一种改进的反向斑点杂交方法及应用

摘要

本发明涉及一种改进的反向斑点杂交方法，本方法通过对常规的反向斑点杂交方法在步骤上的优化，减少了反向斑点杂交实验操作的步骤和时间，而两者方法在检测效果上无差异。本发明方法在反向斑点杂交产品上的应用有助于其在临床检测领域的推广。

权利要求

1.一种反向斑点杂交方法，该方法分为三步，其中第一步为将带标记的PCR产物与固定好探针的膜条和杂交液I在杂交温度下杂交，第三步为加入显色底物和显色液，室温显色5～30min，其特征在于第二步为弃杂交液I，加入预热到洗脱温度的杂交液II和酶在洗脱温度下洗脱；其靶基因为β地中海贫血基因和HCV基因，检测β地中海贫血基因的引物和探针为中山大学达安基因股份有限公司生产的β地中海贫血检测试剂盒中所使用的引物和探针；

检测HCV基因的引物为：

逆转录(RT)引物：5′-GCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACCT-3′(SEQ ID NO：1)聚合酶链反应扩增体系中使用的上游和下游引物序列分别为：PCR上游引物：5′-TCTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGT-3′(SEQ ID NO：2)PCR下游引物：5′-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT-3′(SEQ ID NO：3)寡核甘酸探针均为5′端标记氨基标记，其中探针IC 5′端标记氨基，3′端标记生物素，序列分别是：探针1：5′-CAATGCCTGGAGATTTGGGCG-3′(SEQ ID NO：4)探针1b-1：5′-CCGCGAGACTGCTAGCCG-3′(SEQ ID NO：5)探针1b-2：5′-GCGAGACCGCTAGCCGAGT-3′(SEQ ID NO：6)探针2-1：5′-AGTAGCGTTGGGTTGCGAAAG-3`(SEQ ID NO：7)探针2-2：5′-GTCCTTTCTTGGATAAACCCAC-3′(SEQ ID NO：8)探针2a-1：5′-GCCGGGAAGACTGGGTCCT-3′(SEQ ID NO：9)探针2a-2：5′-CCCACTCTATGCCCGGCCA-3′(SEQ ID NO：10)探针3-1：5′-CCCGCGAGATCACTAGCCG-3′(SEQ ID NO：11)探针3-2：5′-AATCGCTGGGGTGACCGGG-3′(SEQ ID NO：12)探针3b：5′-CGCGCTCAATGCCCGGAAAT-3′{SEQ ID NO：13)探针PC1：5′-ATTTGGGCGTGCCCCCGC-3′(SEQ ID NO：14)探针PC2：5′-CGGAACCGGTGAGTACACC-3′(SEQ ID NO：15)探针IC：5′-GCCGTAACCGTCACAATCCGT-3′(SEQ ID NO：16)；

其特征还在于所使用的酶包括辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。

2.根据权利要求1的反向斑点杂交方法，其特征还在于杂交液I的组成为1×SSC～

6×SSC，0.1％～1％SDS。

3.根据权利要求1的反向斑点杂交方法，其特征还在于杂交液II的组成为

0.1×SSC～1×SSC，0.1％～1％SDS。

4.根据权利要求1的反向斑点杂交方法，其特征还在于所使用的显色底物包括TMB或OPD或NBT/BCIP。

说明书

一种改进的反向斑点杂交方法及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种改进的反向斑点杂交方法，并涉及改进的反向斑点杂交方法在产品上的应用。

背景技术

[0002] 1989 年 由 Saiki 等 (Saiki RK，et al.Proc Natl Acad Sci USA.1989，86(16)：6230-4)提出了反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)技术，该技术是在PCR-ASO(Polymerase chain reaction&allelespecific oligonucleotide)技术的基础上进行了一个实用性的改进。Henry Erlich，Randall Saiki及其同事在检测HLA时提出了一个有效的改进，该方法是将靶基因在PCR过程用放射性元素标记，然后与尼龙膜杂交，从而检测靶基因的突变情况。这一方法可将多个靶基因在同一条件下进行检测从而大大提高了检测的效率。随后，其它科学家证实了该方法可以区分单个碱基的突变，利用共价键的探针固定方法代替紫外交联以及使用非放射性的生物素标记引物的方法，RDB技术的稳定性有了明显的提高。目前Inogenetics的LiPA系列产品(通过CE认证)均是基于上述的原理。

[0003] 从技术原理来说，RDB在本质上也是DNA芯片(一般是中密度芯片)的一种，但它不同于一般所说的玻璃DNA芯片，其信号特异性强，简便易行，技术要求低，仪器设备投入小，检测结果用肉眼就可直接判断，而无需购买昂贵的激光扫描仪，更符合中国目前的国情也更利于在基层医院推广。然而，目前RDB技术整个杂交过程的操作步骤比较多，操作时间也相对较长，成为大规模推广应用的阻力。基于此需求，虽然已经有相应的自动化杂交仪出现，但自动化杂交仪的价格昂贵，并非普通的基层医院可接受。而且，繁多的操作步骤，也对自动化仪器运行的稳定性提出了挑战。

[0004] 因此，需要对现有的RDB技术进行改进以更适合在临床检测中使用，目前国内外尚无与本发明相关的技术报道。

发明内容

[0005] 本发明目的是提供了一种改进的反向斑点杂交方法。

[0006] 常规的反向斑点杂交方法可以一次并行检测多个位点，而且通过固定在基底的探针可以检测不同的样品，一般分为四个步骤：

[0007] 第一步：将带标记的PCR产物与固定好探针的膜条和杂交液I在杂交温度下杂交。

[0008] 该步骤目的是将靶核酸与探针结合，为非选择性结合。

[0009] 第二步：弃杂交液I，加入预热到洗脱温度的杂交液II在洗脱温度下洗脱。

[0010] 该步骤目的是将非特异结合的核酸从探针上洗脱下来，为选择性洗脱。

[0011] 第三步：弃杂交液II，加入一定浓度的能与标记物结合的酶结合5～30min。

[0012] 该步骤目的是将酶与靶核酸交联；

[0013] 第四步：加入显色底物和显色液，室温显色5～30min。

[0014] 该步骤目的是酶与底物显色。

[0015] 第一步中PCR产物的标记常用的包括生物素标记，地高辛标记，也可采用其它标记。

[0016] 第一步中膜条可使用硝酸纤维素、尼龙或醋酸纤维素作为固相支持材料。

[0017] 第一步和第二步中杂交液I的组成为1×SSC～6×SSC，0.1％～1％SDS，优选的方案是2×SSC，0.5％SDS。

[0018] 第三步中杂交液II的组成为0.1×SSC～1×SSC，0.1％～1％SDS，其中优选的方案是0.5×SSC，0.5％SDS。

[0019] 第三步中标记物结合的酶要根据PCR产物的标记使用相应的酶，如与生物素标记物结合的酶包括辣根过氧化物酶(POD)、碱性磷酸酶(AP)。

[0020] 第四步中应根据酶使用相应的显色底物和显色液，如使用辣根过氧化物酶，则显色底物可以是3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine(简称TMB)，相应的显色液优选的方案为0.1M柠檬酸钠(pH4.9)，0.42mM TMB，0.004％H2O2(v/v)；显色底物也可以是1，2-phenylenediamine(简称OPD)，相应的显色液优选的方案为50mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠(pH5.0)，4mM OPD，0.004％H2O2(v/v)；但显色底物不仅局限于TMB和OPD，其他与辣根过氧化物酶结合的底物均可使用。如使用碱性磷酸酶，则显色底物可以选择氮蓝四唑(NBT/BCIP)，相应的显色液优选的方案为0.1M Tris缓冲液(pH9.5)，50mM MgSO4，0.4mg/ml NBT，
0.19mg/ml BCIP。

[0021] 以上步骤中提及的杂交温度和洗脱温度可根据融解温度(Tm值)结合具体实验来确定。

[0022] 本发明的方法是将常规的反向斑点杂交方法的第二步和第三步合并成一步，具体来说弃杂交液I，加入预热到洗脱温度的杂交液II和酶在洗脱温度下洗脱。

[0023] 该步骤可以使用在25℃～56℃均能保持酶活性的酶，优选使用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。

[0024] 该步骤中杂交液II的组成为0.1×SSC～1×SSC，0.1％～1％SDS，其中优选的方案是0.5×SSC，0.5％SDS。

[0025] 本发明的反向斑点杂交方法正是通过对常规的反向斑点杂交方法在步骤上的优化，减少了反向斑点杂交实验操作的步骤和时间，而两者方法在检测效果上无差异。通过本发明的反向斑点杂交方法的实施有利于反向斑点杂交产品在临床检测领域得到更广泛的应用，尤其是普通的基层医院。

附图说明

[0026] 图1利用传统的方法与本发明方法(包括方法A和方法B)检测β地中海贫血结果比较，编号1～3为传统的方法，对应的结果分别为CD41/42杂合子(编号1)，IVS2-654杂合子(编号2)，β珠蛋白正常(编号3)；编号4～6为本发明方法A，对应的结果分别为CD41/42杂合子(编号4)，IVS2-654杂合子(编号5)，β珠蛋白正常(编号6)，编号7～9为本发明方法B，对应的结果分别为CD41/42杂合子(编号7)，IVS2-654杂合子(编号
8)，β珠蛋白正常(编号9)。

[0027] 图2本发明方法检测HCV基因分型的实验结果，编号1～3对应的结果分别为HCV3b型，HCV 1b型，HCV 3a型。

[0028] 图3 HCV 1b型标本测序结果，结果显示该例标本为HCV 1b型。

[0029] 图4 HCV 2a型标本测序结果，结果显示该例标本为HCV 2a型。

[0030] 图5 HCV 3b型标本测序结果，结果显示该例标本为HCV 3b型。

具体实施方式

[0031] 本发明实施方式的描述，旨在通过举例说明更好地理解本发明的本质，而不是限制本发明。

[0032] 本发明实施方式所用的实验材料，如没有特别说明，均为市售产品。

[0033] 实施例1传统的方法与本发明方法在地中海贫血检测中的比较

[0034] 利用已上市试剂盒中山大学达安基因股份有限公司生产的β地中海贫血检测试剂盒，来对比本发明方法与试剂盒方法(即传统的方法)的检测结果。

[0035]

[0036]

[0037] 其中方法A使用的酶是辣根过氧化物酶，方法B使用的酶是碱性磷酸酶。选取3例临床样本，分别是CD41/42杂合子、IVS2-654杂合子、β珠蛋白正常，从实验结果看，方法A、方法B与试剂盒方法均能正确检测相应的结果，三者实施效果没有差异(参见附图1，编号1～3为传统方法，4～6为本发明方法A，7～9为本发明方法B)，而本发明方法的操作步骤比试剂盒方法减少三个步骤，操作时间至少节约30min。实验流程简化有利于质量控制和临床推广。

[0038] 实施例2本发明方法在HCV基因分型检测中的应用

[0039] 1、试剂盒使用的引物和探针序列如下：

[0040] 丙型肝炎病毒(HCV)核酸(RNA)逆转录引物序列为：

[0041] 逆转录(RT)引物：5′-GCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACCT-3′(SEQ ID NO：1)[0042] 聚合酶链反应扩增体系中使用的上游和下游引物序列分别为：

[0043] PCR上游引物：5′-TCTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGT-3′(SEQ ID NO：2)[0044] PCR下游引物：5′-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT-3′(SEQ ID NO：3)[0045] 杂交反应中使用的寡核苷酸探针均为5′端标记氨基标记，其中探针IC 5′端标记氨基，3′端标记生物素，序列分别是：

[0046] 探针1：5′-CAATGCCTGGAGATTTGGGCG-3′(SEQ ID NO：4)

[0047] 探针1b-1：5′-CCGCGAGACTGCTAGCCG-3′(SEQ ID NO：5)

[0048] 探针1b-2：5′-GCGAGACCGCTAGCCGAGT-3′(SEQ ID NO：6)

[0049] 探针2-1：5′-AGTAGCGTTGGGTTGCGAAAG-3`(SEQ ID NO：7)

[0050] 探针2-2：5′-GTCCTTTCTTGGATAAACCCAC-3′(SEQ ID NO：8)

[0051] 探针2a-1：5′-GCCGGGAAGACTGGGTCCT-3′(SEQ ID NO：9)

[0052] 探针2a-2：5′-CCCACTCTATGCCCGGCCA-3′(SEQ ID NO：10)

[0053] 探针3-1：5′-CCCGCGAGATCACTAGCCG-3′(SEQ ID NO：11)

[0054] 探针3-2：5′-AATCGCTGGGGTGACCGGG-3′(SEQ ID NO：12)

[0055] 探针3b：5′-CGCGCTCAATGCCCGGAAAT-3′{SEQ ID NO：13)

[0056] 探针PC 1：5′-ATTTGGGCGTGCCCCCGC-3′(SEQ ID NO：14)

[0057] 探针PC2：5′-CGGAACCGGTGAGTACACC-3′(SEQ ID NO：15)

[0058] 探针IC：5′-GCCGTAACCGTCACAATCCGT-3′(SEQ ID NO：16)

[0059] 2、试剂盒使用的杂交载体的制备

[0060] 用作杂交载体的膜条由尼龙膜作为固相支持材料制成。合成的探针用TE溶液稀释后参照下表所示的阵列以适当方式固定在膜条的适当位置。其中两条通用探针稀释成一管，其中PC1浓度为10pmol/μl，PC2浓度为20pmol/ul，将合并成一管后将探针点至膜条11#位置，形成通用探针点(PC点)；其它探针浓度均为10pmol/μl，将稀释好探针点样至膜条相应位置并晾凉后用0.2mol/L NaOH溶液处理膜条并用蒸馏水充分洗涤，然后保存于
4℃备用。

[0061] 将探针通过紫外线交联，以及用氨基标记的探针交联40％(g/v)EDC(N-乙基-N′-[二四基氨丙基]-碳二亚胺)处理过的尼龙膜。

[0062] 探针的点样阵列如下表所示：

[0063]

[0064] 3、核酸的提取

[0065] 采用Qiagen RNA提取试剂盒提取样品中的丙型肝炎病毒RNA。

[0066] 4、RNA的逆转录体系

[0067] 25μl体系中使用Ambion的RETROscriptTM试剂盒(按说明书要求操作)，加入1μl10mM逆转录(RT)引物，5μl RNA，逆转录反应条件为44℃60分钟，92℃10分钟。

[0068] 5、核酸扩增体系

[0069] 50μl核酸扩增体系包括10mM Tris-HCl(pH8.30)，50mM KCl，3mM MgCl2，100μM PCR上游引物，100μM PCR下游引物，200μM dNTPs，2U TaqE(Promega)及2μl逆转录产物，扩增反应条件为：94℃5分钟，94℃30秒，55℃30秒，72℃45秒，运行40个循环，最后72℃7分钟。

[0070] 6、反向斑点杂交

[0071] 实验步骤如下：

[0072] Step1：准备5ml的塑料管，编号。镊取RDB膜条并编号，对应将膜条放入塑料管中。

[0073] Step2：PCR产物在PCR仪上98℃变性5min，放置冰上。

[0074] Step3：往塑料管中加入4ml杂交液I(2×SSC，0.5％SDS)，再加入变性的PCR扩增产物，10min后置于50℃水浴1h。

[0075] Step4：将膜条转入装有40ml杂交液B(0.5×SSC，0.5％SDS，1％Tween20)的塑料管中，加入2U Streptavidin-POD，50℃振荡15min。

[0076] Step5：配制显色液(20ml 0.1M柠檬酸钠+1ml 5mg/ml四甲基联苯胺+10.0μl3％H2O2)，20～30℃将膜条浸泡于显色液中避光显色3～10min。

[0077] Step6：采集电子图像。

[0078] 结果判读如下表所示：

[0079]显色情况 基因型
11#，12#探针显色，其余无显色 HCV感染
11#，12#探针显色，且1#探针显色，其余无显色 1型感染
11#，12#探针显色，且2#，3#探针同时或者其中之一显色，其余无显色 1b型感染
11#，12#探针显色，且4#，5#探针同时或者其中之一显色，其余无显色 2型感染
11#，12#探针显色，且6#，7#探针同时或者其中之一显色，其余无显色 2a 型感染
11#，12#探针显色，且8#，9#探针同时或者其中之一显色，其余无显色 3型感染
11#，12#探针显色，且10#探针显色，其余无显色 3b型感染

[0080] 选取金标准方法测序确认分别为HCV 1b型、2a型和3b型的三例标本，使用本发明方法进行检测，结果与测序结果完全相符，具体参见附图2～5。

[0081] 序列表

[0082] <110>中山大学达安基因股份有限公司

[0083] <120>一种改进的反向斑点杂交方法及应用

[0084] <140>

[0085] <141>

[0086] <160>16

[0087] <210>1

[0088] <211>27

[0089] <212>DNA

[0090] <213>人工序列

[0091] <220>

[0092] <223>根据特定核苷酸序列设计，以用作逆转录引物。

[0093] <400>1

[0094] gctcatggtgcacggtctacgagacct

[0095] <210>2

[0096] <211>26

[0097] <212>DNA

[0098] <213>人工序列

[0099] <220>

[0100] <223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR引物。

[0101] <400>2

[0102] tctagccatggcgttagtatgagtgt

[0103] <210>3

[0104] <211>26

[0105] <212>DNA

[0106] <213>人工序列

[0107] <220>

[0108] <223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR引物。

[0109] <400>3

[0110] cactcgcaagcaccctatcaggcagt

[0111] <210>4

[0112] <211>21

[0113] <212>DNA

[0114] <213>人工序列

[0115] <220>

[0116] <223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。

[0117] <400>4

[0118] caatgcctggagatttgggcg

[0119] <210>5

[0120] <211>18

[0121] <212>DNA

[0122] <213>人工序列

[0123] <220>

[0124] <223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。

[0125] <400>5

[0126] ccgcgagactgctagccg

[0127] <210>6

[0128] <211>19

[0129] <212>DNA

[0130] <213>人工序列

[0131] <220>

[0132] <223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。

[0133] <400>6

[0134] gcgagaccgctagccgagt

[0135] <210>7

[0136] <211>21

[0137] <212>DNA

[0138] <213>人工序列

[0139] <220>

[0140] <223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。

[0141] <400>7

[0142] agtagcgttgggttgcgaaag

[0143] <210>8

[0144] <211>22

[0145] <212>DNA

[0146] <213>人工序列

[0147] <220>

[0148] <223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。

[0149] <400>8

[0150] gtcctttcttggataaacccac

[0151] <210>9

[0152] <211>19

[0153] <212>DNA

[0154] <213>人工序列

[0155] <220>

[0156] <223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。

[0157] <400>9

[0158] gccgggaagactgggtcct

[0159] <210>10

[0160] <211>19

[0161] <212>DNA

[0162] <213>人工序列

[0163] <220>

[0164] <223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。

[0165] <400>10

[0166] cccactctatgcccggcca

[0167] <210>11

[0168] <211>19

[0169] <212>DNA

[0170] <213>人工序列

[0171] <220>

[0172] <223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。

[0173] <400>11

[0174] cccgcgagatcactagccg

[0175] <210>12

[0176] <211>19

[0177] <212>DNA

[0178] <213>人工序列

[0179] <220>

[0180] <223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。

[0181] <400>12

[0182] aatcgctggggtgaccggg

[0183] <210>13

[0184] <211>19

[0185] <212>DNA

[0186] <213>人工序列

[0187] <220>

[0188] <223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。

[0189] <400>13

[0190] gccgggaagactgggtcct

[0191] <210>14

[0192] <211>18

[0193] <212>DNA

[0194] <213>人工序列

[0195] <220>

[0196] <223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。

[0197] <400>14

[0198] atttgggcgtgcccccgc

[0199] <210>15

[0200] <211>19

[0201] <212>DNA

[0202] <213>人工序列

[0203] <220>

[0204] <223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。

[0205] <400>15

[0206] cggaaccggtgagtacacc

[0207] <210>16

[0208] <211>21

[0209] <212>DNA

[0210] <213>人工序列

[0211] <220>

[0212] <223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。

[0213] <400>16

[0214] gccgtaaccgtcacaatccgt