一种防治糖脂代谢紊乱的中药石油醚提取物及其制备方法

摘要

本发明公开了一种防治糖脂代谢紊乱的中药石油醚提取物，其有效成分为腊醇、β-谷甾醇、正二十六烷酸、白术内酯Ⅲ、齐墩果酸、小檗碱、药根碱、丹酚酸B、环二十四烷、9,12-十八碳二烯酸、5,7-二甲氧基香豆素、人参皂苷Rb1。制备方法是将原料药丹参、女贞子、黄连、大蓟、杜仲、白术、三七和佛手经过C1-3醇提和/或水提后，合并总提取物，再以石油醚萃取总提取物得到防治糖脂代谢紊乱的中药石油醚提取物。本发明提取物去除了原复方中药中大量无效成分，得到更有效的中药提取部位，且制备工艺稳定，质量可控，使用方便、疗效显著、方便生产各种剂型。

权利要求

1.一种防治糖脂代谢紊乱的中药石油醚提取物，其特征在于，有效成分为腊醇、β-谷甾醇、正二十六烷酸、白术内酯Ⅲ、齐墩果酸、小檗碱、药根碱、丹酚酸B、环二十四烷、

9,12-十八碳二烯酸、5,7-二甲氧基香豆素、人参皂苷Rb1；

所用药材原料为：女贞子15～35%、大蓟10～25%、白术5～15%、丹参5～15%、杜仲

5～15%、佛手5～15%、三七5～15%、黄连3～10%；

上述中药石油醚提取物的制备方法，包括以下步骤：

（1）将三七和女贞子进行C1-3醇提，得到C1-3醇提物，将大蓟、白术、丹参、杜仲、佛手和黄连进行水提、浓缩，得到水提物，合并C1-3醇提物和水提物得到总提取物；

（2）将步骤（1）得到的总提取物加入0.5～15倍体积的石油醚，萃取1～5次，合并萃取液，低温干燥，得到防治糖脂代谢紊乱的中药石油醚提取物。

2.根据权利要求1所述的中药石油醚提取物，其特征在于腊醇、β-谷甾醇、正二十六烷酸、白术内酯Ⅲ、齐墩果酸、小檗碱、药根碱、丹酚酸B、 环二十四烷、9,12-十八碳二烯酸、5,7-二甲氧基香豆素、人参皂苷Rb1的重量比例为1～5:1～8:1～8:1～5: 1～8:

1～8:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～6。

3.根据权利要求1所述防治糖脂代谢紊乱的中药石油醚提取物，其特征在于步骤（1）中所述C1-3醇提是选用30～95体积%的C1-3醇提取1～5次，每次提取的C1-3醇体积为药材质量的1～15倍，每次提取时间为5 min～5 h。

4.根据权利要求1所述防治糖脂代谢紊乱的中药石油醚提取物，其特征在于步骤（1）中所述水提是以水煎煮1～5次，每次用水的体积为药材质量的1～15倍，每次煎煮时间为5 min～5 h 。

5.根据权利要求1所述防治糖脂代谢紊乱的中药石油醚提取物，其特征在于步骤（1）中浓缩后的浓缩液体积为药材质量的0.2～5倍。

6.根据权利要求1所述防治糖脂代谢紊乱的中药石油醚提取物，其特征在于是将得到的石油醚提取物按照药剂学上可以接受的载体，加工成为口服制剂或注射制剂。

7.根据权利要求6所述防治糖脂代谢紊乱的中药石油醚提取物，其特征在于所述口服制剂为片剂、胶囊、散剂、丸剂、粉末、颗粒、悬剂、汤、糖浆、酏剂、茶或油剂。

说明书

一种防治糖脂代谢紊乱的中药石油醚提取物及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及中药领域，具体涉及一种用于防治糖脂代谢紊乱相关疾病（高脂血症、糖尿病、代谢综合症、动物粥样硬化等相关疾病）的中药石油醚提取物及其制备方法。

背景技术

[0002] 中国专利200410051250.4公开了一种治疗高脂血症的药物，命名为“复方贞术调脂方”（FTZ），含有女贞子、大蓟、白术、丹参、杜仲、佛手，还可以加入三七和黄连。各组分的优选重量百分比为女贞子20～25%、大蓟12～15%、白术10～15%、丹参10～15%、杜仲10～15%、佛手10～12%、三七10～12%、黄连6～10%。该方用于治疗高脂血症，取得理想疗效，临床总有效率达91%。

[0003] 虽然复方贞术调脂方有良好的血脂调节和抗动脉硬化功能和临床疗效，但是由于是中药复方制剂，还有许多不足之处：（1）其成分较复杂，其有效成分还不够清楚，不易量化，实际应用中其产品质量不易获得有效控制，最终将影响产品临床疗效的稳定性；（2）制备工艺相对简单，方中有效成分得不到应有的纯化，杂质成分多，服用剂量大(每天需要近5克以上)，病人服用顺应性不理想；（3）由于方剂提取物量大，不便制成各种控释剂型，制备药物制剂不能多样化，应用范围受到各种限制。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种疗效确切，有效成分易于量化，质量易于控制，服用量小的防治糖脂代谢紊乱的中药石油醚提取物。

[0005] 本发明的另一目的是提供上述石油醚提取物的制备方法。

[0006] 本发明通过以下技术方案实现上述目的：

[0007] 一种防治糖脂代谢紊乱的中药石油醚提取物，其有效成分为腊醇、β-谷甾醇、正二十六烷酸、白术内酯Ⅲ、齐墩果酸、小檗碱、药根碱、丹酚酸B、 环二十四烷、9,12-十八碳二烯酸、5,7-二甲氧基香豆素、人参皂苷Rb1。

[0008] 上述有效成分腊醇、β-谷甾醇、正二十六烷酸、白术内酯Ⅲ、齐墩果酸、小檗碱、药根碱、丹酚酸B、 环二十四烷、9,12-十八碳二烯酸、5,7-二甲氧基香豆素、人参皂苷Rb1的重量比例为1～5:1～8:1～8:1～5: 1～8: 1～8:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～6。

[0009] 上述中药石油醚提取物的制备方法，采用专利200410051250.4公开的治疗高脂血症的药物“复方贞术调脂方”（简称FTZ）的配方，各组分按重量百分比表示：女贞子15～35%、大蓟10～25%、白术5～20%、丹参5～20%、杜仲5～15%、佛手5～15%，优选组分为：
女贞子15～35%、大蓟10～25%、白术5～15%、丹参5～15%、杜仲5～15%、佛手5～15%、三七5～15%、黄连3～10%。 将原料药丹参、女贞子、黄连、大蓟、杜仲、白术、三七和佛手经过C1-3醇提和/或水提后，合并总提取物，再以石油醚萃取总提取物得到防治糖脂代谢紊乱的中药石油醚提取物。其中C1-3醇为甲醇、乙醇或丙醇。

[0010] 上述方法包括以下步骤：

[0011] （1）将三七和女贞子进行C1-3醇提，得到C1-3醇提物，将大蓟、白术、丹参、杜仲、佛手和黄连进行水提、浓缩，得到水提物，合并C1-3醇提物和水提物得到总提取物；

[0012] （2）将步骤（1）得到的总提取物加入0.5～15倍，优选6～10倍体积的石油醚，萃取1～5次，优选3～4次，合并萃取液，低温干燥，得到防治糖脂代谢紊乱的中药石油醚提取物。

[0013] 其中步骤（1）中所述C1-3醇提优选用30～95体积%的乙醇提取1～5次，优选2～4次，每次提取的C1-3的醇体积为药材质量的1～15倍，优选6～10倍，每次提取时间为5 min～5 h，优选2～3 h。

[0014] 步骤（1）中所述水提是以水煎煮1～5次，优选2～4次，每次用水的体积为药材质量的1～15倍，优选6～12倍，每次煎煮时间为5 min～5 h，优选2～3 h。

[0015] 步骤（1）中所述浓缩是指浓缩后的浓缩液体积为药材质量的0.2～5倍，优选1～2倍。

[0016] 得到的石油醚提取物按照药剂学上可以接受的载体，使用一般制剂方法，加工成为口服制剂或注射制剂，如片剂、胶囊、散剂、丸剂、粉末、颗粒、晶体、溶液、浸出物、悬剂、汤、糖浆、酏剂、茶、油等的形式。用于制备预防或治疗糖脂代谢紊乱相关疾病（高脂血症、糖尿病、代谢综合症、动物粥样硬化等相关疾病）的药物制剂或保健食品。

[0017] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0018] 通过本发明制备方法，可以去除专利200410051250.4的中药复方中大量无效的化学成分，得到有效提取部位，既保留了中药特色，又使传统中药中的有效成分含量大大提高，减少了无效成分对产品加工和制剂质量的影响，使该复方中药有效成分明确，制备工艺稳定，产品质量可控，有利于工业化生产。动物体内试验表明，该复方石油醚提取物对实验性高脂血症、高血糖症有明显降脂、降糖作用，并能降低胆固醇的作用，改善脂质代谢，防治动脉硬化功效，并且没有观察到明显副作用，增加了用药的安全性。

[0019] 本发明提供的复方中药石油醚提取物进一步拓展了复方贞术调脂方有效成分群的应用范围，为预防或治疗糖脂代谢相关疾病提供了一种新途径。本发明与同类防治糖脂代谢脂紊乱相关疾病的药品比较，疗效确切，安全无明显毒副作用，单独使用或与其它药物复配都有良好的应用前景。

[0020] 我们制备的中药石油醚提取物与原方相比较具有以下优点：

[0021] （1） 服用量由原来的6g提取物缩减为100mg，缩减为原来的1/60；

[0022] （2）药物有效成分的含量提高约60倍；

[0023] （3）本发明提供的石油醚提取物稳定性好，可制备多种口服控释制剂，大大拓宽了复方贞术调脂方在药物制剂领域中的应用，显著提高了复方贞术调脂方有效成分的生物利用度，方便使用；

[0024] （4）动物体内试验表明，本发明提取物对实验性高脂血症有明显降脂作用，同时能降低胆固醇，改善脂质代谢，同时对实验性高血糖症有明显降糖作用，改善血糖代谢，并且没有观察到明显副作用，增加了用药的安全性。对于高脂饮食性高脂血症的降血胆固醇的药效，该石油醚提取物部分指标优于原方，达到了减少服用量而不降低药效的目的。

附图说明

[0025] 图1：实施例3复方中药石油醚提取物HPLC色谱图；

具体实施方式

[0026] 下面结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

[0027] 实施例1 中药复方总提取物的制备

[0028] 将女贞子、白术、杜仲、三七、大蓟、丹参、黄连、佛手（重量比为2:1:1:1: 1:2:1:1）中的三七、女贞子两药粉碎成粗粉，以药材量的10倍、8倍和6倍的60体积%乙醇分别回流提取3次，每次2 h，合并提取液，回收乙醇并使醇提部分浓度为1 ml相当于1 g生药；方中其余药材都以12倍、10倍和8倍量的水，分别煎煮提取3次，每次2 h，合并3次水提液，真空减压浓缩至1 g药材/ml提取液，水体部分和前面醇提部分合并得到中药复方总提取物。

[0029] 实施例2 复方总提取物的石油醚提取部位的制备

[0030] 以复方总提取物10倍体积的石油醚萃取1次，分离石油醚层；再以8、6倍体积石油醚萃取各1次，分离得到石油醚层，合并3次的石油醚萃取液，回收石油醚，再于0.08MPa，65℃真空干燥，得到石油醚提取物(FTZEE)；

[0031] 根据中药复方总投料量和得到提取部位的量，计算提取物的得率。石油醚提取物的得率在0.3%～0.5%（1kg生药得石油醚提取物3.0～5.0g）。

[0032] 实施例3 复方总提取物的石油醚提取部位的化学成分分析

[0033] 实施例2复方石油醚提取物(FTZEE)， 经HPLC分析，得图1样指纹图谱。

[0034] FTZ石油醚部位UPLC色谱条件：Agilent HC-C18色谱柱（4.6mm×250mm，1µm），保护柱phenomenex KJO-4282-C18柱；流动相采用乙腈(A)-水(含0.25%冰乙酸+0.13%三乙胺)(B)二元梯度系统。梯度洗脱：2~5% A (0~5 min)，5%~20% A (5~35 min)，20% A (35~45 min)，20%~35% A (45~70 min)，35%~80% A (70~85 min)，80%~100%A (85~87 min)，100%A (87~89 min)。检测波长为254 nm、300 nm和330 nm，柱温为30℃，流速为0.2 mL/min，进样量10 µL。

[0035] 定性分析结果：FTZ石油醚部位主要含有腊醇、β-谷甾醇、正二十六烷酸、白术内酯Ⅲ、齐墩果酸、小檗碱、药根碱、丹酚酸B、 环二十四烷、9,12-十八碳二烯酸、5,7-二甲氧基香豆素、人参皂苷Rb1等成分，其UPLC-MS指纹图谱见附图1，其中各成分的重量比例为1～5:1～8:1～8:1～5: 1～8: 1～8:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～6。

[0036] 实施例4 提取物胶囊的制备方法

[0037] 提取物按照以下重量份组合：实施例2石油醚提取物5份，淀粉5份，羧甲基纤维素5份。将上述比例的各提取物，石油醚提取物与等量的淀粉混合均匀，再与余下淀粉混合，最后与羧甲基纤维素混合，三者混合均匀后干法制粒，减压干燥后，整粒，填充3号胶囊，抛光，质检包装。每粒含FTZEE 30 mg。服用剂量为一日3次，每次1粒。用HPLC方法测定制得的胶囊，其含各有效成分含量结果见表1：

[0038] 表1 FTZEE胶囊HPLC含量测定结果

[0039]

[0040] 制得的胶囊用于进行临床治疗高脂血症，每天3次，每次1粒，连服60天，结果病人血脂总胆固醇、甘油三酯在治疗组治疗后有明显下降，降血脂总有效率为90.5%，与对照组比较有显著差异(P<0.01)。

[0041] 实施例5 提取物片的制备方法

[0042] 用实施例2中制备得到的石油醚提取物5 kg加淀粉5 kg，羧甲基纤维素5kg，混匀，加75%酒精制粒，80℃干燥，加硬脂酸镁适量，压片，包薄膜衣，制得FTZEE片剂约100万片，每片含FTZEE 50 mg。服用剂量为一日2次，每次1片。HPLC法测定上述片剂，每片中各有效成分含量测定结果见表2：

[0043] 表2 FTZEE片HPLC含量测定结果

[0044]

[0045] 采用片剂进行临床治疗高脂血症，每天2次，每次1片，连服60天，结果病人血脂总胆固醇、甘油三酯在治疗组治疗后有明显下降，降血脂总有效率为93.3%，与对照组比较有显著差异(P<0.01)。

[0046] 实施例6提取物蜜丸的制备方法

[0047] 制备FTZEE 5.0 kg，混匀制得FTZEE蜜丸。

[0048] 以上FTZEE加淀粉3 kg，糊精3.0 kg，蜂蜜8. 0 kg泛丸成水蜜丸，干燥得15 kg干燥丸，包装成10万小粒的丸剂，即得0.15g/粒（每粒含FTZEE50 mg）。口服剂量：一次1小粒，一日2次。

[0049] 制得的蜜丸用于进行临床治疗高脂血症，每天2次，每次1粒，连服60天，结果病人血脂总胆固醇、甘油三酯在治疗组治疗后有明显下降，与对照组比较有显著差异(P<0.01)。降血脂总有效率为91.5%。

[0050] 实施例7 急性毒性和长期毒性试验

[0051] （1）小鼠急性毒性试验：将120只19～21g NIH小鼠（雌雄各半）分成6组，每组20只，分别以五种不同剂量的FTZEE（实施例2方法制备）口服灌胃（p.o.）给药，生理盐水（NS）阴性对照。观察小鼠的反应并记录每组小鼠的死亡数目，采用Microsoft Excel的线性回归软件，根据对数剂量与经验概率单位绘制直线，计算LD50。FTZEE对小白鼠口服灌胃的LD50分别为450～751 mg/kg（相当于人临床用量的300～500倍）。

[0052] （2）大鼠长期毒性实验：取Wistar大鼠120只雌雄各半分成4组，每组30只，分别p.o. 给予45 mg/kg、90 mg/kg、180 mg/kg复方中药石油醚提取物，NS阴性对照p.o. 生理盐水。连续给药180天，三个剂量组（相当于人临床用量的30～120倍）大鼠均未见明显血象、心肺肝肾功能及神经系统无异常，也未见心、肺、脾、胃、大脑、肠等重要器官有明显病理变化。

[0053] 结论：本发明的复方中药石油醚提取物毒性很低、安全性高。

[0054] 实施例8 FTZEE对饮食性高血脂模型动物血脂代谢的影响

[0055] 1.实验材料

[0056] 药品与试剂：FTZEE，制备方法同实施例2；复方贞术调脂方提取物 FTZ；总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒。

[0057] 动物：清洁级SD大鼠、体质量(180～225 g)，由南方医科大学省实验动物中心提供；纯种新西兰雌兔、体质量(1.80～2.20 kg)，由广东省实验动物中心提供。

[0058] 2.实验方法

[0059] 2.1对饮食性高血脂模型大鼠的血脂的影响

[0060] 观察不同剂量的FTZEE对高脂血症整体动物大鼠血清TC、TG、LDL-C，HDL-C的影响。

[0061] 按文献报道方法（郭姣,贝伟剑等，复方贞术调脂方对饮食性高脂血症大鼠肝脂酶的作用，中药材，2009，31(4)：582～585）复制并确认高血脂大鼠动物模型成功。

[0062] 将动物随机分组：将96只大鼠编号称重后随机分为8组，每组12只，设定①空白正常对照组；②高脂模型组；③FTZ组；④洛伐他丁组；⑤非诺贝特组；⑥⑦⑧依次为FTZEE高、中、低剂量（15，30，60 mg/kg）各实验组。除正常对照组自由摄取普通饲料外，其余组分别在此基础上每天上午按10 ml／kg量灌胃给予高脂乳剂，4 h后给予相应的药物，其中正常组、模型组给予等量生理盐水，连续给药4周，禁食1 d(不禁水)，第2天清晨末次给药1 h后先从眼眶静脉丛取血，离心、分离血清，分别测定TC、TG、HDL-C、LDL-C。

[0063] 统计学方法：数据用x±s表示，用SSP10.0软件进行方差分析和均数间多重比较。

[0064] 3 结果

[0065] 3.1 对饮食高血脂模型大鼠的血脂的影响

[0066] 研究结果表明，FTZEE可明显降低饮食高血脂模型小鼠血清中总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）及低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），明显升高高密度脂蛋白（HDL-C），有调节血酯的作用，见表3：

[0067] 表3 FTZEE对饮食高血脂模型大鼠的血脂的影响

[0068]

[0069] 注：与对照组比较**P<0.01；与高脂对照比较，F=3.82，▲P<0.05，▲▲p<0.01。

[0070] FTZ和FTZEE对饮食高血脂模型大鼠有明显降血脂作用，且呈现一定的量效关系。防治实验性血脂代谢紊乱的作用，其作用机理可能包括：

[0071] （1）本发明FTZEE经过系列动物实验研究表明，该方降脂疗效显著，同时兼具预防和治疗高血脂双重作用，除能影响脂代谢关键酶，有效调节血脂外，还具有改善血液流变学、抗氧化、抗动脉粥样硬化等多重作用。

[0072] （2）研究结果已证明，FTZEE能大大增强高脂模型大鼠血清中CYP7A1和HL酶活性。

[0073] 实施例9 FTZEE对肝细胞血脂代谢关键酶基因表达和活性的影响

[0074] 考察本发明石油醚提取物对血脂代谢关键酶基因表达和活性的影响。

[0075] 1.方法

[0076] 1.1 对L-O2肝细胞胆固醇7-α-羟化酶（CYP7A1）和肝脂酶（HL）活性的影响[0077] 按常规培养L-O2人正常肝细胞，待细胞融合后分别加入各种不同浓度的FTZEE（实施例2方法制备）和FTZ，继续培养24 h后，收集细胞制成细胞匀浆，用HL检测试剂盒，采用比色法检测HL活性，研究上述不同浓度FTZEE对HL1酶活性的影响，比较不同浓度FTZEE作用下的肝细胞中HL酶活性。

[0078] FTZEE与肝LO2细胞共育培养24 h时间后，收集肝细胞，按Hylemon等报道的方法（详见Hylemon, P. B.; Studer, E. J.; Pandak, W. M. et al 1989. Simultaneous measurement of cholesterol 7 alpha-hydroxylase activity by reverse-phase high-performance liquid chromatography using both endogenous and exogenous [4-14C] cholesterol as substrate. Analysic Biochemistry 182(2): 212-216）制备肝细胞微粒体，用CYP7A1检测试剂盒，采用HPLC法检测CYP7A1活性( Hylemon et al.,1989) ，研究FTZEE对CYP7A1酶活性的影响，比较不同浓度FTZEE作用下的肝细胞中CYP7A1活性变化。

[0079] 1.2 对HMGCoA还原酶活性抑制实验

[0080] 用上述FTZEE进行体外HMGCoA还原酶酶活性抑制实验，测定并计算出它们对HMGCoA还原酶抑制的IC50，并与普伐他汀对比。

[0081] 1.3 对L-O2肝细胞CYP7A1及HL基因表达的影响

[0082] 按常规培养L-O2人正常肝细胞，待细胞融合后分别加入1.0 μg/ml和5.0 μg/ml的FTZEE和25.0 μg/ml的FTZ为三组，继续培养24 h后，收集细胞，用Trigol试剂提取肝细胞中总RNA，RT-PCR法测定肝细胞中CYP7A1及HL酶基因表达情况，观察FTZEE对肝细胞中CYP7A1及HL酶基因表达的影响

[0083] 2 统计方法

[0084] 数据以均值±标准差表示，用方差分析方法进行显著性检验。

[0085] 3 实验结果

[0086] 3.1 对肝细胞肝脂酶的影响

[0087] 不同剂量FTZEE和FTZ处理后肝细胞肝脂酶活性显著增加(P<0.01)，并有明显剂量依赖性，结果见表4。说明本发明中药石油醚提取物（FTZEE）对肝细胞肝脂酶活性具有显著提高作用，有利于加强脂蛋白的清降而降低血甘油三酯和胆固醇。

[0088] 3.2 对肝细胞CYP7A1的影响

[0089] 不同剂量FTZEE和FTZ处理后CYP7A1活性显著增加(P<0.01)，且有明显剂量依赖性的增强，结果见表4。说明本发明中药石油醚提取物（FTZEE）对肝细胞CYP7A1活性具有显著提高作用，有利于促进胆固醇转化成胆汁酸，而排泄，从而降低血胆固醇。

[0090] 表4 不同药物对L-O2细胞CYP7A1及HL活性的影响

[0091]

[0092] 注：同正常对照组相比，*P<0.05；**P<0.01。

[0093] 3.4 对HMG-CoA还原酶活性的抑制作用

[0094] 用大白鼠肝细胞微粒体制成HMG-CoA还原酶溶液、HMG-CoA还原酶的活性测定则采用文献方法进行(Kleinsek, D.A., Ranganathan, S. and Porter, J.W., 1977. Purification of 3-hydroxy-3 -methylglutaryl-coenzyme A reductase from rat liver. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74, 1431-1435)分别测定各药物指定浓度下酶活性，求出FTZEE等各药物对HMG-CoA还原酶酶活性的IC50 (μg/ml)。

[0095] 结果见表5，结果表明FTZEE能明显降低大鼠HMG-CoA还原酶酶活性，且呈剂量依赖性关系。FTZEE可抑制HMG-CoA还原酶的活性，不仅阻碍胆固醇合成关键原料HMG-CoA的合成，而且抑制胆固醇的生物合成，产生降胆固醇作用。

[0096] 表5 FTZEE对-HMG-CoA还原酶活性的IC50(μg/ml)

[0097]

[0098] FTZEE抑制肝HMG-COA R降低酶活性，抑制肝脏TC合成，肝TC含量显著降低。

[0099] 实施例10 中药石油醚提取物对对胰岛B细胞的影响

[0100] 1.1方法

[0101] 1.1.1 对胰岛B细胞的影响

[0102] 按常规培养大鼠胰岛B细胞，待细胞融合后分别加入200 μM H2O2共育1 h，然后加各种不同浓度的FTZEE（实施例2方法制备）和FTZ，继续培养24 h时间后，收集细胞制成细胞匀浆，用超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒，采用比色法检测SOD、CAT及GSH-Px活性和GSH含量，研究上述不同浓度FTZEE对胰岛B细胞SOD、CAT及GSH-Px活性和GSH含量活性的影响。

[0103] 1.1.2对胰岛B细胞中Bcl-2、PPAR-a及Bax和Fas基因表达的影响

[0104] 处理胰岛B细胞方法同1.1.1，用Trizol试剂提取胰岛B细胞中总RNA，RT-PCR法测定胰岛B细胞中Bcl-2及Bax和Fas基因表达情况，观察FTZEE对胰岛B细胞中Bcl-2、PPAR-a及Bax和Fas基因表达的影响。

[0105] 1.2 统计方法：数据以均值±标准差表示，用方差分析方法进行显著性检验。

[0106] 1.3 实验结果

[0107] 1.3.1 对胰岛B细胞SOD、CAT及GSH-Px活性和GSH含量的影响

[0108] 不同剂量FTZEE和FTZ处理后胰岛B细胞SOD、CAT及GSH-Px活性和GSH含量显著增加(P<0.01)，且有明显剂量依赖性的增强，结果见表6。说明本发明FTZEE对胰岛B细胞SOD、CAT及GSH-Px活性和GSH含量具有显著提高作用，有利于抗氧化应激损伤。保护胰岛B细胞。

[0109] 表6 不同药物对氧化应激损伤胰岛B细胞SOD、CAT及GSH-Px活性和GSH含量的影响

[0110]☆☆

[0111] 注：（1）同正常对照组相比 P<0.01；同模型组相比，*P<0.05；**P<0.01。

[0112] （2）FTZ：复方贞术调脂方提取物，FTZEE：复方贞术调脂方石油醚提取物，BBR：盐酸小檗碱。

[0113] 1.3.2 对胰岛B细胞中Bcl-2及Bax和Fas基因表达的影响

[0114] 正常组胰岛B细胞中Bcl-2及Bax和Fas基因表达表达正常，不同剂量FTZEE处理后胰岛B细胞中Bcl-2基因表达显著增加(P<0.01)，而Bax和Fas基因表达显著降低(P<0.01)，说明FTZEE对Bcl-2基因表达有明显促进作用(P<0.01)，而抑制细胞凋亡基因Bax和Fas的表达，从而保护胰岛B细胞免受氧化应激损伤凋亡。结果见表7。

[0115] 表7 不同药物对胰岛B细胞中Bcl-2、PPAR-a及Bax和Fas基因表达的影响[0116]

[0117] 注：（1）同正常对照组相比☆☆P<0.01；同模型组相比，*P<0.05；**P<0.01。

[0118] （2）FTZ：复方贞术调脂方提取物，FTZEE：复方贞术调脂方石油醚提取物，BBR：盐酸小檗碱。

[0119] 实施例11 中药石油醚提取物对正常小鼠血糖的作用

[0120] 动物：健康NIH小鼠60只，雌雄各半，体重为18～22 g。

[0121] 分组：按性别随机分为5组：空白对照组，格列本脲组，复方总提取物组、石油醚提取物组1、2、3组（实施例2方法制备），每组 10 只。

[0122] 实验方法：动物禁食12 h后，自眼眶静脉丛取血，血样3000 rpm 离心10 min，分离血清，按葡萄糖试剂盒说明书操作，测定血糖含量。取血后立即灌胃给予给相应的供试药物，其中格列本脲50 mg/kg，空白对照组灌服同容积生理盐水，各给药容积为0.2 mL/10g体重。在给药后 3 h、6 h和9 h时，分别按上述方法取血测定血糖含量，实验结果见表8。

[0123] 结果经统计学分析选用t检验法，比较各给药组与对照组之差异。

[0124] 表8 中药石油醚提取物对正常小鼠血糖的作用（n=10 x ± s）

[0125]

[0126] 与对照组比，* P ＜ 0.05。

[0127] 实验结果表明，与正常小鼠比，在给药3，6，9小时后阳性对照药格列本脲组、总提取物组和石油醚提取各组对正常小鼠的血糖有显著的降低作用，各组给药6小时后降糖效果最显著。

[0128] 实施例12 中药石油醚提取物（FTZEE）对糖尿病模型小鼠的血糖的影响[0129] 药品与试剂：FTZEE（中药石油醚提取物，实施例2方法制备）；血糖试剂盒（北京北化康泰试剂有限公司）；总胆固醇，甘油三酯，高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒；链脲佐菌素（STZ），美国Sigma公司产品；消渴安胶囊，通化白山药业股份有限公司产品。

[0130] 采用Advantage电子感应血糖仪及配套纸条（瑞士Roche公司产品）测定血糖。

[0131] 实验对象是由南方医科大学省实验动物中心提供的清洁级NIH小鼠，雌雄各半，体重18～22 g。

[0132] 对链脲佐菌素（STZ）型糖尿病模型小鼠的血糖和血脂的影响

[0133] 将80只健康NIH小鼠，编号称重后随机分为8组，每组10只，取其中1组作为正常对照组。其余各组小鼠禁食16小时后，腹腔注射新鲜配制的1%链脲佐菌素溶液150 mg/kg，72小时后，眼内眦取血，采用Advantage电子感应血糖仪及配套纸条（瑞士Roche公司产品）测定血糖，血糖值大于16.7 mmol/L者确定为糖尿病模型鼠。将糖尿病模型鼠按血糖值编号后随机分为7组，FTZEE 3个治疗组（30、60、120 mg/kg）、FTZ2组（250，500 mg/kg）、消渴安胶囊治疗组（500 mg/kg）、模型对照组。各组分别灌胃给药1次/天，连续给药30天，在末次给药前12小时起动物禁食、给药后2小时分别从小鼠眶静脉丛取血，血样3000 rpm离心10 min，分离血清，按葡萄糖试剂盒说明书测定血糖含量。

[0134] 对肾上腺素引起的高血糖小鼠的血糖的影响

[0135] 将60只健康NIH小鼠，编号称重后随机分为6组，每组10只，取其中1组作为正常对照组、肾上腺素组、FTZEE大小剂量（120、60mg/kg）组、FTZ 250 mg/kg组、消渴安胶囊治疗组（500 mg/kg）。各组分别灌胃给药1次/天，正常对照组和肾上腺素组给予等体积生理盐水，连续给药7天，在末次给药2 h后，对照组ip等体积生理盐水，其余各组ip肾上腺素（240 mg/kg）溶液，分别在ip肾上腺素后0.5 h、1 h从小鼠眶静脉丛取血，分离血清、测定血糖。

[0136] 对葡萄糖引起的高血糖小鼠的血糖的影响

[0137] 将60只健康NIH小鼠，编号称重后随机分为6组，每组10只，正常对照组、葡萄糖高糖模型组、FTZEE大小剂量（120、60mg/kg）组、FTZ 250 mg/kg组、消渴安胶囊治疗组（500 mg/kg）。各组分别灌胃给药1次/天，正常对照组和葡萄糖组给予等体积生理盐水（NS），连续给药7天，在末次给药2 h后，对照组腹腔注射（ip）等体积生理盐水，其余各组ip葡萄糖（2 g/kg）溶液，分别在ip葡萄糖后0.5、1、2 h从小鼠眶静脉丛取血，分离血清、测定血糖。

[0138] 实验结果见表9、表10、表11。

[0139] 表9. FTZEE对链脲佐菌素（STZ）型糖尿病模型小鼠的血糖的影响（n=10，x±s）[0140]

[0141] 注:同正常组相比，*P<0.05，**P<0.01；同模型组相比，△P<0.05，△△P<0.01；同治▲ ▲▲疗前相比 P<0.05， P<0.01。

[0142] 表10. FTZEE对肾上腺素引起的高血糖小鼠的血糖的影响（n=10，x±s）[0143]
* ** ▲▲

[0144] 注:同正常组相比，P<0.05，P<0.01；同治疗前相比， P<0.01。

[0145] 表11. FTZEE对葡萄糖引起的高血糖小鼠的血糖的影响（n=10，x±s）[0146]** ▲ ▲▲

[0147] 注:同正常组相比，P<0.01；同治疗前相比 P<0.05， P<0.01。

[0148] 实施例13 FTZEE对氢化可的松诱发小鼠胰岛素抗性的影响

[0149] 将40只小鼠编号称重后随机分为4组，每组10只，取其中一组皮下注射生理盐水（NS）作为正常对照组、一组皮下注射氢化可的松（36 mg/kg）、另两组皮下注射氢化可的松（36 mg/kg）再分别灌胃FTZEE大小剂量（60、120 mg/kg，实施例2方法制备）。各组分别灌胃给药1次/天，正常对照组和氢化可的松组给予等体积生理盐水，连续给药10天，在末次给药2 h后，对照组ip等体积生理盐水，其余各组ip胰岛素（0.5 g/kg），分别在ip葡萄糖后0.5、2 h摘眼取血，分离血清、全自动生化分析仪测定血糖。结果如表12、表13所示。

[0150] 表12 FTZEE对氢化可的松诱发小鼠胰岛素抗性的影响（n=10，x±s）

[0151]

[0152] 表13 FTZEE对氢化可的松诱发小鼠胰岛素抗性的影响（n=10，x±s）

[0153]

[0154] 注:同正常组相比， **P<0.01；同氢化可的松+NS组相比▲P<0.05，▲▲P<0.01。

[0155] 实施例14 FTZEE对链脲佐菌素型糖尿病模型大鼠的作用

[0156] 药品与试剂：链脲佐菌素（STZ），美国Sigma公司产品；枸橼酸钠，汕头市光华化学厂产品，批号20000116。

[0157] 实验对象是雌性Wistar普通级大鼠36只，体重220~250 g。（第一军医大学实验动物中心提供，合格证号：粤检证字第2004B023号）

[0158] 所有大鼠适应性喂养一周后，禁食12 h，取7只大鼠为正常对照组（简称对照组），其他大鼠一次性腹腔注射50 mg/kg STZ （STZ临用前用0.1 mol/L、pH 4.5的枸橼酸钠缓冲液配制，10 min内用完），对照组则注射等量枸橼酸钠溶液。72 h后血糖FBG大于16.7 mmol/L者为高血糖糖尿病模型大鼠。糖尿病大鼠随机分为糖尿病模型组、FTZEE大小剂量组（实施例2方法制备）。大剂组按人与大鼠等效剂量比每日40 mg/5 ml/ kg给药，小剂组每日20 mg/5 ml/kg，模型组和正常组每日给5 ml/kg蒸馏水，上午灌胃一次，治疗15天。各组造模前、造模后、治疗后断尾取血测血糖（FBG）、血清胰岛素（Ins），最后取大鼠胰脏作标本进行HE染色和免疫组化染色。

[0159] 采用Advantage电子感应血糖仪及配套纸条（瑞士Roche公司产品）测定血糖。血糖用葡萄糖氧化酶法，血清胰岛素用放免法。

[0160] 实验数据以均值±标准差（x±s）表示，用方差分析方法进行显著性检验。

[0161] 对血糖的影响结果见表14，模型组和正常组比较，FBG显著升高（P<0.01），大小剂量治疗后和模型组比较FBG显著下降（P<0.01），说明FTZEE有显著降血糖作用。

[0162] 表14 FTZEE对STZ模型各组大鼠血糖变化表（mmol/L）

[0163]

[0164] 注:同正常组相比，*P<0.05，**P<0.01；同模型组相比，△P<0.05，△△P<0.01；同治疗前相比▲P<0.05，▲▲P<0.01。

[0165] 对血清胰岛素的影响结果见表15，模型组和正常组比较，Ins显著降低（P<0.01），大小剂量治疗后血清Ins水平比模型组显著升高（P<0.05），表明FTZEE对Ins分泌有一定的促进作用。

[0166] 表15 FTZEE对STZ模型各组大鼠血清胰岛素变化表（mU/L）

[0167]* ** △ △△

[0168] 注:同正常组相比，P<0.05，P<0.01。同造模前相比，P<0.05， P<0.01；同模▲ ▲▲型组相比 P<0.05， P<0.01。

[0169] HE染色组织学观察发现：正常组胰岛为圆形、椭圆形细胞团，境界清楚，胰岛数及岛内细胞数较多，胞质丰富；STZ模型组胰岛数及岛内细胞数减少，细胞形态不规则，核大小不等、形态不一，部分核固缩，少数细胞呈空泡状；大剂量组胰岛数及岛内细胞数明显增多，细胞分布均匀，核大小基本相等，无核固缩；小剂量组胰岛数及岛内细胞数增多，形态较为规则，少部分核固缩。这说明FTZEE对STZ模型损伤的胰岛细胞组织有显著的保护作用，并能促进胰岛素的分泌。

[0170] 实施例15 预防和/或治疗高血糖/糖尿病的临床验证

[0171] FTZEE片（中药石油醚提取物片，实施例5方法制备）治疗糖尿病60例分析[0172] 试验参照郑筱萸主编，中药新药临床研究指导原则（试行），中国医药科技出版社，2002年第1版，233-237：中药新药治疗糖尿病的临床研究指导原则进行。

[0173] 1.临床资料

[0174] 60例患者均系根据1993年诊断标准确诊的非胰岛素依赖型住院患者，其中，门诊40例，住院20例；随机分为两组，治疗组30例中，男16例，女14例；年龄39~65岁，平均年龄（51.3±8.6）岁。糖尿病病程3~15年，平均病程（6.8±2.9）年；合并高血脂症者19例，冠心病者10例、高血压者18例；对照组30例中，男15例，女15例；年龄38~65岁；平均年龄（51.5±6.8）岁；糖尿病病程2.5~16年，平均病程（6.9±3.1）年；合并高血脂症者20例，冠心病者9例、高血压者17例。两组在性别、年龄、病程、并发症方面经统计学处理，无显著差异（P>0.05），具有可比性。

[0175] 2.诊断标准

[0176] 西医诊断标准（根据1999年WHO专家咨询报告）：空腹血糖（FPG）≥7.0 mmol/L及餐后2小时血糖（2 HPG）≥7.0 mmol/L，随机血糖≥11.1 mmol/L。

[0177] 高压血参照1999年世界卫生组织/国际高血压联盟关于高血压的分类分期方法制定（1999年世界卫生组织/国际高血压联盟关于高血压治疗指南, 高血压杂志, 1999,7(2): 9）。

[0178] 中医诊断标准参照中华人民共和国卫生部中医新药治疗消渴病（糖尿病）的临床研究指导原则(1993)：凡具有或咽干口燥、倦怠乏力、多食易饥、口渴喜饮、气短懒言、五心烦热、心悸失眠、胸胁疼痛、尿赤便秘、舌质红或黯红、淡紫或有瘀点瘀斑，脉沉细或弦涩，中医辨证为气阴两虚、血瘀脉络证者。

[0179] 3.治疗方法

[0180] 治疗组服用中药石油醚提取物片剂(简称FTZEE片)，每次1片，每天2次，2个月为1疗程，其间停用其它降糖药物。

[0181] 对照组采取消渴安胶囊(0.4g/粒，通化白山药业股份有限公司生产)治疗，每次3粒，每天3次，2个月为1疗程，治疗2型糖尿病。

[0182] 两组患者均进行糖尿病教育、饮食控制、适量运动。全部病例观察2个月。

[0183] 4.观察指标

[0184] 治疗前后测血压、空腹血糖(FBG)及餐后2小时血糖(2 HFBG)（葡萄糖氧化酶法）、糖基化血红蛋白（HbALc）、肝肾功能、尿常规、治疗期间2、4、6周同时检测血压。

[0185] 5.临床疗效

[0186] 参照中华人民共和国卫生部中医新药治疗消渴病（糖尿病）的临床研究指导原则(1993)疗效标准进行评定。显效：症状消失，实验室检查多次正常；有效：主要症状及有关实验室检查有改善；无效：症状及有关实验室检查无变化。

[0187] 病人治疗前后血糖、血液流变学变化情况如表16和17所示。

[0188] 表16两组治疗前后血糖、HbALc比较

[0189]★ ★★

[0190] 注：与本组治疗前比较，P<0.05， P<0.01。

[0191] 由表16可见，两组患者治疗后空腹及餐后2小时血糖、糖基化血红蛋白均有明显下降；与对照组比较有显著差异（P<0.01），对照组治疗后也有相似效果，说明FTZEE治疗2型糖尿病在改善血糖、尿蛋白方面有显著疗效。

[0192] 表17示出FTZEE片对糖尿病、代谢综合征的疗效统计，表明FTZEE片对糖尿病病人有降血糖的疗效。

[0193] 表17 FTZEE片对糖尿病、代谢综合征的疗效统计

[0194]

[0195] 注：与消渴丸组比较，*P<0.05。

[0196] 因此，本发明中药石油醚提取物（FTZEE）片对糖尿病的总有效率为90.0%，显效60.0%，比目前常用药的87%的总有效率略高，并且没有观察到明显副作用。

[0197] 结论：FTZEE是经现代中药药理研究证实具促进胰岛素分泌，增加血清胰岛素的含量有降糖、改善血糖代谢的作用。其作用机理可能包括：

[0198] （1）FTZEE能增强B细胞超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性和GSH含量，能抑制脂质过氧化和清除羟基自由基，抗氧化应激损伤，促进胰岛B细胞再生。

[0199] （2）FTZEE能增加胰岛B细胞抗细胞凋亡因子Bcl-2基因表达并抑制胰岛B细胞凋亡因子Bax和Fas基因表达，从而减少凋亡的发生，刺激正常胰岛B细胞分泌胰岛素。

[0200] （3）FTZEE能增加胰岛B细胞抗炎症因子PPAR-a基因表达，拮抗炎症因子的作用，减少胰岛B细胞损伤。通过保护、修复胰岛B细胞而增加血清胰岛素的含量。

[0201] 临床研究结果表明，本发明防治糖脂代谢紊乱的中药石油醚提取物FTZEE具有显著的降糖、改善血糖代谢作用，治疗高血糖及糖尿病血糖代谢紊乱相关疾病临床疗效确切。