一种用于冠心病检测和治疗的纳米磁性粒子的制备方法，包括以下步骤：A、在磁核表面固定过渡层分子，所述的过渡层分子为同时含有氨基、羧基或巯基及能与羟基进行反应的基团的化合物；B、然后在固定了过渡层分子的磁核上固定具有延长纳米粒子在血液中停留时间的功能性分子；C、再在固定了功能性分子的磁核上固定内皮祖细胞或病变内皮细胞的特异性识别配体，即得。该方法既能制出用于冠心病前期病变内皮细胞的检测和定位的磁性纳米粒子，其检测灵敏、可靠；也能制出用于冠心病中后期治疗磁性纳米粒子；对冠心病的修复，治疗效果好。
1.一种用于冠心病检测和治疗的纳米磁性粒子的制备方法，包括以下步骤：
A、在磁核表面固定过渡层分子，所述的过渡层分子为同时含有氨基、羧基或巯基及能与羟基进行反应的基团的化合物；
B、然后在固定了过渡层分子的磁核上固定具有延长纳米粒子在血液中停留时间的功能性分子；
C、再在固定了功能性分子的磁核上固定内皮祖细胞或病变内皮细胞的特异性识别配体，即得；
所述的磁核为粒径在5-50nm之间，具有顺磁性或超顺磁性，且成分为γ-Fe2O3、Fe3O4、MnFe2O4或Mn3O4的粒子；
所述的过渡层分子为多巴胺、含有氨基、羧基或巯基的硅烷偶联剂、柠檬酸、3-巯基丙酸、巯基丁二酸、巯基乙酸、半胱氨酸、巯基丁酸、巯基戊酸、巯基己酸、二巯基丁二酸、谷氨酸或赖氨酸；
所述的功能性分子为：HCOO-PEG-COOH、NH2-PEG-NH2、NH2-PEG-COOH、OH-PEG-COOH或HOOC-PEG-CHO中的一种聚乙二醇衍生物；或者为高碘酸氧化肝素、高碘酸氧化壳聚糖、高碘酸氧化磺化壳聚糖中的一种；
所 述 的 功 能 性 分 子 为 疏 水 多 肽，其 序 列 为 AAAAAFFFFFAAAAA 或Ac-AAAAAARRAAAAAA-CONH2或Ac-AAAAAARRGGGGGG-CONH2；
与内皮祖细胞特异性识别的抗体：CDw90、CD117、HLA-DR、Sca-1、CD130、CD146、Tie-2、HAD-DR；
或者与内皮祖细胞特异性识别的多肽序列：THR PRO SER LEU GLUGLN ARG THR VAL TYR ALA LYS、SER TYR GLN THR LEU LYS GLN HISLEY PRO TYR GLY或SER TRP ASP ISO LEU LYS PRO ASN PRO GLN RPOLEU；
或者与内皮祖细胞特异性识别的核酸序列：tcg tcg ttt tgt cgt ttt gtc gt、ccgccg ccg ccg ccg ccg ccg、gcg gcg gcg cgc gcg gcg gcg、cgg cgg cgg cgg cgg cggcgg、ttc ttc ttc ttc ttc ttc ttc、tta ggt tag gtt agg tta ggt tag g、gct aga cgt tag cgt、gct aga gct tag gct、gat tgc ctg acg tca gag ag、ttc atg acg ttc ctg atc gt、tcc atg act ttcctc agg tt、tcc atg agc ttc ctg atg ct、tgc cgc ttt tgt gct ttt gtg ctt、ccg cgg cca ggc tagcta caa cga cct gga cga t、att gtg gtt ggt agt ata cat ttt tcc gcg gcc agg cta gct aca acgacc tgg acg at、ctt taa tgc ggg gta att tct ttt cca taa tcg c、tta ttt ccc ttc tgt ata tag atatgc taa atc ctt act t；
所述的病变内皮细胞的特异性识别配体为多肽序列：VHPKQHRGGSKGC或CVHSPNKKC；
所述A步中磁核表面固定过渡层分子的具体作法是：将磁核均匀分散在过渡层分子水溶液体系中，磁核与过渡层分子的质量比为1∶0.05～150，固定时间0.5h～36h，磁分离并去离子水清洗；
所述B步在固定了过渡层分子的磁核上固定功能性分子的具体做法是：去离子水中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)形成催化体系，再在催化体系中加入固定了过渡层分子的磁核和功能性分子进行催化偶联反应，最后磁分离并去离子水清洗；各物质质量比为固定了过渡层分子的磁核∶功能性分子∶1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺∶N-羟基琥珀酰亚胺＝1∶1～
所述C步在固定了功能性分子的磁核上固定特异性识别配体的具体做法是：去离子水中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)形成催化体系，再在催化体系中加入固定了功能性分子的磁核和特异性识别配体进行催化偶联反应，最后磁分离并去离子水清洗；各物质质量比为固定功能性分子的磁核∶特异性识别配体∶1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺∶NHS＝1∶1～100∶0.05～
一种用于冠心病检测和治疗的纳米磁性粒子的制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物医用高分子材料与纳米生物技术领域，具体涉及一种用于冠心病检测和治疗的纳米磁性粒子的制备方法。
背景技术
[0002] 冠心病是一种多发的心血管疾病，我国冠心病患者的数量以每年200-400万的速度增加，严重威胁着人们的健康安全。导致冠心病的首要原因是血管内皮细胞发生病变，导致该处血管逐渐形成斑块即动脉粥样硬化，预示患者进入冠心病中晚期；斑块不但导致血流障碍，严重时堵塞血管导致病人猝死。到目前为止，冠心病早期的诊断方法很少，主要原因是难以确认病变的内皮细胞层。冠心病中晚期患者目前主要采用药物洗脱型血管支架来治疗，该治疗虽然可以短期有效缓解了病情，但导致了血管支架置入部位血管内皮细胞层的更严重损伤，进而在术后一段时间内引发支架内血栓和再狭窄，严重影响血管支架术治疗的效果。最近几年研究发现内皮祖细胞可以快速修复内皮细胞层。由此可见：病变血管内皮细胞层的检测对于冠心病的早期检测和预防意义重大；病变内皮细胞或损伤内皮细胞的快速修复，对冠心病患者的治疗意义重大。
发明内容
[0003] 本发明的目的在于提供一种用于冠心病检测和治疗的纳米磁性粒子的制备方法。该方法既能制出用于冠心病前期病变内皮细胞的检测和定位的磁性纳米粒子，其检测灵敏、可靠；也能制出用于冠心病中后期治疗磁性纳米粒子；对冠心病的修复，治疗效果好。
[0004] 本发明实现其发明目的，所采用的技术方案是：一种用于冠心病检测和治疗的纳米磁性粒子的制备方法，包括以下步骤：
[0005] A、在磁核表面固定过渡层分子，所述的过渡层分子为同时含有氨基、羧基或巯基及能与羟基进行反应的基团的化合物；
[0006] B、然后在固定了过渡层分子的磁核上固定具有延长纳米粒子在血液中停留时间的功能性分子；
[0007] C、再在固定了功能性分子的磁核上固定内皮祖细胞或病变内皮细胞的特异性识别配体，即得。
[0008] 本发明方法的机理是：过渡层分子含有可以与羟基反应的基团，而磁核表面带有大量的羟基，所以可以实现过渡层分子在磁核表面的固定。再利用过渡层分子上的羧基与功能性分子的氨基，或过渡层分子上的氨基或巯基与功能性分子的羧基反应实现固定连接，进而提高磁性纳米粒子在血液系统中的停留时间。最后通过功能性分子上的氨基与特异性识别配体上的羧基，或功能性分子上的羧基与特异性识别配体上的氨基反应实现固定连接，实现磁性纳米粒子对内皮祖细胞或病变内皮细胞的特异性识别。
[0009] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0010] 一、本发明制得的磁性纳米粒子表面固定连接有病变内皮细胞特异性识别配体，注射进入人体后，会与癌症细胞(病变内皮细胞)特异结合，使得磁性纳米粒子集中富积于病变内皮细胞部位，显著提高了冠心病病变部位的磁响应成像强度，通过MRI(磁共振成像)对定位磁性纳米粒子的定位，可有效实现癌症部位(病变内皮细胞)的精确检测与定位，从而实现早期冠心病的诊断，对早期冠心病的检测灵敏、可靠。
[0011] 或者本发明制得的磁性纳米粒子表面固定连接有内皮祖细胞特异性识别配体，进入人体后，会与内皮祖细胞特异性结合；从而使内皮祖细胞具有磁响应性，在外加磁场的磁导向作用下，内皮祖细胞会定向富集于指定的病变内皮细胞部位，达到靶向治疗的目的，实现对病变内皮细胞更快、更有效的修复，治疗效果好。
[0012] 二、通过过渡层分子的固定，使磁核表面由带有大量的羟基变为表面富含羧基、氨基或巯基，从而能固定大量的功能性分子；有效延长了注射进入血液中的磁性纳米粒子在血液中的停留时间，延长了磁性纳米粒子的检测和治疗作用时间，提高了检测的灵敏度和可靠性，也提高了治疗的效果。
[0013] 三、大量带羧基、氨基或巯基的功能性分子的固定，也使本发明方法能固定更多的内皮祖细胞或病变内皮细胞的特异性识别配体，进一步提高了冠心病早期检测的灵敏度和修复治疗的疗效。
[0014] 四、制备过程在溶液中进行，反应条件温和，无需复杂仪器，制备简单，易于工业化生产。
[0015] 上述的磁核为粒径在5-50nm之间，具有顺磁性或超顺磁性，且成分为γ-Fe2O3、Fe3O4、MnFe2O4或Mn3O4的粒子。
[0016] 5-50nm之间的纳米粒子在体内停留时间更长，顺磁性或超顺磁性既能保证磁成像的有效实现，也能保证磁导向治疗的实现，Fe，Mn是人体必需的元素，毒副作用小。
[0017] 上述的过渡层分子为多巴胺、含有氨基、羧基或巯基的硅烷偶联剂、柠檬酸、3-巯基丙酸、巯基丁二酸、巯基乙酸、半胱氨酸、巯基丁酸、巯基戊酸、巯基己酸、二巯基丁二酸、谷氨酸或赖氨酸。
[0018] 这些物质既含有能与羟基进行反应的基团，保证了与磁核的结合，又含有氨基、羧基或巯基，也保证了在其表面能更有效的结合功能性分子。
[0019] 上述的功能性分子为HCOO-PEG-COOH、NH2-PEG-NH2、NH2-PEG-COOH、OH-PEG-COOH或HOOC-PEG-CHO中的一种聚乙二醇衍生物。
[0020] 或者高碘酸氧化肝素、高碘酸氧化壳聚糖、高碘酸氧化磺化壳聚糖。
[0021] 这些聚乙二醇衍生物，具有高活性的末端基团，可以高效与过渡层分子连接，本身具有良好的生物相容性，可以保证不被血液中的免疫系统快速清除。而高碘酸氧化肝素、高碘酸氧化壳聚糖、高碘酸氧化磺化壳聚糖均具有高活性的醛基，可以高效与过渡层分子连接，本身也具有良好的生物相容性，可以保证不被血液中的免疫系统快速清除。
[0022] 上 述 的 功 能 性 分 子 为 疏 水 多 肽，其 序 列 为 AAAAAFFFFFAAAA 或Ac-AAAAAARRAAAAAA-CONH2或Ac-AAAAAARRGGGGGG-CONH2。
[0023] 这些物质，可以高效与过渡层分子连接，良好的疏水效果，可以保证不被血液中的免疫系统快速清除。
[0024] 上述的内皮祖细胞的特异性识别配体为：
[0025] 与内皮祖细胞特异性识别的抗体：CDw90、CD117、HLA-DR、Sca-1、CD130、CD146、Tie-2、HAD-DR；
[0026] 或者与内皮祖细胞特异性识别的多肽序列：THR PRO SER LEU GLU GLNARG THR VAL TYR ALA LYS、SER TYR GLN THR LEULYS GLN HIS LEYPRO TYR GLY或SER TRPASP ISO LEU LYS PRO ASN PRO GLN RPO LEU；
[0027] 或者与内皮祖细胞特异性识别的核酸序列：tcg tcg ttt tgt cgt ttt gtc gt、ccgccg ccg ccg ccg ccg ccg、gcg gcg gcg cgc gcg gcg gcg、cgg cgg cgg cgg cgg cggcgg、ttc ttc ttc ttc ttc ttc ttc、tta ggt tag gtt agg tta ggt tag g、gct aga cgt tag cgt、gct aga gct tag gct、gat tgc ctg acg tca gag ag、ttc atg acg ttc ctg atc gt、tcc atg act ttcctc agg tt、tcc atg agc ttc ctg atg ct、tgc cgc ttt tgt gct ttt gtg ctt、ccg cgg cca ggc tagcta caa cga cct gga cga t、att gtg gtt ggt agt ata cat ttt tcc gcg gcc agg cta gct aca acgacc tgg acg at、ctt taa tgc ggg gta att tct ttt cca taa tcg c、tta ttt ccc ttc tgt ata tag atatgc taa atc ctt act t；
[0028] 上述的病变内皮细胞的特异性识别配体为多肽序列：VHPKQHRGGSKGC或CVHSPNKKC。
[0029] 这些已有的特异性识别配体能很好的与病变内皮细胞或内皮祖细胞特异性结合、标识，且不影响细胞的功能。
[0030] 上述A步中磁核表面固定过渡层分子的具体作法是：将磁核均匀分散在过渡层分子水溶液体系中，磁核与过渡层分子的质量比为1∶0.05～150，固定时间0.5h～36h，磁分离并去离子水清洗。
[0031] 上述B步在固定了过渡层分子的磁核上固定功能性分子的具体做法是：去离子水中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)形成催化体系，再在催化体系中加入固定了过渡层分子的磁核和功能性分子进行催化偶联反应，最后磁分离并去离子水清洗；各物质质量比为固定了过渡层分子的磁核∶功能性分子∶1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺∶N-羟基琥珀酰亚胺＝1∶1～100∶0.05～1∶0.05～1。
[0032] 上述C步在固定了功能性分子的磁核上固定特异性识别配体的具体做法是：去离子水中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)形成催化体系，再在催化体系中加入固定了功能性分子的磁核和特异性识别配体进行催化偶联反应，最后磁分离并去离子水清洗；各物质质量比为固定功能性分子的磁核∶特异性识别配体∶1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺∶NHS＝1∶1～100∶0.05～1∶0.05～1。
[0033] 下面结合附图和具体实施方式，对本发明做进一步的详细说明。
附图说明
[0034] 图1为含有内皮祖细胞及用本发明方法固定了内皮祖细胞特异性识别配体的磁性纳米粒子的培养液，体外模拟血流条件36小时后，内皮祖细胞在未施加磁场的玻璃片表面上的粘附情况图。
[0035] 图2为含有内皮祖细胞及用本发明方法固定了内皮祖细胞特异性识别配体的磁性纳米粒子的培养液，体外模拟流动36小时后，内皮祖细胞在施加了磁场的玻璃片表面上的粘附情况图。
具体实施方式
[0036] 实施例1
[0037] 一种用于冠心病检测和治疗的纳米磁性粒子的制备方法，包括以下步骤：
[0038] A、在磁核表面固定过渡层分子，所述的为同时含有氨基、羧基或巯基及能与羟基进行反应的基团的化合物。
[0039] 本例的磁核为粒径在5nm之间，具有顺磁性，且成分为γ-Fe2O3的粒子，过渡层分子为多巴胺。
[0040] 本例的A步中磁核表面固定过渡层分子的具体作法是：将磁核均匀分散在的过渡层分子水溶液体系中，磁核与过渡层分子的质量比为1∶0.05，固定时间0.5h，磁分离并去离子水清洗。
[0041] B、然后在固定了过渡层分子的磁核上固定具有延长纳米粒子在血液中停留时间的功能性分子；
[0042] 本例的功能性分子为分子式为HCOO-PEG-COOH的聚乙二醇衍生物。
[0043] 本例在固定了过渡层分子的磁核上固定功能性分子的具体做法是：去离子水中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)形成催化体系，再在催化体系中加入固定了过渡层分子的磁核和功能性分子进行催化偶联反应，最后磁分离并去离子水清洗；各物质质量比为固定了过渡层分子的磁核∶功能性分子∶1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺∶N-羟基琥珀酰亚胺＝1∶1∶0.05∶0.05。
[0044] C、再在固定了功能性分子的磁核上固定内皮祖细胞或病变内皮细胞的特异性识别配体，即得。
[0045] 本例的特异性识别配体为内皮祖细胞的特异性识别配体，更具体而言是内皮祖细胞的特异性识别抗体CDw90。
[0046] CDw90本例在固定了功能性分子的磁核上固定特异性识别配体的具体做法是：去离子水中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)形成催化体系，再在催化体系中加入固定了功能性分子的磁核和特异性识别配体进行催化偶联反应，最后磁分离并去离子水清洗；各物质质量比为固定功能性分子的磁核∶特异性识别配体∶EDC∶NHS＝1∶1∶0.05∶0.05。
[0047] 实施例2-30
[0048] 实施例2-30的制备方法均与实施例1方法的操作相同，不同的仅仅是：A、各实施例选用的磁核，过渡层分子、磁核/过渡层分子的质量比及固定时间；B、功能性分子种类和固定过渡层分子的磁核/功能性分子/EDC/NHS的质量比；C、与内皮祖细胞特异性识别的配体种类和固定功能性分子的磁核/特异性识别配体/EDC/NHS的质量比，均相应更换为以下表1所列的种类、质量比、时间(为便于比较，表中也列出实施例1的数据)。
[0049] 表1：实施例1-30各步选用的物质种类、物质比例及过渡层分子的固定时间[0050]
[0051]
[0052]
[0053]
[0054] (注：表中实施例29、30的特异性识别配体为病变内皮细胞的特异性识别配体，而其余各例的特异性识别配体均为内皮祖细胞的特异性识别配体)
[0055] 以下实验证明，本发明方法制得的磁性纳米粒子，能使内皮祖细胞聚集在施加磁场区域，以修复受损血管。
[0056] 体外流动腔模拟血流条件下，施加磁场区域和未施加磁场区域内皮祖细胞的粘附能力的实验：5
[0057] 将玻璃片放在平板流动腔中，将含有内皮祖细胞密度为1×10 个/mL和本发明制得的磁性纳米粒子0.75mg/mL的培养液50ml，灌注入流动腔系统，调节流动腔内的液体流速，使剪切力大小约为1.0Pa，类似小动脉的剪切力。平板流动腔在在CO2孵箱(37℃，5％CO2)孵育36小时后取出清洗、固定并Actin免疫荧光染色观察。图1为未施加磁场的玻璃片表面上，内皮祖细胞的粘附图，图2为施加磁场的玻璃片表面内皮祖细胞的粘附图。由图1、图2可见，内皮祖细胞粘附在施加磁场的玻璃片表面的量远大于未施加磁场的玻璃片表面的粘附量，说明本发明方法制得的磁性纳米粒子能使内皮祖细胞更快的聚集粘附在施加磁场的区域，从而对受损血管的区域施加磁场，即可对受损血管进行更快、更好的“靶向治疗″修复。
