微生物发酵生产低温植酸酶的方法转让专利
申请号 : CN201010162606.7
文献号 : CN102093987B
文献日 : 2013-05-01
发明人 : 张庆芳 , 迟乃玉 , 窦少华 , 陈璨
申请人 : 大连大学
摘要 :
本发明所述的一种微生物发酵生产低温植酸酶的方法是将产生植酸酶酶的微生物逐级低温驯化，使其在低温环境中生长良好；将低温驯化后的植酸酶产生菌在12～18℃逐级扩大培养，按发酵液体积的4～10％接种量接入液体发酵培养基中，在12～18℃培养72～144h，即微生物发酵生产低温植酸酶结束；发酵液在6,000～10,000rpm离心收集液体，收集的液体即为粗酶液；根据不同需要和使用对象不同，将粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
权利要求 :
1.一种微生物发酵生产低温植酸酶的方法，其包括以下步骤：
(1) 菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号：2.1894T
或2.1481 或2.1695，菌株先活化；将上述产生植酸酶的微生物逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→15℃→12℃，使其在低温环境中生长良好；菌种低温驯化培养基：植酸钙0.5～2 g、葡萄糖20～40 g、NH4NO3 3～8 g、KCl 0. 3～0.5 g、MgSO4·7H2O 0.3～0. 5 g 、MnSO4·4H2O 0.01～0. 03 g 、FeSO4·7H2O 0.01～0. 03 g、琼脂20 g、蒸馏水1 L、pH 5. 5,121℃高压蒸气灭菌30 min；
(2)按常规方法将上述低温驯化后的植酸酶产生菌在12～18℃逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；液体种子培养基: 葡萄糖30～50 g、蛋白胨6～10 g、硫酸铵
1～2 g、KCl 0.3～0.5 g、MgSO4·7H2O 0.3～0.5 g、蒸馏水1 L、pH 值5.5, 121℃高压蒸气灭菌30 min；
(3)将液体一级种子或二级种子,按发酵液体积的4～10%接种量接入液体发酵培养基中，在12～18℃培养72～144 h，即微生物发酵生产低温植酸酶结束；液体发酵培养基: 葡萄糖30～60 g、蛋白胨6～10 g、硫酸铵1～2 g、KCl0.3～0.5 g、MgSO4·7 H2O
0.3～0.5 g、蒸馏水1 L、pH值 5.5, 121℃高压蒸气灭菌30 min；
(4)将(3)的发酵液在6,000～10,000 rpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；
(5)根据不同需要和使用对象不同，将(4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
说明书 :
微生物发酵生产低温植酸酶的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及微生物学、酶工程、发酵工程、生物化学等领域，具体涉及一种低温植酸酶微生物发酵生产方法。该发明生产的低温植酸酶主要应用于饲料行业、食品加工、环境保护、医药等领域。可以提高原料的利用率、转化率和生产率，降低生产成本，改善并提高产品质量。
背景技术
[0002] 植酸酶是肌醇六磷酸水解酶，可以催化水解反应将磷酸盐从植酸中释放出来，促进动物对矿质元素的吸收及利用，更重要是提高磷利用率，降低环境中的磷污染(黄遵锡等，1999)。此外植酸酶还是一种新型食品添加剂和制备药用肌醇磷酸酯的催化剂。植酸酶作为一种新型的绿色添加剂，用于单胃动物饲料中可使植物性饲料中磷的利用率提高60％；减少了成品饲料中无机磷的添加量，促进了动物生长发育，提高了动物生产性能；动物粪便中无机磷排出量减少40％，降低磷对环境的污染(姚斌等，2000)。鉴于植酸酶广泛的应用前景，国内外对其研究倍受关注，植酸酶对猪、禽等单胃动物的营养作用研究表明：可以显著提高植酸磷和其他养分的利用率，减少环境污染(韩延明等，1996；乌□娜等，
2008)。20世纪90年代以来，采用DNA重组技术使微生物植酸酶的产量和活性大幅度提高，降低植酸酶的生产成本，促使其广泛应用(姚斌等，1998)。目前应用的植酸酶大多是中温和高温型植酸酶(张若寒等，1996；Luis Pasamonts et al，1997)，有关低温植酸酶的研究尚处于起步阶段，主要集中在菌种选育、发酵条件优化、酶学性质以及相关基因克隆等方面；而低温植酸酶产业化、规模化生产及应用还未见报道。低温植酸酶具有低温高催化活力和高催化效率；能缩短加工过程的时间并省却昂贵的加热或冷却费用；在节能方面有相当大的优势；经过温和的热处理可使低温酶的活力丧失；可以从根本上省却中温和高温型酶的加热、冷却设备和工艺。因此低温植酸酶应用将对饲料、食品、制药、低温环境修复等领域产生深远的影响，将为人类摆脱发展中所面临的资源、能源危机以及环境污染等问题提供现实的机遇，其具有非常广阔的开发潜力和应用前景。
2008)。20世纪90年代以来，采用DNA重组技术使微生物植酸酶的产量和活性大幅度提高，降低植酸酶的生产成本，促使其广泛应用(姚斌等，1998)。目前应用的植酸酶大多是中温和高温型植酸酶(张若寒等，1996；Luis Pasamonts et al，1997)，有关低温植酸酶的研究尚处于起步阶段，主要集中在菌种选育、发酵条件优化、酶学性质以及相关基因克隆等方面；而低温植酸酶产业化、规模化生产及应用还未见报道。低温植酸酶具有低温高催化活力和高催化效率；能缩短加工过程的时间并省却昂贵的加热或冷却费用；在节能方面有相当大的优势；经过温和的热处理可使低温酶的活力丧失；可以从根本上省却中温和高温型酶的加热、冷却设备和工艺。因此低温植酸酶应用将对饲料、食品、制药、低温环境修复等领域产生深远的影响，将为人类摆脱发展中所面临的资源、能源危机以及环境污染等问题提供现实的机遇，其具有非常广阔的开发潜力和应用前景。
发明内容
[0003] 本发明的目的是提供一种微生物发酵生产低温植酸酶的方法，该方法主要是微生物经过低温驯化后，在12～18℃液体发酵生产低温植酸酶的方法，这种生产方法获得的低温植酸酶粗酶液活性可以达到160U/mL，如再经过分离和纯化，可以得到不同浓度和纯度的酶制剂。该酶制剂应用操作简单、方便、快捷、成本低。可以从根本上避免中温、高温酶的加热、冷却设备和工艺。
[0004] 本发明所述的一种微生物发酵生产低温植酸酶的方法具体包括以下步骤：
[0005] (1)将产生植酸酶的 微生物逐级低温 驯化，驯化温度由高 到低，25℃→22℃→20℃→18℃→15℃→12℃，使其在低温环境中生长良好；
[0006] (2)按常规方法将低温驯化后的植酸酶产生菌在12～18℃逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；
[0007] (3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的4～10％接种量接入产酶培养基中，在12～18℃培养72～144h时，即微生物发酵生产低温植酸酶结束；
[0008] (4)将(3)的发酵液在6,000～10,000rpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；
[0009] (5)根据不同需要和使用对象不同，将(4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
[0010] 本发明中使用的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，初期活化和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。植酸酶产生菌(CGMCC菌T种编号：2.1894或2.1481 或2.1695等)，菌株先活化，再经过逐级低温驯化，发酵生产低温植酸酶时按本发明方法进行培养。低温驯化后的菌株在4℃环境中可保存2个月，用25～
40％甘油制成的菌悬液、在零下80℃条件下可以长期保藏。
具体实施方式：
40％甘油制成的菌悬液、在零下80℃条件下可以长期保藏。
具体实施方式：
[0011] 实施例一：
[0012] (1)、培养基制备
[0013] ①菌种活化培养基：葡萄糖50g、蛋白胨10g、硫酸铵2g、KCl 0.5g、MgSO4·7H2O0.5g、MnSO4·4H2O 0.03g、FeSO4·7H2O 0.03g，蒸馏水1L，pH 5.5，121℃高压蒸气灭菌
30min。
30min。
[0014] ②菌种低温驯化培养基：植酸钙0.5～2g、葡萄糖20～40g、NH4NO33～8g、KCl0.3～0.5g、MgSO4·7H2O 0.3～0.5g、MnSO4·4H2O 0.01～0.03g、FeSO4·7H2O 0.01～
0.03g、琼脂20g、蒸馏水1L、pH 5.5，121℃高压蒸气灭菌30min。
0.03g、琼脂20g、蒸馏水1L、pH 5.5，121℃高压蒸气灭菌30min。
[0015] ③液体种子培养基：葡萄糖30～50g、蛋白胨6～10g、硫酸铵1～2g、KCl 0.3～0.5g、MgSO4·7H2O 0.3～0.5g、蒸馏水1L、pH值5.5，121℃高压蒸气灭菌30min。
[0016] ④产酶培养基：葡萄糖30～60g、蛋白胨6～10g、硫酸铵1～2g、KCl 0.3～0.5g、MgSO4·7H2O 0.3～0.5g、蒸馏水1L、pH5.5，121℃高压蒸气灭菌30min。
[0017] (2)将产生植酸酶的菌种，按中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；
[0018] (3)将(2) 活 化 好 的 菌 种 逐 级 低 温 驯 化，驯 化 温 度 由 高 到 低，25℃→22℃→20℃→18℃→15℃→12℃，使其在低温环境中生长良好；
[0019] (4)按常规方法将低温驯化后的植酸酶产生菌在12～18℃培养24～48h，按5％的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子：
[0020] (5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积4～6％的接种量接入5L的产酶培养基中，在12～14℃培养120～144h时，即微生物发酵生产低温植酸酶结束；
[0021] (6)将(5)的发酵液在6,000～10,000rpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；
[0022] (7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温植酸酶制剂。
[0023] 实施例二：
[0024] (1)、培养基制备
[0025] ①菌种活化培养基：葡萄糖50g、蛋白胨10g、硫酸铵2g、KCl 0.5g、MgSO4·7H2O0.5g、MnSO4·4H2O 0.03g、FeSO4·7H2O 0.03g，蒸馏水1L，pH值5.5，121℃高压蒸气灭菌
30min。
30min。
[0026] ②菌种低温驯化培养基：植酸钙0.5～2g、葡萄糖20～40g、NH4NO33～8g、KCl0.3～0.5g、MgSO4·7H2O 0.3～0.5g、MnSO4·4H2O 0.01～0.03g、FeSO4·7H2O 0.01～
0.03g、琼脂20g、蒸馏水1L、pH值5.5，121℃高压蒸气灭菌30min。
0.03g、琼脂20g、蒸馏水1L、pH值5.5，121℃高压蒸气灭菌30min。
[0027] ③液体种子培养基：葡萄糖30～50g、蛋白胨6～10g、硫酸铵1～2g、KCl 0.3～0.5g、MgSO4·7H2O 0.3～0.5g、蒸馏水1L、pH值5.5，121℃高压蒸气灭菌30min。
[0028] ④产酶培养基：葡萄糖30～60g、蛋白胨6～10g、硫酸铵1～2g、KCl0.3～0.5g、MgSO4·7H2O 0.3～0.5g、蒸馏水1L、pH值5.5，121℃高压蒸气灭菌30min。
[0029] (2)将产生植酸酶的菌种，按中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；
[0030] (3)将(2) 活 化 好 的 菌 种 逐 级 低 温 驯 化，驯 化 温 度 由 高 到 低，20℃→16℃→18℃→15℃→12℃，使其在低温环境中生长良好；
[0031] (4)按常规方法将低温驯化后的植酸酶产生菌在12～18℃培养24～48h，按5％的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；
[0032] (5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积6～8％的接种量接入50L的产酶培养基中，在14～16℃培养96～120h时，即微生物发酵生产低温植酸酶结束；
[0033] (6)将(5)的发酵液在6,000～10,000rpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；
[0034] (7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温植酸酶制剂。
[0035] 实施例三：
[0036] (1)、培养基制备
[0037] ①菌种活化培养基：葡萄糖50g、蛋白胨10g、硫酸铵2g、KCl 0.5g、MgSO4·7H2O0.5g、MnSO4·4H2O 0.03g、FeSO4·7H2O 0.03g，蒸馏水1L，pH 5.5，121℃高压蒸气灭菌
30min。
30min。
[0038] ②菌种低温驯化培养基：植酸钙0.5～2g、葡萄糖20～40g、NH4NO33～8g、KCl0.3～0.5g、MgSO4·7H2O 0.3～0.5g、MnSO4·4H2O 0.01～0.03g、FeSO4·7H2O 0.01～
0.03g、琼脂20g、蒸馏水1L、pH 5.5，121℃高压蒸气灭菌30min。
0.03g、琼脂20g、蒸馏水1L、pH 5.5，121℃高压蒸气灭菌30min。
[0039] ③液体种子培养基：葡萄糖30～50g、蛋白胨6～10g、硫酸铵1～2g、KCl 0.3～0.5g、MgSO4·7H2O 0.3～0.5g、蒸馏水1L、pH 5.5，121℃高压蒸气灭菌30min。
[0040] ④产酶培养基：葡萄糖30～60g、蛋白胨6～10g、硫酸铵1～2g、KCl0.3～0.5g、MgSO4·7H2O 0.3～0.5g、蒸馏水1L、pH5.5，121℃高压蒸气灭菌30min。
[0041] (2)将产生植酸酶的菌种，按中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；
[0042] (3)将(2) 活 化 好 的 菌 种 逐 级 低 温 驯 化，驯 化 温 度 由 高 到 低，25℃→22℃→18℃→15℃，使其在低温环境中生长良好；