一种通过带病组培诱导获得抗枣疯病突变株的方法

摘要

以带枣疯病组培苗为材料，通过持续带病继代培养，利用带病组培苗中高浓度的病原形成强大选择压，诱发抗枣疯病突变，进而通过形态变异筛选及形态变异稳定性观察、分子水平遗传变异鉴定和对枣疯病抗性的组培微嫁接鉴定等，筛选出对枣疯病抗性显著提高的突变株。利用该技术，可实现在组织培养条件下规模化快速诱导获得抗枣疯病新种质，其应用有助于推动抗枣疯病育种的进程，有利于枣产业的持续健康发展。

权利要求

1.一种通过持续带病组培诱导获得抗枣疯病突变株的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）带枣疯病组培苗材料的准备，以感染枣疯病的嫩芽为外植体，在不加入任何植物生长调节剂的MS培养基中进行启动培养和继代培养，获得大量的带病组培苗；

（2）疑似突变株的初步筛选，在步骤（1）获得的带病组培苗中，以叶片明显变大、茎增粗、节间伸长、托叶刺不可见或变正常、腋芽不萌发或正常萌发为标准，挑选出在外观形态上看似健康的疑似突变株；

（3）疑似突变株的复选，将步骤（2）初选出的疑似突变株，在不加任何植物生长调节剂的MS培养基中单独继代培养，观察其外观形态的分化情况；将外观形态仍表现健康的疑似突变株的继代组培苗再次挑选出来，继续在不加任何植物生长调节剂的MS培养基中单独培养；如此反复进行继代培养和挑选，直到疑似突变株在继代培养后不再出现形态分化、全部表现为外观形态健康的植株为止，作为复选突变株；

（4）突变株的决选和确定，对步骤（3）筛选出的复选突变株进行基因组DNA的AFLP分子标记检测，以一直表现典型枣疯病症状、未发生疑似突变的同一品种的组培苗为对照，鉴定出具有特征性DNA差异条带的突变株，作为决选突变株；进而以其为接穗，在组培条件下嫁接到表现典型枣疯病症状的组培苗砧木上，进行枣疯病抗性鉴定，接穗芽萌发45天后仍不表现枣疯病症状的，确定为抗枣疯病突变株。

说明书

一种通过带病组培诱导获得抗枣疯病突变株的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种通过持续带病组培诱导获得抗枣疯病突变株的方法。 背景技术

[0002] 枣疯病(Jujube witches’broom disease)由植原体(phytoplasma)引起，是枣树生产上发生最普遍、危害最严重的致死性传染性病害。枣树感染枣疯病后，叶片变小、花器和托叶刺退化成小叶、枝叶丛生，轻者3-5年、重者1-2年后死亡。枣疯病为维管束系统病害，防治非常困难，选育优良抗病品种是解决枣疯病问题的根本途径。目前，利用传统地方品种中存在的自然变异进行株系选优，仍是枣树最主要的新品种选育方法。河北农业大学中国枣研究中心，经过8年时间，通过株系选优选育出了国内外第一个高抗枣疯病枣树新品种‘星光’。但株系选优存在着被动等待变异、可遇不可求、难于定向培育品种的问题。 [0003] 本专利发明人在对感染枣疯病的婆枣进行组织培养的过程中，发现在大量的病苗群体中有看似健康的个体(疑似抗病突变株)。其基本特征是：叶片明显变大，茎增粗，节间伸长，无托叶刺变成小叶的状况，托叶刺不可见或变正常，腋芽不萌发或正长萌发。据此分析，如果能建立一套利用带病组培苗中强大的病原选择压、通过对带病组培苗的持续培养诱发抗病突变株的方法，将会大大推动抗枣疯病育种的进程，有利于枣产业的持续健康发展。

[0004] 通过文献查阅，通过带病(枣疯病)组培苗的持续培养诱发抗枣疯病突变株的方法，尚未见报道。

发明内容

[0005] 本发明建立了一套通过带病(枣疯病)组培苗的持续培养诱导抗枣疯病突变株的方法，为抗枣疯病品种选育开辟了新途径。

[0006] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：以带枣疯病组培苗为材料，通过持续继代培养，诱发抗枣疯病突变株，通过形态变异筛选、分子水平遗传变异鉴定和枣疯病抗性鉴定等，筛选出对枣疯病抗性显著提高的突变株。

[0007] 本发明的具体内容，即组培条件下诱发抗枣疯病突变株的具体方法如下： [0008] (1)带枣疯病组培苗材料的准备。采集感染枣疯病的嫩芽为外植体，在不加入任何植物生长调节剂的MS培养基中(蔗糖浓度为30g/L，培养基灭菌前pH值6.0)进行启动培养和继代培养(培养室温度为28±2℃)，获得大群体的带病组培苗。

[0009] (2)疑似突变株的初步筛选。在上述获得的带病组培苗中，观察筛选在外观形态上看似健康的个别的疑似突变株，确定疑似突变株的基本标准是：与正常的带病组培苗相比，叶片明显变大，茎增粗，节间伸长，托叶刺不可见或变正常，腋芽不萌发或正长萌发。 [0010] (3)疑似突变株的复选。将按上述标准确定的疑似突变单独挑选出来，转入新的不添加任何植物生长调节剂的MS培养基中单独继代培养，这些疑似突变株在培养过程中还会出现形态上的分化，有的继续保持健康状态，有的变回疯苗状态；将外观形态仍表现健康的组培 苗再次挑选出来，继续单独培养；如此反复，直到疑似突变株在继代培养后不再出现形态分化，全部表现为健康植株为止，作为复选突变株。

[0011] (4)突变株的决选和确定。对上述筛选出的复选突变株进行AFLP(扩增片段长度多态性，Amplificd fragment length polymorphism)检测，以一直表现典型枣疯病症状、未发生疑似突变的同一品种的组培苗为对照，鉴定出具有特征性DNA差异条带的复选突变株，作为决选突变株；进而以其为接穗，在组培条件下嫁接到表现典型枣疯病症状的组培苗砧木上，进行枣疯病抗性鉴定，接穗芽萌发45天后仍不表现枣疯病症状的，确定为抗枣疯病突变株。

[0012] 本发明专利的有益效果是，建立了一套较完善的利用带病组培苗中强大的病原选择压、通过对带病组培苗的持续培养诱发抗枣疯病突变株的方法。利用该技术，可实现在组织培养条件下规模化快速获得抗枣疯病新种质，其应用将会大大推动抗枣疯病育种的进程，有利于枣产业的持续健康发展。

附图说明

[0013] 图1是筛选疑似突变株的形态标准。

[0014] 图2是大群体、次群体和变异株, 突变株、次群体和疯苗群体(从左至右)。 [0015] 图3是嫁接接种鉴定突变株的抗病性。

具体实施方式

[0016] 以感病品种婆枣感染枣疯病的嫩芽为外植体，在不加任何植物生长调节剂的MS培养基(基灭菌前pH值6.0，蔗糖浓度为30g/L)中进行启动培养和继代培养(培养室温度为28±2℃)，获得组培苗；以叶片明显变大、茎增粗、节间伸长、托叶刺不可见或变正常、腋芽不萌发或正长萌发为标准，从中挑选出在形态上看似健康的疑似突变株系个；将疑似突变株系单独在不添加任何植物生长调节剂的MS培养基中继代培养，从中剔除恢复病症的组培苗而将外观形态仍表现健康的组培苗再次挑选出来，进一步单独继代培养；如此反复7次，筛选出继代培养后不再出现形态分化、全部表现健康的疑似突变株系7个；对这些疑似突变株进行AFLP检测，以未发生疑似突变一直表现典型的枣疯病症状的婆枣组培苗为对照，鉴定出具有特征性差异条带的突变株系3个，进而以其为接穗，在组培条件下嫁接到表现典型枣疯病症状的婆枣组培苗砧木上进行枣疯病抗性的嫁接接种鉴定，最后鉴定筛选出在接穗芽萌发45天后仍没有表现出枣疯病症状的抗枣疯病突变株系3个。