狗鱼幼鱼弹状病毒RT-PCR检测方法和试剂盒转让专利
申请号 : CN200910189342.1
文献号 : CN102108416B
文献日 : 2013-02-20
发明人 : 刘荭 , 兰文升 , 何俊强 , 叶奕优 , 陈红莲
申请人 : 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心
摘要 :
本发明公开了狗鱼幼鱼弹状病毒(PFRV)的RT-PCR检测方法和试剂盒。本发明的检测方法和试剂盒使用特异性引物对PFRV进行检测，引物具有很好的引发特性，具有较宽的Mg2+浓度、引物浓度、dNTP浓度和退火温度范围，本发明建立的RT-PCR检测方法具有很好的特异性，具有较高的灵敏度，检测病毒悬液抽提核酸的灵敏度均达102.5TCID50。
权利要求 :
1.狗鱼幼鱼弹状病毒（Pike fry rhabdovirus,PFRV）的RT-PCR非诊断目的的检测方法，所述方法包括利用特异性引物对，以病毒基因组RNA为模板进行RT-PCR反应，其特征在于：所述引物对为能扩增出狗鱼幼鱼弹状病毒G基因的基因片段的引物对，并且所述引物对选自以下中的至少一组：a：分别为Seq ID No.1和Seq ID No.2所示序列的引物对；
Seq ID No.1：5’--AGTTGTCGTACATCCTGTTCATTTAG--3’Seq ID No.2：5’--ATGTTATCTCTTCCCTTCGATTGAT--3’b：分别为Seq ID No.3和Seq ID No.4所示序列的引物对，Seq ID No.3：5’--GTTGTCGTACATCCTGTTCATTTAG--3’Seq ID No.4：5’--GTGCAAGCTCTCCTTTTTTCTC--3’。
2.根据权利要求1所述的非诊断目的的检测方法，其特征在于：所述RT-PCR的反转录及PCR在同一反应体系中进行。
3.根据权利要求2所述的非诊断目的的检测方法，其特征在于：所述RT-PCR的反应体
2+
系中，Mg 终浓度为1.6mM～3.6mM，dNTP终浓度为0.2mM～0.4mM，引物终浓度为0.05mM～
1.0mM，退火温度为50℃～65℃。
4.根据权利要求3所述的非诊断目的的检测方法，其特征在于：所述RT-PCR的反应体
2+
系中，Mg 终浓度为2.1mM～2.6mM，dNTP终浓度为0.4mM，引物终浓度为0.25mM，退火温度为55℃。
5.根据权利要求4所述的非诊断目的的检测方法，其特征在于：所述RT-PCR的反应程序为：42℃反转录30min，94℃预变性4min，35个循环：94℃变性50s，在所述退火温度下退火50s，72℃延伸1min，35个循环后72℃延伸10min。
6.狗鱼幼鱼弹状病毒（Pike fry rhabdovirus,PFRV）的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有能扩增出狗鱼幼鱼弹状病毒G基因的基因片段的引物对，所述引物对选自以下中的至少一组：a：分别为Seq ID No.1和Seq ID No.2所示序列的引物对；
Seq ID No.1：5’--AGTTGTCGTACATCCTGTTCATTTAG--3’Seq ID No.2：5’--ATGTTATCTCTTCCCTTCGATTGAT--3’b：分别为Seq ID No.3和Seq ID No.4所示序列的引物对，Seq ID No.3：5’--GTTGTCGTACATCCTGTTCATTTAG--3’Seq ID No.4：5’--GTGCAAGCTCTCCTTTTTTCTC--3’。
说明书 :
狗鱼幼鱼弹状病毒RT-PCR检测方法和试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及病毒的检测方法和检测试剂盒，特别是涉及狗鱼幼鱼弹状病毒RT-PCR检测方法和试剂盒。
背景技术
[0002] 根据国际病毒学分类委员会(International comittee on taxonomy ofviruses，ICTV)第8次报告，弹状病毒科(Rhabdoviridae)分为6个属，包括感染植物的质型弹状病毒属(Cytorhabdovirus)和核型弹状病毒属(Nucleorhabdovirus)，以及感染脊椎动物的水疱性口膜炎病毒属(Vesiculovirus)、狂犬病毒属(Lyssavirus)、短暂热病毒属(Ephemerovirus)和短外弹状病毒属(也称非毒粒蛋白弹状病毒属)(Novirhabdovirus)，还有部分弹状病毒尚未分类，如Sigma virus，Flanders virus等。迄今报道感染鱼类的弹状病毒已有十几种，包括传染性造血器官坏死病毒(Infetioushematopoietic necrosis virus，IHNV)、病毒性出血性败血症病毒(Viralhaemorrhagic septicemia virus，VHSV)、牙鲆弹状病毒(Hirame rhabdovirus，HRV)、蛇头鱼弹状病毒(Snakehead rhabdovirus，SHRV)、鲤春病毒血症病毒(Spring viraemia of carp virus，SVCV)、狗鱼幼鱼弹状病毒(Pike fryrhabdovirus，PFRV)、弹状病毒903/87(Rhabdovirus 903/87，903/87)、鳜鱼弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus，SCRV)、胭脂鱼弹状病毒(Chinesesucker rhabdovirus)及海鲑弹状病毒28/97(Sea trout rhabdovirus 28/97，STRV)等(Granoff and Webster，1999；张奇亚和李正秋，1999；Zhang et al.，2000；Johansson et al.，2001，2002)。在ICTV第6次报告上，SVCV，PFRV被列为水疱性口膜炎病毒属暂定种(Wunner et al.，1995)。在ICTV第7次报告中，正式把IHNV、VHSV、HRV、SHRV列为粒外弹状病毒属，SVCV、PFRV等仍归为水疱性口膜炎病毒属的暂定种(Walker et al.，2000)。其他鱼类弹状病毒的分类地位尚未确定。
[0003] 随着鱼类养殖业的快速发展，鱼类病毒病已成为养殖鱼类的最大病害。由于缺乏有效的治疗方法，鱼类病毒性疾病的控制以预防为主，因而病毒的诊断与检测技术研究成了鱼类病毒研究中非常活跃的领域。鱼类弹状病毒有很强的致病性，特别是VHSV、IHNV、HRV、SHRV和SVCV在世界各地广泛流行，给水产养殖业造成重大的经济损失。因而这些病毒的流行病学备受科研工作者的关注。
[0004] 狗鱼幼鱼弹状病毒(PFRV)是一种与鲤春病毒血症病毒(SVCV)同源性很高的病毒，目前还未引起人们高度重视。PFRV主要在欧洲狗鱼幼鱼中流行(Wolf，1988)。1972年该病毒在荷兰感染狗鱼幼鱼，引起大规模死亡，第一株PFRV从此批患病的狗鱼幼鱼中分离出来(De Kinkelin，1973)。PFRV与SVCV亲缘关系最近，G蛋白的同源性＞70％。对PFRV、SVCV及与它们血清学相关的鱼类弹状病毒G蛋白部分核苷酸序列进行系统进化分析，结果显示它们形成4个基因型，PFRV和SVCV分别形成一个基因型，分别为基因型III和I，其他病毒形成基因型II和IV(Stone et al.，2003)。SVC主要感染鲤科鱼类，被世界动物卫生组织列为必须申报的疾病，中国农业部将SVC列为二级动物疫病。随着对SVC的日益重视，对SVCV监控力度的加大，这些与SVCV亲缘关系高的病毒也将会越来越引起人们的重视。因而寻找特异、灵敏快速的检测方法，对于防控疾病的发生和发展十分关键。
[0005] 在中国，鱼类病毒SVCV已经引起人们高度的重视，并于每年春秋两季对全国鲤鱼进行SVCV监测。但是与SVCV亲缘关系很高的鱼类病毒PFRV目前还没有引起人们的重视，没有纳入检测的范围。随着与这2种病毒血清学相关的病毒相继分离(Ahne，1975；Ahne et al.，1982；Fijan et al.，1984；Ahne and Thomsen，1986；Haenen and Davidse，1989；Jorgensen et al.，1989；Rowley et al.，2001；Stone et al.，2003；Way et al.，2003)，人们对这些病毒的关注会越来越多。因而需要建立切实可行的检测方法。
[0006] 目前，鉴定PFRV及与其血清学相关的病毒一般采取先用敏感细胞分离，然后用血清学方法鉴定的方式(De Kinkelin，1973；Ahne，1975；Ahne etal.，1982；Fijan et al.，1984；Ahne and Thomsen，1986；Haenen and Davidse，1989；Jorgensen et al.，1989；
Rowley et al.，2001；Stone et al.，2003；Way et al.，2003)。采用这种检测方式不仅周期长，而且使用免疫学方法，如间接荧光抗体试验或酶联免疫吸附试验，PFRV与SVCV之间存在交叉反应( et al.，1989；Way，1991)，检测结果不准确。在除狗鱼幼鱼外的其他鱼种类中分离到的一些弹状病毒与PFRV血清学同源性很高，开始被认为是PFRV，但测定其部分G基因核苷酸序列进行系统进化分析发现，这些序列与PFRV相应序列的差异足够大以至于可以归类于不同的基因型(Rowley et al.，2001；Stone et al.，2003)。因此，迫切需要建立分子生物学方法对PFRV进行检测。
Rowley et al.，2001；Stone et al.，2003；Way et al.，2003)。采用这种检测方式不仅周期长，而且使用免疫学方法，如间接荧光抗体试验或酶联免疫吸附试验，PFRV与SVCV之间存在交叉反应( et al.，1989；Way，1991)，检测结果不准确。在除狗鱼幼鱼外的其他鱼种类中分离到的一些弹状病毒与PFRV血清学同源性很高，开始被认为是PFRV，但测定其部分G基因核苷酸序列进行系统进化分析发现，这些序列与PFRV相应序列的差异足够大以至于可以归类于不同的基因型(Rowley et al.，2001；Stone et al.，2003)。因此，迫切需要建立分子生物学方法对PFRV进行检测。
发明内容
[0007] 本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种狗鱼幼鱼弹状病毒的RT-PCR检测方法。
[0008] 本发明的另一目的在于提供一种狗鱼幼鱼弹状病毒的检测试剂盒。
[0009] 为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0010] 本发明公开了狗鱼幼鱼弹状病毒(Pike fry rhabdovirus，PFRV)的RT-PCR检测方法，所述方法包括利用特异性引物对，以病毒基因组RNA为模板进行RT-PCR反应，所述引物对为能扩增出狗鱼幼鱼弹状病毒G基因的基因片段的引物对，并且所述引物对选自以下中的至少一组：
[0011] a：分别含有Seq ID No.1和Seq ID No.2所示序列的引物对；
[0012] Seq ID No.1：5’--AGTTGTCGTACATCCTGTTCATTTAG--3’
[0013] Seq ID No.2：5’--ATGTTATCTCTTCCCTTCGATTGAT--3’
[0014] b：分别含有Seq ID No.3和Seq ID No.4所示序列的引物对，
[0015] Seq ID No.3：5’--GTTGTCGTACATCCTGTTCATTTAG--3’
[0016] Seq ID No.4。5’--GTGCAAGCTCTCCTTTTTTCTC--3’。
[0017] 在本发明优选的实施方式中，所述引物对选自以下中的至少一组：
[0018] c：具有Seq ID No.1和Seq ID No.2所示序列的引物对；
[0019] d：具有Seq ID No.3和Seq ID No.4所示序列的引物对。
[0020] 本发明的RT-PCR的反转录及PCR优选在同一反应体系中进行，所述在同一反应体系中进行是指：将传统的两步法RT-PCR改成一次性加入试剂，然后进行反转录及PCR反应的一步法。
[0021] 所述RT-PCR的反应体系中，Mg2+终浓度优选为1.6mM/L～3.6mM/L，更优选2.1mM/L～2.6mM/L；dNTP终浓度优选为0.2mM/L～0.4mM/L，更优选0.4mM/L；引物终浓度优选为0.05mM/L～1.0mM/L，更优选0.25mM/L；退火温度优选为50℃～65℃，更优选55℃。
[0022] 在本发明具体的实施方式中，所述RT-PCR的反应程序为：42℃反转录30min，94℃预变性4min，35个循环：94℃变性50s，在所述退火温度下退火50s，72℃延伸1min，35个循环后72℃延伸10min。
[0023] 本发明开公开了狗鱼幼鱼弹状病毒(Pike fry rhabdovirus，PFRV)的检测试剂盒，所述试剂盒含有能扩增出狗鱼幼鱼弹状病毒G基因的基因片段的引物对，所述引物对选自以下中的至少一组：
[0024] a：分别含有Seq ID No.1和Seq ID No.2所示序列的引物对；
[0025] Seq ID No.1：5’--AGTTGTCGTACATCCTGTTCATTTAG--3’
[0026] Seq ID No.2：5’--ATGTTATCTCTTCCCTTCGATTGAT--3’
[0027] b：分别含有Seq ID No.3和Seq ID No.4所示序列的引物对，
[0028] Seq ID No.3：5’--GTTGTCGTACATCCTGTTCATTTAG--3’
[0029] Seq ID No.4。5’--GTGCAAGCTCTCCTTTTTTCTC--3’。
[0030] 优选的，所述引物对选自以下中的至少一组：
[0031] c：具有Seq ID No.1和Seq ID No.2所示序列的引物对；
[0032] d：具有Seq ID No.3和Seq ID No.4所示序列的引物对。
[0033] 由于采用了以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于：
[0034] 本发明的检测方法和试剂盒使用特异性引物对PFRV进行检测，所用的两对引物2+
均具有很好的引发特性，其在比较宽的Mg 浓度、引物浓度、dNTP浓度和退火温度范围内均
3.5
能很好的引发模板扩增，且当PFRV核酸模板为10 TCID50/0.1mL，扩增25个循环产物浓度已经达到检测要求。本发明建立的RT-PCR检测方法具有很好的特异性，检测鱼类弹状病毒HRV、IHNV、VHSV、SVCV和其他常见鱼类病毒IPNV、VNNV的结果均为阴性；具有较高的灵敏
2.5
度，检测病毒悬液抽提核酸的灵敏度均达10 TCID50。
均具有很好的引发特性，其在比较宽的Mg 浓度、引物浓度、dNTP浓度和退火温度范围内均
3.5
能很好的引发模板扩增，且当PFRV核酸模板为10 TCID50/0.1mL，扩增25个循环产物浓度已经达到检测要求。本发明建立的RT-PCR检测方法具有很好的特异性，检测鱼类弹状病毒HRV、IHNV、VHSV、SVCV和其他常见鱼类病毒IPNV、VNNV的结果均为阴性；具有较高的灵敏
2.5
度，检测病毒悬液抽提核酸的灵敏度均达10 TCID50。
附图说明
[0035] 图1为Mg2+浓度优化结果的电泳图像，
[0036] 1：Marker DL2000；2：1.6mM/L；3：2.1mM/L；4：2.6mM/L；5：3.1mM/L；6：3.6mM/L；7：Negative control。
[0037] 图2为dNTP浓度优化结果的电泳图像，
[0038] 1：Marker DL2000；2：0.2mM/L；3：0.25mM/L；4：0.3mM/L；5：0.35mM/L；6：0.4mM/L；7：Negative control。
[0039] 图3为引物浓度优化结果的电泳图像，
[0040] 1：Marker DL2000；2：1.0mM/L；3：0.75mM/L；4：0.5mM/L；5：0.25mM/L；6：0.15mM/L；7：0.1mM/L；8：0.05mM/L；9：Negative control。
[0041] 图4为退火温度优化结果的电泳图像，
[0042] 2-5：F1/R1；7-10：F2/R2；1，6，11：Marker DL2000；2，7：50 ℃；3，8：55 ℃；4，9：60℃；5，10：65℃。
[0043] 图5为反应循环数优化结果的电泳图像，
[0044] 2-6：F1/R1；8-12：F2/R2；1，7，13：Marker DL2000；2，8：25；3，9：30；4，10：35；5，11：40；6，12：45。
[0045] 图6为引物特异性的RT-PCR扩增结果的电泳图像，
[0046] 2-10：F2/R2；12-20：F1/R1；1，11：DL2000；2，12：IHNV；3，13：IPNV；4，14：VHS V；5，15：HRV；6，16：VNNV；7，17：SSS0604；8，18：9701；9，19：PFRV；10，20：Negative control。
[0047] 图7为引物灵敏度结果的电泳图像，
[0048] 1：Marker DL2000；2：100；3：10-1；4：10-2；5：10-3；6：10-4；7：Negativecontrol。
具体实施方式
[0049] 实施例1
[0050] 1材料和方法
[0051] 1.1病毒和细胞系
[0052] PFRV为F4株，由中国科学院水生生物研究所赠送，SVCV和IHNV参考株由英国CEFAS的OIE参考实验室B.Hill教授惠赠；VHSV参考株由挪威国家兽医研究所OIE参考实验室Roar Gudding博士惠赠、IPNV、HRV、VNNV由本室分离。
[0053] IHNV、SVCV、VHSV、VNNV、IPNV、HRV和PFRV分别用EPC、CO、RTG-2、SSN-1、CHSE-214、FHM和BF-2细胞扩增。SSN-1细胞购自泰国Kasetsart大学水生动物健康研究所，RTG-2细胞由水生生物研究所赠送，BF-2细胞由检疫研究所(布雷西亚)细胞保藏中心赠送，CHSE-214细胞、EPC细胞由英国环境、渔业和水产养殖科学研究中心赠送、FHM细胞由德国慕尼黑大学和中国科学院水生生物研究所赠送，CO细胞由中国科学院水生生物研究所赠送。
[0054] EPC、CO、CHSE-214、FHM、BF-2和RTG-2细胞均用含10％胎牛血清的199培养液培养，SSN-1细胞用含10％FBS的L-15培养液培养。接种病毒后，用加抗生素(100IU/mL青霉素；100μg/mL链霉素)的相应培养液培养。
[0055] 1.2设备、试剂和培养基
[0056] 设备：PCR仪(T3，Biometra)，恒温培养箱(Binder，德国产)，凝胶成像仪(BDA TI1型，Biometra)。
[0057] 试剂：Taq DNA聚合酶、dNTP、EB和DEPC购于上海生物工程技术有限公司；逆转录酶、RNA酶抑制剂和DNA Marker购于大连宝生物工程有限公司；199和L-15为Gibco公司产品；其他试剂均为分析纯。实验所用水均为DEPC处理水，实验器皿均经过高温灭菌2次。
[0058] 199培养液：取一袋199培养基粉剂(GIBCO)加入900mL去离子水，充分搅拌，直至无不溶性物质为止，加入100mL灭活的胎牛血清，将总体积调至1000mL，搅匀，加入NaHCO3调节pH至7.2-7.8，无菌过滤，分装，-20℃保存备用。
[0059] 199+HEPES：在199培养液中加入终浓度为10％FCS、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素、0.02M HEPES，调节pH值至7.6；
[0060] 细胞消化液：将2.5g胰酶，40g NaCl，2.0g KCl，5.0g葡萄糖，2.9g NaHCO3，1.0g EDTA依次溶解于500mL超蒸水中，待完全溶解后，过滤除菌，分装，-20℃保存备用。
[0061] L-15培养液：在配置1L剂量的L-15培养基粉剂加入900mL去离子水，充分搅拌，直至无不溶性物质为止，加入100mL灭活的胎牛血清，将总体积调至1000mL，搅匀，加入NaHCO3调节pH至7.2-7.8，无菌过滤，分装，-20℃保存备用。
[0062] 1.3引物设计
[0063] 根据Genbank中PFRV G基因(AJ538069)序列，使用Primer Premier5.0软件设计2对引物。并通过NCBI数据库进行BLAST验证引物序列特异性后，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列见表1。
[0064] 表1PFRV RT-PCR引物
[0065]
[0066] a序列位置参考Genbank No.AJ538069中的序列。
[0067] 1.4病毒滴度的测定
[0068] 病毒滴度测定采用终点稀释法，参考Reed和Muench(1938)的方法。
[0069] 具体方法如下：
[0070] 1)传BF-2细胞入96孔板，置于25℃培养箱培养(＜24h)；
[0071] 2)10倍系列稀释待测病毒；
[0072] 3)将各稀释度的病毒悬液接种到细胞长成单成的96孔板中，每稀释度加3孔，每孔加100μL，对照组加100μL培养液；
[0073] 4)将96孔板置于适宜温度培养箱中培养，直至CPE完全；
[0074] 5)倒置显微镜下观察，计算病毒滴度(TCID50/0.1mL)。
[0075] 1.5病毒核酸的提取
[0076] 病毒核酸提取参照TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit说明书进行操作。
[0077] 1.6 One Tube RT-PCR反应条件优化
[0078] 本发明将传统的两步法RT-PCR改成一次性加入试剂，然后进行反转录及PCR反2+
应的一步法，在试剂加入时参考两步法的试剂加入剂量，并对Mg 、dNTP和引物浓度进行优化。在进行单项反应条件优化时，其他试剂的加入量参考下列配方进行：
应的一步法，在试剂加入时参考两步法的试剂加入剂量，并对Mg 、dNTP和引物浓度进行优化。在进行单项反应条件优化时，其他试剂的加入量参考下列配方进行：
[0079]*5×AMV RT Buffer 4μL
10×PCR buffer 8μL
MgCl2(25mM) 8μL
dNTPs Mixture(10mM/L each) 4μL
RNasin Inhibitor(40U/μL) 1μL
AMV RTase XL(5U/μL) 1μL
Taq Polymerase(5U/μL) 1μL
F Primer(50pmol) 1μL
R Primer(50pmol) 1μL
RNA 10μL
RNase Free dH2O 61μL
Total 100μL
10×PCR buffer 8μL
MgCl2(25mM) 8μL
dNTPs Mixture(10mM/L each) 4μL
RNasin Inhibitor(40U/μL) 1μL
AMV RTase XL(5U/μL) 1μL
Taq Polymerase(5U/μL) 1μL
F Primer(50pmol) 1μL
R Primer(50pmol) 1μL
RNA 10μL
RNase Free dH2O 61μL
Total 100μL
[0080] *5×AMV RT Buffer(250mM Tris-HCl pH 8.3，375mM KCl，40mMdithiothreitol，40mM MgCl2).
[0081] RT-PCR反应程序如下：42℃反转录30min，94℃变性4min，接着进行35个循环(94℃变性50s，适宜温度退火50s，72℃延伸1min)，接下来72℃延伸10min。反应结束后，将扩增产物点样在含1.5％EB的琼脂糖凝胶中电泳，紫外下拍照。
[0082] Mg2+浓度优化：反应体系中加入Mg2+，使其终浓度分别为1.6mM/L，2.1mM/L，2.6mM/L，3.1mM/L和3.6mM/L。
[0083] dNTP浓度优化：反应体系中加入dNTP，使其终浓度分别为0.2mM/L，0.25mM/L，0.3mM/L，0.35mM/L和0.4mM/L。
[0084] 引物浓度优化：反应体系中加入引物，使每条引物的终浓度均为0.05mM/L，0.1mM/L，0.15mM/L，0.25mM/L，0.5mM/L，0.75mM/L和1.0mM/L。
[0085] 退火温度优化：选择优化后的组分配置进行RT-PCR扩增，以50℃，55℃，60℃和65℃为退火温度进行RT-PCR，选取最优温度。
[0086] 最适循环数优化：将PFRV核酸模板稀释到103.5TCID50/0.1mL。选择优化后的组分配置及优化后的退火温度进行RT-PCR扩增25个，30个，35个，40个和45个循环，以确定其最适循环数。
[0087] 1.7RT-PCR的特异性试验
[0088] 提取鱼类病毒PFRV、HRV、IHNV、VHSV、SVCV、IPNV、VNNV核酸作为模板进行PFRV RT-PCR检测，观察结果确定其特异性。
[0089] 1.8RT-PCR的灵敏度试验
[0090] 取PFRV病毒液250μL，提取病毒RNA，将RNA作10倍系列稀释，以每个稀释度的核酸作为模板进行RT-PCR。
[0091] 2结果
[0092] 2.1病毒滴度测定结果
[0093] 10倍系列稀释PFRV病毒悬液，接种96孔板BF-2单层细胞，20℃培养至CPE完全，5.5
采用Reed-Muench氏方法计算，PFRV的滴度为10 TCID50/0.1mL。
采用Reed-Muench氏方法计算，PFRV的滴度为10 TCID50/0.1mL。
[0094] 2.2优化的组分配置及反应条件
[0095] Mg2+浓度优化：电泳结果见图1，Mg2+终浓度为1.6mM/L-3.6mM/L，两对引物RT-PCR2+
的产物均形成较亮的特征条带。使用F1/R1时，Mg 终浓度为2.6mM/L，特征条带亮度最高。
2+ 2+
使用F2/R2时，Mg 终浓度为2.1mM/L，特征条带最亮。因此，引物F1/R1和F2/R2 Mg 的最佳终浓度分别为2.6mM/L、2.1mM/L。
的产物均形成较亮的特征条带。使用F1/R1时，Mg 终浓度为2.6mM/L，特征条带亮度最高。
2+ 2+
使用F2/R2时，Mg 终浓度为2.1mM/L，特征条带最亮。因此，引物F1/R1和F2/R2 Mg 的最佳终浓度分别为2.6mM/L、2.1mM/L。
[0096] dNTP浓度优化：电泳结果见图2，反应体系中dNTP终浓度为0.2mM/L-0.4mM/L，2对引物RT-PCR的产物均形成较亮的特征条带，且随dNTP加入量的增加，亮度有增加的趋势，故2对引物均选择dNTP终浓度为0.4mM/L为最适终浓度。
[0097] 引物浓度优化：电泳结果见图3，引物终浓度为0.05mM/L-1.0mM/L，2对引物RT-PCR的产物均形成较亮的特征条带。当2对引物终浓度为0.25mM/L，引物二聚体最少，且特征条带亮度很高，故0.25mM/L为2对引物的最适终浓度。
[0098] 退火温度优化：依据优化后的组分配置反应体系进行RT-PCR优化退火温度，电泳结果见图4，退火温度从50℃-65℃，模板均可扩增，退火温度为55℃时，2对引物引发扩增产物电泳条带较亮，更高或更低退火温度下扩增，电泳条带亮度有减弱趋势，故选择55℃为最适退火温度。
[0099] 最适循环数优化：以优化的组分配置反应体系，选55℃为退火温度进行RT-PCR对3.5
循环数进行优化。电泳结果见图5，PFRV核酸模板为10 TCID50/0.1mL时，进行25个-45个循环，电泳均有特征条带产生，30个循环以上，扩增产物电泳条带均很亮，为了节省时间，且使扩增产物达到最大，选择35个循环为RT-PCR扩增循环。
循环数进行优化。电泳结果见图5，PFRV核酸模板为10 TCID50/0.1mL时，进行25个-45个循环，电泳均有特征条带产生，30个循环以上，扩增产物电泳条带均很亮，为了节省时间，且使扩增产物达到最大，选择35个循环为RT-PCR扩增循环。
[0100] 对Mg2+、dNTP和引物浓度进行优化后，RT-PCR反应体系中试剂的加入量如下：
[0101]*5×AMV RT Buffer 4μL
10×PCR buffer 8μL
MgCl2(25mM) 4μL(F1/R1)，2μL(F2/R2)
dNTPs Mixture(各10mM) 4μL
RNasin Inhibitor(40U/μL) 1μL
AMV RTase XL(5U/μL) 1μL
Taq Polymerase(5U/μL) 1μL
Primer(25pmol/μL) 1μL
Primer(25pmol/μL) 1μL
RNA 10μL
RNase Free dH2O 61μL
Total 100μL
10×PCR buffer 8μL
MgCl2(25mM) 4μL(F1/R1)，2μL(F2/R2)
dNTPs Mixture(各10mM) 4μL
RNasin Inhibitor(40U/μL) 1μL
AMV RTase XL(5U/μL) 1μL
Taq Polymerase(5U/μL) 1μL
Primer(25pmol/μL) 1μL
Primer(25pmol/μL) 1μL
RNA 10μL
RNase Free dH2O 61μL
Total 100μL
[0102] *5×AMV RT Buffer(250mM Tris-HCl pH 8.3，375mM KCl，40mMdithiothreitol，40mM MgCl2).
[0103] 对退火温度和循环数进行优化后，PCR反应程序如下：42℃反转录30min，94℃变性4min，接着进行35个循环(94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸1min)，接下来72℃延伸10min。反应结束后，将RT-PCR扩增产物点样在含1.5％EB的琼脂糖凝胶中电泳，紫外下拍照。
[0104] 2.3RT-PCR的特异性试验
[0105] 采用优化后反应体系和扩增条件，用PFRV的引物对PFRV、HRV、IHNV、VHSV、SVCV、IPNV、VNNV进行RT-PCR，电泳结果见图6，用2对引物检测PFRV时，有特征条带产生，而用2对引物检测其他RNA病毒和阴性对照时，没有特征条带产生，表明这2对引物均能特异性地引发PFRV核酸模板扩增。
[0106] 2.4RT-PCR的灵敏度试验
[0107] 取250μL病毒抽提后加25μL DEPC水溶解，取10μL核酸进行10倍系列稀释，每稀释度取10μL采用优化后的反应条件进行RT-PCR，检测结果见图7，2对引物检测结果为阳性的最大稀释度均为10-3，相应的灵敏度为102.5 TCID50。
[0108] 3讨论
[0109] PFRV主要在欧洲狗鱼幼鱼中流行(Wolf，1988)。1972年该病毒在荷兰感染狗鱼幼鱼，引起大规模死亡，第一株PFRV从此批患病的狗鱼幼鱼中分离出来(De Kinkelin，1973)。PFRV与SVCV亲缘关系最近，G蛋白的同源性＞70％。对PFRV、SVCV及与它们血清学相关的鱼类弹状病毒G蛋白部分核苷酸序列进行系统进化分析，结果显示它们形成4个基因型，PFRV和SVCV分别形成一个基因型，分别为基因型III和I，其他病毒形成基因型II和IV(Stone et al.，2003)。SVC主要感染鲤科鱼类，被世界动物卫生组织列为必须申报的疾病，中国农业部将SVC列为二级动物疫病。随着对SVC的日益重视，对SVCV监控力度的加大，这些与SVCV亲缘关系高的病毒也将会越来越引起人们的重视。因而寻找特异、灵敏快速的检测方法，对于防控疾病的发生和发展十分关键。
[0110] 目前，细胞培养技术仍是水生动物病毒诊断的“黄金标准”，但需要专业人员操作，且诊断时间长，一般需要4d-7d。血清中和试验、ELISA技术虽然特异性强，但由于水生动物抗体产生水平偏低，一般检测其抗原，且检测灵敏度偏低。上述方法还有一个缺点，难以将检测的病毒鉴定到种。因而在水生动物疾病检验检疫中很少单独使用。PCR技术一般针对某个特定病毒的核苷酸序列设计引物，能将病毒鉴定到种，在确定某些鱼是否感染某种病毒时有独特的优势，特别是在没有敏感细胞可用于培养的情况下。因而在检验检疫中，PCR技术成为了一个非常重要的手段。在鱼类病毒检测中，PCR技术和细胞培养结合使用，灵敏度和病毒检出率更高。
[0111] G蛋白是一种糖基化蛋白，主要编码膜相关蛋白(McAllister andWagner，1975)，在成熟的病毒粒子表面形成胞膜蛋白突起，构成抗原决定簇(Huang et al.，1996；徐耀先等，2000)。所有弹状病毒G蛋白都属于单一的I型跨膜糖蛋白。每个病毒粒子包含约1200个糖蛋白分子，以400个三聚体的形式通过其C末端的跨膜结构域附着于病毒粒子表面(Gaudin etal.，1992)。G蛋白由500个左右的氨基酸组成，不同属的弹状病毒G蛋白同源性很低(Walker and Kongsuwan，1999)，但弹状病毒拥有共同的特征，包括2个-6个潜在的糖基化位点、12个-16个保守的半胱氨酸残基，2-3段疏水的7氨基酸重复，N端有1个可被移除的疏水信号肽，C端有1个疏水的跨膜序列和1个疏水的细胞质尾(Coll，1995)。
[0112] 与PFRV血清学相关的病毒G基因上的一段序列已收录到NCBI数据库，我们选择PFRV G基因上相应的一段序列作为设计引物的模板，这样方便我们设计特异性高的引物。G基因适合作为设计引物模板的理由还有两点：1、G基因是编码抗原决定簇的主要基因(Huang et al.，1996；徐耀先等，2000)，在同种病毒中该基因应该比较保守；2、依据上章PFRV各蛋白与其他水疱性口膜炎病毒相应蛋白的同源性分析结果，与同源性最高的SVCV相比，G蛋白为第4保守蛋白，与其他水疱性口膜炎病毒相比，G基因为第3保守蛋白，因而容易设计特异性高的引物。
[0113] 本发明设计了2对检测PFRV的RT-PCR引物，并对2对引物RT-PCR的反应条件进2+
行了优化。在优化过程中发现，这2对引物具有很好的引发特性，其在比较宽的Mg 浓度、引物浓度、dNTP浓度和退火温度范围内均能很好的引发模板扩增，且当PFRV核酸模板为
3.5
10 TCID50/0.1mL，扩增25个循环产物浓度已经达到检测要求。本研究建立的RT-PCR方法具有很好的特异性，检测鱼类弹状病毒PFRV、HRV、IHNV、VHSV、SVCV和其他常见鱼类病毒
2.5
IPNV、VNNV的结果均为阴性；具有较高的灵敏度，检测病毒悬液抽提核酸的灵敏度均达10 TCID50。因而这2对引物可以用于临床检测。
行了优化。在优化过程中发现，这2对引物具有很好的引发特性，其在比较宽的Mg 浓度、引物浓度、dNTP浓度和退火温度范围内均能很好的引发模板扩增，且当PFRV核酸模板为
3.5
10 TCID50/0.1mL，扩增25个循环产物浓度已经达到检测要求。本研究建立的RT-PCR方法具有很好的特异性，检测鱼类弹状病毒PFRV、HRV、IHNV、VHSV、SVCV和其他常见鱼类病毒
2.5
IPNV、VNNV的结果均为阴性；具有较高的灵敏度，检测病毒悬液抽提核酸的灵敏度均达10 TCID50。因而这2对引物可以用于临床检测。
[0114] 4小结
[0115] 依据PFRV G基因保守序列，设计2对特异性引物；对RT-PCR的反应组分Mg2+、dNTP、引物浓度及反应的退火温度、循环数进行优化；按照优化好的RT-PCR条件进行特异性试验和灵敏度试验，结果显示：检测IHNV、SVCV、VHSV、VNNV、IPNV、HRV和PFRV时，只有2.5
PFRV扩增产物电泳出现特征条带；对病毒悬液抽提核酸的检测灵敏度为10 TCID50。
PFRV扩增产物电泳出现特征条带；对病毒悬液抽提核酸的检测灵敏度为10 TCID50。
[0116] 实施例2
[0117] 一种检测试剂盒，用于狗鱼幼鱼弹状病毒(Pike fry rhabdovirus，PFRV)的RT-PCR检测。所述试剂盒中含有以下引物序列：
[0118] Seq ID No.1：5’--AGTTGTCGTACATCCTGTTCATTTAG--3’(F1)
[0119] Seq ID No.2：5’--ATGTTATCTCTTCCCTTCGATTGAT--3’(R1)
[0120] 上述引物能够扩增出狗鱼幼鱼弹状病毒G基因的部分基因片段。
[0121] 所述试剂盒还含有使用说明书。
[0122] 实施例3
[0123] 一种检测试剂盒，用于狗鱼幼鱼弹状病毒(Pike fry rhabdovirus，PFRV)的RT-PCR检测。所述试剂盒中含有以下引物序列：
[0124] Seq ID No.3：5’--GTTGTCGTACATCCTGTTCATTTAG--3’(F2)
[0125] Seq ID No.4。5’--GTGCAAGCTCTCCTTTTTTCTC--3’(R2)。
[0126] 上述引物能够扩增出狗鱼幼鱼弹状病毒G基因的部分基因片段。
[0127] 所述试剂盒还含有使用说明书。
[0128] 附1病毒缩略语表
[0129]缩略词 英文名 中文名
PFRV Pike fry rhabdovirus 狗鱼幼鱼弹状病毒
IHNV Infetious hematopoietic necrosis 传染性造血器官坏死病毒
IPNV Infectious pancreatic necrosis virus 传染性胰脏坏死病毒
SVCV Spring viraemia of carp virus 鲤春病毒血症病毒
VHSV Viral haemorrhagic septicemia virus 病毒性出血败血症病毒
VNNV Viral nervous necrosis virus 病毒性神经坏死病毒
HRV Hirame rhabdovirus 牙鲆弹状病毒
PFRV Pike fry rhabdovirus 狗鱼幼鱼弹状病毒
IHNV Infetious hematopoietic necrosis 传染性造血器官坏死病毒
IPNV Infectious pancreatic necrosis virus 传染性胰脏坏死病毒
SVCV Spring viraemia of carp virus 鲤春病毒血症病毒
VHSV Viral haemorrhagic septicemia virus 病毒性出血败血症病毒
VNNV Viral nervous necrosis virus 病毒性神经坏死病毒
HRV Hirame rhabdovirus 牙鲆弹状病毒
[0130] 附2细胞及其他缩略语表
[0131]缩略词 英文名 中文名
BF-2 Blue gill fry 铜吻磷鳃太阳鱼成纤维细胞
CO Overy of grass carp 草鱼性腺细胞
CHSE-214 Chinook salmon embryo 大鳞大麻哈鱼胚胎细胞
EPC Epithelioma papulosum cyprini 鲤鱼上皮瘤细胞
FHM Fathead minnow 海水鲤科鱼类细胞
GCF Grass carp fin 草鱼鳍条细胞
PG Pike gonad 狗鱼性腺细胞
SSN-1 Stripped snakehead 纹醴细胞
N Nucleoprotein 核蛋白
P Phosphoprotein 磷酸化蛋白
M Matrix protein 基质蛋白
G Glycoprotein 糖蛋白
L RNA-dependent RNA polymerase RNA依赖的RNA聚合酶
NV Non-virion 非毒粒蛋白
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附试验
RT-PCR Reverse transcription polymerase chain 反转录聚合酶链式反应
LAMP Loop-mediated isothermal amplification 环媒恒温扩增
FIP Forward inner primer 前内引物
BIP Backward inner primer 后内引物
RACE Rapid-amplification of cDNA ends cDNA末端快速扩增
IUdR 5-iodo-2’-deoxyuridine 5’-碘-2’-去氧尿嘧啶
BF-2 Blue gill fry 铜吻磷鳃太阳鱼成纤维细胞
CO Overy of grass carp 草鱼性腺细胞
CHSE-214 Chinook salmon embryo 大鳞大麻哈鱼胚胎细胞
EPC Epithelioma papulosum cyprini 鲤鱼上皮瘤细胞
FHM Fathead minnow 海水鲤科鱼类细胞
GCF Grass carp fin 草鱼鳍条细胞
PG Pike gonad 狗鱼性腺细胞
SSN-1 Stripped snakehead 纹醴细胞
N Nucleoprotein 核蛋白
P Phosphoprotein 磷酸化蛋白
M Matrix protein 基质蛋白
G Glycoprotein 糖蛋白
L RNA-dependent RNA polymerase RNA依赖的RNA聚合酶
NV Non-virion 非毒粒蛋白
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附试验
RT-PCR Reverse transcription polymerase chain 反转录聚合酶链式反应
LAMP Loop-mediated isothermal amplification 环媒恒温扩增
FIP Forward inner primer 前内引物
BIP Backward inner primer 后内引物
RACE Rapid-amplification of cDNA ends cDNA末端快速扩增
IUdR 5-iodo-2’-deoxyuridine 5’-碘-2’-去氧尿嘧啶
[0132] 序列表
[0133] <110>深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心
[0134] <120>狗鱼幼鱼弹状病毒RT-PCR检测方法和试剂盒
[0135] <130>DHC0910506
[0136] <160>4
[0137] <170>PatentIn version 3.3
[0138] <210>1
[0139] <211>26
[0140] <212>DNA
[0141] <213>人工序列
[0142] <400>1
[0143] agttgtcgta catcctgttc atttag 26
[0144] <210>2
[0145] <211>25
[0146] <212>DNA
[0147] <213>人工序列
[0148] <400>2
[0149] atgttatctc ttcccttcga ttgat 25
[0150] <210>3
[0151] <211>25
[0152] <212>DNA
[0153] <213>人工序列
[0154] <400>3
[0155] gttgtcgtac atcctgttca tttag 25
[0156] <210>4
[0157] <211>22
[0158] <212>DNA
[0159] <213>人工序列
[0160] <400>4
[0161] gtgcaagctc tccttttttc tc 22