一种用于改变和改善纤维表面性质的组合物和造纸方法

摘要

本发明公开了一种用于改变和改善纤维表面性质的组合物，其主要由以下组分组成：无催化活性的蛋白质组分，所述蛋白质组分为纤维结合蛋白质，其对纤维表面有较强亲和力，和具有催化活性的蛋白质组分，所述蛋白质组分为能够改变纤维表面性质的纤维改性酶；所述纤维素结合蛋白质对纤维改性酶的蛋白质的重量比例在1∶0.1-1∶10之间。本发明还提供了上述组合物用于造纸的方法。所述组合物处理纸浆时，不但纸浆的滤水性能的大大提高，而且纸张的强度性质也显着增强。

权利要求

1.一种用于改变和改善纤维表面性质的组合物，其特征是，主要由以下组分组成：i) 无催化活性的蛋白质组分，所述蛋白质组分为纤维素结合蛋白质，其对纤维表面有强亲和力，和ii) 具有催化活性的蛋白质组分，所述蛋白质组分为能够改变纤维表面性质的纤维改性酶；

所述纤维素结合蛋白质对纤维改性酶的蛋白质的重量比例为1：0.1－1：10。

2、根据权利要求1所述的用于改变和改善纤维表面性质的组合物，其特征是，所述纤维素结合蛋白质是：（a） 由一个纤维素结合结构域组成的纤维素结合蛋白质单体,或

（b）由两个或更多的纤维素结合结构域组成的纤维素结合蛋白质聚合体，其中所述纤维素结合结构域通过一个或多个反应性基团共价键合到合成聚合物组分，或（c）含有至少一个纤维素结合结构域组成的纤维素结合蛋白质与合成聚合物的合成体，其中所述合成聚合物含有由烯属不饱和水溶性或潜在水溶性单体和带有反应性基团的烯属不饱和单体形成，其中所述反应性基团可直接与纤维素结合结构域蛋白质反应, 或（d) 含有至少一个纤维素结合结构域组成的纤维素结合蛋白质与无催化活性蛋白质的聚合体，其中所述无催化活性蛋白质是失去酶活性的纤维素酶或半纤维素酶的催化结构域，其聚合体组分结构与纤维素酶或半纤维素酶结构相同，但其催化结构域已失去催化功能。

3、 根据权利要求1所述的用于改变和改善纤维表面性质的组合物，其特征是，所述纤维改性酶为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维二糖酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、漆酶、葡萄糖氧化酶，锰过氧化酶和木质素过氧化酶中的任一种以上。

4、 根据权利要求1－3任一项所述的用于改变和改善纤维表面性质的组合物，其特征是，在造纸工艺中，所述组合物的无催化活性的蛋白质组分用量为每吨干浆料0.01-10千克，和具有催化活性的蛋白质组分用量为每吨干浆料0.05-10千克。

5、一种造纸方法，其特征是，主要包括以下步骤：

a) 形成含水的纤维素造纸浆料，

b) 将权利要求1－4任一项所述组合物加入到纤维素造纸浆料中， c) 将步骤b）中得到的所述造纸浆料送上网，由此通过滤出水而由纤维固体组分形成纸页，d) 将纸页经过压榨段和干燥段，最终生产出纸产品。

6、根据权利要求5所述的造纸方法，其特征是，所述组合物加入到纸浆料中为先加入无催化活性的蛋白质组分，然后加入具有催化活性的蛋白质组分，或者将两者同时加入。

7、根据权利要求5－6任一项所述的造纸方法，其特征是，所述组合物和纸浆的反应时间为5-1200分钟，反应pH为3-10，反应温度为20-80℃。

8、根据权利要求7所述的造纸方法，其特征是，所述组合物和纸浆的反应时间为

20-400分钟，反应pH为5-8，反应温度为30-65℃。

说明书

一种用于改变和改善纤维表面性质的组合物和造纸方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物酶和使用生物酶改变纤维的技术，具体地，涉及一种用于改变和改善纤维表面性质的组合物和造纸方法。

背景技术

[0002] 纸或纸板的制造原料主要是纤维素木质纤维的含水浆料，造纸工艺流程通常包括将该浆料沉积到移动的网或织物上，由此通过滤出水而由固体组分形成纸页，然后是压榨段和干燥段，最终生产出纸产品。

[0003] 但是，近年来造纸工业面临原料短缺的问题越来越严重，迫使造纸工业使用质量低下的回收废纸和非木浆为主要生产原料。这些原料具有强度低和滤水性能差等缺点，严重影响抄纸速度(生产效率)和纸张强度和其它性质。为了提高纸张质量和生产效率，目前纸厂在纸浆上网之前，一般通过向浆料中添加多种化学品。比如，目前造纸工业应用多种聚合物添加剂，包括阳离子淀粉、阴离子淀粉、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酰胺、阴离子聚丙烯酰胺，以及低分子量阳离子聚合物等，来增加纸浆的脱水性能或强度。但是，这些方法和技术具有成本高和环保效益差等缺陷，因此，制浆造纸工业需要更好的新方法和新技术来解决这些问题。

[0004] 生物技术有望成为实现这一目标的一条有效途径。早在六十年代，酶改性纸浆就应用于对降低打浆能耗的研究。1986年努等人报道了木聚糖酶对漂白化学浆的酶法打浆作用。(Noe，P.et al.，Action ofxylanases on chemical pulp fibers，J.Wood Chern.Techno.，6：167，1986)。近十年来，人们对生物技术在制浆造纸工业的应用进行了大量的研究，研究范围几乎涉及了制浆造纸工业的各个方面。例如，美国专利US4,923,565，US5,110,412和US5,308,449提出使用纤维素酶或半纤维素酶提高造纸纸浆的脱水性。US5,725,732提出使用纤维素酶和半纤维素酶解决纤维的掉毛缺陷，US6,066,233建议用纤维素酶和果胶酶结合使用可通过纸浆的滤水性。美国专利US5,582,681提出用纤维素酶、半纤维素酶和脂肪水解酶等混合酶制剂提高卫生纸的柔韧性。此外用纤维素酶、半纤维素酶处理纸浆，还可改善纤维压缩性，使纸页微孔性下降，密度提高，透明度提高。

[0005] 但是，研究结果表明，现有的生物酶产品和使用方法用于制浆造纸，虽然能提高滤水性能和其它的某些性质，但最终纸产品的强度显着降低，同时纤维流失率增加，造成生产成本增加。目前还没有利用酶处理来改善纸浆的滤水性能同时，降低打浆能耗和提高纸张机械强度的技术。因此，开发一种能够改善非木材浆的打浆性能同时能够改善非木材浆强度性能的生物处理技术，对中国造纸工业的可持续性发展具有重要意义。

发明内容

[0006] 本发明的目的之一在于提供一种用于改变和改善纤维表面性质的组合物，该组合物处理纸浆时，不但纸浆的滤水性能的大大提高，而且纸张的强度性质也显着增强。

[0007] 实现上述目的的技术方案如下：

[0008] 一种用于改变和改善纤维表面性质的组合物，其含有：

[0009] i)无催化活性的蛋白质组分，所述蛋白质组分为纤维结合蛋白质，其对纤维表面有较强亲和力，和

[0010] ii)具有催化活性的蛋白质组分，所述蛋白质组分为能够改变纤维表面性质的纤维改性酶；

[0011] 所述纤维素结合蛋白质与纤维改性酶蛋白质的重量比例在1∶0.1至1∶10之间。

[0012] 本发明的另一目的提供新的造纸方法，该方法比现有技术更有效地提高脱水速度和纸张强度；再者，能够提高生活用纸(面巾和卫生纸)强度的同时，增加其柔软性，还可以在造纸过程中改善纸张内部和表面施胶。

[0013] 实现上述目的的技术方案如下：

[0014] 一种造纸方法，主要包括以下步骤：

[0015] a)形成含水的纤维素造纸浆料，

[0016] b)将上述任一种用于改变和改善纤维表面性质的组合物加入到纸浆料中；

[0017] c)将纸浆送上网，由此通过滤出水而由纤维等固体组分形成纸页，[0018] d)将纸页经过压榨段和干燥段，最终生产出纸产品。

[0019] 优选地，所述组合物加入到纸浆料中为先加入无催化活性的蛋白质组分，然后加入具有催化活性的蛋白质组分。

[0020] 其中所述组合物的无催化活性的蛋白质组分用量为每吨干浆料0.01-10千克，具有催化活性的蛋白质组分用量为每吨干浆料0.05-10千克。更优选地，所述组合物的总用量为每吨浆料0.02-35千克，最优选的用量范围是每吨干浆料0.05-5千克。

[0021] 优选地，其中所述组合物和纸浆的反应时间为5-1200分钟。所述组合物和纸浆的反应pH为3-10；其中所述组合物和纸浆的反应温度为20-80℃。更优选地，所述组合物和纸浆的反应时间为20-400分钟，反应pH为5-8，反应温度为30-65℃。

[0022] 与现有技术相比，本发明的优点如下：

[0023] 现有造纸技术中纸浆打浆存在的问题是主要是纤维分丝帚化少，打浆过程中当纤维被切断较多而分丝帚化较少时，纤维的强度下降，纤维间的结合力降低，导致纸浆的强度下降。现有的生物酶纸浆处理技术对纸浆纤维的反应是基本无选择性的、无控制性的和无目标性的，因此他们往往在提高纸浆的滤水性能时，导致纸浆强度的显着下降。本发明采用纤维改性酶与纤维结合蛋白质处理浆料，通过纤维结合蛋白质选择性的吸附在非晶型纤维表面，将此部分表面覆盖，减少甚至避免纤维改性酶对其反应作用，让纤维改性酶集中在晶型纤维表面的反应，激活该部分纤维的表面活性，从而能选择性地改变纤维表面。本发明能够增加纤维反应活性，提高纤维间的结合力，不仅能改善纸浆的滤水性能，而且在改善纸的各种物理强度，同时能够改变纸浆的打浆性能，大大地降低打浆能耗。本发明对造纸生产产业具有重要意义。

附图说明

[0024] 图1是实施例1的比较CBP在微晶纤维素和非晶纤维素的吸附与纤维素用量的关系的结果示意图；

[0025] 图2是实施例2的对比在有无添加CBP的条件下还原性葡聚糖的释放量的结果示意图；

[0026] 图3是实施例3的各种处理条件下的纤维长度的分布对比结果示意图；

[0027] 图4是实施例4的展示出各种处理条件下的标准自由度的结果示意图；

[0028] 图5-8是实施例5的展示出各种处理对纸张的各种强度性质的影响的结果示意图；

[0029] 图9-10是实施例6的展示出各种处理对纸张的各种强度性质的影响的结果示意图；

[0030] 图11是实施例7的造纸方法流程图。

具体实施方式

[0031] 本发明中的“纤维改性酶”是指所有能够对纤维表面进行化学反应、从而改变纤维表面和内部性质的生物酶，包括水解酶和氧化还原酶。其中，水解酶包括纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶、果胶酶和角质酶。氧化还原酶包括漆酶(laccase)、木质素过氧化酶(lignin peoxidase)和锰过氧化(manganese peroxidase)。

[0032] 纤维素酶：本发明中的“纤维素酶”是指所有的对纤维素有降解作用的生物酶，包括外切葡聚糖酶(又称纤维二糖水解酶)(CBH)、内切葡聚糖酶(EG)和β-葡萄糖苷酶(BG))。

[0033] 内切纤维素酶：本发明中的“内切纤维素酶”是指表现葡聚糖内切酶类型活性的，并且是由给定微生物产生的纤维素酶体系的一部分的所有纤维素酶组分，也叫“葡聚糖内切酶或内切葡聚糖酶(EG)”。萄聚糖内切酶水解可溶性的纤维素衍生物，例如羧甲基纤维素(CMC)，降低这种溶液的粘度。

[0034] 外切纤维素酶，本发明中的“外切纤维素酶”是指外切葡聚糖酶(exo-1，4-β-D-glucanase，EC 3.2.1.91)，该类酶作用于纤维素线状分子末端，水解β-1，4-D-14糖苷键，依次切下一个纤维二糖分子，故又称为纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase，CBH)。

[0035] 纤维素结合蛋白质(cellulose binding protein，CBP)：本发明中的“纤维素结合蛋白质”是指对纤维素表面具有特别亲和力、能强烈地吸附在纤维素表面的没有催化活性的蛋白质。在文献中，又称为纤维素结合结构域(Cellulose Binding Domain，CBD)，纤维素结合模块(Cellulose Binding Module，CBM)，纤维素吸附结构域，纤维素亲合结构域。在本发明的实际使用中，其CBP组分可以是

[0036] (a)由一个纤维素结合结构域(CBD)组成的纤维素结合蛋白质单体，[0037] (b)由两个或更多的纤维素结合结构域(CBD)组成的纤维素结合蛋白质聚合体，其中所述纤维素结合结构域(CBD)通过一个或多个反应性基团共价键合到所述合成聚合物组分，

[0038] (c)由含有至少一个纤维素结合结构域(CBD)融合到另外的蛋白质分子形成CBD-蛋白质聚合物，其中另外的蛋白质是无催化活性的蛋白质，包括失去酶活性的纤维素酶或半纤维素酶的催化结构域，这种聚合体组分结构与纤维素酶或半纤维素酶结构相同中，但其催化结构域已失去催化功能。正常的具有催化活性的纤维素酶一般具有两个结构域，即一个具有催化功能的结构域(catalytic domain，CD)和一个没有催化活性的纤维素结合结构域(Cellulose Binding Domain，CBD)，两结构域之间由一段连接短肽。因此，这些酶去活性之后即变成一种特殊的纤维素结合蛋白质。其它的聚合体实例包括纤维结合域与牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)组成的CBD-BSA聚合体，纤维结构域与淀粉糖结合域(amylose binding domain，ABD)组成的CDB-ABD聚合体。

[0039] (d)由一个纤维素结合结构域(CBD)接枝到合成聚合物而形成的纤维结合蛋白质-合成聚合物的合成体，例如，Takuya Kitaoka等(J Wood Sci.，2001，47：322-324)描述的纤维素结合蛋白质和聚丙烯酰胺(APAM)合成CBD-APAM聚合物。

[0040] CMC酶活性(CMCase)：本发明所用的″CMC酶活性″是指纤维素酶组分在它们将纤维素降解成葡萄糖、纤维二糖和二糖的能力方面的萄聚糖的酶活性，用羧甲基纤维素的溶液粘度的降低来确定。CMC酶活性可由如下所示的CMC的粘度降低来确定：制备在pH9.0的0.1M二是甲基氨基甲烷缓冲注中含有35g/l CMC(Hercules 7L FD)的基质溶液。将要分析的酶样品溶解在相同的缓冲注中。将10ml基质溶液和0.5ml酶溶液混合，并转移至在40℃下热稳定的粘度计中。在混合后和再过10分钟时，尽可能快速地读取粘度读数。在这些条件下，将粘度降低至一半的酶的量被定义为1单位的CMC酶活性。

[0041] 进一步地，对本发明的一些专业术语进行详细的描述。

[0042] 纤维素酶是指能降解纤维素产生葡聚糖的一组酶的总称，包括

[0043] (a)内切葡聚糖酶(endo-1，4-β-D-glucanase，EC 3.2.1.4)，来自真菌的简称为EG，来自细菌的简称为Cen。该类酶主要作用于纤维素内部的非结晶区，随机水解β-1，4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端的小分子纤维素，其分子量大小约为23-146KD；

[0044] (b)外切葡聚糖酶(exo-1，4-β-D-glucanase，EC 3.2.1.91)，来自真菌的简称为CBH，来自细菌的简称为Cex。该类酶作用于纤维素线状分子末端，水解β-1，4-D-14糖苷键，依次切下一个纤维二糖分子，故又称为纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase，CBH)，分子量约38-118KD。

[0045] (c)纤维二糖酶，即β-葡萄糖苷酶(β-1，4-glucosidase，EC 3.2.1.21)，简称BG。这类酶一般将纤维二糖或可溶性的纤维糊精水解成葡萄糖分子，其分子量约为76KD。

[0046] 工业上使用的纤维素酶通常包含所有三种纤维素酶活性，按照其适用pH范围，纤维素酶通常被分成三个主要类别：酸性、中性和碱性纤维素酶。典型酸性纤维素酶在pH4-6起作用，中性纤维素酶在pH 6-8的范围内起作用，而碱性纤维素酶在pH 8-10范围作用。目前，使用最广泛的真菌来源的纤维素酶为里氏木霉(Trichoderma reesei)。

[0047] 纤维素结合结构域(CBD)

[0048] 纤维素酶一般具有两个结构域：一个具有催化功能的结构域(catalytic domain，CD)，一个没有催化活性的纤维素结合结构域(Cellulose Binding Domain，CBD)，两结构域之间由一段连接短肽(长度33～300氨基酸不等)相连。纤维素结合结构域又被称为纤维素结合模块(Cellulose Binding Module，CBM)，在中文翻译中，又被称为纤维素吸附结构域、纤维素亲合结构域。通常，当纤维素结合结构域(CBD)被从纤维素酶切割分开或单独表达，自成一体时，则称为纤维素结合蛋白质(Cellulose Binding Protein，CBP)。

[0049] 纤维素结合结构域的主要功能是将相邻的催化结构域传递到晶体纤维素底物上，许多纤维素酶主要依靠在肽链N端或C端的CBD结合底物。到目前为止，已经有130个不同的CBD被确定，基于氨基酸序列的相似性分属于13个不同的CBD家族(http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/)[4]。同一家族中的CBD一般具有结构相似性，而不同家族的结构拓扑多样。细菌纤维素酶的CBD由100-110个氨基酸组成，同源性较低。一些细菌的CBD结构有一定的共同特点：带电荷氨基酸含量很低；羟基氨基酸含量很高；都含有Trp、Asn和Gly，而且两个Cys在N、C末端的位置完全相同。

[0050] 纤维素酶的CBD一般认为协助水解不溶性结晶纤维素，通过蛋白酶水解去除CBD，或者删除相应基因编码序列后，纤维素酶对不溶性纤维素的活性显着降低；而对可溶性底物，酶的活性却没有受到明显影响。然而，有的CBD的作用似乎不在于跟底物结合，而是破坏晶体纤维素链间的非共价相互作用；或者不仅结合底物，还提供结合不同底物结构的优先权。实验证实家族II的CBD能够促使纤维素中氢键的断裂，从而释放单根纤维素分子链。C.fimi的CenA或Cex单独的CBD不具备对纤维素的水解活力，但能破坏棉纤维，形成短纤维，具有疏解结晶纤维素的能力。另外，研究表明第I家族CBD吸附纤维素的过程是可逆的，而第II家族此过程却是不可逆的。

[0051] 纤维素亲合结构域蛋白质可有例如～WO..A-01134019中描述的任何CDD.合适的纤维素亲合结构域蛋白质可由食纤维梭茵(Clostridium cellulovorans.)，粪碱纤维单胞菌(Cellulomonas fimi.)、精氏木霉菌(Trichoderma reesei)或双抱叶腹菌(M.Bispora)获得。特别优选的是由食纤维梭茵获得的纤维素亲合结构域蛋白质.纤维素亲合结构域蛋白质可为通过纤维素亲合结构域蛋白质暴露的疏水段的分子问疏水性相互作用形成的聚集体，或可选地其可以是非聚集形式.有利地，水溶性烯属不饱和单体在水中的溶解性为在25′C每100ml水至少为5g单体.当单体为潜在水溶性时，其可被政性(例如在聚合之后)，以提供从而在水中可溶(例如具有上述定义的溶解性)的单体单元。

[0052] 为了避免常规纤维素酶对纤维过分剪切而降低纤维强度的缺陷，美国专利US6,294,366和US6,635，146公开了使用截短的纤维素酶(CBD-truncated cellulose)处理纸浆，截短的酶缺少纤维素结合结构域(CBD)，使用这样的纤维素酶处理纸浆，可以避免这样的纤维强度的损失。在相似的纺织工业应用中，US 5,916,799公开了含有纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶的纤维素酶组合物，这两种酶已经进行了有限的蛋白水解，从而将酶的核心和纤维素结合结构域分开，发现得到的酶组合物降低返染。W096/23928公开了使用截短的纤维素酶处理含有纤维素的织物，发现能够减少染料的再沉积并增加磨损。

[0053] Shoseyov 等 (Chapter 8：Modulation of Wood Fibers and Paper by Cellulose-Binding Domain，In Applications of Enzymes to Lign℃ellulosics；Edited by Mansfield et al..ACSSymposium Series；American Chemical S℃iety：Washington，DC，2003，page116-132)发现，单独使用纤维素亲合结构域(cellulose-binding domain，CBD)蛋白能提高纸张的强度，而且聚合纤维结合蛋白(即由两个或更多的单体纤维结合蛋白组成的聚合分子，又称纤维键联蛋白)比单体纤维结合蛋白对纸张强度的提高更有效。Levy等(Cellulose，2002，9：91-98)报道，经过纤维结合蛋白质处理后的纸张的强度和纸面防湿性都大大地提高。Pala等(Chapter 7：Cellulose-Binding Domain as a Tool for Paper Recycling，In Applications of Enzymes to Lign℃ellulosics；Edited by Mansfield et al..ACS Symposium Series；American Chemical S℃iety：Washington，DC，2003，page105-115)报道，用CBD处理后的回收废纸的强度有显着增加。Kitaoka等(J Wood Sci.，2001，47：322-324)描述了使用纤维素亲合结构域蛋白质和阴离子聚合物聚丙烯酰胺(CBD-APAM)合成新的聚合物，作为干强度或湿强度添加剂，比常规干强/湿度添加剂更有效。

[0054] 本发明涉及纤维素结合结构域蛋白质(cellulose binding protein，CBP)和纤维改性酶联合使用来选择性地改变纤维表面的性质，以提高纸张的强度和其它的物理化学性质，增加造纸生产的效率，降低能耗，为造纸行业节约生产成本，提高经济利润。

[0055] 本发明所涉及的纤维素结合蛋白质(CBP)和纤维改性酶可以是以其单个成分的产品分别加入造纸过程中的相同或不同的位置，以可以将两组分混合配方成一个产品加入造纸过程中，达到改善纸张各种质量和提高生产效率的目的。

[0056] 本发明所涉及的使用纤维素结合蛋白质(CBP)的目的和效果是通过CBP优选吸附在纤维表面的部分区域(非晶型区)以保护该区域、避免纤维改性酶的过度反应，从而达到选择性的纤维表面改性和修复。

[0057] 实施例1：CBP在纤维素表面的选择性吸附。

[0058] 材料：微晶纤维素和纤维素结合蛋白质(CBP)从SigmaAldrich公司购得。其中，CBP(SigmaAldrich产品编号C8581)是从食纤维杆菌(Clostridium cellulovorans)的纤维素混合体中提取的分子量为17kDa的片段，通过大肠杆菌(E.Coli)表达。微晶纤维素为SigmaAldrichS3504。非晶纤维素用微晶纤维素按照Schroeder等(Schroeder L.，Gentile V and Atalla R.，″Nondegradative preparation of amorphous cellulose″，IPC Technical Paper Series 15，1985.15pp)所描述的方法制取。

[0059] 吸附测量方法：先将0.50mg的微晶或非晶纤维素加入含pH缓冲剂溶液的微离心试管中，混合至纤维素均匀分散，然后将1-15μg高纯度的CBP蛋白质加入试管中，再加入pH缓冲剂至100μl，将试管放入25℃的恒温水槽中，混合1小时，然后用高速离心机在12,000g的离心速度下分离5分钟。取上清层的溶液用光谱法分析残留的CBP蛋白质。吸附的CBP蛋白质按(初始浓度-残留浓度)计算。

[0060] 结果：图1比较该CBP在微晶纤维素和非晶纤维素的吸附与纤维素用量的关系。明显，该CBP在非晶纤维素表面的吸附比在微晶纤维素表面的吸附要高的多，表明其对非晶纤维素的高选择性和高亲和力。

[0061] 实施例2.CBP对纤维素酶降解纤维素的影响。

[0062] 材料：CBP(SigmaAldrich产品编号C8581)是从食纤维杆菌(Clostridium cellulovorans)的纤维素混合体中提取的分子量为17kDa的片段，通过大肠杆菌(E.Coli)表达。微晶纤维素为SigmaAldrich S3504。纤维素酶为SigmaAldrich C2730(Trichoderma reesei ATCC 26921)。方法：先将0.50mg的微晶纤维素和0.5mg非晶纤维素加入含pH缓冲剂溶液的微离心试管中，混合至纤维素均匀分散。对于CBP吸附的条件试验，将15μg的CBP蛋白质加入试管中，再加入pH缓冲剂至100μl，将试管放入25℃的恒温水槽中，混合1小时后。然后加入纤维素酶(3--200μg)，再混合0-200分钟，最后用高速离心机在12,000g的离心速度下分离5分钟。取上清层的溶液用光谱法分析所释放的还原性葡聚糖含量。取在200分钟无CBP的条件下的还原性葡聚糖释放量为100％，其余条件下按相对的％计算。

[0063] 结果：图2对比在有无添加CBP的条件下还原性葡聚糖的释放量。很明显，CBP与纤维素酶在纤维素表面竞争吸附，降低纤维素酶对纤维素的水解，从而减少还原性葡聚糖的产生。在不同的使用条件下(反应pH和温度)重复上述实验，得到了类似的试验结果，如表1所示。

[0064] 表1

[0065]

[0066] 实施例3：CBP对用纤维素酶处理漂白木浆时所起的纤维保护作用。

[0067] 试验材料准备：漂白美国北方硬木硫酸盐化学浆从美国北方一家纸厂取得。原浆浓度为10％，白度为90％ISO。使用前，将其配制浆浓度到1.0％，将pH调节到6.0-6.5。CBP为Sigma Aldrich产品(编号C8581)，纤维素酶为Novozymes公司的 342，其为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和半纤维素酶等混合酶。

[0068] CBP和生物酶反应条件：取上述配好的浆(1％浓度)200克，放入混合搅拌器中，用恒温控制器控制浆的温度在50℃。控制样品：不加任何药剂，混合搅拌10小时；CBP处理：加入一定量的(500克/吨干浆料)CBP蛋白质，然后混合搅拌10小时；纤维素酶酶处理：加入一定量(500克/吨干浆料)Novozym 342酶后，再混合搅拌10小时；CBP+生物酶处理：
先加入CBP(500克/吨干浆料)，混合搅拌1小时，然后加入Novozym 342酶(500克/吨干浆料)，再混合搅拌10小时。

[0069] 纤维长度及其它性质的测量：将上述制备好的浆，加自来水稀释到0.3％的浆浓，混匀，测量温度和浆浓度，纤维的长度及纤维形态的分析用H&W公司的纤维分析仪测量，其原理是采用显微照相和图像分析。

[0070] 结果：图3展示出在长时间(10个小时)处理后，各种处理条件下的纤维长度的分布对比。与控制条件相比，Novozym342酶处理后的纸浆的纤维长度显着变短，说明此纤维素酶对纤维有剪切作用。加入CBP蛋白质后，纤维素酶对纤维的剪切作用有明显的减弱，表明CBP蛋白质对纤维有保护作用。

[0071] 实施例4：CBP和纤维素酶对原生木浆脱水性能的影响。

[0072] 试验材料准备：未漂白美国南方松木化学浆从美国南方一家纸厂取得，原浆浓度为10％。使用前，将其配制浆浓度到5.0％，并加入pH缓冲剂将浆的pH调节到6.0-6.5。CBP为SigmaAldrich产品(编号C8581)，纤维素酶为Novozymes公司的 342，其为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和半纤维素酶等混合酶。

[0073] CBP和生物酶反应条件：取上述配好的浆200克，放入混合搅拌器中，用恒温控制器控制浆的温度在50℃。控制样品：不加任何药剂，混合搅拌1小时；CBP处理：加入一定量的(500克/吨干浆料)CBP蛋白质，然后混合搅拌1小时；生物酶处理：先混合搅拌30分钟，加入一定量(250克/吨干浆料)Novozym342酶后，再混合搅拌30分钟；CBP+生物酶处理：先加入CBP(500克/吨干浆料)，混合搅拌30分钟，然后加入Novozym 342酶(250克/吨干浆料)，再混合搅拌30分钟。

[0074] 自由度测量：将上述制备好的浆，加自来水稀释到0.3％的浆浓，混匀，测量温度和浆浓度，按TAPPI标准测量方法测量并换算出标准自由度。

[0075] 结果：图4展示出各种处理条件下的标准自由度。与控制条件相比，纤维素酶对纸浆的自由度有显着的提高，说明其对脱水性能的促进作用。CBP蛋白质对纸浆的自由度的提高不如纤维素酶显着。CBP+纤维素酶混合使用，自由度比CBP或纤维素酶单独使用更高，表明CBP和纤维素酶有加强互助作用(synergism)。

[0076] 实施例5：CBP和纤维素酶对原生木浆纸张强度性质的影响

[0077] 试验材料准备：未漂白美国南方松木化学浆从美国南方一家纸厂取得，原浆浓度为10％。使用前，将其配制浆浓度到5.0％，并加入pH缓冲剂将浆的pH调节到6.0-6.5。CBP为SigmaAldrich产品(编号C8581)，纤维素酶为Novozymes公司的 342，其为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和半纤维素酶等混合酶。

[0078] CBP和生物酶反应条件：取上述配好的浆200克，放入混合搅拌器中，用恒温控制器控制浆的温度在50℃控制样品：不加任何药剂，混合搅拌1小时；CBP处理：加入一定量的(500克/吨干浆料)CBP蛋白质，然后混合搅拌1小时；生物酶处理：先混合搅拌30分钟，加入一定量(250克/吨干浆料)Novozym 342酶后，再混合搅拌30分钟；CBP+生物酶处理：先加入CBP(500克/吨干浆料)，混合搅拌30分钟，然后加入Novozym 342酶(250克/吨干浆料)，再混合搅拌30分钟。

[0079] 手抄纸准备和强度测量：将上述制备好的浆，加自来水稀释到1.0％的浆浓，混匀，测量温度和浆浓度，按TAPPI方法，精确制备10-12张6.5克重的手抄纸。烘干后，手抄纸放在恒温和恒湿度的控制箱中24小时，然后按TAPPI测量方法测量其厚度(密度)、抗张强度、耐破度、撕裂强度和环压强度。

[0080] 结果：图5-8展示出各种处理对纸张的各种强度性质的影响。与控制条件相比，加入纤维素酶处理后，纸张的撕裂强度、抗张强度、耐破度和环压强度都下降。CBP处理后，纸张的各种强度性质都显着提高。先加入CBP，然后加入纤维素酶，不仅纸浆的脱水性显着提高，其纸张的各种强度包括撕裂强度都显着增加。本例证明纤维素结合蛋白质和纤维素酶组合物对原生木浆强度性质有极其显着的互助加强效应。

[0081] 实施例6：CBP和纤维素酶对回收废纸纸张强度性质的影响

[0082] 试验材料和准备：纸浆原料为100％的回收纸板，含60％的牛皮板纸，20％的瓦楞纸，20％的全废纸挂面板纸(testliner)。60克混合废纸加1升白水用碎浆机(40000转)制取纸浆。CBP为Sigma Aldrich产品(编号C8581)，纤维素酶为Novozymes公司的342，其为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和半纤维素酶等混合酶。

[0083] CBP和生物酶处理

[0084] 空白条件：取上述配好的浆200克，放入混合搅拌器中，用恒温控制器控制浆的温度在50℃。控制样品：不加任何药剂，混合搅拌1小时。CBP处理：加入300克/吨(干浆料)CBP蛋白质，然后混合搅拌1小时。生物酶处理：先混合搅拌30分钟，加入一定量(300或1000克/吨干浆料)Novozym 342酶后，再混合搅拌30分钟。CBP+生物酶处理：先加入CBP(300克/吨干浆料)，混合搅拌30分钟，然后加入Novozym 342酶(300克/吨或1000克/吨干浆料)，再混合搅拌30分钟。机械磨浆：用槽式打浆机(Valley Beater)打浆15分钟。

[0085] 手抄纸准备和强度测量：将上述制备好的浆，加自来水稀释到1.0％的浆浓，混匀，测量温度和浆浓度，按TAPPI方法，精确制备10-12张6.5克重的手抄纸。烘干后，手抄纸放在恒温和恒湿度的控制箱中24小时，然后按TAPPI测量方法测量其厚度(密度)、抗张强度、耐破度、撕裂强度和环压强度。

[0086] 结果：图9-10展示出各种处理对纸张的各种强度性质的影响。与控制条件相比，机械打浆显着提高纸张的抗张强度和耐破度，但是，纸张的撕裂强度和滤水性能也极大的下降。抗张强度、耐破度和环压强度都下降。用纤维素酶单独处理，纸浆的滤水性能性质提高，但是各种机械强度性质大大下降。用CBP单独处理后，纸浆的滤水性能基本不变，但是纸张的强度性质有所提高。先加入CBP，然后加入纤维素酶，不仅纸浆的脱水性显着提高，其纸张的各种强度包括撕裂强度都显着增加。本实施例证明纤维素结合蛋白质和纤维素酶组合物对回收废纸的纸张强度性质有其显着的互助加强效应。

[0087] 实施例7：在造纸厂的使用方法

[0088] 此实施例仅说明本发明在一全废纸回收纸厂的一些应用的方法。在实际应用中，本领域的技术人员可根据本发明公开的技术，以及根据纸厂具体的生产流程和条件试验，确定最佳应用方案。

[0089] 所述造纸方法，主要包括以下步骤：

[0090] a)将造纸原材料形成含水的纤维素造纸浆料，

[0091] b)将有效量的CBP和纤维改性酶分别或一起加入到纸浆料中，

[0092] c)将纸浆送上网，由此通过滤出水而由纤维等固体组分形成纸页，[0093] d)将纸页经过压榨段和干燥段，最终生产出纸产品。

[0094] 具体地，纸厂的生产流程如图11所示。废纸在碎浆除渣之后，进行分级，长短纤维分别处理，长纤维作面层，短纤维为底层，分送双流浆箱式夹网纸机。

[0095] 生产条件包括：原料为100％的回收废纸(含废旧纸箱(℃C)和混合废纸(mixed waste，含办公室废纸和旧报纸))；碎浆时间10-30分钟；温度为30-50℃；pH为5-8；产品A(CBP)为已失去活性的含纤维结合域(CBD)的纤维素酶；产品B(纤维改性酶)含纤维素酶(Novozymes公司的 342，其为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和半纤维素酶等混合酶。)，果胶酶(Novozymes公司的 863)，和氧化还原酶(Novozymes公司漆酶产品 51003)。产品A和B的具体用量需根据纸厂的生产产品(品种及其质量要求)和纸浆原料(组成和质量)而定。

[0096] 试验证明，对该厂的生产条件，最佳应用方案是，对短纤维纸浆，先加入CBP产品(产品A)，让CBP吸附在纤维之后，再加入含纤维改性酶产品(产品B)进行处理。而对长纤维纸浆部分，直接将混合产品(A+B)加入在热分散之后。并且，根据纸厂对产品质量、生产产量和经济要求，具体的产品A和产品B的用量进行调节，获得每种要求的产品。典型的结果如表2所示。

[0097] 表2是实例7中使用CBP和纤维改性酶组合物或二者联合使用对用100％废纸(OCC和混合废纸)生产纸箱板纸(定量为170克/平方米)的结果。其中SCT为英文short compress test，即短距压缩测试。层间抗张强度为Scott Bond(也称Plybond)。

[0098] 其中，试验产品配方1为：产品A的用量为每吨干浆料0.1千克，产品B用量为每吨干浆料0.5千克；组合物(A+B，按蛋白质重量比1∶1)用量为每吨干浆料10千克。

[0099] 试验产品配方2为：产品A的用量为每吨干浆料10千克，产品B用量为每吨干浆料0.1千克；组合物(A+B，按蛋白质重量比1∶5)用量为每吨干浆料2千克。

[0100] 试验产品配方3为：产品A的用量为每吨干浆料10千克，产品B用量为每吨干浆料10千克；组合物(A+B，按蛋白质重量比5∶1)用量为每吨干浆料5千克。

[0101] 表2

[0102]

[0103] 以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。