192]

[0193] 其中R、R1硬脂酰基， m=6；n=450；R2为甲基。

[0194] 实施例7 乳剂的制备及其首次注射对大鼠血浆IgM含量的影响

[0195] 处 方 组 成：心 磷 脂 酰 PEG 酯 (PEG分 子 量 为 10000): 磷 脂 : 豆油:MCT=3:10:10:90(重量比),按照常规方法，制备乳剂，粒度小于200nm。参考实施例3的方法，测定首次注射乳剂后大鼠血浆IgM含量，结果未能引起IgM含量的增加。

[0196] 实施例8 微乳的制备及其首次注射对大鼠血浆IgM含量的影响

[0197] 处方组成：磷脂酰PEG酯(PEG分子量为5000):油酸:乙醇=10:2:1(重量比),按照常规方法，制备微乳，参考实施例3的方法，测定首次注射微乳后大鼠血浆IgM含量，结果未能引起IgM含量的增加。

[0198] 本实施例采用结构式如下的磷脂酰PEG酯(PEG分子量为5000)

[0199]

[0200] 其中R选自C16的双甘油酯，n=113；R1选自甲基。

[0201] 实施例9 纳米粒的制备及其首次注射对大鼠血浆IgM含量的影响

[0202] 处方组成：PEG-CHS(PEG分子量为5000):单甘酯:MCT：胆固醇油酸酯=1:0.2:1：1(重量比),按照常规方法，制备纳米粒（粒度为76nm），参考实施例3的方法，测定首次注射纳米粒后大鼠血浆IgM含量，结果未能引起IgM含量的增加。