一种改进的渗透培养基浸花法转化玉米的方法

摘要

本发明涉及一种改进的浸花法转化玉米的方法，其特征在于渗透培养基的表面活性剂为Kinetic和Induce，渗透调节剂为甘露醇，并添加抗氧化剂DTT和L-Cysteine，添加抗生素。利用本发明的浸花法转化玉米转，具有简便、高效及低成本等特点。

权利要求

1.一种改进的农杆菌介导的浸花法转化玉米的方法，其特征在于该方法的渗透培养基含有甘露醇5%+6-BA 4μg/L+As 200uM+DTT 1mM+L-Cysteine 8.8mM+Kinetic或Induce

50μl/L+Amp 50mg/L，pH=5.8。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Kinetic的pH为5.0-6.0，所述Induce的pH为4.0-6.0。

说明书

一种改进的渗透培养基浸花法转化玉米的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种农杆菌介导的，使用改进的渗透培养基，利用浸花法转化玉米的方法与应用。

背景技术

[0002] 很大作用。此外饲料消费也是玉米最重要的消费渠道，约占消费总量的70％左右。作为工业原料使用也是玉米消费的主要渠道。玉米可开发产品众多，是粮食作物中用量最大的工业原料。玉米广泛用于生产淀粉、造纸、食品、纺织、医药等行业。以玉米淀粉为原料生产的酒精是一种清洁的“绿色”燃料，有可能在21世纪取代传统燃料而被广泛使用。 [0003] 玉米适合旱地种植，在中国播种面积很大，分布也很广，是中国北方和西南山区及其它旱谷地区人民的主要粮食之一。但目前玉米的转化技术还存在一些难题，如难于进行组织培养、转化再生能力差等。要应用基因技术改良性状，还比较困难。 [0004] 目前的转基因技术可分为物理法、化学法及生物学法。无论那一种方法，都要依靠转化细胞的脱分化和再分化这一组织培养植株再生过程，实现外源基因的转移，获得转基因植株。但是该途径有其局限性，如组织培养及转化再生能力的基因型依赖性比较强，而且有些物种难于进行组织培养，以及逃逸体、嵌合体、转化率低下、过敏反应导致感染部位的褐化坏死、细胞脱分化和再分化中产生的体细胞变异以及转基因株的育性降低或丧失都有可能干扰转基因植株的分析及应用。植物原位转基因方法是一种不需要组织或细胞培养手段而达到植物在活体而非离体手段状态下的转化。浸花法转化是植物原位转基因方法中的一种，是利用材料花序与农杆菌接触，在活体条件下，完成可遗传细胞的转化，并通过对后代的筛选，获得转化株。目前浸化花法转化已应用于双子叶植物十字花科的芸薹属作物中并获得成功，利用浸化花法转化禾本科作物未见报道。我们之前的研究已利用改进的浸化花法转化方法，成功获得禾本科作物转基因植株。在此基础上，我们对转化液的成分进行了改良，并取得了一定的进展。此转基因方法，具有简便、高效及低成本等特点，具有较大的实际应用价值。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种使用改进的渗透培养基，利用浸花法转化玉米的方法。 [0006] 本发明所提供浸花法转化玉米的方法，包括在活体条件下，将农杆菌渗透培养基注射 到待转化植株的雌花序中，利用农杆菌将目的基因整合到目的植株基因组中的方法。 [0007] 1.浸花法转化可在外界的强压下进行，也可在常温常压下进行。目前应用较多的浸花法转化要进行抽真空处理，但是对于株型较大的植物品种进行抽真空处理则不太可行。在常温常压下进的转化时，渗透培养基中需要添加能够帮助提高渗透能力的表面活性剂，通常添加的是温和的有机硅表面活性剂silwet L-77。有机硅表面活性剂是一类高效表面活性剂，本身无毒害作用，表面张力低，湿润、扩展性能好，具有很好的展着成膜性，被广泛使用。但在酸、碱或加热等条件下，其硅氧键易被裂解，结构易受到破坏。在我们的研究中，使用了另外两种渗透剂：Kinetic和Induce。因为silwet L-77在酸性条件下容易水解，而在转化时我们希望转化液是偏酸性的。silwet L-77的pH为6.0-7.0，而Kinetic的pH为5.0-6.0，Induce的pH为4.0-6.0，更符合我们实验的要求。KINETIC和Induce，在技术上避免了Silwet L-77在使用上的很多缺点，如在在某些pH值条件下易水解，且毒性太强。

[0008] 2.转化液中添加抗氧化剂DTT和L-Cysteine。我们在研究中发现，使用浸花法转化玉米雌穗时，有花丝褐变腐烂的现象，严重影响了结实率与转化率。这种外植体的褐化可能是植物对受伤和病原体侵害的一种防御反应。而这种因农杆菌的侵染和制造伤口引起的褐化和细胞死亡可能会阻碍T-DNA进入植物细胞。有文献报道，DTT和L-Cysteine可以有效的减少外植体的褐化现象，同时提高农杆菌的感染率。

[0009] 3.将转化液中的蔗糖改为甘露糖。转化液中蔗糖的主要重用是维持一定的渗透压，而甘露醇也常被作为渗透压调节剂使用。我们尝试了，在转化液种使用甘露糖作为渗透压调节剂。

[0010] 4.转化液中添加抗生素。我们发现，在以往的试验中，当向玉米雌穗苞叶中注射农杆菌转化液时，同时也会带入许多其它外源微生物，这些微生物进入到玉米雌穗苞叶中后，由于具有充足的营养与湿润的环境，很容易大量繁殖生长。这不仅影响到了农杆菌的生长，而且可能也是导致花丝腐烂的一个重要因素。我们向转化液中添加了抗生素，目的是抑制其它外源微生物，保证农杆菌的生长。

[0011] 含有本发明表达载体、细胞系、宿主菌、渗透培养基配方及转化方法均属本发明的保护范围。

[0012] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

[0013] 图1质粒KAT-A1图谱

[0014] 图2转基因植株PCR鉴定，图中ck+为质粒阳性对照，wt为野生型阴性对照，1-9为转基因植株。

[0015] 图3新旧渗透培养基转基因玉米对比，图中左图为使用新渗透培养基处理一天后的玉米花丝情况，右图为使用改良前的渗透培养基处理一天后的玉米花丝情况。 [0016] 下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法，所用试剂购自上海生工生物工程有限公司，KINETIC和Induce购自浙江泰达作物科技有限公司，引物均由上海英骏生物技术有限公司合成，PCR试剂盒来自Invitrogen公司，方法均参照试剂盒提供的方法进行。红色荧光蛋白报告基因AsRed购自美国Clontech Laboratories Inc。实验中所用的载体、菌种属于本实验室。

[0017] 实施例1、浸花法转化获得玉米转基因植株

[0018] 一、浸花法转化玉米植株

[0019] 1.实验材料

[0020] 农杆菌菌株：农杆菌菌株为Agl0，本实验室保存。含有质粒载体KAT-A1。 [0021] 质粒：KAT-A1含有来源于水母的红色荧光蛋白报告基因AsRed，带有hpt筛选标记基因，可抗Hygmycin抗生素。KAT-A1载体为本实验室构建。(如图1)

[0022] 供转化玉米品种：由我公司培育品种：K12、K36。

[0023] 2.根癌农杆菌的培养

[0024] 挑取甘油冻存的含有目的基因的农杆菌，于YEB+Amp+Rif平板上画线，28°黑暗培养2天。挑取单菌落接种于50ml抗性YEB液体培养基中，28°200rpm摇过夜。吸取上述培养物接种于1L YEB液体培养基中28°150rpm摇过夜，直至OD600＝2。将上述OD600＝2的农杆菌悬浮液在6000rpm离心15min，沉淀后的农杆菌，悬浮于渗透培养基中，用于植物转化。

[0025] 3.转化菌液准备

[0026] 配制转化用渗透培养基。渗透培养基：1/2 MS培养基+甘露糖5％+6-BA 4μg/L+As200uM+DTT 1mM+L-Cysteine 8.8mM+Kinetic or Induce 50μl/L+Amp 50mg/L pH＝5.8

[0027] 将培养好的农杆菌用渗透培养基重悬，稀释到OD600＝1.0左右备用。 [0028] 4.植株选择准备

[0029] 选取露天生长处于初花期，生长健壮的植株，作为待转化植株。对其进行编号、挂牌。

[0030] 5.农杆菌菌液浸染植物花序

[0031] 1)使用注射器，将菌液从玉米雌花序底部注射到玉米雌花序的苞皮中，直到菌液从 花序顶端溢出。

[0032] 2)浸染过程结束，所有花或雌蕊都已被浸润后，用硫酸钠纸袋将处理过的花序套住，以保持一定的湿度。

[0033] 3)重复

[0034] 整个转化过程每天进行一次，共重复三次。每次浸染后都需要套袋，纸袋可于最后一次转化后的24hr后去掉。

[0035] 7.收获

[0036] 转化后其他管理按照常规技术进行，直至种子成熟收获。每个转化植株都采取单株收种(T0代种子)，对T1代进行筛选及其它检测。

[0037] 实施例2、T1代转化株的筛选及检测

[0038] 1.T1代转化株的抗生素筛选

[0039] 将收获的T1代种子，用Hygmycin筛选。转化株由于带有hpt抗性基因，而对Hygmycin不敏感。Hygmycin筛选浓度为20mg/L，两周后选取抗性植株，做进一步的分子检测验证。

[0040] 2.T1代转化株的PCR检测

[0041] 对表现Hygmycin抗性的植株，PCR检测hpt基因。植物基因组DNA的提取采用CTAB法。根据hpt基因的序列，设计PCR扩增引物序列如下：

[0042] 引物1(上游引物)：5′TCGGCGAGTACTTCTACACAGC 3′

[0043] 引物2(下游引物)：5′CTGGCAAACTGTGATGGACGAC 3′

[0044] 利用引物1和引物2以抗性植株基因组DNA模板，扩增hpt基因，扩增体系和程序为：

[0045] 10X Buffer：2ul；

[0046] 10mM dNTP：0.5ul；

[0047] 10uM引物1：0.4ul；

[0048] 10uM引物2：0.4ul；

[0049] genomic DNA：10pg；

[0050] Taq DNA Polymerase(5U/ul)：0.5ul；

[0051] ddH2O：补足20ul。

[0052] PCR反应条件为：

[0053] 预变性：95℃，5分钟；

[0054] 变性：94℃，20秒；

[0055] 退火：55℃，30秒；

[0056] 延伸：72℃，1分钟；

[0057] 30个循环；72℃，10分钟。

[0058] 反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，可以检测到500bp的目的片段(图二)。实验结果呈阳性，证明基因已经整合到水稻基因组中，即得到T1代转基因植株。

[0059] 以上实验证明，利用我们改进的转化液，可以对玉米进行浸花法转化，对这类作物的分子育种具有重要意义。