一种嚏根草配基空间异构体化合物及其制备和应用转让专利
申请号 : CN200910248445.0
文献号 : CN102101878B
文献日 : 2013-02-27
发明人 : 梁鑫淼 , 刘艳芳 , 张秀莉 , 丰加涛 , 肖远胜 , 薛兴亚
申请人 : 中国科学院大连化学物理研究所
摘要 :
本发明提供了一种嚏根草配基空间异构体化合物及其制备和应用，通过大孔树脂和二维制备色谱分离技术从传统中药蟾皮中制备嚏根草配基空间异构体化合物，其主要制备步骤为将蟾皮剪碎，乙醇提取，总提物经大孔树脂分离得蟾蜍二烯内酯提取物，再经过二维制备色谱分离纯化得到该化合物。经体外实验证明其具有较好的抑制肿瘤细胞的作用。
权利要求 :
1.一种嚏根草配基空间异构体化合物的制备方法，其特征在于：
1)取蟾蜍二烯内酯提取物，经制备型HPLC分离，色谱条件为：反相Xterra C18色谱柱，A：0.1％v/v甲酸水；B：0.1％v/v甲酸乙腈，梯度洗脱：5％B～95％B，60min；分离过程中采用紫外检测器检测，检测波长300nm，按检测过程中不同样品峰的保留时间分别收集各馏分，共收集20个馏分；
2)取Fraction 5回收溶剂，经HPLC分离，色谱条件为：环糊精色谱柱，A：正己烷；B：异丙醇，梯度洗脱：5％B～30％B，55min，收集各个色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物I的馏分；
取Fraction 6回收溶剂，经HPLC分离，色谱条件为：环糊精色谱柱，A：0.1％v/v甲酸水；B：0.1％v/v甲酸乙腈，梯度条件：95％B～60％B，40min，收集各个色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物II的馏分；
取Fraction 10回收溶剂，经HPLC分离，色谱条件为：环糊精色谱柱，A：水；B：甲醇，梯度洗脱：5％B～50％B，35min，收集各个色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物III的馏分；
化合物I， 化合物II，
化合物III。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
所述蟾蜍二烯内酯提取物的制备过程为：蟾皮用乙醇提取，回收乙醇后浓缩液上大孔树脂，先用水及低浓度乙醇洗脱，再用高浓度乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂即得蟾蜍二烯内酯提取物；
低浓度乙醇是指10％～50％的乙醇，高浓度乙醇是指70％～100％的乙醇。
3.根据权利要求2的制备方法，其特征在于：所述蟾蜍二烯内酯提取物中蟾蜍二烯内酯的重量百分含量为60％～90％。
说明书 :
一种嚏根草配基空间异构体化合物及其制备和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及二烯内酯类化合物，具体地说是一种嚏根草配基空间异构体新化合物及其制备方法，其是一种通过大孔树脂处理和二维制备色谱分离技术从传统中药蟾皮中制备分离出来的新化合物。
背景技术
[0002] 蟾蜍是中医临床应用较早的药物，在我国己有上千年的临床应用历史。其药用部位为：皮、蟾酥、干燥全体。蟾皮有清热解毒、利水消胀之功效，辛、凉、微毒，主治痈疽、肿毒，我国民间多用来治疗原发性肝癌、肺癌等，具有较好的临床效果(代丽萍等.药学学报，2007，42(8)：858-861)。
[0003] 二烯内酯类化合物是蟾皮中的主要的活性成分，现代药理学研究表明其具有强心、抗菌、抗肿瘤等作用(贾彩云等.中草药，2005，36(2)：244；Enomoto A，et al.J Nat Prod，2004，67(12)：2070；Cunha Filho GA，et al.Toxicon，2005，45(6)：777；Usanova IV，et al.Eksp Klin Farmakol，2002，65(4)：23)。
[0004] 目前报道的该类化合物有250多种，但空间异构体的报道极少。然而空间异构体，尤其是手性异构体在生物活性上可能有较大差异，是制药领域的研究热点之一。
发明内容
[0005] 鉴于此，本发明人经过深入研究，从中华大蟾蜍干燥皮中提取分离得到一种新的蟾蜍二烯内酯类化合物，经体外实验证明其具有较好的抑制肿瘤细胞的作用。
[0006] 本发明提供了一种嚏根草配基空间异构体新化合物，所述化合物具有如下所示三种结构式之一，
[0007] 化合物I
[0008] 化合物II
[0009] 化合物III
[0010] 本发明提供了蟾蜍二烯内酯提取物的提取方法：蟾皮用乙醇提取，回收乙醇后浓缩液上大孔树脂，先用水及低浓度乙醇洗脱，再用高浓度乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂即得蟾蜍二烯内酯类提取物，蟾蜍二烯内酯提取物中蟾蜍二烯内酯的重量百分含量为60％～90％。
[0011] 其中所说的低浓度乙醇是指5％～50％的乙醇，高浓度乙醇是指70％～100％的乙醇。
[0012] 其中所说的大孔树脂可以选择非极性或极性大孔树脂，所说的非极性大孔树脂可以选择AB-8，D-101，XAD-4，X-5，HPD-100；所说的极性大孔树脂可以选择HPD-400，S-8，NAK-9。
[0013] 本发明还提供了蟾蜍二烯内酯类化合物的制备方法：取蟾蜍二烯内酯提取物，采用二维HPLC制备色谱纯化后可获得高纯度单体，第一维采用反相色谱柱，第二维采用环糊精色谱柱。
[0014] 所述化合物具体制备方法为：
[0015] 1)取蟾蜍二烯内酯提取物，经制备型HPLC分离，色谱条件为：反相Xterra C18色谱柱，A：0.1％(v/v)甲酸水；B：0.1％(v/v)甲酸乙腈，梯度洗脱：5％B～95％B，60min。分离过程中采用紫外检测器检测，检测波长300nm，按检测过程中不同样品峰的保留时间分别收集各馏分，共收集20个馏分；
[0016] 2)取Fraction 5回收溶剂，经HPLC分离，色谱条件为：环糊精色谱柱，A：正己烷；B：异丙醇，梯度洗脱：5％B～30％B，55min，收集各个色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物I的馏分；
[0017] 取Fraction 6回收溶剂，经HPLC分离，色谱条件为：环糊精色谱柱，A：0.1％(v/v)甲酸水；B：0.1％(v/v)甲酸乙腈，梯度条件：95％B～60％B，40min，收集各个色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物II的馏分；
[0018] 取Fraction 10回收溶剂，经HPLC分离，色谱条件为：环糊精色谱柱，A：水；B：甲醇，梯度洗脱：5％B～50％B，35min，收集各个色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物III的馏分。
[0019] 所述的化合物可在制备治疗和预防实体瘤的药物中的应用，如：宫颈癌、乳腺癌等。
[0020] 本发明提供了一种通过大孔树脂和二维制备色谱分离技术从传统中药蟾皮中制备嚏根草配基空间异构体新化合物的方法。经体外实验证明其具有较好的抑制肿瘤细胞的作用。具体实施方案
[0021] 现结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
[0022] 实施例1：蟾蜍二烯内酯提取物的制备
[0023] 取蟾皮5Kg用95％乙醇提取3次，用醇量为10倍，每次提取时间为120分钟，合并滤液，滤液减压浓缩至5L，上大孔树脂，先用水洗脱，再用5％～50％乙醇洗脱，再用70％～100％的乙醇洗脱，收集后者，减压回收溶剂，干燥得到蟾蜍二烯内酯提取物62g。
[0024] 实施例2：蟾蜍二烯内酯馏分制备
[0025] 取实施例1所得到的蟾蜍二烯内酯提取物，经制备型HPLC分离(XterraC18，A：0.1％(v/v)甲酸水；B：0.1％(v/v)甲酸乙腈，梯度条件：5％B～95％B，60min；)，分离过程中采用紫外检测器检测，检测波长300nm。按检测过程中不同样品峰的保留时间分别收集各馏分；共收集20个馏分(Fraction1～20)。
[0026] 实施例3：化合物I的制备
[0027] Fraction 5回收溶剂，经HPLC分离(环糊精色谱柱，A：正己烷；B：异丙醇，梯度条件：5％B～30％B，55min)，收集其中主要的色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物I(峰3)的馏分3mg，HPLC检测含量为99％，经理化测定，数据如下：白色1
粉末，HR-MS，[M+H]+(m/z)：417.2275，UV：298nm，HNMR(CD3OD，400MHz)δ：10.12(1H，s)，
8.01(1H，dd，J＝9.6，1.6)，7.56(1H，s)，6.43(1H，d，J＝9.6)，3.55(1H，m)，2.17(1H，d，
13
J ＝ 5.6)，0.78(1H，s) 等；CNMR(CD3OD，100MHz)δ：210.2，167.9，155.4，145.1，133.2，
117.5，86.2，70.8，69.3，55.7，51.2，47.3，43.2，42.5，35.7，36.8，31.2，31.6，26.3，25.2，
23.9，22.4，19.7。
粉末，HR-MS，[M+H]+(m/z)：417.2275，UV：298nm，HNMR(CD3OD，400MHz)δ：10.12(1H，s)，
8.01(1H，dd，J＝9.6，1.6)，7.56(1H，s)，6.43(1H，d，J＝9.6)，3.55(1H，m)，2.17(1H，d，
13
J ＝ 5.6)，0.78(1H，s) 等；CNMR(CD3OD，100MHz)δ：210.2，167.9，155.4，145.1，133.2，
117.5，86.2，70.8，69.3，55.7，51.2，47.3，43.2，42.5，35.7，36.8，31.2，31.6，26.3，25.2，
23.9，22.4，19.7。
[0028] 实施例4：化合物II的制备
[0029] Fraction 6回收溶剂，经HPLC分离(环糊精色谱柱，A：0.1％(v/v)甲酸水；B：0.1％(v/v)甲酸乙腈，梯度条件：95％B～60％B，40min)，收集其中主要的色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物I(峰4)的馏分2mg，HPLC检测含量为98％，经
1
理化测定，数据如下：白色粉末，HR-MS，[M+H]+(m/z)：417.2281，UV：300nm，HNMR(CD3OD，
400MHz)δ：9.92(1H，s)，7.89(1H，dd，J ＝ 10，2.4)，7.34(1H，s)，6.18(1H，d，J ＝ 10)，
13
3.83(1H，m)，2.46(1H，dd，J＝8.8，6.4)，0.58(1H，s)等；CNMR(CD3OD，100MHz)δ：208.5，
163.4，149.2，147.9，123.5，114.1，84.2，74.4，66.4，53.8，50.5，42.2，41.8，40.1，38.9，
37.0，30.9，30.5，28.6，28.2，24.0，21.0，21.8。
1
理化测定，数据如下：白色粉末，HR-MS，[M+H]+(m/z)：417.2281，UV：300nm，HNMR(CD3OD，
400MHz)δ：9.92(1H，s)，7.89(1H，dd，J ＝ 10，2.4)，7.34(1H，s)，6.18(1H，d，J ＝ 10)，
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3.83(1H，m)，2.46(1H，dd，J＝8.8，6.4)，0.58(1H，s)等；CNMR(CD3OD，100MHz)δ：208.5，
163.4，149.2，147.9，123.5，114.1，84.2，74.4，66.4，53.8，50.5，42.2，41.8，40.1，38.9，
37.0，30.9，30.5，28.6，28.2，24.0，21.0，21.8。
[0030] 实施例5：化合物III的制备
[0031] Fraction 10回收溶剂，经HPLC分离(环糊精色谱柱，A：水；B：甲醇，梯度条件：5％B～50％B，35min)，收集其中主要的色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物I(峰1)的馏分5mg，HPLC检测含量为99％，经理化测定，数据如下：白色粉末，HR-MS，
1
[M+H]+(m/z)：417.2264，UV：299nm，HNMR(CD3OD，400MHz)δ：9.14(1H，s)，8.67(1H，dd，J＝
9.7，2.2)，8.34(1H，s)，7.18(1H，d，J＝9.5)，4.43(1H，d＝4.2)，3.78(1H，dd，J＝7.3，
13
5.5)，1.01(1H，s)等；CNMR(CD3OD，100MHz)δ：211.4，175.3，151.2，149.5，128.3，119.0，
90.8，85.6，68.3，57.4，56.2，46.4，45.2，43.9，39.2，38.3，34.2，35.6，27.3，29.2，25.9，
20.7，20.3。
1
[M+H]+(m/z)：417.2264，UV：299nm，HNMR(CD3OD，400MHz)δ：9.14(1H，s)，8.67(1H，dd，J＝
9.7，2.2)，8.34(1H，s)，7.18(1H，d，J＝9.5)，4.43(1H，d＝4.2)，3.78(1H，dd，J＝7.3，
13
5.5)，1.01(1H，s)等；CNMR(CD3OD，100MHz)δ：211.4，175.3，151.2，149.5，128.3，119.0，
90.8，85.6，68.3，57.4，56.2，46.4，45.2，43.9，39.2，38.3，34.2，35.6，27.3，29.2，25.9，
20.7，20.3。