肺炎链球菌C多糖的纯化方法

摘要

本发明涉及肺炎链球菌C多糖的纯化方法。本发明的肺炎链球菌C多糖纯化方法包括菌体裂解、乙醇分级沉淀、去除蛋白杂质等步骤。通过对C多糖纯化方法工艺参数的优化，获得的C多糖结构完整，磷含量、氨基己糖含量、糖醛酸含量等关键指标，以及抗原活性、分子量大小等均与参比C多糖接近，而且杂质含量低，收率较高，适合作为肺炎链球菌多糖疫苗、蛋白结合疫苗生产中C多糖检测的对照品，也可用于评价肺炎链球菌多糖疫苗、蛋白结合疫苗的检测试剂。

权利要求

1.一种肺炎链球菌C多糖的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)培养肺炎链球菌CSR SCS2 Clone1菌株，离心收集菌体；

(2)用生理盐水溶解、稀释菌液，使菌液在600nm处的OD值在2.5左右；在菌液中加入终浓度为0.2％的脱氧胆酸钠，2-8℃放置3小时；调节菌体裂解液pH值到5.0，离心收获上清液；

(3)调节上一步所得的上清液pH值到6.5，加入终浓度为0.5M的CaCl2；再调pH值到

7.0，加入终浓度为30％的乙醇，2-8℃放置3小时；离心收获上清液；

(4)调节上一步所得的上清液pH值到5.0，以5％为一个梯度依次加入乙醇，2-8℃放置过夜，离心收获沉淀；最终乙醇浓度达到75％，合并各次沉淀；

(5)用蒸馏水复溶上一步所得的沉淀，加入终浓度为0.5％的脱氧胆酸钠，调节pH值到

3.0，离心收获上清液；

(6)浓缩、干燥上一步所得上清液，得到精制C多糖。

2.如权利要求1的纯化方法，其特征在于，步骤(6)所述的浓缩是指用截留分子量为

10000道尔顿的超滤膜超滤浓缩，所述的干燥为冷冻干燥。

说明书

肺炎链球菌C多糖的纯化方法

技术领域

[0001] 本发明涉及肺炎链球菌抗原多糖的纯化方法，尤其涉及肺炎链球菌C多糖的纯化方法。

背景技术

[0002] 肺炎链球菌(S.pneumoniae)，属于芽胞杆菌纲乳杆菌目链球菌科链球菌属，是一种革兰阳性球菌，菌体呈矛头状，多成双排列，宽端相对，尖端向外。在痰液、脓汁、肺组织病变中亦可呈单个或短链状。肺炎链球菌无鞭毛，无芽胞，在机体内或含血清的培养基中能形成荚膜，荚膜需特殊染色才可见。

[0003] 肺炎链球菌经常寄居于正常人的鼻咽腔中，多数不致病或致病力弱，仅少数有致病力。作为一种条件致病菌，肺炎链球菌通常形成带菌状态，当机体免疫力下降时，尤在呼吸道病毒感染后或婴幼儿、年老体弱者易发生肺炎链球菌肺部感染。肺炎链球菌主要引起人类大叶性肺炎，约占细菌性肺炎的80％。肺炎后可继发胸膜炎、脓胸，也可引起中耳炎、乳突炎、副鼻窦炎、脑膜炎和败血症等。

[0004] 肺炎链球菌的抗原主要包括：

[0005] 1、荚膜多糖抗原：是一类型特异性多糖抗原，根据荚膜多糖的不同，肺炎链球菌可区分为约90多个血清型。荚膜多糖抗原可以诱导人体产生特异性抗体，对同型感染有保护作用。针对肺炎链球菌的荚膜多糖疫苗、荚膜多糖-蛋白偶联疫苗均已广泛使用。

[0006] 2.菌体抗原

[0007] (1)C多糖：一种特异性多糖，存在于肺炎链球菌胞壁中，为各型菌株所共有。在2+
Ca 存在时，肺炎链球菌C多糖可为血清中一种称为C反应蛋白(C reactiveprotein；CRP)的球蛋白所沉淀。C多糖在人体内可诱导产生高滴度抗体水平，但该抗体却并没有保护性。

[0008] (2)M蛋白：是一种型特异抗原。

[0009] C多糖是由重复单位组成的细胞壁磷壁酸，为肺炎链球菌的共同抗原，存在于所有血清型肺炎链球菌的细胞壁中。在荚膜多糖疫苗、荚膜多糖-蛋白偶联疫苗生产过程中，分离纯化的荚膜多糖不可避免的混杂有C多糖。为了精确定量疫苗中荚膜多糖的含量，需要对荚膜多糖中混杂的C多糖进行检测。

[0010] 在荚膜多糖疫苗效力评价方面，人体内存在的抗C多糖抗体常常干扰对荚膜多糖抗体的定量测定，例如用ELISA方法测定的抗荚膜多糖抗体数值偏高。经改进的ELISA检测方法，需要在测定前先用C多糖对血清样本中的C多糖抗体进行吸附，以得出更加准确的实验结果。

[0011] 一般认为，C多糖由2-8个重复单位组成，每个重复单位由五个单糖结构构成，包括一个葡萄糖、一个2-乙酰胺-4-氨基-2，4，6-三脱氧半乳糖(AAT)、两个半乳糖胺和一个5-磷酸核糖醇，重复单位之间通过磷酯键相连。在两个半乳糖胺残基上连接有磷酸胆碱集团，是C多糖的显著特征。不同的研究者报道的C多糖结构不完全相同，主要差异在于重复单位中磷酸胆碱的数量以及乙酰化程度。这种差异可能与肺炎链球菌的种类、菌体培养方法、C多糖的提取方法等多种因素有关。

[0012] 本领域迫切需要结构完整的C多糖样品和/或对照品，用于肺炎链球菌多糖疫苗或结合疫苗的质量控制以及相关检测试剂的生产。因此，建立质量可控、重复性好、适合大规模生产的肺炎链球菌培养、C多糖分离纯化工艺具有重要意义。

发明内容

[0013] 本发明要解决的技术问题是提供一种肺炎链球菌C多糖的分离纯化工艺，以满足生物制品行业对C多糖样品和/或对照品的需要。

[0014] 本发明提供了肺炎链球菌C多糖的纯化方法，包括如下步骤：

[0015] (1)培养肺炎链球菌菌体；

[0016] (2)在菌液中加入终浓度为0.1～0.8％的脱氧胆酸钠(DOC)，冷库放置至裂解菌体；调节菌体裂解液pH值在3.0～5.0范围，离心收获上清液；

[0017] (3)调节上一步所得的上清液pH值到6.5，加入终浓度为0.5M的CaCl2；再调pH值到7.0，加入终浓度为25～30％的乙醇，冷库放置；离心收获上清液；

[0018] (4)调节上一步所得的上清液pH值到5.0，以5％为一个梯度依次加入乙醇，2-8℃放置，离心收获沉淀；最终乙醇浓度达到80％，分别收集各次沉淀；

[0019] (5)用蒸馏水复溶上一步所得的沉淀，加入终浓度为0.5％的脱氧胆酸钠(DOC)，调节pH值在3.0～5.0范围，离心收获上清液；

[0020] (6)浓缩、干燥上一步所得上清液，得到精制C多糖。

[0021] 在一个优选的方案中，菌体裂解前将菌液进行稀释，稀释的菌液在600nm处的OD值约为2.5。

[0022] 在一个优选的方案中，步骤(2)的脱氧胆酸钠终浓度为0.1～0.2％，pH值为5.0。

[0023] 在一个优选的方案中，步骤(3)的乙醇终浓度为30％。

[0024] 在一个优选的方案中，步骤(4)以5％为一个梯度依次加入乙醇至乙醇终浓度为75％。

[0025] 在一个优选的方案中，步骤(5)的pH值为5.0。

[0026] 在一个优选的方案中，步骤(6)用截留分子量为10000道尔顿的超滤膜超滤浓缩所得上清液，冻干浓缩液即可得精制多糖。

[0027] 本发明的肺炎链球菌C多糖的纯化方法，其中所述的肺炎链球菌为粗造型肺炎链球菌；优选的肺炎链球菌菌株选自CSR SCS2 Clone1、R6A、R36A、RSC-2；更优选的肺炎链球菌菌株为CSR SCS2 Clone1。

[0028] 本发明的肺炎链球菌C多糖的纯化方法，步骤(2)、(3)、(4)所述的冷库放置，是指在4～15℃的温度范围内进行操作；优选地，温度范围为4～10℃；更优选地，温度范围为7℃。

[0029] 本发明的肺炎链球菌C多糖的纯化方法，对C多糖的纯化的各个步骤及多种参数进行了优化。不仅考虑了各参数对C多糖的化学指标(尤其是磷含量指标)和抗原活性的影响，同时考虑了蛋白、核酸杂质的去除，而且兼顾了C多糖的收率。本发明的肺炎链球菌C多糖的纯化方法获得的C多糖结构完整，磷含量、氨基己糖含量、糖醛酸含量等关键指标，以及抗原活性、分子量大小等均与参比C多糖(丹麦血清研究所提供)接近，而且杂质含量低，收率较高，适合作为肺炎链球菌多糖疫苗、蛋白结合疫苗生产中C多糖检测的对照品，也可用于评价肺炎链球菌多糖疫苗、蛋白结合疫苗的检测试剂。

附图说明

[0030] 图1、纯化C多糖的全波长扫描图谱。

[0031] 图2、纯化C多糖的H NMR图谱(上半部为样品多糖图谱；下半部为参比多糖图谱)。

[0032] 图3、纯化C多糖的HPLC图谱(1：参比多糖；2：样品多糖；各图上半部为206nm扫描图谱，下半部为280nm扫描图谱)。

[0033] 图4、纯化C多糖的免疫双扩散图谱(中心孔：兔抗C多糖抗体；周边孔：C多糖)。

[0034] 图5、在不同温度下裂解菌体制备的C多糖的的HPLC图谱(1：参比多糖；2、3、4菌体裂解温度分别为7℃、15℃、37℃；各图上半部为206nm扫描图谱，下半部为280nm扫描图谱)。

[0035] 图6、在不同DOC浓度下裂解菌体制备的C多糖的的HPLC图谱(1：参比多糖；2、3、4、5菌体裂解的DOC浓度分别为0.1％、0.2％、0.4％、0.8％；各图上半部为206nm扫描图谱，下半部为280nm扫描图谱)。

[0036] 图7、在不同pH条件下去除菌体残骸制备的C多糖的HPLC图谱(1：参比多糖；2、3、4去除菌体残骸的pH值分别为pH3.0、pH4.0、pH5.0；各图上半部为206nm扫描图谱，下半部为280nm扫描图谱)。

[0037] 图8、不同浓度乙醇沉淀核酸制备的C多糖的HPLC图谱(1：参比多糖；2、3、4、5、6沉淀多糖的乙醇浓度分别为25～60％、60～80％、25～65％、35～65％、30～75％；各图上半部为206nm扫描图谱，下半部为280nm扫描图谱)。

[0038] 图9、不同NaAC浓度下沉淀多糖制备的C多糖的HPLC图谱(1：参比多糖；2、3、4沉淀多糖时的NaAC浓度分别为0％、5％、10％；各图上半部为206nm扫描图谱，下半部为280nm扫描图谱)。

[0039] 图10、不同蛋白质去除方法制备的C多糖的HPLC图谱(1：参比多糖；2、3、4去除蛋白质的方法分别为冷酚法、氯仿-正丁醇法、DOC法；各图上半部为206nm扫描图谱，下半部为280nm扫描图谱)。

具体实施方式

[0040] 菌株

[0041] 常用于纯化制备C-Ps的肺炎链球菌菌株包括CSR SCS2 Clone1、R6A、R36A、RSC-2等。本发明采用的肺炎链球菌菌株为CSR SCS2 Clone1，为一株II型肺炎链球菌的荚膜突变株，因失去荚膜成为粗糙型(有荚膜则为光滑型)。也有研究报道称在其细胞表面包裹有一层C多糖“荚膜”层。使用CSR SCS2Clone1菌株在C多糖的分离纯化中不受荚膜多糖的干扰，所以被多数研究者采用，例如Schiffman，G.et al，(1971)Capsulation of Pneumococcus with soluble cellwall-like polysaccharide.J.Exp.Med.134，600-617.以及 U.B.S.et al，(1984)C-polysaccharide in a pneumococcal vaccine.Acta Pathol.Microbiol.Immunol.Scand.Sect.C 92：351-356。

[0042] C多糖对照品

[0043] 本发明采用的C多糖对照品为从丹麦血清研究所(STATENS SERUMINSTITUT)的Cell Wall Polysaccharide(pneumococcal CWPS)，货号为KCWPS3。

[0044] C多糖的质量检测

[0045] (1)全波长扫描结果

[0046] 取预先溶解好的C-Ps溶液(1mg/ml)，于分光光度计下进行350～190nm全波长扫描，观察C-Ps的最大吸收峰、及280nm，260nm处的光吸收。

[0047] (2)生化指标检测

[0048] A核酸含量测定

[0049] 用蒸馏水溶解C-Ps(浓度为1mg/ml)，用蒸馏水作空白对照，于分光光度计260nm处扫描，按公式：C＝ABS260×5计算样品中核酸的含量。

[0050] B蛋白含量测定

[0051] 采用Lowrry法：将C-Ps用蒸馏水溶解为1mg/ml。以人血清白蛋白为标准蛋白，制作工作曲线。取待测样品1ml测定C-Ps溶液中残余蛋白的含量。

[0052] C氨基己糖含量测定

[0053] 二氨基苯甲醛显色法：以氨基葡萄糖作标准制作工作曲线，显色液以530nm波长比色。取1ml待测样品测定氨基己糖含量。

[0054] D糖醛酸含量测定

[0055] 咔唑-乙醇溶液显色法：以葡萄糖醛酸作标准，显色液以530nm波长比色，制作工作曲线。取待测样品1ml，测定其糖醛酸含量。

[0056] E磷含量测定

[0057] 磷含量测定(参照《中国药典》2005版附录36)：以磷酸二氢钾为标准，制作工作曲线(测定步骤同样品)。精确吸取适量预先溶解好的C-Ps溶(1mg/ml)，加4ml硫酸并加热使其碳化，加2ml高氯酸消化，立即加入2ml蒸馏水，加0.04mol/L钼酸铵溶液0.4ml混匀，加入还原剂(亚硫酸氢钠，亚硫酸钠，1-氨基-2-萘酚-4-磺酸)0.2ml，加水2ml混匀，于820nm处比色。

[0058] (3)核磁波谱分析

[0059] 用重水溶解多糖，浓度为5mg/ml。搅拌10分钟使其充分溶解后常温下低速(7200g)离心10分钟，以去除气泡和不溶解的沉淀物。取样品溶液加入核磁管，超声驱除核1
磁管内壁气泡。利用600M分析样品，包括 H-NMR波谱特征

[0060] (4)HPLC色谱分析

[0061] 采用高效液相(HPLC)体积排阻色谱(Size-exclusion chromatography，SEC)分析C-Ps，使用TSKG3000SW色谱柱。进样方法：流动相为0.2mol/L磷酸二氢钠溶液，流速为0.5ml/分钟，洗脱液用UV206、UV280、示差折光检测器三个通道监测。按以上进样方法平衡色谱柱1～2小时后进样含有5％蓝色葡聚糖2000和5％重铬酸钾溶液，分别测定色谱柱的外水体积Vo和内水体积Vi(Vi＝V重铬酸钾-Vo)。进样C-Ps(浓度1mg/ml)，样品运行时间为50分钟。最后处理数据并出色谱报告。

[0062] (5)体外抗原活性检测

[0063] A免疫双扩散试验

[0064] 免疫扩散法就是使抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自由扩散而相遇，从而形成抗原抗体复合物，由于复合物分子量较大并产生聚集，不再继续扩散而形成肉眼可见的带状或线状沉淀带。沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原，抗体的特异性和浓度，而且与其分子的大小及扩散速度有关，当抗原体存在多种成分时，将呈现多条沉淀线以至交叉反应线，因此可用来检查抗原和免疫血清的特异性、纯度或浓度。

[0065] 用生理盐水配制含0.6～0.7％琼脂的琼脂溶液，微波炉中加热至完全溶解后[0066] 倒平板，打孔器打梅花孔。中间孔加入兔抗C多糖血清，周围各孔加不同批次的C-Ps溶液(1mg/ml)。置平皿于37℃孵房。12小时后取出，观察沉淀线并照相。

[0067] B速率比浊法

[0068] 速率比浊法的原理：一定量抗体中加入适量抗原，经一定时间后形成免疫复合物，使用仪器测量其反应液的浊度值。复合物形成越多，浊度值越高，以此绘制校正曲线，可测定抗原含量。因此可利用此原理检测纯化多糖的抗原活性。

[0069] 将C-Ps多糖稀释成0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、5μg/ml，使用6倍稀释的血清，用速率比浊仪测定免疫浊度值。

[0070] 实施例一、肺炎链球菌的培养和C多糖的分离纯化

[0071] 1、肺炎链球菌的培养

[0072] CSR SCS2 Clone1菌株第一代先接种至固体培养基-羊血琼脂培养基表面，37℃恒温CO2孵箱培养八小时之后用接种环刮取菌落传代，重新接种至新的固体培养基表面，划线；37℃恒温CO2孵箱培养8小时后用接种环刮取菌落接种于小三角瓶200ml液体培养基中，补加50％的葡萄糖，使终浓度到1％的葡萄糖；37℃恒温CO2孵箱培养8小时后将小三角瓶中的菌液接种于大三角瓶600ml液体培养基中，补加50％的葡萄糖，使终浓度到1％的葡萄糖；37℃恒温CO2孵箱培养8小时后将菌液接种至大立瓶10000ml液体培养基中，补加50％的葡萄糖，使终浓度到1％的葡萄糖；37℃恒温孵房摇床震荡培养6小时后，收获菌液。
用分光光度计于600nm测定收获菌液的OD值。

[0073] 2、C多糖的分离纯化

[0074] 离心收获菌体，将菌体溶于适量的生理盐水中，于600nm测OD值。用生理盐水稀释菌液，使菌液的浓度约为25亿，OD值在2.5左右即可。

[0075] 稀释好的菌液加入终浓度为0.2％的DOC，于2-8℃中搅拌裂解。裂解3h后，调pH5.0，离心弃去沉淀收获上清液。调上清液的pH值在6.5左右，测量上清液体积，加入3M CaCl2使终浓度为0.5M，搅拌均匀后调pH7.0；测量溶液体积，加入95％酒精使终浓度达
30％；搅拌均匀，2-8℃放置3h后离心，收获上清液。

[0076] 所得上清液调pH5.0后测量体积，加入95％酒精使终浓度为75％，2-8℃放置过夜后离心收获沉淀。将收获的沉淀溶于蒸馏水中(20000ml培养液所获得的沉淀加蒸馏水约500ml)，测量多糖水溶液体积，加入DOC使终浓度为0.5％，搅拌均匀后调pH3.0，离心收获上清液。

[0077] 用截留分子量为10000道尔顿的超滤膜超滤浓缩所得上清液，冻干即可得精制多糖。

[0078] 按上述方法制备4个批次的C多糖，批号分别为091201、091207A、091211A、100128A。

[0079] 实施例二、C多糖的质量检测

[0080] 1、全波长扫描

[0081] 实施例一.2所制备的C多糖通过350～190nm段的全波长扫描，结果显示C-Ps在202.6nm处有最大光吸收，光吸收值ABS为2.096；在260，280nm处的光吸收值很低。批号为100128A的C多糖全波长扫描结果见图1。

[0082] 2、化学成分检测

[0083] 实施例一.2所制备的C多糖，用化学法测定核酸、蛋白、氨基己糖、糖醛酸和磷的百分含量，不同批次的测定结果见表1，表中实验数据均为三次检测的平均值。其检测结果与丹麦血清研究所购买的C-Ps的检测结果基本一致。

[0084] 表1纯化C多糖各成分百分含量

[0085]

[0086] 3、核磁共振波谱分析1

[0087] 实施例一.2所制备的C多糖经600兆赫兹一维核磁共振波谱法分析，其 H-NMR峰形和位移与参比糖C-Ps的图谱完全吻合，两者与文献报道的结果一致，批号为100128A的C多糖H-NMR结果见图2。

[0088] 4、HPLC色谱分析

[0089] 实施例一.2所制备的C多糖使用HPLC色谱法分析，其峰保留时间与参比C-Ps基本一致，批号为100128A的C多糖的HPLC结果见图3。

[0090] 5、体外抗原活性测定

[0091] 实施例一.2所制备的C多糖通过免疫双扩散法和速率比浊法测定抗原活性。不同批次C多糖比浊法测定的抗原性结果见表2，表中实验数据均为三次检测的平均值；免疫双扩散试验结果见图4。结果显示精制C-Ps具有良好的抗原活性。

[0092] 表2速率浊度法测定不同批次C多糖的抗原性

[0093]

[0094] 实施例三、C多糖纯化工艺的优化

[0095] 1、菌体裂解条件的优化

[0096] (1)裂解温度

[0097] 参照实施例一的方法培养肺炎链球菌以及分离纯化C多糖，不同之处在于将稀释好的菌液分装于3个1000ml三角瓶中，瓶中加磁子搅拌。每个三角瓶加入终浓度为0.2％的DOC，分别于7℃，15℃，37℃三种条件下使菌体裂解过夜。涂片观察裂解结果。

[0098] 参照实施例二的方法检测各试验组C-Ps的化学指标和体外抗原活性，用高效液相色谱测多糖的分子量。

[0099] 涂片观察到7℃，15℃，37℃三种条件下菌体裂解完全，镜检视野中全部为细胞碎片。多糖化学指标检测结果见表3，多糖抗原活性检测结果见表4，表中实验数据均为三次检测的平均值；HPLC图谱见图5。

[0100] 表3裂解温度对C多糖特异性成分百分含量的影响

[0101]

[0102]

[0103] 表4裂解温度对C多糖抗原性的影响

[0104]

[0105] 由检测结果可以看出，在三种裂解温度下制备的C-Ps其生化指标之间并无显著差异，尤其对于针对特异基团磷酸胆碱的磷的百分含量，三者之间无明显变化；从速率比浊结果可以看出当温度在7℃、15℃时C-Ps抗原活性较好，37℃条件下多糖抗原活性与参比品相差较远；HPLC检测结果也可以看出在7℃时制备所得的多糖与参比糖图谱基本一致。所以在纯化工艺建立时，菌体裂解温度选择在2-8℃进行。

[0106] (2)脱氧胆酸钠浓度

[0107] 参照实施例一的方法培养肺炎链球菌以及分离纯化C多糖，不同之处在于将稀释好的菌液分装于4个三角瓶中，加磁子搅拌。菌液中依次加入终浓度为0.1％，0.2％，0.4％，0.8％的DOC，于2-8℃搅拌裂解。涂片观察裂解结果。

[0108] 参照实施例二的方法检测各试验组C-Ps的化学指标和体外抗原活性，用高效液相色谱测多糖的分子量。

[0109] 结果显示菌体裂解完全，镜检视野中全为细胞碎片。多糖化学检测结果见表5，糖抗原活性检测结果见表6，表中实验数据均为三次检测的平均值；HPLC检测结果见图6。

[0110] 表5细菌裂解时DOC浓度对C多糖各成分百分含量的影响

[0111]

[0112] 表6细菌裂解时DOC浓度对C多糖抗原性的影响

[0113]

[0114] 由检测结果可以看出，在四种DOC裂解浓度下，纯化的C-Ps其化学检测指标之间并无显著差异。对于针对特异基团磷酸胆碱的磷的百分含量，四者之间无明显变化。速率比浊结果显示，DOC浓度为0.1％时，多糖抗原活性较好，但在冷库中裂解菌体所需时间较长，适当提高DOC浓度可以缩短菌体裂解的时间。由速率比浊检测结果可以看出，当DOC浓度逐渐升高时，多糖的抗原活性会随之降低，可以推测DOC的浓度可能会影响多糖的抗原活性。从HPLC检测结果也可以看出不同DOC浓度之间并无明显差别。所以我们选择裂解菌体的DOC浓度在0.2％左右。

[0115] (3)裂解时间

[0116] 参照实施例一的方法培养肺炎链球菌以及分离纯化C多糖，不同之处在于将稀释好的菌液装入三角瓶，加磁子搅拌。菌液中加入终浓度为0.2％的DOC。于2-8℃搅拌裂解。每隔2h涂片镜检一次，直至菌体裂解完全。

[0117] 由镜检结果可以看出，在7℃、裂解液中DOC的浓度为0.2％时，菌体裂解2h或者4h后，镜检发现菌体裂解完全，镜检视野中全为细胞裂解碎片。由此可见，菌液中DOC终浓度为0.2％时，在不影响多糖抗原活性的前提下，于2-8℃菌体裂解2～3h就能达到裂解完全的目的。

[0118] 2、菌体裂解液pH值的选择

[0119] 参照实施例一的方法培养肺炎链球菌以及分离纯化C多糖，不同之处在于菌液中加入终浓度为0.2％的DOC，于2-8℃搅拌裂解3h后，用乙酸溶液将裂解液的pH值分别调至5.0、4.0、3.0。离心去除细胞碎片沉淀，收获上清液用于后续步骤。

[0120] 参照实施例二的方法检测各试验组C-Ps的化学指标和体外抗原活性，用高效液相色谱测多糖的分子量。

[0121] 多糖化学指标检测结果见表7，多糖抗原活性检测结果见表8，表中实验数据均为三次检测的平均值；HPLC图谱见图7。

[0122] 表7裂解液pH值对C多糖各成分百分含量的影响

[0123]

[0124] 表8裂解液pH值对C多糖抗原性的影响

[0125]

[0126] 化学检测结果表明：当裂解液的pH值不同时，所得多糖各项化学检测指标之间并无明显差异。速率比浊检测结果发现当pH值越低时，多糖抗原活性会随之降低。当pH值在3.0时，多糖的抗原活性仅为参比糖的二分之一。参照高效液相色谱图可以看出，pH值在5.0时多糖的图谱与标准糖图谱接近。所以在选择pH时，我们选择在pH5.0下进行实验操作。

[0127] 3、乙醇分级沉淀参数的优化

[0128] (1)乙醇分级沉淀时乙醇浓度的选择

[0129] 参照实施例一的方法培养肺炎链球菌以及分离纯化C多糖，不同之处在于稀释好的菌液加入终浓度为0.2％的DOC，于冷库中搅拌裂解3h。调pH5.0，离心弃去沉淀收获上清液，调溶液的pH值在6.5左右，测量上清液体积；加入3MCaCl2使终浓度为0.5M，搅拌均匀后测量体积；加入无水乙酸钠(NaAC)使终浓度为5％，搅拌均匀后调pH7.0。测量溶液体积；加入95％酒精使终浓度达25％或30％。搅拌均匀，冷库放置3h后离心，收获上清液用于后续步骤(本步骤用于沉淀核酸)。

[0130] 上一步骤获得的上清液调节pH值到5.0，测量体积，加入95％酒精，以5％为一个梯度依次提高上清液中乙醇浓度，冷库放置过夜，直到沉淀出现，离心收获沉淀；循环该步骤，直到溶液中的酒精浓度最高达到80％为止。分别收集各次沉淀用于后续步骤(本步骤用于分级沉淀C多糖)。

[0131] 试验共分为4组：

[0132] 第一组：沉淀核酸时的乙醇终浓度为25％；沉淀C多糖时的乙醇浓度以5％梯度依次上升，最终达到80％，分别收集25-60％和60-80％酒精区间的沉淀。

[0133] 第二组：沉淀核酸时的乙醇终浓度为25％；沉淀C多糖时的乙醇浓度以5％梯度依次上升，最终达到65％，收集25-65％酒精区间的沉淀。

[0134] 第三组：沉淀核酸时的乙醇终浓度为30％；沉淀C多糖时的乙醇浓度以5％梯度依次上升，最终达到65％，收集30-65％酒精区间的沉淀。

[0135] 第四组：沉淀核酸时的乙醇终浓度为30％；沉淀C多糖时的乙醇浓度以5％梯度依次上升，最终达到75％，收集30-75％酒精区间的沉淀。

[0136] 参照实施例二的方法检测各试验组C-Ps的化学指标和体外抗原活性，用高效液相色谱测多糖的分子量。

[0137] 选择不同酒精浓度时制得多糖的化学检测结果见表9，速率比浊检测结果见表10，表中实验数据均为三次检测的平均值；HPLC图谱见图8。

[0138] 表9乙醇浓度对C多糖各成分百分含量的影响

[0139]

[0140] 表10乙醇浓度对C多糖抗原性的影响

[0141]

[0142] 由化学检测结果可以看出：当用25％酒精去除核酸沉淀时，制备所得多糖中核酸含量可高达4.45％；当升高去除核酸时的酒精浓度，多糖中核酸的百分含量便会显著降低。但是在去除核酸时，酒精浓度过高会将特异性多糖沉淀去除。所以本试验选择在去除核酸时酒精浓度为30％。由化学检测结果也可以看出在沉淀特异性多糖时，酒精浓度区间在
30～75％的结果较佳。由速率比浊检测结果可以看出酒精浓度在75％以上时，所得物质多为杂质。30％酒精浓度之下的沉淀多为核酸，最适沉淀特异多糖的酒精区间为30～75％。
参考HPLC色谱图也可以看出当酒精浓度在30～75之间所得多糖的谱图与参比糖图谱基本一致。

[0143] (2)乙醇分级沉淀时盐离子浓度选择

[0144] 参照实施例一的方法培养肺炎链球菌以及分离纯化C多糖，不同之处在于稀释好的菌液加入终浓度为0.2％的DOC。于2-8℃搅拌裂解。裂解3h后，调pH5.0，离心弃去沉淀收获上清液，调溶液的pH值在6.5左右，测量上清液体积；加入3M CaCl2使终浓度为0.5M，搅拌均匀后测量体积；加入无水乙酸钠(NaAC)使终浓度分别为0％、5％、10％，搅拌均匀后调pH7.0。测量溶液体积，加入95％酒精使终浓度达30％。搅拌均匀，2-8℃放置3h后离心，收获上清液。

[0145] 测量30％酒精沉淀后所得上清液的体积，加入无水乙酸钠(NaAC)使终浓度分别为0％，5％，10％，搅拌均匀后调pH5.0。加入95％酒精使终浓度为75％。2-8℃放置过夜后离心收获沉淀。

[0146] 参照实施例二的方法检测各试验组C-Ps的化学指标和体外抗原活性，用高效液相色谱测多糖的分子量。

[0147] 选择不同盐离子浓度时制得多糖的化学检测结果见表11，速率比浊检测结果见表12，表中实验数据均为三次检测的平均值；HPLC图谱见图9。

[0148] 表11NaAC浓度对C多糖各成分百分含量的影响

[0149]

[0150] 表12NaAC浓度对C多糖抗原性的影响

[0151]

[0152] 由化学检测结果可以看出，盐浓度的高低对对氨基己糖和糖醛酸的百分含量并没有显著影响；而对于磷的百分含量而言，盐浓度越高，磷含量越低。推测可能是由于强碱弱酸盐的加入使溶液暂时呈碱性。在碱性下，多糖链中磷酸胆碱基团由于水解的原因易脱落，从而使多糖中磷的百分含量降低。速率比浊检测结果显示，当盐浓度为0％时多糖的抗原活性最佳。同时结合HPLC检测结果也可以看出用低盐浓度沉淀多糖，多糖的HPLC图谱与参比糖的更接近。

[0153] 4、蛋白质去除方法的比较

[0154] 参照实施例一的方法培养肺炎链球菌以及分离纯化C多糖，不同之处在于将乙醇分级沉淀收获的多糖沉淀重新溶于蒸馏水中(20000ml培养液所获得的沉淀加蒸馏水约500ml)，所得溶液平均分为三份，分别进行下面三项试验。

[0155] (1)苯酚除蛋白

[0156] 测量多糖水溶液体积，加入无水NaAC使终浓度为0.3M。搅拌均匀后测量体积，加入等体积的苯酚-乙酸钠缓冲液，剧烈震荡30min后离心。收获上层水相，测量体积后加入等体积的苯酚-乙酸钠缓冲液，剧烈震荡30min后离心。收获上层水相装入透析袋，5万毫升蒸馏水，每12h换一次透析液。透析两天，用截留分子量10000道尔顿的超滤膜超滤浓缩回收液，后冻干便可得精制多糖。对精制多糖进行化学检测和多糖抗原性的检测，同时用高效液相色谱测多糖的分子量。

[0157] (2)氯仿-正丁醇除蛋白

[0158] 测量多糖水溶液体积，加入约1/2体积的4∶1氯仿∶正丁醇溶液，充分震荡20分钟后离心，收获上层水相。加入等体积的氯仿∶正丁醇溶液，充分震荡20分钟后离心，收获上层水相。合并以上两步骤的下层有机相，用蒸馏水洗涤两次。将所得的水相合并，用截留分子量10000道尔顿的超滤膜超滤浓缩回收液，冻干即可得精制多糖。对精制多糖进行化学检测和多糖抗原性的检测，同时用高效液相色谱测多糖的分子量。

[0159] (3)DOC除蛋白

[0160] 测量多糖水溶液体积，加入DOC使终浓度为0.5％，搅拌均匀后调pH3.0。离心收获上清液。用截留分子量10000道尔顿的超滤膜超滤浓缩回收液，冻干即可得精制多糖。对精制多糖进行化学检测和多糖抗原性的检测，同时用高效液相色谱测多糖的分子量。

[0161] 参照实施例二的方法检测各试验组C-Ps的化学指标和体外抗原活性，用高效液相色谱测多糖的分子量。

[0162] 采用三种方法去除杂质蛋白获得的C多糖，化学指标检测结果见表13，速率比浊检测结果见表14，表中实验数据均为三次检测的平均值；HPLC图谱见图10。

[0163] 表13蛋白质沉淀方法对C多糖各成分百分含量的影响

[0164]

[0165] 表14蛋白质沉淀方法对C多糖抗原性的影响

[0166]

[0167] 由化学检测结果可以看出，苯酚抽提法去除蛋白效果最佳，但由于乙酸钠-苯酚缓冲液属于弱碱性缓冲液，多糖中的磷酸胆碱基团在此环境中很可能会发生水解脱落，从而使磷的百分含量显著降低。另外，采用冷酚抽提法，特异多糖的产率较低。与其他两种方法相比，采用冷酚法取出蛋白时，多糖的产率仅仅为后者的二分之一。而氯仿-正丁醇法虽然在去除杂质蛋白方面有较多应用，但由于氯仿为毒性物质，限制了该方法的应用。在本试验中，氯仿-正丁醇法去除蛋白质的效果也并不理想。在酸性环境下采用DOC去除蛋白质效果显著，而且对于多糖的抗原活性及特异基团的完整性均无显著影响。速率比浊法检测结果显示，采用冷酚法去除蛋白时多糖的抗原活性会显著降低。当选用DOC法时多糖的抗原活性会大幅度升高，这说明采用冷酚法除蛋白可能会造成多糖抗原活性的破坏。原因可能是由于苯酚乙酸钠缓冲液为弱碱性环境，在此环境中多糖中磷酸胆碱基团会遭到破坏。磷酸胆碱基团为多糖的主要抗原决定基，在破坏后，多糖中磷的百分含量会显著降低，同时抗原活性也会略有下降。同时结合HPLC检测结果也可以看出用DOC除蛋白并不会影响多糖的分子量。综合考虑，在制备特异性C-Ps时选用DOC法去除蛋白杂质。