一种对A型流感病毒复制有抑制作用的siRNA及其编码序列

摘要

本发明公开了一条对流感病毒复制有抑制作用的siRNA；针对H1N1的shRNA表达载体pU6-siH1N1的构建及其对A型流感病毒的干扰作用的鉴定技术。本发明首先利用分子生物学的实验技术构建了十几条siRNA的表达载体；然后通过鸡胚实验测HA滴度的方法确定了siRNA对流感病毒干扰的有效性。

权利要求

1.一种对A型流感病毒复制有干扰作用的siRNA，其核苷酸序列如序列表Seq ID No:2所示。

2.权利要求1所述的siRNA在制备作为治疗A型流感病毒感染的药物中的应用。

3.含有权利要求1所述的siRNA的表达载体。

说明书

一种对A型流感病毒复制有抑制作用的siRNA及其编码序

列

[0001] 本申请是以下发明专利申请的分案申请：

[0002] 申请日：2008年3月6日

[0003] 申请号：200810026651.2

[0004] 发明名称：对A型流感病毒复制有抑制作用的siRNA及其编码序列技术领域

[0005] 本专利涉及对流感病毒有干扰作用的siRNA序列的设计和干扰作用的鉴定背景技术

[0006] 流行性感冒(Influenza)，简称流感，被称为最古老和最致命的人类瘟疫之一。据历史记载，早在1510年英国就发生了由全球第一起由流感引起的流行病。如今，美国每年有2万人死于流感，俄罗斯每年也有1万人死于流感，英国每年有5万人由流感发展成肺炎，其中约20％死亡。据估计，全球每年流感患者死亡人数高达60万人，多于艾滋病患者死亡的人数。美国已将流感列为继心脏病、癌症、中风、肺气肿之后的威胁生命的第五大“杀手”。

[0007] 流行性感冒，是由甲(A)、乙(B)、丙(C)三型流行性感冒病毒(Influenzavirus)分别引起的急性呼吸道传染病。甲乙丙不仅反映了病毒被发现的年代及前后顺序，更主要的是反映了对人类危害程度的顺序。甲型变动常以流行形式出现，引起世界性流感大流行，在动物中分布广泛，并也能在动物引起流感流行和造成大量动物死亡。

[0008] 尽管由死病毒、减毒毒株或重组表面糖蛋白组成的抗流感疫苗能够有效地保护约70～80％的健康成年人免于患病，但是疫苗只能针对一小部分毒株，对于新的潜在爆发的毒株可能没有作用。而且，对于高风险人群如婴孩、老人、孕妇和其它各种免疫力低下的人群，疫苗的保护作用是非常有限的，保护率低于40％。由于大部分的死亡都是发生在高风险人群中，疫苗对于这些最需要它们的人却不能起到很好的保护作用。正在应用的几种抗流感药物也能够降低流感感染的发生和减轻流感感染时的症状。但是，药物的副作用、病人的承受能力、可能出现的抗药性变异限制了这些药物的大规模使用。所以，对于预防和治疗流感病毒感染的方法仍然有很急切的需要，特别是在高风险人群中和爆发流感时。因此，流感的防治至少在今后50年内仍然是一个严重的问题，寻找更有效的预防和治疗途径是医学研究的重大课题。

[0009] RNA干扰(RNA interference，RNAi)是1998年首先在线虫发现的由双链RNA介导的序列特异性的转录后基因沉默机制。RNAi一经发现，迅速成为生物学研究领域中最为活跃的热点之一，Science杂志在2001年将其列为十大科学成就之一，2002年又将其列为十大科技之首；Nature杂志也将小RNA评为2002年度最重要的科技发现之一；Andrew Z.Fire和Craig C.Mello因RNA干扰的发现而获得了2006年诺贝尔生理医学奖。随着广泛深入的实验研究的进行，人们对RNAi的机制有了更多的了解。

[0010] 目前认为RNAi的主要过程为：①siRNA形成阶段。RNAi的诱导物在细胞质内被RNaseIII Dicer切割成为21-23nt的小分子干扰RNA(small interferingRNA，siRNA)，siRNA的结构特征是5′端单磷酸，3′端羟基，而且3′端有2～3-nt的碱基突出；②RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced Silencing Complex，RISC)的形成阶段。siRNA与RNAi特异性酶(如Ago-2)结合，形成RISC，具有特异性的核酸内切酶活性能特异性地降解与siRNA同源的mRNA；③效应阶段。RISC中siRNA变性，双链解开，卸下正义RNA，反义RNA仍结合在复合物上，并引导RISC与同源的靶目标mRNA结合，在核酸内切酶的作用下，将靶目标mRNA切断(切割位置在siRNA的中央，距离5′端10-nt)，从而阻断了其翻译成蛋白质，表现为基因沉默。miRNA导致基因沉默的机制与此稍有不同，它们与靶mRNA 3′非编码区(untranslated region，UTR)通过不完全互补结合，抑制翻译过程和蛋白质的合成。

[0011] RNAi能够被迅速应用于多种生物和功能的研究，得益于它的实验方法相对简单，周期短，表型易于观察。RNAi实验中最关键的因素是干扰靶点的选择、siRNA的制备和基因导入方法

[0012] 作为一种快速、有效、特异的抑制基因表达的工具，尤其是发现在哺乳动物细胞也存在这一机制后，RNAi被广泛用于基因功能的研究以及肿瘤、病毒性疾病和遗传性疾病的治疗研究。

[0013] 自2003年以来RNAi抗IAV的已经有很多，有细胞水平的，也有动物水平的，有用合成的siRNA的，也有用载体的。Ge等针对A型流感病毒病毒的八个基因设计并合成了20个siRNA，与H1N1共转染MDCK细胞和十日龄鸡胚，结果提示以NP和PA基因为靶点的siRNA对A型流感病毒病毒感染有较好的抑制作用。Eric Ka-Wai Hui等通过研究指出以病毒的M基因为靶点的化学合成siRNA能够特异性地抑制293T细胞中流感病毒的基质蛋白M1的表达，并且利用慢病毒载体来表达针对M基因的siRNAs同样能够特异性地抑制MDCK细胞中M1的表达和流感病毒的复制。我国学者郭骁才等采用自己编写的计算机程序结合系统发育重建方法，对6101个siRNA分子进行了计算机筛选，结果表明设计的siRNA的分子针对NP和PB1应该是最有效的。在动物水平实验上，Stephen等证明了针对A型流感病毒H1N1的NP和PA高度保守区域的特异的siRNA能够抑制病毒在小鼠体内的复制，并且能够抑制多种H5和H7亚型病毒的体内复制。另外，Qing Ge等发现将化学合成的siRNAs和一种多聚阳离子载体PEI一起静脉注射到小鼠后眼窝，可以抑制病毒感染的小鼠的肺部内的病毒复制。同样的结果也可见于小鼠被能够表达siRNAs前体的慢病毒载体与PEI共注射或与Infasurf共灌输到小鼠肺部。发明内容：

[0014] 本发明的目的在于提供3条对A型流感病毒复制有抑制作用的siRNA及其编码序列。所述的3条对A型流感病毒复制有抑制作用的siRNA的序列分别如序列表400<1>、400<2>和400<3>所示。

[0015] 本发明所述的三条siRNA的动物水平的实验结果表明，RNAi不但能有效抑制H1N1的病毒复制，而且能够抑制A型流感病毒其它亚型(如H3N1)的复制，为其用于流感的治疗和预防提供了实验依据。

具体实施方式

[0016] 以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

[0017] 实施例1：siRNA序列的设计和靶点的选择

[0018] 设计和合成siRNA应遵循的一般原则是：①应避免选择5′和3′端UTR和起始密码区；②应根据目的基因的mRNA，选择其AUG起始密码子下游50～100nt区域处的编码序列；③GC含量应在30％～50％之间；④尽量避免3个同样的核苷酸连续出现；⑤每条链的3′端要有2个碱基(最好是TT)突出；⑥最后，选择的DNA片段经BLAST查询，应与其它人类基因无同源性，以避免非特异性抑制。

[0019] 采用这一原则，设计出序列表所述的三条siRNA序列<400>1、<400>2、以及<400>3，并采用常规方法进行合成，进行以下的试验。

[0020] 实施例2：shRNA表达载体的构建

[0021] 以129Sv/Ev小鼠基因组DNA为模板进行PCR，扩增出276bp的U6启动子序列。PCR产物经EcoRI和XbaI双酶切，与经同样双酶切的pBluescript载体(美国Stratagene公司)连接得到载体pU6P，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒进行测序，以证实插入序列的正确性。

[0022] 实施例3：pU6-siH1N1载体的构建

[0023] 载体pU6P用EcoRV-Xba I双酶切，质粒酶切产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分离，切胶用胶回收试剂盒进行胶回收，与合成的siRNA寡核苷酸链进行连接反应。转化后挑取阳性克隆。

[0024] 实施例4：鸡胚实验验证pU6-siH1N1干扰H1NI流感病毒增殖的有效性[0025] 同时注射H1N1流感病毒(1000倍稀释液0.1ml)和pU6-siH1N1(5微克)进九日龄鸡胚气室下尿囊腔，33℃培养72小时，取尿囊液，测血凝效价。

[0026] 血凝试验测定尿囊液病毒滴度，具体过程如下：

[0027] (1)于微量血凝板的每孔中滴加稀释液1×PBS 50μL，根据被检样品数量定所加排数。

[0028] (2)吸取被检尿囊液分别滴加于第一列孔，每个样品50μL，然后由左至右顺序倍比稀释至第11列孔，再从第11列孔各吸取50μL弃之。最后一列不加样品作空白对照。

[0029] (3)于每孔中加入0.5％红细胞悬液50μL。

[0030] (4)置微型振荡器上振荡1min，或手持血凝板绕圆圈混匀。

[0031] (5)放室温下(18～20℃)30min，或37℃下15～20min，观察结果。

[0032] 经三次重复实验，序列表所述的三条序列<400>1、<400>2、以及<400>3对流感病毒复制的抑制率如下：

[0033]序列 抑制后病毒滴度/未抑制病毒滴度
序列<400>1 8/512
序列<400>2 16/512