本发明的同时测定五种CYP450酶探针药代谢产物的检测方法，属于医药检测的技术领域。CYP450酶分多种亚型，每种亚型酶的特异性底物可作为探针药用于评价该种酶的活性。将探针药与肝微粒体共孵育得到相应的代谢产物，通过高效液相色谱-质谱联用法同时检测多种P450酶的探针药物的代谢物，即可同时评价几种酶的活性。本发明方法主要包括以下步骤：(1)肝微粒体的孵化；(2)样品预处理；(3)探针药物代谢产物的测定。本发明提供的检测方法，线性关系良好、准确度高、重现性好而且灵敏、可靠，可用于各种药物对P450酶诱导、抑制的评价。
1.一种同时测定五种CYP450酶探针药代谢产物的检测方法，所述的五种CYP450酶是CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19；主要有以下三个步骤：(1)肝微粒体的制备及孵化：
首先制备大鼠肝微粒体；分别选择非那西丁、咪达唑仑、异喹胍、甲苯磺丁脲和美芬妥英作为五种CYP450酶的探针药物，分别建立五种探针药物孵化体系；将肝微粒体分别与五种探针药物进行孵化反应，使这五种探针药物在其特异性酶的作用下分别转化成对乙酰氨基酚、4’-羟基异喹胍、1’-羟基咪达唑仑、4’-羟基甲苯磺丁脲和4’-羟基美芬妥英；
②取5只玻璃试管，分别加入内标溶液，再分别加入5种①的探针药孵化液；所述的内标溶液是，以体积比为1∶1的甲醇和水作溶剂，含500ng/mL褪黑素和100ng/mL克伦特罗的甲醇-水溶液；
③再加入体积比为1∶1的甲醇水溶液和蒸馏水，振摇；
④再加入体积比为乙酸乙酯∶异丙醇＝95∶5的溶液，涡流，振荡，离心；
⑤分离④中上清液于干净10mL玻璃试管中，氮气下吹干；
(3)探针药物代谢产物的测定：探针药物代谢产物测定的条件是：①色谱条件：Agilent 1100高效液相色谱输液泵，Agilent 1100自动进样器；色谱柱：Zorbax SB-Aq柱，150mm×4.6mm I.D.，5μm粒径；流动相：含0.1％甲酸的乙腈和含0.1％甲酸的水，梯度洗脱，见表1；柱温40℃；流速1.0mL/min；
时间(min) 0.00 0.50 3.00 4.50 5.00 6.00 8.00 水(v％) 80 80 20 10 10 80 80 乙腈(v％) 20 20 80 90 90 20 20②质谱条件：API4000型三重四极杆串联质谱仪，配有离子喷雾离子源以及Analyst
1.3数据处理系统；离子喷射电压为5000V；温度为500℃；源内气体1：N2为60p.s.i.，气体
2：N2为65p.s.i.，气帘气体：N2为20p.s.i.；检测方式：正离子检测；扫描方式：选择反应监测方式，用于定量分析的离子反应分别为：对乙酰氨基酚m/z 152.3→m/z 110.2，4’-羟基异喹胍m/z 192.0→m/z 132.1，1’-羟基咪达唑仑m/z 342.3→m/z 203.2，4’-羟基甲苯磺丁脲m/z 287.4→m/z 171.1，4’-羟基美芬妥英m/z 235.4→m/z 150.0，内标褪黑素m/z 233.2→m/z 174.1，内标，克伦特罗m/z 277.2→m/z 203.1；DP电压分别为53V、
35V、70V、36V、50V、37V、50V；CE分别为22eV、26eV、36eV、24eV、26eV、19eV，22eV。
2.根据权利要求1所述的同时测定五种CYP450酶探针药代谢产物的检测方法，其特征在于，所述的步骤(1)的肝微粒体的孵化，孵化体系的组成为：大鼠肝微粒体蛋白1.0mg/mL、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸1.0mmol/L、MgCl210.0mmol/L、KCl 10.0mmol/L、和用体积比甲醇∶水＝1∶1配制的探针药物；以pH 7.4的0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液定容至
3.根据权利要求1所述的同时测定五种CYP450酶探针药代谢产物的检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)样品预处理中，步骤①为：孵化反应30min后，取反应液100μL，立即加入100μL冰冷甲醇；
步骤②为：取5只10mL玻璃试管，分别加入100μL的内标溶液，再分别加入5种探针药的①孵化液各100μL；
步骤③为：加50μL甲醇水溶液和200μL蒸馏水，振摇20下；
步骤④为：加入3mL乙酸乙酯∶异丙醇＝95∶5的溶液，涡流2min，振荡10min，
步骤⑥为：将⑤中的得到的残留物用150μL流动相溶解，取30μL用于测定。
同时测定五种CYP450酶探针药代谢产物的检测方法
技术领域
[0001] 本发明属医药检测的技术领域，涉及一种同时测定5种CYP450酶探针药代谢产物的检测方法，。
背景技术
[0002] 细胞色素P450酶系(CYP450)是人体内最重要的药物代谢酶，与药物代谢密切相关的同工酶有CYP1A2、CYP2A6、、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4。药物可显著影响药酶细胞色素P450的活性，使其诱导或抑制，并加速或减缓底物和其他药物代谢，这些构成了药物体内过程和药物相互作用的主要机制。
[0003] 探针药物法指经CYP450代谢的特异性底物，以其代谢物和原型药的比例或速率衡量酶代谢能力变化来衡量CYP450相关亚型的酶活力或表达量的方法。
[0004] 现有技术的测定五种CYP450酶探针药代谢产物的检测方法，可以参见如下两篇吉林大学博士论文。①《优克那非临床前药代动力学研究》【作者】王江；【导师】顾景凯；2008年。②《去甲基文拉法辛前体药物和比索洛尔的药物动力学研究》【作者】刘明远；【导师】顾景凯；李又欣；2007年。
发明内容
[0005] 本发明要解决的技术问题是，建立一种同时测定5种CYP450酶探针药代谢产物的检测方法。
[0006] 本发明的技术方案是：
[0007] 一种同时测定五种CYP450酶探针药代谢产物的检测方法，所述的五种CYP450酶是CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19；主要有以下三个步骤：
[0008] (1)肝微粒体的制备及孵化：
[0009] 首先制备大鼠肝微粒体；分别选择非那西丁、咪达唑仑、异喹胍、甲苯磺丁脲和美芬妥英作为五种CYP450酶的探针药物，分别建立五种探针药物孵化体系；将肝微粒体分别与五种探针药物进行孵化反应，使这五种探针药物在其特异性酶的作用下分别转化成对乙酰氨基酚、4’-羟基异喹胍、1’-羟基咪达唑仑、4’-羟基甲苯磺丁脲和4’-羟基美芬妥英；
[0010] (2)样品预处理：样品预处理按下述步骤操作，
[0011] ①孵化反应终止后，取反应液，立即加入冰冷甲醇；
[0012] ②取5只玻璃试管，分别加入内标溶液，再分别加入5种①的探针药孵化液；所述的内标溶液是，以体积比为1∶1的甲醇和水作溶剂，含500ng/mL褪黑素和100ng/mL克伦特罗的甲醇-水溶液；
[0013] ③再加入体积比为1∶1的甲醇水溶液和蒸馏水，振摇；
[0014] ④再加入体积比为乙酸乙酯∶异丙醇＝95∶5的溶液，涡流，振荡，离心；
[0015] ⑤分离④中上清液于干净10mL玻璃试管中，氮气下吹干；
[0016] ⑥将⑤中的得到的残留物用流动相溶解；
[0017] (3)探针药物代谢产物的测定：探针药物代谢产物测定的条件是：
[0018] ①色谱条件：Agilent 1100高效液相色谱输液泵，Agilent 1100自动进样器；色谱柱：Zorbax SB-Aq柱，150mm×4.6mm I.D.，5μm粒径；流动相：含0.1％甲酸的乙腈和含0.1％甲酸的水，梯度洗脱，见表1；柱温40℃；流速1.0mL/min；
[0019] 表1梯度洗脱程序
[0020]时间(min) 0.00 0.50 3.00 4.50 5.00 6.00 8.00
水(v％) 80 80 20 10 10 80 80
乙腈(v％) 20 20 80 90 90 20 20
[0021] ②质谱条件：API4000型三重四极杆串联质谱仪，配有离子喷雾离子源以及Analyst 1.3数据处理系统；离子喷射电压为5000V；温度为500℃；源内气体1：N2为60p.s.i.，气体2：N2为65p.s.i.，气帘气体：N2为20p.s.i.；检测方式：正离子检测；扫描方式：选择反应监测方式，用于定量分析的离子反应分别为：对乙酰氨基酚m/z 152.3→m/z 110.2，4’-羟基异喹胍m/z 192.0→m/z 132.1，1’-羟基咪达唑仑m/z 342.3→m/z203.2，4’-羟基甲苯磺丁脲m/z 287.4→m/z 171.1，4’-羟基美芬妥英m/z 235.4→m/z 150.0，内标褪黑素m/z 233.2→m/z 174.1，内标，克伦特罗m/z 277.2→m/z 203.1；DP电压分别为53V、35V、70V、36V、50V、37V、50V；CE分别为22eV、26eV、36eV、24eV、26eV、19eV，
22eV。
[0022] 上述肝微粒体的制备孵化的步骤是为了评价CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19的酶活性，分别选择非那西丁、咪达唑仑、异喹胍、甲苯磺丁脲和美芬妥英作为其探针药物。5种探针药物分别建立孵化体系。30min后加入到100μL冰冷的甲醇中终止孵化反应。
[0023] 大鼠肝微粒体的制备可以采用常规的做法。也可以按照如下方法进行：实验前动物禁食18h，将所用试剂、用具置于4℃预冷。动物拉颈椎处死，开腹取出肝脏，用滤纸吸干水分，称重；立即放于冰冷的蔗糖溶液中清洗，用剪刀剪成碎块，反复清洗至无血色；加4倍肝重的蔗糖溶液，在冰浴中用组织匀浆机制成匀浆，再超声分散30s；4℃下20000×g离心20min；弃去沉淀，上清液在4℃下100000×g离心60min；弃去上清液，沉淀用焦磷酸钾缓冲液悬浮均匀，在4℃下100000×g离心60min，沉淀即为肝微粒体，用Tris-HCl缓冲液悬浮均匀，保存于-80℃。
[0024] 肝微粒体的孵化可以采用常规的做法；或者按照如下方法进行：建立五种孵化体系，分别加入适当浓度的非那西丁、咪达唑仑、异喹胍、甲苯磺丁脲和美芬妥英作为CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9和CYP2C19的探针药，使这5种探针药在其特异性酶的作用下分别转化成对乙酰氨基酚、4’-羟基异喹胍、1’-羟基咪达唑仑、4’-羟基甲苯磺丁脲和4’-羟基美芬妥英。
[0025] 孵化体系的组成为：大鼠肝微粒体蛋白1.0mg/mL、NADPH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)1.0mmol/L、MgCl210.0mmol/L、KCl 10.0mmol/L、适当浓度的探针药物(用体积比甲醇∶水＝1∶1配制)，以0.1mol/LTris-HCl缓冲液(pH 7.4)定容至500μL，孵化体系中甲醇的终浓度不超过0.01％。
[0026] 上述样品预处理的步骤①孵化反应30min，到终止时间后，取反应液体积为100μL，加入冰冷甲醇的体积为100μL；样品预处理的步骤②中加入的内标溶液为含
500ng/mL褪黑素、100ng/mL克伦特罗的甲醇-水(1∶1，v/v)溶液，体积为100μL；样品预处理的步骤②分别加入5种探针药的①溶液的体积为100μL；样品预处理的步骤③加入甲醇-水(1∶1，v/v)溶液的体积为50μL和蒸馏水体积为200μL，振摇次数为20下；样品预处理的步骤④加入乙酸乙酯-异丙醇(95∶5，v/v)为3mL，涡流时间为2min，振荡时间为10min，离心转速为每分钟3500转，离心时间为5min；样品预处理的步骤⑤氮气吹干温度为40℃；样品预处理的步骤⑥残留物用150μL流动相溶解，取30μL用于测定。
[0027] 上述探针药物代谢产物测定步骤的色谱条件是：美国Agilent公司的Agilent1100高效液相色谱输液泵，Agilent 1100自动进样器；色谱柱：Zorbax SB-Aq柱，
150mm×4.6mm I.D.，5μm粒径，Agilent公司；流动相：乙腈(含0.1％FA)和水(含0.1％FA)，梯度洗脱，见表1；柱温40℃；流速1.0mL/min。
[0028] 上述探针药物代谢产物测定步骤的质谱条件是：API4000型三重四极杆串联质谱仪，是美国Applied Biosystem公司的产品，配有离子喷雾离子源以及Analyst1.3数据处理系统；离子喷射电压为5000V；温度为500℃；源内气体1(GS1，N2)为60p.s.i.；气体2(GS2，N2)为65p.s.i.；气帘气体(N2)为20p.s.i.；检测方式：正离子检测；扫描方式：选择反应监测(MRM)方式，用于定量分析的离子反应分别为m/z 152.3→m/z 110.2(对乙酰氨基酚)，m/z 192.0→m/z 132.1(4’-羟基异喹胍)，m/z 342.3→m/z 203.2(1’-羟基咪达唑仑)，m/z 287.4→m/z171.1(4’-羟基甲苯磺丁脲)，m/z 235.4→m/z 150.0(4’-羟基美芬妥英)，m/z 233.2→m/z 174.1(内标，褪黑素)，m/z 277.2→m/z 203.1(内标，克伦特罗)；DP电压为分别为53V、35V、70V、36V、50V、37V、50V；CE分别为22eV、26eV、36eV、
24eV、26eV、19eV，22eV。
[0029] 本发明采用梯度洗脱法，将原本需要多次分析才能准确定量的5种极性差别很大的代谢产物在一次色谱分离中都得到满意的色谱行为，并使用正离子检测MRM扫描方式对五种探针药代谢产物和两种内标同时定量，快捷方便。
[0030] 对本发明所述的一种同时测定五种CYP450酶探针药代谢产物的检测方法进行了如下评价：
[0031] (1)对照溶液线性
[0032] (2)孵育样品线性
[0033] 将上述对照溶液、孵育样品进行浓度测定，进行绘制标准曲线。对照溶液的标准曲线相关系数R为0.9982；孵育样品溶液的标准曲线相关系数R为0.9978。
[0034] 通过对比可以得出以下结论：本发明所述的一种同时测定5种CYP450酶探针药代谢产物的检测方法其中孵育样品溶液浓度的测定方法线性关系良好、准确度高、重现性好而且灵敏、可靠，可用于各种药物对P450酶诱导、抑制的评价。
附图说明
[0035] 图1是五种探针药代谢产物(4’-羟基异喹胍，对乙酰氨基，1’-羟基咪达唑仑，4’-羟基美芬妥英，4’-羟基甲苯磺丁脲)与两种内标(克伦特罗，褪黑素)的色谱图。
具体实施方式
[0036] 实施例1对广东省某公司研制的非甾体抗炎一类新药对大鼠5种CYP450酶活性影响的评价。
[0037] 按本发明的检测过程，将6组大鼠肝微粒体中给药组和对应的空白对照组的检测数据，列于表2。
[0038] 表2大鼠肝微粒体中给药组和空白对照组中CYP1A2、CYP2D6及CYP3A4、CYP2C9、CYP2C19活性(nmol/mg protein/min)
[0039]
[0040] *与对照组相比，P＜0.05，差异有显著性。
