一种杏仁功能性混合肽及其制备方法

摘要

本发明公开了一种杏仁功能性混合肽及其制备方法。本发明所提供的杏仁功能性混合肽是按照包括下述步骤的方法制备得到的：1)将脱脂杏仁粕与水混合后，在80℃-90℃的条件下加热使蛋白变性，得到杏仁粕浆液；2)向杏仁粕浆液中同时加入中性蛋白酶和复合蛋白酶进行酶解，得到杏仁粕酶解液；3)将酶解液升温至90-95℃，保持10-20min使酶灭活，离心取上清液，即为杏仁功能性混合肽原液；4)将混合肽原液通过截留分子量为5000Da的超滤膜，收集超滤液，得到杏仁功能性混合肽。该杏仁功能性混合短肽在等电点和较高温度下仍具有良好的溶解性和稳定性。试验证明，该杏仁功能性混合短肽具有多种生物学功能，可将其开发成相关功能食品如降压饮料、活性肽粉等。

权利要求

1.一种制备杏仁功能性混合肽的方法，包括下述步骤：

1)原料预处理：将脱脂杏仁粕与水混合后，在80℃-90℃的条件下加热使蛋白变性，得到杏仁粕浆液；

2)酶处理：向步骤1)得到的杏仁粕浆液中同时加入中性蛋白酶和复合蛋白酶进行酶解，得到杏仁粕酶解液；

3)酶灭活：使所述杏仁粕酶解液中的中性蛋白酶和复合蛋白酶灭活，离心取上清液，即为杏仁功能性混合肽原液；

4)超滤：将步骤3)得到的杏仁功能性混合肽原液通过截留分子量为5000Da的超滤膜，收集超滤液，得到杏仁功能性混合肽。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中所述脱脂杏仁粕与水的质量比为1∶25-50。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤2)中所述中性蛋白酶的加入量为3000-4000U/g蛋白；所述复合蛋白酶的加入量为2000-3000U/g蛋白，所述复合蛋白酶为N120P复合蛋白酶。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中所述酶解的条件如下：酶解温度50-55℃，酶解时间120-180min，酶解pH值为6-8。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)中按照下述方法使所述中性蛋白酶和复合蛋白酶灭活：将杏仁粕酶解液升温至90-95℃，保持10-20min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述脱脂杏仁粕在使用前经过粉碎处理并通过60-80目筛。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括对步骤4)得到的杏仁功能性混合肽进行浓缩并干燥的步骤；所述干燥为冷冻干燥或喷雾干燥。

8.权利要求1-7中任一所述的方法制备得到的杏仁功能性混合肽。

9.根据权利要求8所述的杏仁功能性混合肽，其特征在于：所述杏仁功能性混合肽中肽的质量百分含量高于75％；所述肽中，分子量小于5000D的肽含量≥90％。

10.权利要求8或9所述的杏仁功能性混合肽在制备抗高血压保健品和/或抗氧化保健品和/或清除自由基保健品中的应用。

说明书

一种杏仁功能性混合肽及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种杏仁功能性混合肽及其制备方法。

背景技术

[0002] 杏蔷薇科落叶乔木植物原产我国，野生种和栽培品种资源都非常丰富。杏仁具有丰富的营养价值和良好的药用价值。每100g杏仁中含蛋白质25g～27g，油脂47g～56g，碳水化合物及粗纤维含量约占12g～19g，还含有钙、磷、铁、硒等多种元素和VE、硫胺素、核黄素、尼克酸、抗坏血酸等多种维生素。杏仁中富含的优质蛋白质、脂肪及其他成分对人体有极其重要的作用，长期食用可防癌、抗癌，增强抵抗力，延缓衰老，有益心脑健康。甜杏仁蛋白含有人体所需的多种氨基酸且含量丰富，是有利于人体氨基酸营养平衡、具有保健作用的天然干果资源，此外，苦杏仁中特有的具有多种药理作用的苦杏仁苷含量达5.5％，苦杏仁苷具有抑制和杀死癌细胞的作用。

[0003] 目前国内外杏制品均以鲜食为主，加工比例不高。大部分杏仁仅限于制作杏仁乳、杏仁罐头、焙烤杏仁及杏仁油初加工产品，而榨取油脂后剩余的杏仁粕多用于生产杏仁蛋白粉等科技含量和产品附加值较低的产品。杏仁蛋白在加工中存在这功能性质和生理活性较差、吸收较差等缺点，因此研发具有良好功能性质和生理活性的杏仁蛋白深加工产品势在必行。

[0004] 多肽是由氨基酸以不同组成和排列方式构成的，是二肽到复杂的线型或环型结构的不同肽类的总称。其中可调节生物体生理功能的多肽被称为功能肽或生物活性肽(Bioactive peptides)。生物活性肽的吸收机制优于氨基酸，蛋白质经消化道中酶作后并不完全是以游离氨基酸的形式被吸收，而主要是以短肽的形式被吸收，且机体对短肽的吸收代谢速度比对游离氨基酸快、耗能低、不易饱和，且肽间吸收无竞争性与抑制性的特点。因此，功能性短肽的生物效价和营养价值更高。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种脱脂杏仁粕提取物(杏仁功能性混合肽)及其制备方法。

[0006] 本发明所提供的杏仁功能性混合肽是按照包括下述步骤的方法制备得到的：

[0007] 1)原料预处理：将脱脂杏仁粕与水混合后，在80℃-90℃的条件下加热使蛋白变性，得到杏仁粕浆液；

[0008] 2)酶处理：向步骤1)得到的杏仁粕浆液中同时加入中性蛋白酶和复合蛋白酶，酶解过程中需不断搅拌以使酶和底物充分接触，得到杏仁粕酶解液；

[0009] 3)酶灭活：使杏仁粕酶解液中的中性蛋白酶和复合蛋白酶灭活，离心取上清液，即为杏仁功能性混合肽原液；

[0010] 4)超滤：将步骤3)得到的杏仁功能性混合肽原液通过截留分子量为5000Da的超滤膜，去除大分子片段，得到杏仁功能性混合肽。

[0011] 其中，步骤1)中所述脱脂杏仁粕与水的质量比为1∶25-50。所述脱脂杏仁粕在使用前需经过粉碎处理并过60-80目筛，制成杏仁蛋白粉。

[0012] 步骤2)中的中性蛋白酶的加入量为3000-4000U/g蛋白，复合蛋白酶的加入量为2000-3000U/g蛋白。

[0013] 本发明中所述中性蛋白酶是由枯草芽孢杆菌经发酵提取而得的，属于一种内切酶，其最适作用pH值为6-8，温度35-55℃；如丹麦NOVO公司的Neutrase0.8L。所述复合蛋白酶具体可为N120P复合蛋白酶，如荷兰Sherry公司的N120P复合蛋白酶。

[0014] 所述酶解的条件为：酶解温度50-55℃，酶解时间120-180min，酶解pH值为6-8。

[0015] 步骤3)中可按照下述方法使所述中性蛋白酶和复合蛋白酶灭活：将杏仁粕酶解液升温至90-95℃，保持10-20min。

[0016] 上述方法还包括对步骤4)得到的杏仁功能性混合肽进行浓缩并干燥的步骤。所述干燥可采用冷冻干燥或喷雾干燥。

[0017] 本发明所制备的杏仁功能性混合肽中肽的质量百分含量高于75％，灰分含量≤6％，糖含量≤7％，干燥失重≤7％，脂肪≤2％；分子量小于5000D的肽含量≥90％，三氯乙酸氮溶解指数≥95％。

[0018] 本发明的再一个目的是提供所述杏仁功能性混合短肽的应用。

[0019] 本发明所提供的杏仁功能性混合短肽可用于制备抗高血压活性和/或抗氧化活性的保健品

[0020] 本发明以粉状脱脂杏仁粕为原料，通过酶水解、膜分离等技术，制备出杏仁功能性混合短肽。本发明的方法采用两种蛋白酶对杏仁粕进行同步复合酶解，使其水解度达到20％以上，短肽得率≥60％。与杏仁蛋白性相比，本发明的杏仁功能性混合短肽在等电点和较高温度下仍具有良好的溶解性和稳定性。并且发明人通过试验证明，该杏仁功能性混合短肽具有多种生物学功能，如抗高血压活性和抗氧化活性等，可将其开发成相关功能食品如降压饮料、活性肽粉等。此外杏仁功能性混合短肽解决了杏仁蛋白本身营养丰富却不易被吸收的难题，给人们提供了一种具有较高的营养保健功能且可被人体迅速吸收营养保健品。

具体实施方式

[0021] 下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。

[0022] 下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

[0023] 实施例1、杏仁功能性混合短肽的制备

[0024] 本发明杏仁功能性混合短肽的制备步骤如下：

[0025] 原料预处理→酶解→灭酶→离心→超滤精制→真空浓缩→干燥

[0026] 详细步骤为：

[0027] ①原料预处理：冷榨脱脂杏仁粕经粉碎、过60-80目筛制成杏仁蛋白粉。

[0028] 再对其进一步处理：

[0029] 杏仁蛋白粉→与水混合(料水质量比1∶40)→90℃下水浴搅拌→冷却[0030] ②酶解：将中性蛋白酶(丹麦NOVO公司，Neutrase0.8L)和复合蛋白酶(荷兰Sherry公司，N120P)分别按3500u/g底物和2500u/g底物蛋白加入反应体系中进行酶解，水解温度50-55℃，水解时间180min，pH6.5，反应过程中不断搅拌。

[0031] ③酶灭活：快速升温至90-95℃，保持10-20min使酶灭活，4200g离心15-20min，取上清液即为杏仁功能性混合短肽原液。

[0032] ④超滤精制：将所得杏仁功能性混合短肽原液通过截留分子量为5000Da的超滤膜，去除大分子片段，得到分子量小于5000Da的杏仁功能性混合短肽液。

[0033] ⑤浓缩干燥：通过真空浓缩至固形物含量35％-40％，经喷雾干燥或冷冻干燥制成干粉，杏仁功能性混合短肽得率≥60％(以蛋白含量计)。

[0034] 总氮的测定采用凯氏定氮法；三氯乙酸氮溶指数的测定采用Lowry法；脂肪和灰分的测定采用AOAC法；总糖的测定采用苯酚-硫酸法。

[0035] 测定结果表明上述方法制备得到的杏仁功能性混合短肽是一种白色或微黄色粉末，分子量小于5000D的短肽含量为85％，灰分5％，糖含量5％，干燥失重4.5％，脂肪0.1％，三氯乙酸氮溶指数(TCA-NSI)为99.5％，所得混合短肽的分子量小于5000Da。

[0036] 实施例2、杏仁功能性混合短肽的制备

[0037] ①原料预处理：冷榨脱脂杏仁粕经粉碎、过60-80目筛制成杏仁蛋白粉。

[0038] 再对其进一步处理：

[0039] 杏仁蛋白粉→与水混合(料水质量比1∶50)→90℃下水浴搅拌→冷却[0040] ②酶解：将中性蛋白酶(丹麦NOVO公司，Neutrase0.8L)和复合蛋白酶(荷兰Sherry公司，N120P)分别按4000u/g底物和3000u/g底物蛋白加入反应体系中进行酶解，水解温度50-55℃，水解时间180min，pH6，反应过程中不断搅拌。

[0041] ③酶灭活：快速升温至90-95℃，保持10-20min使酶灭活，4200g离心15-20min，取上清液即为杏仁功能性混合短肽原液。

[0042] ④超滤精制：将所得杏仁功能性混合短肽原液通过截留分子量为5000Da的超滤膜，去除大分子片段，得到杏仁功能性混合短肽液。

[0043] ⑤浓缩干燥：通过真空浓缩至固形物含量35％-40％，经喷雾干燥或冷冻干燥制成干粉，杏仁功能性混合短肽得率≥60％(以蛋白含量计)。

[0044] 总氮的测定采用凯氏定氮法；三氯乙酸氮溶指数的测定采用Lowry法；脂肪和灰分的测定采用AOAC法；总糖的测定采用苯酚-硫酸法。

[0045] 测定结果表明上述方法制备得到的杏仁功能性混合短肽是一种白色或微黄色粉末，分子量小于5000D的短肽含量为82％，灰分5％，糖含量6％，干燥失重4.5％，脂肪0.1％，三氯乙酸氮溶指数(TCA-NSI)为99.5％，所得混合短肽的分子量小于5000Da。

[0046] 实施例3、杏仁功能性混合短肽的制备

[0047] ①原料预处理：冷榨脱脂杏仁粕经粉碎、过60-80目筛制成杏仁蛋白粉。

[0048] 再对其进一步处理：

[0049] 杏仁蛋白粉→与水混合(料水质量比1∶25)→90℃下水浴搅拌→冷却[0050] ②酶解：将中性蛋白酶(丹麦NOVO公司，Neutrase0.8L)和复合蛋白酶(丹麦NOVO公司，Protamex)分别按3000u/g底物和2000u/g底物蛋白加入反应体系中进行酶解，水解温度50-55℃，水解时间180min，pH7.5，反应过程中不断搅拌。

[0051] ③酶灭活：快速升温至90-95℃，保持10-20min使酶灭活，4200g离心15-20min，取上清液即为杏仁功能性混合短肽原液。

[0052] ④超滤精制：将所得杏仁功能性混合短肽原液通过截留分子量为5000Da的超滤膜，去除大分子片段，得到杏仁功能性混合短肽液。

[0053] ⑤浓缩干燥：通过真空浓缩至固形物含量35％-40％，经喷雾干燥或冷冻干燥制成干粉，杏仁功能性混合短肽得率≥60％(以蛋白含量计)。

[0054] 总氮的测定采用凯氏定氮法；三氯乙酸氮溶指数的测定采用Lowry法；脂肪和灰分的测定采用AOAC法；总糖的测定采用苯酚-硫酸法。

[0055] 测定结果表明上述方法制备得到的杏仁功能性混合短肽是一种白色或微黄色粉末，分子量小于5000D的短肽含量为78％，灰分5％，糖含量7％，干燥失重4.5％，脂肪0.1％，三氯乙酸氮溶指数(TCA-NSI)为99.5％，所得混合短肽的分子量小于5000Da。

[0056] 实施例4、杏仁功能性混合短肽的功能活性实验

[0057] ①超氧阴离子自由基的清除

[0058] 在一系列的试管中加入离子强度为0.05M，pH为8.2的Tris-Hcl缓冲液9ml，再分别加入样品溶液100μl，空白组加入同体积的蒸馏水，再加入0.045M邻苯三酚(以0.01MHCL配制)100μl，震荡计时三分钟，加入10％抗坏血酸100μl终止反应，立即在
325nm处测吸光值。

[0059]

[0060] 式中SA-清除自由基的能力，％；A0-空白样测定值；AS-样品测定值[0061] ②羟自由基的清除

[0062] 在试管中依次加入9.1mM水杨酸-乙醇溶液0.5ml，样品0.5ml，9.1mM Fe2+溶液0.5ml，蒸馏水3.5ml，最后加入88mM H2O25ml，显色摇匀后，在510nm下测定清除活性。

[0063]

[0064] 式中SA-清除自由基的能力，％；A0-为空白样测定值；AS-为样品测定值[0065] ③DPPH自由基

[0066] 依次添加，0.1mM的DPPH95％乙醇溶液1.5ml，样品1.5ml，震荡后在室温下放置30min，517nm测定吸光度。

[0067]

[0068] 式中SA-清除自由基的能力，％；A1-DPPH+样品；A2-95％乙醇+样品；A3-DPPH+蒸馏水

[0069] ④抗氧化

[0070] 10ml具塞玻璃试管依次中加入0.15M(pH7.0)的磷酸盐缓冲液1.5ml，样品100μl，50mM亚油酸-乙醇溶液100μl和50mM的FeCl2-EDTA溶液50μl，采用漩涡分散器震荡三分钟，于50℃暗处水浴保温一段时间。

[0071] 在具塞玻璃试管依次加入75％乙醇3ml，上述混合液100μl，1M的Fecl2的1MHCL溶液100μl，30％KSCN100μl，采用漩涡分散器震荡三分钟后，立即在480nm测定溶液的吸光度。