一种改造除虫链霉菌产生多拉菌素的方法

摘要

本发明公开了一种利用磷氮霉素生物合成基因改造阿维菌素生物合成途径生产多拉菌素的技术，具体地说是一种通过对阿维菌素产生菌进行改造产生多拉菌素的技术。对阿维菌素生物合成途径中聚酮合成酶起始模块进行替换，再将合成环己基甲酰辅酶A的生物合成途径引入可以使得除虫链霉菌获得发酵生产多拉菌素的能力。所述用来替换的编码起始模块以及编码环己基甲酰辅酶A的生物合成酶的基因pnAT1ACP1和pnP1，pnP2，pnP3，pnP4均来自于磷氮霉素的生物合成基因簇。本发明还公开了利用上述基因构建产生多拉菌素突变菌种的方法和应用，相应突变菌种发酵获得的多拉菌素产量以及纯度与未经改造的菌株相比有大幅提高。

权利要求

1.一种改造除虫链霉菌产生多拉菌素的方法，其特征在于利用磷氮霉素聚酮合成酶起始模块的编码基因pnAT1ACP1置换阿维菌素聚酮合成酶起始模块的编码基因aveAT1ACP1，同时将磷氮霉素基因簇中合成环己基甲酰辅酶A的生物合成基因pnP1-pnP4在置换突变株中异源表达；

其中，所述的磷氮霉素聚酮合成酶起始模块的编码基因pnAT1ACP1的核苷酸序列如下：

cgggtcgagg tgatccagcc ggccctgttc gccgtcatgg tgtcgctcgc ggagctgtgg 60cggtcgaacg gcgtcacgcc cgccgcggtc gtgggccaca gtttcggtga gatcgcggcg 120gtgaccgccg ccggagcgct caccctggcg gacggcgcaa ggctggtcgc cgccgtcagc 180aaggcactgg cacagctcca gggcaacgga gagatggtcg ccgtggcgct ccccgacgcg 240caggtcaccg aactggtcgc cgagtgggat ctggacctgg acatcgcggt cgtcaacggc 300cctcgttcga cggtcgtcgc gggccccacc gaggccgcga cagccttggt ggagcggctg 360cgggaccggg acgtgcgggc cacactgctg cccatcggga tcgccgggca ctcgcggcgc 420atggagcccg cccacgcata cctggtacag gaggcctcgg cggtacggcc gcgtgccacc 480gggatacccg tgtacacgtc cacgacgacc gatcctctcg acaccggcga cctggacgcc 540gagcactggt tccacagcct tcgggagccc gcccggttcc agcaggtcat cgaggaactg 600ctcggccagg gccaccgggt gttcgtggag atgagcccgc acccggtgct cgccctgtcg 660atcgaggaga ccgccgcgca cctcggccgg gacgtcgtcg tcctcgaaac gatgcgtcgt 720gacgacgcgg gccacgaccg ctacctacgc gccctggccg aggcacacct gcacggcgtc 780gcccccgact ggagcaccgt cctccccgac gcacgccgcg tcacgctgcc tccgtaccgg 840ctcgacctgg acacggcgga cgccgccggc agcggcggca ccgagccggg cgccggactc 900cgcgagcggc tgctgggggt cgccccggaa cgacgcatcg aagaggccgt acgcctcgtg 960gtggacgccg tggccgcgca catcgagccg tcggcgacgg ccatcggcgc ggaccaggcg 1020 ttccggtcgc tgggggtgga ctccgcgggc gccctccggg tccgcaaccg gctggtcgag 1080acgaccgggc tgcggctgcc cgcgacgatc ctgttcgacc accccactcc gcgcgcgctg 1140gcggaggaac tg 1152所述的磷氮霉素基因簇中合成环己基甲酰辅酶A的生物合成基因pnP1-pnP4基因的核苷酸序列如下：

gacaccgacg ccatcgaatc ggcgaccgcc gaagaacttc tcgcattcgt cgagaagcat 60ttcgactagt tccccggtcc cgcgcaggag cgggaccgcg ccgcagcatt aggggccact 120aggggttagt gaatcgatcc aataccggag agcattcatc aagaggatct gcgaaatgcc 180taggagtgaa catatcccat gcaccttctc gtcaagggag ttcagcaccg gatttccagc 240gaaatcctcg taccgaactc caaatatcat gcacaccgtg cgctgatcct cgcttcgctc 300gcggacggag agagccgcat ccacggcctg tccgacgccc ggcacgtcga gtacaccgtt 360cggctgctgc gcgacctcgg cgtacagatc gtccgcgagg gcgacacctt tgtggtgcgg 420gggctcggcg gccactaccg gccggtccgg gacaccgtct cggccggcag ctccggcacc 480accctctatt tcatggccgg gctcgcgtcc ctgtcgaacc gcgcggtcac gatcaccggg 540cagaaatact ttcggaaacg ccccgtgggt ccgctgctgc gcgcgctgga acagctgggc 600gtacgcctgg agtcggtaaa tgactgcccg cccattcagg tccgaagcca gcggcccacg 660ggcggcgagg tgaccattcc gggcaccttg tcccagtgga tatccggcct gctgctgctc 720 gcgccgttcg ccaccggccc caccgtcatc accgtggcgg gcacgctgaa cgaacgcacc 780tatctggagc tgaccgtcgc gatgatgcgg cagttcggcc tggaagtgac cgtggccccc 840gactggcggc gcttcgacgt ggcgccgcac cagagcgtgc ggcccaccga gctgacgttg 900ccccccgaca tcggttccgc ggccttcgcc gtcgccaccg ccgcgctgca cccctccgac 960gtactcctgc gcggtatgcc gagcctgacc ggtggccccg ccgaccaccc cgagttccac 1020ttcatcgaca tagcacgctc gatgggtgtc cccatggaac tggacccggt ggccggcggt 1080gtccggatcc agcaggacgc cccgctgctg aaggccgtcg acgtcgactg ccgtgacgtg 1140ccggacatgc ttcccgtcct gtccaccctc gccaccttcg cgcacggcga gtcggtgttc 1200cacaatgtcg cgcacacccg gctgaaggag tccgaccggg ccggcgcgat gctccagctc 1260aactccatgg gcgccgcact ggagttggcc gacgacaccc tgcgggtgac cggggtggac 1320ggtctggtcg gcgcggagct gtcgtcgtac aacgaccacc gggtgctgat gtcgctggcc 1380gtcgccgcct cacgcgcccg gggccactcc acgctgacct acccccacgc ctaccgcatc 1440tcgtatccgg gcttcctcga catgatgaat gccgtcgggg tgccgacgtc cgtggagaag 1500ggccccggac gctccgccag gagccgtgcc cgcacacccg tccggcccgt cgcggacccg 1560gaccacgcct gccaggtcac cttgccggag tggctggccc ggcacgcggc gtcccgcccc 1620 ggggacaccg ccctcgtgga cgtacgcccg gacggcgact ccgtcgtcac ctggagcgag 1680ctggccggcc aggtggacaa ggccgccgcg ctgctgctcg aactcggcgt gcagccgggc 1740gagaacgtgg cgtaccagtt gcccaaccgc ctggagtgcg tggtgctgtc gctggcggcc 1800ctgcggatcg gcgccgtctg ctgtccgatc attccgttct tccgggaacg cgaactcggc 1860ttcgttctgc gccgctccgg ggcccgcgtc ctcgtcgtca tggacgagta ccggtcccgg 1920cgccccgcgg aggaggcact cgccctcgcc gcgaccggtg gcccggacac ggcacacctg 1980gagcatgtcg tggtgctggc ccggtcggcc ggcggcagcc gactgccgca gccgcctccg 2040aacggcgtcc gcctgtacga ctgggggacg gccctgaaga cgacgacggt cgaccgggcg 2100gccctcgacg cgatccaccc gacggccgag acgacggcgc agctgctgtt cacctcgggc 2160accaccggcg agcccaaggg ggtcatgcag ccgtcctcgc acctggtccg ggccgtctcg 2220atggagatcc ggcatctcgg cctcggtccc gaggacgccg tctgggtgcc gtctccgctc 2280tcccaccaga ccgggttcct gtacgggatg acgctggcga ccgtgctggg cgtgccccag 2340atcctgcagt ccgagtggga cgcgcggcgc gccctcgtct cgctgaacac gcaccgggcg 2400acgttcgtcc aggccgccac gccgttcctg gccgacctgg tgaaagcggt cgaggagatc 2460ggcgaggcgc cccggcatct gcggatcttc gtggccaccg gcgccaccgt gccccgctcg 2520 ctggccgagc acgcgagcga ggtgctgggc acgaaggtgt gcggcgcctt cggcaccacc 2580gaaacctgcc tcggcgcgat gtccacgccg accgacgcac cggagcggcg ctggggcacc 2640gacgggcggg tcctcgacgg cgtacggcta agggtcaccg acgaccaggg cgaggtgctg 2700gcaccgggcg ccgagggcaa cttcgagatc ctctcgccga cgacgttcga ggggtatctc 2760gaccgccccg acctgaccgc ggaggccttc accccggacg gctggttccg caccggcgac 2820ctcgcggtga tcgacgagtc gggctacgtc cgtatcaccg gccggatcaa ggacgtgatc 2880aaccgcggcg gcgagaagat ccccgtcgcc gagatggagc agctgctgtt cggtcacccc 2940gccgtcgacg acgtggccat cgtggccatg cccgacgagc ggctcggcga gcgtgcctgt 3000gcgttcgtcg ttctcaagga cggcgcgctg ctcggcttcg aggagatgtg ccactacctg 3060gacgggcacc aggcagccaa gcagtactgg ccggaacggc tccagctcgt tgcggacctc 3120ccgcgtaacc cgatcggcaa ggtccagaag ttcgaactgc gggccagggc acgccacctg 3180cgcccccata ccgtgcagtg acaggagaag acggagtgcg acagatgatg gacgggcagc 3240agttcaacaa ggtccgtgac gcggtcgagc agtgggtgga aggcccgggc gagcgctggg 3300ccgaacacat cgaggagacc ggggaggtac ccgaggcggt gtggaccgag ctcaacgagc 3360tcgggttcct gcggctcgcc gccccggtgg agtacggcgg ccagggcatc gggttcaccc 3420 ggtggatgga actgatggag gtcttctccc gctcccacgg ttccctgcgc atgatcgtgc 3480acgtcgtcaa cggcatctgg cggtcgatgg acggtcacgc ctccgacgac cagcgcaagc 3540ggttcgtcgt gccgtcggtc ctgggcgaga tcaagatcgc gttcgccctg accgagccgg 3600gcaacggcac cggagcggac atcacgacct cggtggtccg cgagggcgac acctactacc 3660tgtcgggccg caagcacttg atcacgttcg ggatgcgctg tgactactac ctcctggcgg 3720cgcgcgtcgc gggcacgacg ggccacgagg gcaccgtcgc cctgctggtg ccgcgggacg 3780cgcccggagt acgggccgaa gactcctccc acacgatggg cgtcaccggt accgaccacg 3840cctcgatcgt cttcgaccgc accccggtgc ccgtggacca ccggctcggc gaggagggcc 3900aggggctgga ggtgtttctc ggcggattcc tcaccccgtc gcggatatcc gtcgcgatga 3960gctgcgtcgg cctcgcccaa cgcgcccagc aactcgccgt cgactacgcc cgctcccggg 4020tgaccttcgg caaagcgctg acagagcgtc aggccattca gttcatgctc gccgagaacg 4080cggcggacat cgaggcggcc cgacagctcg tgctgcacgc cgcgcgccgc ttcgaggagg 4140gcgccgacga cgcatccatg cagtcctcga tggccaagat gcacgcggtg acgatgctga 4200ccaccgtcac cgacaaggcg ctgcaggtcc acggcgggct cggctactgg aagtcccaga 4260agatcgagcg cgtctaccgt gacgcccgcg cgcagcgctt cgaggagggc cccaacgagg 4320 tgcaaaaggc cgtggtcttc cgcgaactgc tgcaacaggc cgcaaccgtc accccaggag 4380ccgcgcgatg aacgacaacc gacaggacga cgcgaccggc ggcgccaaga tctccctcat 4440cacgggcgct tcgcgcggca tcggacgcgc ccttgcgctc accctggccc gccagggcgg 4500caccgtggtc gtcaactaca agaagaacgt cggcctggcc gagaagaccg tcgccgacat 4560cgaggaggcc ggcggccggg gcattgccgt ccaggccgac gtcgaaacga cggaaggcgt 4620cacggcgttg ttcgacgagg tctcccgtcg ctacggacgc ctggaccact tcgtctccaa 4680cgccgccgcc ggcgtcttca agaacatcct cgacctcggc cggcaccacc tggaccgctc 4740ctacgccatg aacctgcgcc ccttcgtgct gggcgcccag caggcggtca ggctcatgga 4800cgacggcggc cggatcgtcg cgctgtcgtc ctacggctcg atccgcgcct acccgacgta 4860cgccgcgctc ggcgggatga aggcggcgat cgaggcgtgg gtgcgttata tggcggtcga 4920gttcgcgccg tacggcatca acgtcaatgc ggtgaacggc ggcctgatcg attccgactc 4980gctcgcctac ttctacggcg tcgacggcat gcccgacatg cgcggcgtcc tggatcgcat 5040cccggccggg cgacccggca ccgtgcagga gatggccgac accgtcgcct tcctgctggg 5100tgcgggcgcc ggatatgtca caggccagac tctggtcgtc gacgggggcc tgagcgtggt 5160cgcaccgccg ttcttcgccg acgccggcga agcactgcgc ctgcctcccc gcccgacacg 5220 ggaaacctga gggaagaggg gcgtgcgcca tgtacgacca tgtcttccgg gccggcgcca 5280tcggcaccat gatgctcccg catcgcatcg tcatgggcgc catgcacctc aacctggaga 5340cccgagacga tgacggcgct gccctggccg cgttctacgc cgagcgcgcg gcagcgggcg 5400cggcgctcat catcaccggt ggcgtggcag tgaacgccgt gggcgcgggc ggcccggggt 5460acgcggtgat cggcgactcc cgggacaggg cggccctctc ggcggcggtg cgtgcggtgc 5520acgaccgcgg tggacggatc gcgcttcagc tctttcacgc cgggcggtac gcgcggcccg 5580gcgccggcga ggtggttgct cgccccgtcg ccccgtcgcc ggtgtacagc ggcttctccc 5640gctgcacccc ccgggagatg acccccgggg acatcaccac cacgatcgac gacttcgccg 5700agggtgcgtg caccgcgcgc gccctcggat tcgacgccgt ggaggtgatg ggctccgagg 5760gctatctgat caaccagttc acggcaccgc tgaccaacct gcgcgacgac gcgtggggcg 5820gtgacgccga acgacggcgc aggtttccgc tggaggtgct gcgcgcggtc cgcgcagccg 5880tgggccggga tttcccggtg ctcttccgca tctccgggaa cgacctggtg gcaggtggca 5940ctccgcccgg tgaggtcacc gcgctcgcgg tggcgcttgc cgacgccggg gccgacgcgc 6000tctccgtcgg cgtggggtgg cacgagtcac cggtgcccac cgtgcagtcc caggtccccg 6060ccggtacctg ggcggccgtc ggcaaggcac tgaaacgcgc gctgctggca gtcggccaca 6120 aggatgtcgc ggtgatcgcc gccaaccgca tccacgactt cgcgcaggcc gacgaagccc 6180tgtccggtgg cgagttggat ttcgtggcca tggcgcggcc gttcctggcc gacccggaga 6240tcgtcgccaa gtcggccgca ggccgccccg accaggtcaa tctctgcctc gcctgcaacg 6300aggcgtgcat cgaccgctcc ttcggcaccg acagggtgtc ctgcctcgtc aaccccagag 6360ccggccacga agaggagttt cccccaccgc agccggcccg ccaccgcagt gggctgttcg 6420gccgctacgc cgtgatcggt gcgggcatcg ccggactgga ggccgcccgc acactggccg 6480gcctcggcca ccatgtcgag gtgtacgaag cggcggcccg cgtcggcggt caattccggc 6540tggcctccca ggtgccggga aaggcggaat tcgccgagac catccgccac cacgtacggg 6600aactacggga agccggcgtg ccgttgcacc tgggccgtcg catcggcggc gaggacgtcc 6660cggagctgcg gtcgttcgac ggtgtggtgc tggccacggg tgtgcgcccc gccaggttgt 6720ccctgtccgg cgcggagctg ccccatgtac gggactacgc ccaggcgttc gccgatccgg 6780aggcgctcca cggacggctc gtcatcatcg gcgggggtgg catcgcagtc gatctggccc 6840acaccctgac cacggacccg gatgccaagg tgacgccgga ggagttcctg gcccggcatg 6900ccgtgcccga gaacgctccg cggcccggga cggaacccgc cgtccgtggc gcgctgcgcg 6960aggtgacgct gctgcggcgc ggcccacgga tcggagcggg catcggcccc agcacccgct 7020 gggtcgtcct gcggaacctg aagtccgccg gtgtacagat gctcaccggc gtgacctgcc 7080gggagatcac acccgccggc gtcatcgtca ctgacgcgga agggagagac cgctacctcg 7140acgccgacca cgtcgtgctt gcggtcggcc aggtcccggt acgacacctg gccccgctgt 7200tgcacgaggc cggtgtcccc gtcgtcaccg cgggcggcgc cgcgggaacg gacgggctca 7260acgccgtacg ggccacagcc gaaggcctgc gagcggcgca ccggataacc cgcgtcgccg 7320tggggtga 7328。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于用磷氮霉素聚酮合成酶起始模块的编码基因pnAT1ACP1基因置换除虫链霉菌中阿维菌素聚酮合成酶起始模块的编码基因包括如下步骤：

(1)：以除虫链霉菌的基因组为模板，采用PCR方法获得基因置换所须的左臂包括上游序列及部分相应基因序列约2kb；

(2)：以除虫链霉菌的基因组为模板，采用PCR方法获得基因置换所须的右臂包括下游序列及部分相应基因序列约2kb；

(3)：以包含磷氮霉素聚酮合成酶起始模块的编码基因pnAT1ACP1的粘粒为模板，采用PCR方法获得基因置换所须的目的基因约1.2Kb；

(4)：将得到的左右臂序列和目标基因片段通过相应的酶切位点克隆入pKC1139载体中构建成基因置换重组质粒；

(5)：将(4)获得的重组质粒以接合转移的方法转入除虫链霉菌中，经整合、松弛培养诱导发生双交换及筛选鉴定后完成目标基因替换。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于将磷氮霉素基因簇中合成环己基甲酰辅酶A的生物合成基因pnP1-pnP4在置换突变株中异源表达包括如下步骤：

(1)：以包含该基因的粘粒为模板，采用PCR方法获得基因异源表达所须的pnP1的部分序列约1kb；

(2)：以包含该基因的粘粒为模板，采用PCR方法获得基因异源表达所须的pnP4部分序列约0.8kb；

(3)：以包含该基因的粘粒为模板，采用酶切方法获得基因异源表达所须的pnP1以及pnP4基因余下部分序列还有完整的pnP2，pnP3序列约5.2Kb；

(4)：将得到的序列和红霉素启动子基因序列通过相应的酶切位点克隆入pSET152载体中构建成基因置换重组质粒；

(5)：将(4)获得的重组质粒以接合转移的方法转入阿维菌素生物合成起始模块替换的突变株中，经抗性筛选鉴定后完成目标基因异源表达。

说明书

一种改造除虫链霉菌产生多拉菌素的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程领域以及微生物学领域，涉及一类与多拉菌素生产相关的基因以及操作该类基因生产多拉菌素的方法。技术背景

[0002] 多拉菌素被誉为阿维菌素家族最为优秀的杀虫药物，是一种新型大环内酯类抗寄生虫药物，对线虫、昆虫和螨均具有高效驱杀作用。具有高效，用量小，安全范围高的特点，其生物活性相对阿维菌素，杀虫活性更高，而对人体以及牲畜的毒性更低，目前已经开始用于皮下注射。从化学结构上来讲其与阿维菌素的差别仅仅在于第25位取代基不同，阿维菌素Bla在第25位是一个2-甲基丁基，而多拉菌素在第25位是一个环己基，从生物合成的角度来看造成该部分结构不同的主要原因是催化形成该化合物的聚酮合成酶起始模块选择的底物不同。

[0003] 从阿维菌素生物合成过程来看，阿维菌素的起始模块包括一个酰基转移酶(AT)和一个酰基载体蛋白(ACP)，它们识别甲基丁酰辅酶A或异丁酰辅酶A作为起始单元。已有工作[Science(1998)279，199-202]表明阿维菌素生物合成的起始模块具有选择底物的宽泛性，目前多拉菌素的生产也正是利用了这一点，即通过中断起始单元的生物合成途径，然后在发酵过程中加入环己基甲酸作为起始单元来达到产生多拉菌素的目的。但由于起始模块的最适底物仍然是甲基丁酰辅酶A或异丁酰辅酶A，所以产物中经常混有阿维菌素。

[0004] 本发明针对上述方法的局限性，通过将阿维菌素生物合成起始模块替换成为来源于磷氮霉素生物合成的聚酮合成酶中的以环己烷羧酸盐为特异底物的起始模块[中国专利201010547279.7]，然后再将编码环己基甲酰辅酶A生物合成酶的基因在替换的突变株中进行异源表达，成功地得到了产多拉菌素为主的突变株。如果在发酵的过程中再添加环己基甲酸，通过加大前体的供应量，会使得产多拉菌素的量进一步提高，相对于原始菌株直接喂养环己基甲酸产生多拉菌素有了显著的提高，降低了所产组分的复杂性，并且所产组分主要是多拉菌素。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种改造阿维菌素产生菌生产多拉菌素的基因及方法。

[0006] 在本发明的一个方面，提供两种位于磷氮霉素生物合成基因序列以内的基因序列及其用途。通过在除虫链霉菌中将编码催化阿维菌素生物合成聚酮酶起始模块的基因替换成为编码催化磷氮霉素生物合成聚酮酶起始模块的基因，再导入编码催化形成磷氮霉素生物合成过程中所需的环己基甲酰辅酶A的酶的基因，提高了多拉菌素的产量，所述的基因选自：磷氮霉素聚酮合成酶起始模块的编码基因pnAT1ACP1基因和pnP1，pnP2，pnP3，pnP4，并且诉述的基因来自磷氮霉素生物合成基因簇[中国专利201010547279.7]。

[0007] 本发明的第二方面，提供一种通过增加前体的供应量来提高除虫链霉菌中多拉菌素表达量的方法。包括以下步骤：在除虫链霉菌基因组中引入编码催化形成环己基甲酰辅酶A的酶的基因，并且诉述的基因选自：pnP1，pnP2，pnP3，pnP4基因，在发酵培养基中添加环己基甲酸。

[0008] 在本发明的一个优选例中，所述的将目的基因在除虫链霉菌基因组上进行替换包括以下步骤：

[0009] (a)构建含有需要替换目标基因5和3’旁侧序列和磷氮霉素聚酮合成酶起始模块的编码基因pnAT1ACP1基因的替换载体。

[0010] (b)将含有基因取代载体的宿主菌株作为供体菌株，通过供体菌株-链霉菌接合转移的方法导入到除虫链霉菌中，得到含有基因取代载体的除虫链霉菌转化子。

[0011] (c)转化子经高温诱导得到单交换突变株，再将单交换传代后获得发生了同源双交换的重组除虫链霉菌突变株。

[0012] (d)所述替换载体中基因的5’端旁侧序列、磷氮霉素聚酮合成酶起始模块的编码基因pnAT1ACP1基因5’-3’序列和基因3’端旁侧序列按上述顺序且按上述方向顺次连接。

[0013] 用于构建替换载体的出发载体为任意一种大肠杆菌-链霉菌穿梭载体，如pKC1139，pKC505，pIJ653，pIJ8154，优选为pKC1139。以pKC1139为出发载体构建的基因取代载体为pWJb7381。

[0014] 本发明的另一优选例中，所述的将环己基甲酰辅酶A生物合成酶在除虫链霉菌替换突变株中异源表达包括以下步骤：

[0015] (a)构建含有编码环己基甲酰辅酶A全基因序列和红霉素启动子的异源表达载体。

[0016] (b)将含有基因取代载体的宿主菌株作为供体菌株，通过供体菌株-链霉菌接合转移的方法导入到除虫链霉菌中，得到含有基因取代载体的除虫链霉菌转化子。

[0017] (c)转化子经抗性筛选得到带有抗性的单克隆，再经传代考验其稳定性，得到稳定的突变株

[0018] (d)所需异源表达基因在其启动子区域连上红霉素启动子序列。按照PermE(红霉素启动子)-pnP1-pnP4的顺序连接。

[0019] 用于构建异源表达载体的出发载体任意一种大肠杆菌-链霉菌穿梭载体，如pKC1139，pKC505，pIJ653，pIJ8154，pSET152，优选为pSET152。以pSET152为出发载体构建的基因取代载体为pWJb835。

[0020] 本发明的另一优选例中宿主细胞为大肠杆菌细胞。

[0021] 本发明的第四个方面，提供了一种生产多拉菌素的方法，包括下面步骤：

[0022] (1)发酵本发明上述的经替换以及异源表达环己基甲酰辅酶A合成酶的除虫链霉菌；

[0023] (2)从发酵产物中分离多拉菌素。

[0024] 在本发明的一个优选例中，所述的被替换基因位于除虫链霉菌基因组中，且只有一个拷贝。

[0025] 本发明的一个优选例中，用于替换的基因以及意愿表达的基因均来自于磷氮霉素生物合成基因序列。

[0026] 在本方明的第六个方面，提供所述的经替换以及引入环己基甲酰辅酶A生物合成途径的除虫链霉菌的用途，其特征在于用于生产多拉菌素。

[0027] 本发明的其它方面由于本发明的公开内容，对于本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明：

[0028] 图1：阿维菌素生物合成基因起始模块替换设计。

[0029] Phoslactomycin B：磷氮霉素，Avermectin：阿维菌素，Doramectin：多拉菌素，Cyclohexanecarboxylic acid：环己基甲酸

[0030] 图2：替换除虫链霉菌中阿维菌素生物合成基因序列中aveAT1ACP1基因置换质粒pWJb7381的构建过程。

[0031] pWJb6-24-4，pWJb6-24-3，pWJb7-62，pWJb6-24-1，pWJb7381：自 命名重组 质粒；derived from pANT841：以载体pANT841出发构建derived frompGEM-5zf：以载体pGEM-5zf出发构建；derived from pKC1139：以载体pKC1139出发构建，derived from pAGe-1：以载体pAGe-1出发构建。酶切位点：HindIII，BglII，XbaI，XhoI。

[0032] 图3：异源表达环己基甲酰辅酶A的质粒pWJb835的构建过程。

[0033] pnP1，pnP2，pnP3，pnP4：编码环己基甲酰辅酶A合成酶的基因；primer 7，primer8，primer 9，primer 10：引物7，引物8，引物9，引物10；pWJb7981，pWJb7982，pWJb7942，pWJb7100，pWJb806，pWJb835：自命名重组质粒；derived from pANT841：以载体pANT841出发构建；derived from pGEM-5zf：以载体pGEM-5zf出发构建；derived from pSP72：以载体pSP72出发构建，derived from pSET152：以载体pSET152出发构建。酶切位点：HindIII，SpeI，BamHI，XbaI，EcoRI。PermE：红霉素启动子基因。

[0034] 图4：aveAT1ACP1基因置换突变菌株的PCR验证。用引物pnLDF：5′-TTTCTCGAGCGGGTCGAGGTGATCCAG-3’和引物pnLDR：5’-TTTAGATCTCAGTTCCTCCGCCAGCGC-3’扩增出约1.2Kb的序列，切胶回收后用pnLDF和pnLDR为引物测序验证。泳道1，3，7，9，10，11，12，15，18：1.2kb区域显示信号，泳道13：5000bp marker(从上到下依次为5KB，3Kb，2Kb，1Kb，750bp，
500bp)

[0035] 图5：最终突变菌株与野生型菌株发酵产物的分析对比。(A)HPLC图谱；(B)柱状对比图，1代表野生型，2代表最终突变株，均在发酵培养基内添加环己基甲酸(200mg/L)。Ave B2a：阿维菌素B2a组分，Ave Bla：阿维菌素Bla组分，Dor B2：多拉菌素B2组分，Dor：
多拉菌素组分。

具体实施方式

[0036] 本发明人经过广泛而深入的研究，发现了五个可用于改造除虫链霉菌(阿维菌素)生产多拉菌素的基因，所述基因为磷氮霉素聚酮合成酶起始模块的编码基因pnAT1ACP1，pnp1，pnp2，pnp3，pnp4基因。将所述的磷氮霉素聚酮合成酶起始模块的编码基因pnAT1ACP1基因在除虫链霉菌基因组中替换掉催化形成阿维菌素的合成酶的aveAT1ACP1，在发酵培养基中加入环己基甲酸，可大大提高多拉菌素的产量。基于以上完成了本发明。所述基因来自磷氮霉素生物合成的基因簇中。如本发明所用，所用到的基因编码的蛋白为参与磷氮霉素生物合成过程中骨架以及前体合成的次级代谢过程，新引入的基因不会影响除虫链霉菌的生长状态。

[0037] 在本发明中，所用的“pnAT1ACP1”是指在磷氮霉素生物合成过程中，编码催化磷氮霉素骨架合成过程中负责选择起始单元的选择的酰基转移酶和酰基载体蛋白的基因。其控制了磷氮霉素生物合成过程中所利用到的起始单元，并且本发明就是将该基因替换掉除虫链霉菌中阿维菌素生物合成过程中编码负责阿维菌素起始单元选择的模块基因，经替换后，不影响除虫链霉菌的生长状态。

[0038] 在本发明中，所用的磷氮霉素基因簇中合成环己基甲酰辅酶A生物合成的基因“pn1，pn2，pn3，pn4”是指在磷氮霉素生物合成过程中，编码催化形成起始单元环己基甲酰辅酶A的酶的基因，本发明将这四个基因按照从pn1-pn4的顺序，在起始区域加一个红霉素启动子后，构建到整合型载体pSET152后，导入到替换过的除虫链霉菌替换过的突变株中，形成最终的突变株，该途径的引入不会影响除虫链霉菌的生长状态。

[0039] 在本发明中，“除虫链霉菌”(Streptomyces avermitilis)是一种能够产生阿维菌素(avermectins AVM)的菌，并且经过改造只产阿维菌素B组分。

[0040] 在本发明中，大肠杆菌-链霉菌穿梭载体是指一类能由大肠杆菌转到链霉菌中的质粒，包括(但是不限于)pKC1139，pSET152。

[0041] 在本发明中，“基因转移”是指将外源的遗传物质由供体菌导入到受体菌内的过程，其可以通过转化、接合转移、转导、细胞融合等手段来实现。“接合转移”是指细菌通过性菌毛相互连接沟通，将遗传物质(主要是质粒DNA)从供体菌转移给受体菌。

[0042] 本发明用于替换的磷氮霉素生物合成酶起始模块基因pnAT1ACP1如核苷酸序列表序列1所示；

[0043] 本发明用于异源表达的磷氮霉素基因簇中合成环己基甲酰辅酶A生物合成的基因pn1-pn4如核苷酸序列表序列2所示。

[0044] 本发明提供的替换质粒的构建方法，系由载体和在多克隆位点上加入需要替换的目的基因旁侧序列和用于替换的基因序列组成，载体为大肠杆菌和链霉菌穿梭质粒，可以为pKC1139、p0J260、pWHM3等及其类似的载体。

[0045] 本发明提供的异源表达质粒的构建方法，系由载体在多克隆位点加入需要异源表达的目的基因和红霉素启动子基因序列组成，在题为大肠杆菌和链霉菌穿梭质粒，可以为pSET152等其类似的载体。

[0046] 进一步的描述如下：

[0047] 本发明的基因能够增强多拉菌素的生物合成，当将该类基因引入到除虫链霉菌中后(替换阿维菌素生物合成起始模块和直接导入编码环己基甲酰辅酶A生物合成酶基因)，可以提高多拉菌素的产量。并且本发明人选择了合适的接合转移载体，即带有温敏型复制子的质粒pKC1139，利用同源重组技术，得到了稳定的基因替换突变株，再通过利用稳定的整合型载体pSET152导入环己基甲酰辅酶A的生物合成途径，得到稳定的最终突变株。

[0048] 在检测阿维菌素产量时，可通过测量出发菌株和改良菌株产生的有效组分Bla(avemectin Bla)的含量为标准，检测多拉菌素的产生以及产量是否提高。

[0049] 本发明中所用于实施例或其他内容所显示的成分用量、反应条件等数字均为大约数值。因此除非文中特别注明，本说明书的上述数字参数均为近似值，其可根据所需得到的本发明的结果而加以变化。

[0050] 除特别说明外。文中所用到的专业术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或者均等的方法及材料均可应用于本发明的方法之中。实验中未注明的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述条件或者按照制造厂商所建议的条件。

[0051] 本发明的主要特点在于：

[0052] 1.发现了两种应用于改造除虫链霉产生多拉菌素的基因。

[0053] 2.发现将阿维菌素生物合成起始模块基因替换为磷氮霉素聚酮合成酶起始模块的编码基因pnAT1ACP1基因可以大大改善除虫链霉菌的多拉菌素的产量。

[0054] 3.发现将环己基甲酰辅酶A生物合成酶基因导入到替换突变株中可以进一步提高多拉菌素的产量

[0055] 4.发现在突变株发酵时往发酵培养基中加入环己基甲酸，可以抑制阿维菌素组分的产生，改善组分的数量。

[0056] 5.本发明采用接合转移的手段将替换质粒以及异源表达质粒导入到受体菌中，诱导发生双交换，得到了稳定的基因型突变株。

[0057] 下面结合具体的实施例来进一步说明本发明。应该理解的是，所用实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

[0058] 实施例中所用培养基，除特殊说明外，液体均用YEME培养基，固体均用MS培养基。

[0059] 实施例一：替换aveAT1ACP1基因

[0060] 1：左右交换同源臂的获得

[0061] 以Streptomyces avermitilis的基因组为模板，采用引物5’-TTTAAGCTTACGCCCGGCGCGGGCTGAG-3’和引物5’-TTTCTCGAGCCCGGGAGCGTCCGGCGAG-3’扩增得到左臂约2kb的PCR产物，平端连入pGEM-5zf的多克隆位点中的EcoRV切口中，再用引物5’-TTTAGATCTGCGGCGCTCGGCCACCTC-3’和引物5’-TTTTCTAGAATCCCCCGCGTCCCGGCG-3’得到右臂约2kb的PCR产物，平端连入pANT841的多克隆位点StuI切口中。

[0062] 2：磷氮霉素聚酮合成酶起始模块的编码基因pnAT1ACP1片段的获得[0063] 以包含有该段基因的粘粒为模板，采用引物5′-TTTCTCGAGCGGGTCGAGGTGATCCAG-3′和引物5’-TTTAGATCTCAGTTCCTCCGCCAGCGC-3′扩增得到约1.15Kb的PCR产物，平端连入pGEM-5zf的多克隆位中的EcoRV切口中。

[0064] 3：重组质粒pWJb7381的获得

[0065] 将左臂从载体中用核酸内切酶HindIII和XhoI切出来，将右臂用核酸内切酶BglII和XbaI从构建的质粒中切出来，将磷氮霉素聚酮合成酶起始模块的编码基因pnAT1ACP1从载体中用BglII和XhoI切出，所得到的片段一起连入用HindIII和XbalI切好的pKC1139中，具体构建可见附图1。

[0066] 4：替换aveAT1ACP1基因突变株的获得

[0067] 将用于替换的重组质粒pWJb7381转入到大肠杆菌ET12567中，通过大肠杆菌和链霉菌之间的属间接合转移将重组质粒导入到链霉菌中，37℃整合后松弛诱导发生双交换，双交换突变株利用PCR验证，基因型验证结果见图2，由于替换的基因片段本身与原来的基因相差不大，因此将扩增出的目标带回收后测序验证，得到突变株2。

[0068] 实施例二：导入环己基甲酰辅酶A的生物合成途径

[0069] 1：基因片段的获得

[0070] 以包含该基因片段的粘粒为模板，用引物5’-AAGCTTACCGACGCCATCGAATCG-3’和引物5’-CCTGCTGGATCCGGACAC-3’扩增得到pnp1的5’端约1Kb的片段，平端连入到pANT841多克隆位点中的StuI切口中。用核酸内切酶BamHI和EcoRI切上述模板粘粒，得到一条包含了pnp1的3’端一部分以及完整的pnp2，pnp3和pnp4的5’端一部分共5.482Kb的片段，将其连入到pSP72多克隆位点中的BamHI和EcoRI双酶切切口中。用引物
5’-GGCGGAATTCGCCGAGAC-3’和引物5’-TCTAGACGCACGTTCTCACCCCAC-3’，以上述粘粒为模板，扩增得到pnp4余下的部分约800bp序列，平端连入到pGEM-5zf多克隆位点中的EcoRV切口中。

[0071] 2：红霉素启动子基因序列的获得

[0072] 用核酸内切酶HindIII和EcoRI切含有红霉素启动子的质粒pLL6214，得到约500bp的红霉素启动子序列

[0073] 3：异源表达质粒pWJb835的构建

[0074] 将pnp1的5’端用HindIII和BamHI切出来，包含有pnp1余下部分，pnp2，pnp3以及pnp4的5‘端一部分的片段用BamHI和EcoRI切出来，三片段连入到载体pGEM-3zf的多克隆位点中的HindIII和EcoRI双酶切切口中，再将连好的这个片段(包含完整的pnp1，pnp2，pnp3以及pnp4的5’端的片段)用HindIII和EcoRI切出来得到约6.5Kb片段，将pnp4的3’端从克隆载体中用XbaI和EcoRI切出来，将这两个片段连入到pGEM-3zf的多克隆位点中的HindIII和XbaI双酶切切口中。再将这个质粒用HindIII和XbaI切出来得到约7.3Kb(包含完整的pnp1-pnp4)的片段，连同红霉素启动子基因序列(用HindIII和EcoRI切出)，连入到pSET152多克隆位点中的XbaI和EcoRI双酶切切口中，得到最终重组质粒pWJb835。

[0075] 4：最终突变株的获得

[0076] 将用于异源表达的重组质粒pWJb835转入到大肠杆菌ET12567中，通过大肠杆菌和链霉菌之间的属间接合转移将重组质粒导入到链霉菌突变株2中，得到带有阿布拉抗性的突变株，这就是最终突变株。

[0077] 3：突变株和原始出发菌株产多拉菌素效价比测定

[0078] 在相同发酵条件下对比出发菌株和突变后的菌株产多拉菌素Bla的量分析。

[0079] 将保存好的孢子解冻后，涂于平板培养基上，平板培养基配方为：葡萄糖(国药集团化学试剂有限公司)1.5％、天门冬酰氨(华美生物工程公司)0.05％、进口牛肉浸膏(中国医药(集团)上海化学试剂公司)0.3％、磷酸二氢钾(天津市化学试剂六厂)0.05％、琼脂1.8％。30℃培养五天后，用打孔器取一小块放到种瓶内。

[0080] 种子培养基配方为：玉米淀粉3％、豆粕粉0.8％、花生饼粉1％、酵母浸提物0.4％、氯化钴(中国医药(集团)上海化学试剂公司，1％的溶液)0.3％、淀粉酶4μ/g淀粉。

[0081] 配制时先将玉米淀粉糊化(玉米淀粉用少量水溶解，加入淀粉酶，搅拌均匀，倒入约1/2总量的沸水中，煮沸)，加入其他原料(也用冷水调匀)，定容后调pH值6.8～7，分装40ml/250ml三角瓶，121℃灭菌25min。28℃，200rpm培养两天后，吸取1.5ml到摇瓶中。

[0082] 发酵培养基配方为：玉米淀粉14％、豆粕粉2.8％、酵母粉1％、钼酸钠(1％)2.2‰、硫酸锰(0.1％)2.3‰、硫酸铵(5％)5‰、氯化钴(1％)2‰。

[0083] 配制时先将玉米淀粉用冷水溶解调匀，加入淀粉酶(1.5～2单位没克淀粉)，水浴加热，变稀后计时保温12min(在升温过程中，料液会由乳白色变为半透明浆糊状，此时开始计时)，取出，加入其它原料(先用冷水调匀)，加入环己基甲酸(200mg/L)，定容，调pH至7.5，然后加入碳酸钙0.8‰，搅拌均匀，边搅拌边分装30ml/250ml三角瓶，121℃灭菌25min。

[0084] 摇瓶在28℃，200rpm的条件下培养十天，取1ml菌液，加2ml甲醇，超声10min，离心取上清，HPLC检测。

[0085] 检 测 条 件 为：检 测 波 长：UV ＝ 245nm；柱 子：VARIAN 250/4.6SN282566MICROSORB-MV 100-5C18R008620005；流动相条件：v＝1mL/min；A溶液＝H2O；B溶液＝CH3OH；洗脱条件为85％B，15％A，洗脱时间为20min。

[0086] 分析HPLC结果可以看出，原始出发菌株多拉菌素的产量约为15ug/ml，突变株的产量为60ug/ml，增产为300％。具体的HPLC图谱以及产量对比柱形图见附图5。