一种内参内置型双荧光素酶报告载体及其应用

摘要

本发明公开了一种内参内置型双荧光素酶报告载体及其应用。萤火虫荧光素酶基因融合到pRL-TK载体的海肾荧光素酶基因和氨苄青霉素抗性基因之间，两种荧光素酶处于同一个载体上，萤火虫荧光素酶基因作为内参。利用一步式二元搭桥耦联长距离PCR及大肠杆菌体内同源重组方法,将萤火虫荧光素酶基因和海肾荧光素酶基因置于同一个载体上,同时在海肾荧光素酶基因的3’非翻译区引入单克隆位点以方便目的片段的克隆,由此构建成内参内置型的双荧光素酶报告载体。本发明具有重复性高,复孔变异小,操作简便,定量准确的优点。本发明适用于微小RNA靶分子的筛选、鉴定和确认,也适用于在细胞水平定量分析微小RNA的活性变化。

权利要求

1.一种内参内置型双荧光素酶报告载体，其特征在于，萤火虫荧光素酶基因融合到pRL-TK载体的海肾荧光素酶基因和氨苄青霉素抗性基因之间，两种荧光素酶处于同一个载体上，萤火虫荧光素酶基因作为内参；所述内参内置型双荧光素酶报告载体序列为SEQ ID No:4所示。

2.权利要求1所述内参内置型双荧光素酶报告载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：根据萤火虫荧光素酶基因和报告载体pRL-TK的序列, 设计、合成嵌合体引物pF-Fluc,pR-Fluc和P1R；其中，pF-Fluc为5’AAGGATCCAGGTGGCACTTTTCGTGCGATCTGCATCTCAATTAG3’,pR-Fluc为5’GAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACCTCACATGTTCTTTCCTGC3’P1R 为5’CGAAAAGTGCCACCTGGATCCTT3’；

以pGL3-promoter为模板，实施一步二元式搭桥耦联长距离PCR方法,获得萤火虫荧光素酶基因和报告载体pRL-TK的融合线性片段；

Dpn I 消化PCR产物,去除带甲基化的模板质粒DNA； 转化大肠杆菌菌株DH5α；

挑取单克隆菌落测序鉴定；

酶切确认重组质粒的整合情况。

3.权利要求1所述的内参内置型双荧光素酶报告载体在微小RNA靶分子鉴定中的用途。

4.权利要求1所述的内参内置型双荧光素酶报告载体在测量微小RNA的生物学活性中的用途。

5.权利要求1所述的内参内置型双荧光素酶报告载体表达活性的评价方法，其特征为，在哺乳动物细胞系中转染不同浓度的该报告载体，通过检测荧光素酶活性来测试其表达特性以及线性范围。

6.如权利要求5所述的评价方法，其特征在于，哺乳动物细胞系为人宫颈癌Hela细胞、非洲绿猴肾细胞Vero或小鼠肌原细胞C2C12。

说明书

一种内参内置型双荧光素酶报告载体及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学与细胞生物学领域，涉及一种用于微小RNA(microRNA)靶分子鉴定和活性分析的报告载体。

背景技术

[0002] 微小RNA(microRNA)是一类长约19～25nt、能在转录后水平负调节靶mRNA表达的小分子单链非编码RNA(CHIANG，H.R.；SCHOENFELD，L.W.；RUBY，J.G.；AUYEUNG，V.C.；SPIES，N.；BAEK，D.；JOHNSTON，W.K.；RUSS，C.；LUO，S.；BABIARZ，J.E.；BLELLOCH，R.；
SCHROTH，G.P.；NUSBAUM，C.andBARTEL，D.P.(2010).Mammalian microRNAs：experimental evaluation of noveland previously annotated genes.Genes Dev，vol.no.p.doi：
gad.1884710[pii]10.1101/gad.1884710.)。它们广泛存在于真核生物体内，参与生物体发育过程中细胞分化、增殖、凋亡等多种生理病理途径的调控(SONG，G.；ZHANG，Y.andWANG，L.(2009).MICRORNA-206 targets NOTCH3，activates apoptosis，inhibitstumor cell migration and foci formation.J Biol Chem，vol.no.p.doi：M109.046862[pii]10.1074/jbc.M109.046862.)。目前普遍认为，miRNA及其靶mRNA结合的特异性主要由“种子序列(seed sequence)”(guide strand的第2至第8个核苷酸)调控(BRENNECKE，J.；STARK，A.；RUSSELL，R.B.and COHEN，S.M.(2005).Principles ofmicroRNA-target recognition.PLoS Biol，vol.3，no.3，p.e85.doi：10.1371/journal.pbio.0030085.)。已有证据表明，miRNA识别靶标mRNA序列的特异性并不是很高。在动物体内，微小RNA与靶分子序列不需要完全互补即可发挥作用，有研究者指出，有一些miRNA的靶mRNA可以多达数百种(BACKES，C.；MEESE，E.；LENHOF，H.P.and KELLER，A.(2010).A dictionary on microRNAsand their putative target pathways.Nucleic Acids Res，vol.38，no.13，p.4476-4486.doi：
gkq167[pii]10.1093/nar/gkq167.)。因此如何快速准确的筛选和鉴定微小RNA的靶分子是目前微小RNA研究领域的最大瓶颈。目前已有多个报告系统用于实现上述目的，其中最常用的是双荧光素酶报告基因系统(BARTEL，D.P.(2009).MicroRNAs：target recognition and regulatory functions.Cell，vol.136，no.2，p.215-233.doi：S0092-8674(09)00008-7[pii]10.1016/j.cell.2009.01.002.)。现有的双荧光素酶报告系统包括两个单独的载体，一个含有海肾荧光素酶基因(Renillaluciferase，Rluc)，在其3’UTR含有多克隆位点，用于克隆预测靶基因的目的片段；另一个含有萤火虫荧光素酶基因(Firefly luciferase，Fluc)，用作转染和数据标准化的内参。因此，这个报告系统需要制备，转染两个载体，其缺点显而易见：(1)步骤较为复杂，无形中增加了物质成本和劳动量；(2)重复性差，批次内差异和批次间差异较大，结果不稳定，易造成误判。针对上述缺陷，我们设计了内参内置型荧光素酶报告载体，利用一步式二元搭桥耦联长距离PCR及大肠杆菌体内同源重组方法，将萤火虫荧光素酶基因和海肾荧光素酶基因置于同一个载体上，同时在海肾荧光素酶基因的
3’非翻译区引入多克隆位点以方便目的片段的克隆。相比现有技术，本发明具有重复性高，复孔变异小，操作简便，定量准确的优点。本发明的内置型双荧光素酶报告载体适用于微小RNA靶分子的筛选，鉴定和确认，也适用于在细胞水平定量分析微小RNA的活性变化.发明内容

[0003] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种内参内置型双荧光素酶报告载体，使其不仅可以用于微小RNA靶分子的筛选，鉴定和确认，同时也可以作为生物感应器，测量体内微小RNA的生物学活性。

[0004] 本发明首先提供一种内参内置型双荧光素酶报告载体，萤火虫荧光素酶基因融合到pRL-TK载体的海肾荧光素酶基因和氨苄青霉素抗性基因之间，两种荧光素酶处于同一个载体上，萤火虫荧光素酶基因作为内参，序列为SEQ ID No：4所示。

[0005] 本发明还提供上述内参内置型双荧光素酶报告载体的构建方法。该方法包括以下步骤：

[0006] (1)根据萤火虫荧光素酶基因和报告载体pRL-TK的序列，设计、合成嵌合体引物pF-Fluc，pR-Fluc和PiR；其中，pF-Fluc为

[0007] 5’AAGGATCCAGGTGGCACTTTTCG

[0008] pR-Fluc为

[0009] 5’GAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCAC

[0010]

[0011] P1R为5’CGAAAAGTGCCACCTGGATCCTT3’

[0012] (2)实施一步二元式搭桥耦联长距离PCR方法，获得萤火虫荧光素酶基因和报告载体pRL-TK的融合线性片段。

[0013] (3)Dpn I消化PCR产物，去除带甲基化的模板质粒DNA；

[0014] (4)转化大肠杆菌菌株DH5α；

[0015] (5)挑取单克隆菌落测序鉴定；

[0016] (6)酶切确认重组质粒的整合情况。

[0017] pF-Fluc引物的5’端部分与P1R为反向互补序列(实际为同源序列，是在细菌体内发生同源重组产生重组质粒的关键元件)，其3’端部分与萤火虫荧光素酶基因的5’端退火；pR-Fluc引物的5’端部分与pRL-TK基因的插入位点的序列互补，其3’端部分与萤火虫荧光素酶基因的5’端退火。

[0018] 按照上述引物设计，通过实施一步二元式搭桥耦联长距离PCR大量扩增萤火虫荧光素酶基因与报告载体pRL-TK的线性融合片段。该反应的体系组成和条件为：

[0019] (1)成分 初始浓度 用量 终浓度

[0020] PCR buffer 10× 5μl 1×

[0021] dNTP 2mmol/L 5μl 200μmol/L

[0022] 硫酸镁MgSO4 25mmol/L 2μl 1mmol/L

[0023] KOD plus 1unit/μl 1μl 0.02unit/μl

[0024] pF-Fluc 10μmol/L 4μl 800nmo/L

[0025] pR-Fluc 10μmol/L 1μl 200nmo/L

[0026] P1R 10μmol/L 3μl 600nmo/L

[0027] pGL3-promoter 25ng/μl 1μl 0.5ng/μl

[0028] pRL-TK 50ng/μl 1μl 1ng/μl

[0029] 双蒸水 28μl

[0030] 总体积 50μl

[0031] (2)实施PCR反应的参数如下：

[0032] 预变性 95℃ 2min

[0033]

[0034] 上述PCR产物经限制性内切酶Dpn I消化去除携带甲基化的模板质粒，只保留了新生成的线性融合片段，再转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，允许该片段在大肠杆菌体内以同源重组的方式产生重组质粒。

[0035] 本发明的内参内置型双荧光素酶报告载体，可以用于微小RNA(microRNA)靶分子鉴定。萤火虫荧光素酶基因(内参基因)和海肾荧光素酶基因(报告基因)被置于同一个载体上，且各自含有独立的启动子和终止子，不含有任何额外的人工碱基，这保证了二者在细胞内可以正常表达不会相互干扰，同时简化了转染步骤降低了实验成本，即在实施荧光素酶检测的时候只需要转染一个载体。

[0036] microRNA的靶分子片段可以通过XbaI和ApaI限制性位点克隆到海肾荧光素酶基因的3’UTR，通过以海肾荧光素酶基因作为报告基因来检测特定microRNA与靶分子的调控情况。

[0037] 本发明的内参内置型双荧光素酶报告载体，还可以作为生物感应器，测量体内微小RNA的生物学活性。通过在哺乳动物细胞系中以不同品牌的转染试剂转染该双荧光素酶报告载体，以检测荧光素酶活性来判断内源表达的microRNA的活性抑制效果。

[0038] 本发明还提供了验证此报告载体生物学活性的评价方法。通过在哺乳动物细胞系中转染不同浓度的该报告载体，以检测荧光素酶活性来判断该报告载体的活性线性范围。

[0039] 所述的哺乳动物细胞系包括人宫颈癌Hela细胞，非洲绿猴肾细胞Vero，小鼠肌原细胞C2C12。

[0040] 本发明通过将萤火虫荧光素酶基因(内参基因)和海肾荧光素酶基因(报告基因)置于同一个载体上，构建成内参内置型的双荧光素酶报告载体，从设计理念和技术层面上克服了现有荧光素酶报告系统的不足，避免了转染多个质粒的繁琐步骤，提高了实验的重复性和可靠性。

[0041] 与现有技术手段相比，本发明具有如下的优势和益处：

[0042] 1、简化操作步骤，降低实验成本；

[0043] 2、增大实验通量，提高实验结果的重复性和可靠性；

[0044] 3、萤火虫荧光素酶基因(内参基因)和海肾荧光素酶基因(报告基因)被置于同一个载体上，各自含有独立的启动子和终止子，活性稳定，线性范围宽广，完全满足microRNA靶标鉴定和活性分析的需要；

[0045] 4、预留限制性内切酶位点XbaI和ApaI，方便将目的基因克隆到海肾荧光素酶基因的3’UTR；

[0046] 5、适用于多种细胞系统，适用范围广，应用前景大；

[0047] 6、定量准确。

[0048] 除非特别指出或是单独定义，本文所使用的科学和技术术语具有本发明所属领域技术人员共知的、无歧义的相同含义。本文所提及的所有已公开的专利申请和参考文献均已通过完整引用的方式并入本申请中。另外，本文所述的材料、方法以及实施案例本意在于说明和阐述而非限制或限定。

附图说明

[0049] 本发明的上述目标和其他目的，特点和优势可显而易见地从下面对本发明优选方案的详细描述和附图示出的内容得到。附图所要传达的准确信息在本说明中得到详细阐述，每副附图中所用参考符号代表的意义在本说明中也被明确规定。附图并不一定是按比例示出，其重点在于描述本发明的效果和优势。附图所表达的实验结果和实践形式对于本领域专业科技人员来说是易于理解的、可以重复验证的。

[0050] 图1描述的是生物感应器构建原理

[0051] 为了克服现有报告系统的缺点和不足，计划将萤火虫荧光素酶基因融合到报告载体pRL-TK的海肾荧光素酶基因和氨苄青霉素抗性之间，以得到同时表达两种荧光素酶的单一质粒载体，从而构建成内参内置型双荧光素酶报告载体即microRNA的生物感应器。考虑到采用酶切-连接的方法无法完成上述目标，因此采用了不依赖于连接酶的克隆方法。首先根据萤火虫荧光素酶基因和pRL-TK载体的序列，设计、合成嵌合体引物：pF-Fluc，pR-Fluc和P1R；pF-Fluc引物的5’端部分与P1R为反向互补序列(实际为同源序列，是在细菌体内发生同源重组产生重组质粒的关键元件)，其3’端部分与萤火虫荧光素酶基因的
5’端退火；pR-Fluc引物的5’端部分与pRL-TK基因的插入位点的序列互补，其3’端部分与萤火虫荧光素酶基因的5’端退火。按照上述引物设计，通过实施一步二元式搭桥耦联长距离PCR即可大量扩增萤火虫荧光素酶基因与报告载体pRL-TK的线性融合片段.上述PCR产物经限制性内切酶Dpn I消化去除携带甲基化的模板质粒，只保留了新生成的线性融合片段，再转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，允许该片段在大肠杆菌体内以同源重组的方式产生重组质粒。经过夜培养后挑取单克隆菌落测序验证和酶切鉴定。嵌合体引物设计和一步二元式搭桥耦联长距离PCR是本技术的核心所在，其主要用处包括两个方面：一是使目的基因与目的载体在预定位点融合成为线性片段，二是利用长距离PCR大量扩增获得此类融合线性片段，以保证得到高阳性率的重组质粒。这样得到的重组质粒本身不含有任何额外的人工碱基，有利于在同一个载体上同时表达两种报告基因。

[0052] 图2一步二元式搭桥耦联长距离PCR扩增萤火虫荧光素酶基因与报告载体pRL-TK的线性融合片段

[0053] 萤火虫荧光素酶基因的长度为2.4kb，报告载体pRL-TK的长度是4kb，二者融合成为线性片段的长度是6.4kb。在实施一步二元式搭桥耦联长距离PCR时，pRL-TK的添加量设置两个梯度，分别是10ng和50ng。从1％琼脂糖凝胶电泳结果分析，两个反应均可以成功扩增出6.4kb的线性融合片段，而且随pRL-TK添加量的增加，线性融合片段的产量也随之增加。M是1KB分子量标准。图中2.4kb条带即是萤火虫荧光素酶基因，6.4kb的条带即是预期的线性融合片段。

[0054] 图3酶切鉴定重组质粒的整合情况

[0055] 重组质粒经测序分析后得到正确的重组子，命名为pFila(plasmidFirefly Renilla)载体。为了进一步确认其真实性，采用XbaI单酶切鉴定的方法。pFila含有单一的XbaI限制性位点，经XbaI酶切后线性长度是6.4kb。由1％琼脂糖凝胶电泳结果分析，酶切后的条带长度与理论分析相符。”-”表示不加XbaI内切酶样品，即环状重组质粒。

[0056] 图4pFila载体图谱

[0057] 根据理论设计和测序以及酶切鉴定结果，绘制了pFila的图谱.pFila的长度是6486bp，包含复制起始序列(ori)，氨苄青霉素抗性基因，萤火虫荧光素酶基因，海肾荧光素酶基因等结构元件。其中，萤火虫荧光素酶基因位于海肾荧光素酶基因和氨苄青霉素抗性基因之间，其本身是内对照，用于排除转染效率的差异导致的实验结果误差。海肾荧光素酶基因是目的报告基因，其3’UTR含有XbaI和ApaI多克隆位点，方便克隆microRNA的靶基因序列。

[0058] 图5表达活性及线性范围检测

[0059] 为了评价pFila作为双荧光素酶报告载体的可用性，测试萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶在细胞内的表达活性是主要检验手段。pFila以浓度梯度的形式转染人源宫颈癌Hela细胞，鼠源肌原细胞C2C12和猴源的非洲绿猴肾细胞Vero等三种不同种属来源的哺乳M动物细胞系。以Promega公司的DLRAssay试剂盒检测pFila的表达情况，确认其能够同时表达两种荧光素酶并检测是否处于一定的线性范围。由图示信息可知从10ng到320ng的宽广范围内，pFila均可以在三种哺乳动物细胞系中稳定表达萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶，而且二者的活性强度与pFila的转染数量成严格的线性关系。图中横坐标表示pFila的转染量，横坐标表示荧光素酶的活性绝对值(任意单位)。

[0060] 图6重现microRNA-16与其靶标CCNE1的调控作用

[0061] 为了评价pFila作为双荧光素酶报告载体是否可以用于microRNA与其靶分子的调控作用分析，选择microRNA-16及其已知靶基因CCNE1作为检测对象。图6A描述的是将CCNE1的3’UTR及其突变体克隆到pFila的XbaI和ApaI位点之间，形成含有microRNA-16靶基因的报告载体(分别命名为pFila-CCNE1-wildtype和pFila-CCNE1-mut1&2)。图6B描述的是将上述报告载体与microRNA-16模拟物一起转染人宫颈癌Hela细胞，检测靶基因的响应情况.pFila-CCNE1-wildtype在micro RNA-16模拟物存在的条件下，海肾荧光素酶的表达活性显著下降(p＜0.01)；与此相反，pFila-CCNE1-mut1&2在microRNA-16模拟物存在的条件下，海肾荧光素酶的表达活性得到回复(p＜0.01)。本实验同时设置靶向敲除海肾荧光素酶mRNA的小干扰RNA(siRNA)作为阳性对照。由此结果可知，pFila完全满足microRNA靶标鉴定和功能分析的需要。

[0062] 图7microRNA-16的抑制效果检测

[0063] 为了评价双荧光素酶报告载体pFila是否可以作为灵敏的生物感应器用于microRNA的活性分析，选择microRNA-16的已知靶基因CCNE1作为检测对象。本实验设置了四种不同品牌的转染试剂，分别是Lipofectamine2000，RNAiMAX，Fugene，Sofast，转染microRNA-16抑制物。以pFila-CCNE1-wildtype和pFila-CCNE1-mut1&2作为生物反应器测试内源microRNA-16的功能缺失效果。图示结果可知RNAiMAX具有最佳的转染效率，相比于其它三种转染试剂，其对内源microRNA-16的抑制效果最强。其它三种转染试剂也均有不同程度的抑制效果。由此可见，pFila是一种新型的microRNA生物感应器，可以灵敏探测体内microRNA的有效活性。

[0064] 图8pFila序列及其特征

[0065] SEQ ID No：4，下划线序列表示与萤火虫荧光素酶基因退火的引物序列，黑体序列表示与pRL-TK载体退火的序列。pFila的详细特征如下：

[0066] 碱基对： 6486bp

[0067] HSV TK启动子 7-759

[0068] 内含子 826-962

[0069] T7RNA聚合酶启动子(-17to+2) 1006-1024

[0070] T7RNA polymerase转录起始位点 1023

[0071] 海肾荧光素酶基因 1034-1969

[0072] XbaI酶切位点 1971-1976

[0073] ApaI酶切位点 1995-2000

[0074] SV40多聚腺苷化信号 2039-2240

[0075] SV40启动子 2279-2481

[0076] 萤火虫荧光素酶基因 2511-4163

[0077] SV40多聚腺苷化信号 4195-4416

[0078] 氨苄青霉素抗性基因 4800-5660

[0079] pBR322复制起点 5802-6445

具体实施方式

[0080] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔等著，黄培堂等译，科学出版社，2002，分子克隆实验指南第三版所建议的条件。

[0081] 实施例1 设计、合成用于克隆萤火虫荧光素酶基因的的嵌合体引物[0082] 萤火虫荧光素酶基因的序列来自于报告载体pGL3-promoter，计划将其克隆到报告载体pRL-TK上的海肾荧光素酶基因和氨苄青霉素抗性基因之间。所用嵌合体引物序列为：

[0083] pF-Fluc(SEQ ID No：1)

[0084] 5’AAGGATCCAGGTGGCACTTTTCG

[0085] pR-Fluc(SEQ ID No：2)

[0086] 5’GAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCAC

[0087]

[0088] P1R(SEQ ID No：3)5’CGAAAAGTGCCACCTGGATCCTT3’

[0089] 所有引物由上海英骏生物科技有限公司合成，以干粉形式分装、运输、保存。引物用TE缓冲液(ph＝8.0)稀释为10μmol/L的溶液，-20℃保存备用。

[0090] 实施例2 一步二元式搭桥耦联长距离PCR扩增萤火虫荧光素酶基因与报告载体pRL-TK的线性融合片段

[0091] i)试剂与材料来源

[0092] 高保真DNA聚合酶KOD plus及其配套的缓冲液(10×buffer)，dNTP，硫酸镁MgSO4均购自东洋纺生物科技有限公司，货号为KOD-201，-20℃冻存。报告载体pGL3-promoter和pRL-TK购自美国Promega公司，按照北京天根生物科技有限公司提供的小提中量超纯质粒抽提试剂盒说明书抽提纯化，-20℃冻存。

[0093] ii)体系组成见表1。

[0094] 表1 PCR组分及使用浓度

[0095]成分 初始浓度 用量 终浓度
PCR buffer 10× 5μl 1×
dNTP 2mmol/L 5μl 200μmol/L
硫酸镁MgSO4 25mmol/L 2μl 1mmol/L
KOD plus 1unit/μl 1μl 0.02unit/μl
pF-Fluc 10μmol/L 4μl 800nmo/L
pR-Fluc 10μmol/L 1μl 200nmo/L
P1R 10μmol/L 3μl 600nmo/L
pGL3-promoter 25ng/μl 1μl 0.5ng/μl
pRL-TK 50ng/μl 1μl 1ng/μl
或pRL-TK 10ng/μl 1μl 0.2ng/μl
双蒸水 28μl
总体积 50μl

[0096] 在冰上将以上成分依次加入，充分混匀。

[0097] iii)反应条件

[0098] 实施PCR反应的参数如下：

[0099] 预变性 95℃ 2min

[0100]

[0101] iv)产物检测

[0102] PCR反应结束后，取5μl产物用1％琼脂糖凝胶做电泳检测，EB染色，紫外成像系统拍照记录结果。

[0103] 实施例3 DpnI消化PCR产物

[0104] 限制性内切酶DpnI特异识别并切割甲基化的GATC序列，购自立陶宛Fermentas公司，货号ER1702。反应体系的组成见表2。

[0105] 表2 Dpn I酶切体系

[0106]成分 初始浓度 用量 终浓度
Buffer TangoTM 10× 3μl 1×
Dpn I 10units/μl 1μl 0.33unit/μl
PCR产物 26μl
总体积 30μl

[0107] 在冰上将以上成分依次加入，充分混匀。

[0108] 放在37℃水浴锅中温育2h，结束后置于冰上，用于转化。

[0109] 实施例4 转化大肠杆菌DH5α

[0110] 大肠杆菌DH5α的感受态细胞和氨苄青霉素LB平板(50μg/ml)的制备均按照分子克隆(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔等著，黄培堂等译，科学出版社，2002，分子克隆实验指南第三版)的条件实施.转化体系的组成如下：

[0111] 经DpnI消化的PCR产物 5μl

[0112] DH5α感受态细胞 50μl

[0113] 总体积 55μl

[0114] 将以上成分混匀，冰浴30min；

[0115] 42℃热激90s；

[0116] 加入不含有氨苄抗生素的液体LB培养基500μl，置于37℃摇床以200rpm/min的转速复苏45min；

[0117] 在台式离心机上以8000rpm/min的转速离心，将菌体沉淀下来，然后去除450μl LB培养基；

[0118] 将剩余的100μl样品涂布在.氨苄青霉素LB平板上，置于37℃温箱过夜培养16h。

[0119] 实施例5 挑取单克隆菌落测序鉴定

[0120] 因携带有甲基化的模板质粒在DpnI的作用下已经被切割，故只有发生了同源重组形成的重组环状质粒才能在氨苄青霉素LB平板上生长。挑取直径在2～4mm左右的单菌落，置于5ml含有氨苄抗生素(50μg/ml)的液体LB培养基中，在37℃摇床以200rpm/min的转速培养8h，送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。经序列分析得到正确的重组子，命名为pFila(plasmid Firefly Renilla)载体。

[0121] 实施例6 酶切确认重组质粒的身份

[0122] pFila的长度为6.4kb，且含有单一的Xba I位点。为了进一步确认萤火虫荧光素酶基因是否已经正确融合到pRL-TK载体上，用Xba I单酶切可以得到单一的6.4kb片段.酶切体系的组成见表3。

[0123] 表3 酶切鉴定体系

[0124]成分 用量 终浓度
10×Buffer 1μl 1×
Xba I 0.5μl 0.05unit/μl
pFila 1μl 300ng/μl
双蒸水 7μl
总体积 10μl

[0125] 在冰上将以上成分依次加入，充分混匀。

[0126] 放在37℃水浴锅中温育2h，取全部产物用1％琼脂糖凝胶做电泳检测，[0127] EB染色，紫外成像系统拍照记录结果。

[0128] 实施例7 表达活性及线性范围检测

[0129] 将pFila载体以浓度梯度的形式转染人源宫颈癌Hela细胞，鼠源肌原细胞C2C12和猴源的非洲绿猴肾细胞Vero等三种不同种属来源的哺乳动物细胞系。以Promega公司M的DLRAssay试剂盒检测pFila的表达情况，确认其能够同时表达两种荧光素酶并检测是否处于一定的线性范围。转染试剂采用Invitrogen公司的Lipofectamine2000脂质体，细胞培养板购自Corning公司，Opti-MEM购自Gibco公司.转染体系的组成见表4。

[0130] 表4 转染组分及使用量

[0131]

[0132] 转染前一天，将4×104cells铺到24孔板中，隔夜生长后按照表中所列体系配制转染复合物，滴于24孔板中，补加400μl完全培养基，置于37℃，5％CO2的条件下培养。在转染48h后收集细胞用于按照Promega公司的DLRM Assay试剂盒说明书进行荧光素酶活性测定。

[0133] 实施例8 重现microRNA-16与其靶标CCNE1的调控作用

[0134] 表5转染成分与使用量

[0135]

[0136] 为了验证pFila载体的有效性，选取microRNA-16和其已知靶分子人细胞周期基因CCNE1(cyclin E1)作为检测对象(WANG，F.；FU，X.D.；ZHOU，Y.andZHANG，Y.(2009).Down-regulation of the cyclin E1 oncogene expression bymicroRNA-16-1 induces cell cycle arrest in human cancer cells.BMB Rep，vol.42，no.11，p.725-730.)，测定pFila是否可以重现二者的相互作用。将人细胞周期基因CCNE1(cyclin E1)的3’UTR及其突变体(为方便叙述，分别记作pFila-CCNE1-wt和pFila-CCNE1-mut)克隆至pFila的M单克隆位点XbaI和ApaI之间，转染Hela细胞，以Promega公司的DLRAssay试剂盒检测microRNA-16对CCNE1的调控效果。转染体系的组成见表5。

[0137] 转染前一天，将4×104cells铺到24孔板中，隔夜生长后按照表中所列体系配制转染复合物，滴于24孔板中，补加400μl完全培养基，置于37℃，5％CO2的条件下培养。在M转染48h后收集细胞用于按照Promega公司的DLR Assay试剂盒说明书进行荧光素酶活性测定。

[0138] 实施例9 microRNA-16的抑制效果检测

[0139] 以四种不同的转染试剂将靶向microRNA-16的2’O-甲基化修饰的反义寡核苷酸与含有CCNE1-3’UTR的重组质粒转染Hela细胞，检测内源性microRNA-16的功能抑制效果。转染体系的组成见表6.Lipofectamine2000，RNAIMAX购自Invitrogen公司；Fugene购自罗氏公司，Sofast购自厦门太阳马公司；Opti-MEM购自Gibco公司。2’O-甲基化修饰的反义寡核苷酸序列为5’CGC CAA UAUUUACGU GCU GCU A3’，由上海吉玛生物制药科技有限公司(Genepharma Co.Ltd.)合成纯化。

[0140] 转染前一天，将4×104cells铺到24孔板中，隔夜生长后按照表中所列体系配制转染复合物，滴于24孔板中，补加400μl完全培养基，置于37℃，5％CO2的条件下培养。在M转染48h后收集细胞用于按照Promega公司的DLR Assay试剂盒说明书进行荧光素酶活性测定。

[0141] 表6 转染成分与使用量

[0142]