一种糖基固定相的制备方法

摘要

本发明提供一种糖基固定相的制备方法。该方法是在无重金属催化的条件下使用点击化学反应制备糖基键合硅胶固定相，包括如下步骤：在纯水、有机溶剂或有机溶剂/水混合溶剂中加入含有末端炔基的糖和3-叠氮基丙基硅胶，在40～140℃下反应24～96小时，过滤，依次用甲醇、水、甲醇洗涤，所得固体于真空干燥箱中40～80℃条件下干燥6～12小时，即得糖基固定相。该方法为无重金属催化反应，因此最终产物中不含重金属残留，完全避免重金属对产品性能带来的不利影响。制备过程简单可靠，反应条件温和，而且十分容易放大到大量制备。应用范围广，本发明提供的糖基固定相可作为亲水作用色谱分离材料，广泛用于分离寡糖、中药强极性组分，强极性生物样品等各类强极性化合物。

权利要求

1.一种糖基固定相的制备方法，其特征在于：利用叠氮基与炔基的1，3-环加成反应将含有炔基的糖固载到硅胶表面，包括如下步骤：在水、甲醇、乙醇、吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、体积比为1/10～10/1的甲醇/水、体积比为1/10～10/1的乙醇/水、体积比为1/10～10/1的乙腈/水或体积比为1/10～10/1的四氢呋喃/水中加入含有末端炔基的糖和3-叠氮基丙基硅胶，在40～

140℃下反应24～96小时，过滤，依次用甲醇、水、甲醇洗涤，所得固体于真空干燥箱中

40～80℃条件下干燥6～12小时，即得糖基固定相；

含有末端炔基的糖为修饰了炔丙基的单糖、二糖、聚合度为3～10的寡糖中的一种或多种；

以每克3-叠氮基丙基硅胶计，含有末端炔基的糖用量为1～50mmol；

以每克3-叠氮基丙基硅胶计，所用溶剂量为1～100mL。

说明书

一种糖基固定相的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及液相色谱固定相，具体的说是一种糖基固定相的制备方法。技术背景

[0002] 反相高效液相色谱(RP-HPLC)是目前使用最为广泛的高效分离技术。但是，反相液相色谱主要依靠单一的疏水作用力来实现对化合物的分离，其对强极性化合物(如寡糖，糖苷，强极性寡肽等)的保留很弱，甚至不保留。为了对强极性化合物有较好的保留作用而达到分离的目的，使用极性固定相是一种很好的途径。亲水作用液相色谱模式(HILIC)是一种用于分离强极性化合物的色谱技术，类似于正相色谱，使用极性固定相和极性相对较小的流动相。但是，亲水作用色谱的固定相依然是使用正相固定相，主要是直接使用硅胶，氨基，氰基等作为固定相存在着重现性差和使用寿命短的问题。近年来，专门为亲水作用色谱开发的亲水作用色谱固定相也得到了较快发展，包括酰胺基固定相、醇基固定相、两性离子固定相等。但是，当前对各类亲水作用固定相缺乏系统的比较研究，还没有被广泛使用和普遍接受的亲水作用色谱固定相。

[0003] 点击化学(click chemistry)是美国斯克利普斯研究所(Scripps Research Institute)的K.B.Sharpless教授等提出的一个合成化学概念，其核心内容是：以高选择性，高转化率，条件温和，操作简单的化学反应来实现功能基团的偶联，达到高效制备功能分子和功能材料的目的。当前，最为广泛使用的“点击化学”(click chemistry)反应是一价铜催化的Huisgen 1，3-diploar cycloaddition反应。点击化学已经被广泛应用到小分子合成、材料制备和固体材料表面修饰(包括色谱固定相合成)的研究中。一价铜催化的点击化学反应用于制备环糊精固定相、麦芽糖固定相、寡聚乙二醇固定相、蛋白质固定相和手性固定相等都出现了报道。但是，由于使用重金属铜作为催化剂，点击化学反应产物中往往含有残留的铜离子，对最终产品的性质产生影响，特别是在材料制备和生物偶联中的不良影响更为突出。无重金属催化的点击化学反应是点击化学反应应用于材料合成技术和生物偶联技术的重要方向。当前，无重金属催化的点击化学应用于色谱分离材料制备技术未见报道。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种糖基固定相的制备方法和用途。该方法是在无重金属催化的条件下使用点击化学反应制备糖基键合硅胶固定相，制备方法简单可靠。该方法制备的糖基固定相不含重金属残留，分离效率和选择性高，在亲水色谱模式下对强极性化合物有很好的保留和分离，适合强极性化合物的分离分析。

[0005] 本发明的技术方案是：

[0006] 一种糖基固定相的制备方法，在不使用重金属催化剂的条件下，利用叠氮基与炔基的1，3-环加成反应将含有炔基的糖固载到硅胶表面，包括如下步骤：

[0007] 在水、甲醇、乙醇、吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜或体积比为1/10～10/1的甲醇/水、乙醇/水、乙腈/水、四氢呋喃/水混合溶剂中加入含有末端炔基的糖和3-叠氮基丙基硅胶，在40～140℃下反应24～96小时，过滤，依次用甲醇、水、甲醇洗涤，所得固体于真空干燥箱中40～80℃条件下干燥6～12小时，即得糖基固定相。其中，含有末端炔基的糖可以是修饰了炔丙基的单糖、二糖、聚合度为3～10的寡糖。以每克3-叠氮基丙基硅胶计，含有末端炔基的糖用量为1～50mmol，所用溶剂量为1～100mL。

[0008] 本发明具有如下优点：

[0009] 1.本发明提供的制备方法为无重金属催化反应，因此最终产物中不含重金属残留，完全避免重金属对产品性能带来的不利影响。

[0010] 2.制备过程简单可靠。点击化学反应，反应条件温和，可以在水溶液中进行，而且十分容易放大到大量制备。

[0011] 2.应用范围广。本发明提供的糖基固定相可作为亲水作用色谱分离材料，广泛用于分离寡糖、中药强极性组分，强极性生物样品等各类强极性化合物。

附图说明

[0012] 图1为本发明实施例1制备的糖基固定相用于分离壳寡糖的色谱图；

[0013] 图2为本发明对照例1制备的糖基固定相用于分离壳寡糖的色谱图。

具体实施方式

[0014] 下面结合实例和附图，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

[0015] 所述含有末端炔基的糖参照文献[H.B.Mereyala and S.R.Gurrala，Carbohy.Resear.，1998，307，351-354；A.K.Pathak，et al，Carbohy.Resear.，2004，339，683-691]方法制备，简要过程如下：在乙酸酐溶液中加入糖，加热回流2～4小时，冷却至室温，倒入冰水中析出固体，即得乙酰糖；将全乙酰糖溶于二氯甲烷中，然后冰水浴中加入丙炔醇和三氟化硼/乙醚，室温下搅拌2～4小时，加入K2CO3继续搅拌30分钟，过滤除去固体，浓缩干燥滤液得固体产品，用二氯甲烷/正己烷重结晶即得炔化乙酰糖；将炔化乙酰糖溶于甲醇溶液中，缓慢滴加甲胺醇溶液，室温搅拌12～24小时，浓缩干燥溶液得油状固体，过硅胶柱色谱纯化即得炔基糖。

[0016] 所述3-叠氮基丙基硅胶参照文献[Z.M.Guo，et al，Chem.Commun.，2006，4512-4514]方法制备，简要过程如下：在甲苯中加入氯丙基三甲氧基硅烷和叠氮化钠，于
70～80℃条件下反应24小时。然后往反应体系中加入经160℃加热6～18小时的微球型硅胶，在60～130℃条件下继续反应24小时，用砂芯漏斗过滤，依次用二氯甲烷，甲醇，水，丙酮洗涤，所得固体于真空干燥箱中40～80℃条件下干燥6～12小时，即得3-叠氮基丙基硅胶。

[0017] 实施例1

[0018] 在250mL烧瓶中加入80mL甲醇和80mL水，然后加入4.5g含末端炔基的麦芽糖，3g 3-叠氮基丙基硅胶，在70℃条件下反应48小时，用砂芯漏斗过滤，依次用甲醇，水，甲醇洗涤，所得固体于真空干燥箱中60℃条件下干燥12小时，即得不含重金属残留的麦芽糖基固定相。元素分析表征结果显示该固定相碳含量为8.65％，氮含量为3.46％，证实麦芽糖被成功的键合到硅胶表面。

[0019] 所得到的麦芽糖基固定相，用匀浆法填装4.6×150mm不锈钢色谱柱，分离壳寡糖的色谱图如图1所示，聚合度为2～7的壳寡糖得到了很好的分离。图1所用色谱条件为：流动相A为100mM甲酸铵水溶液(pH 3.0)，流动相B为乙腈。流动相流速为1.0mL/min，梯度为：0～30min，25％A～50％A。

[0020] 对照例1

[0021] 与实施例1不同之处在于使用重金属铜作为催化剂，具体过程为：在250mL烧瓶中加入80mL甲醇和80mL水，然后加入5.6g含末端炔基的麦芽糖，0.075g CuSO4和0.24gNaAsc，3g 3-叠氮基丙基硅胶，在70℃条件下反应48小时，用砂芯漏斗过滤，依次用甲醇，水，10％EDTA水溶液，水，甲醇洗涤，所得固体于真空干燥箱中60℃条件下干燥12小时。

[0022] 所得到的麦芽糖基固定相，用匀浆法填装4.6×150mm不锈钢色谱柱，分离壳寡糖的色谱图如图2所示，没有色谱峰出现，即壳寡糖在该固定相产生死吸附，无法流出。壳寡糖产生死吸附的主要原因是固定相上残留的铜离子与壳寡糖分子中的氨基具有较强的螯合作用。所用色谱条件与实施例1相同。

[0023] 实施例2

[0024] 在1000mL烧瓶中加入600mL二甲亚砜，然后加入50g含末端炔基的麦芽糖，10g3-叠氮基丙基硅胶，在100℃条件下反应24小时，用砂芯漏斗过滤，依次用甲醇，水，甲醇洗涤，所得固体于真空干燥箱中40℃条件下干燥24小时，即得不含重金属残留的麦芽糖基固定相。元素分析表征结果显示该固定相碳含量为7.26％，氮含量为3.58％，证实麦芽糖被成功的键合到硅胶表面。

[0025] 实施例3

[0026] 与实施例1不同之处在于，采用葡萄糖代替麦芽糖，按实施例1的合成步骤可得无重金属残留的葡萄糖固定相。

[0027] 实施例4

[0028] 与实施例1不同之处在于，采用麦芽三糖代替麦芽糖，按实施例1的合成步骤可得无重金属残留的麦芽三糖固定相。

[0029] 实施例5

[0030] 与实施例1不同之处在于，采用纤维十糖代替麦芽糖，按实施例1的合成步骤可得无重金属残留的纤维十糖固定相。