包含经发酵和酶处理的绿豆种子提取物、用于皮肤抗老化的化妆品组合物

摘要

本发明提供一种包含发酵和酶处理的绿豆提取物作为活性成分的、用于保护皮肤的化妆品组合物，并且提供采用所述化妆品组合物的化妆方法；所述提取物通过下述工序制备：用酿酒酵母或乳杆菌将绿豆发酵，再用蛋白酶对其进行处理。本发明所述发酵-酶处理的绿豆提取物包含较高的异黄酮，具有提高皮肤细胞活性、减轻皮肤刺激性、加速皮肤细胞蛋白(例如胶原)合成，从而产生改善因老化引起的皮肤问题以及保护皮肤的效果。

权利要求

1.一种用于防止皮肤老化的化妆品组合物，所述化妆品组合物包含发酵-酶处理的绿豆提取物作为活性成分，其中，所述发酵-酶处理的绿豆提取物通过以下工序得到：通过将绿豆用酿酒酵母或乳酸菌发酵，制备发酵液；用蛋白酶对所述发酵液进行酶的二次处理，以产生所述的活性成分；其中，所述的蛋白酶选自于由胃蛋白酶、胰蛋白酶、羧肽酶、氨肽酶和二肽酶组成的组，所述的发酵-酶处理的绿豆提取物以0.0001-30.0％(w/w)的浓度包含于所述化妆品组合物中。

2.一种用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物，所述化妆品组合物包含发酵-酶处理的绿豆提取物作为活性成分，其中，所述发酵-酶处理的绿豆提取物通过以下工序得到：通过将绿豆用酿酒酵母或乳酸菌发酵，制备发酵液；用蛋白酶对所述发酵液进行酶的二次处理，以产生所述的活性成分；其中，所述的蛋白酶选自于由胃蛋白酶、胰蛋白酶、羧肽酶、氨肽酶和二肽酶组成的组，所述的发酵-酶处理的绿豆提取物以0.0001-30.0％(w/w)的浓度包含于所述化妆品组合物中。

3.一种用于皮肤保湿的化妆品组合物，所述化妆品组合物包含发酵-酶处理的绿豆提取物作为活性成分，其中，所述发酵-酶处理的绿豆提取物通过以下工序得到：通过将绿豆用酿酒酵母或乳酸菌发酵，制备发酵液；用蛋白酶对所述发酵液进行酶的二次处理，以产生所述的活性成分；其中，所述的蛋白酶选自于由胃蛋白酶、胰蛋白酶、羧肽酶、氨肽酶和二肽酶组成的组，所述的发酵-酶处理的绿豆提取物以0.0001-30.0％(w/w)的浓度包含于所述化妆品组合物中。

4.如权利要求1-3任一项所述的化妆品组合物，其中，所述发酵-酶处理的绿豆提取物通过以下工序得到：通过用乳杆菌将绿豆发酵，制备发酵液；用蛋白酶对所述发酵液进行酶处理，以产生所述的活性成分。

5.如权利要求1-3任一项所述的化妆品组合物，其中，所述的化妆品组合物以选自于由下列形式组成的组的形式进行配制：溶液、悬浮液、乳液、膏、啫喱、霜、露、粉、皂和喷雾剂。

说明书

包含经发酵和酶处理的绿豆种子提取物、用于皮肤抗老化

的化妆品组合物

技术领域

[0001] 本发明涉及包含发酵-酶处理的绿豆提取物(Phaseolus radiatus extract of fermentation-enzyme treatment)的化妆品组合物；具体而言，本发明涉及包含发酵-酶处理的绿豆提取物作为活性成分的化妆品组合物，所述绿豆提取物通过对经发酵的绿豆用蛋白酶进行酶的二次处理(secondary enzyme treatment)得到，所述经发酵的绿豆通过用酵母或乳酸菌将绿豆发酵而制得。

背景技术

[0002] 随着老化的进行，人的皮肤显示出各种老年性变化。通常，随着老化的进行，皮肤变得干燥、缺乏弹性、产生皱纹并且变暗。此外，皮肤对外部刺激也变得更加敏感，而需要更长的时间来恢复。这样的老年性变化是自然的，无法100％地阻止。然而，以任何手段延迟老化或减缓老化的进程是可能的。因此，生产的大部分化妆品主要用来防止老化。

[0003] 使用化妆品抑制皮肤老化最有效的方式之一是向化妆品中添加各种抗老化成分。因此，化妆品公司一直在尝试开发和筛选抗老化成分。最近，通过发酵得到的活性成分已经被应用于化妆品产品。

[0004] 例如，已经将采用枯草杆菌得到的发酵液(fermented liquor)应用于化妆品组合物，所述枯草杆菌已用于生产发酵食品(如经发酵的大豆和纳豆)。这种发酵液的特征在于通过微生物将刺激性组分分解或转化，这能减轻皮肤刺激性(skin irritation)。所以，现在确信通过微生物制备的发酵产品对皮肤具有积极的作用，因而将该发酵产品应用于化妆品组合物。

发明内容

[0005] 因此，本发明人尝试改善因老化引起的各种皮肤问题。所以，本发明人通过下述内容完成本发明：证实采用酵母或乳酸菌将绿豆发酵得到的、经发酵的绿豆提取物具有优异的抗老化作用；尤其证实当用蛋白酶对所述经发酵的绿豆提取物进行二次处理时，所产生的产物能显著地改善因老化引起的皮肤问题(如干燥和皱纹)。

[0006] 本发明的实施方式针对提供一种用于防止皮肤老化的化妆品组合物，所述化妆品组合物包含发酵-酶处理的绿豆提取物。

[0007] 本发明的另一个实施方式针对提供一种用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物，所述化妆品组合物包含发酵-酶处理的绿豆提取物。

[0008] 本发明的另一个实施方式针对提供一种用于皮肤保湿的化妆品组合物，所述化妆品组合物包含发酵-酶处理的绿豆提取物。

[0009] 本发明的另一个实施方式针对提供一种化妆方法，所述方法包括将所述包含发酵-酶处理的绿豆提取物的化妆品组合物施用到皮肤上的步骤，从而产生加速胶原的生物合成、提高皮肤细胞活性及保湿的效果。

[0010] 本发明涉及用于防止皮肤老化的化妆品组合物，所述化妆品组合物包含发酵-酶处理的绿豆提取物。包含在本发明的化妆品组合物中的活性成分(发酵-酶处理的绿豆提取物)通过下述工序得到：采用酵母或乳酸菌将绿豆发酵；用蛋白酶对发酵液进行二次处理。本发明所述的提取物能提高细胞活性，加速胶原合成，并减轻皮肤刺激性。因此，包含这种提取物的化妆品组合物具有改善皱纹和保湿的效果，这表明对于会产生防止皮肤老化的优异效果的化妆品组合物而言，上述组合物是极佳的候选物。

具体实施方式

[0011] 为实现本发明的目标，本发明提供了一种用于防止皮肤老化的化妆品组合物，所述化妆品组合物包含发酵-酶处理的绿豆提取物。

[0012] 另外，本发明提供了一种用于改善皮肤皱纹和皮肤保湿的化妆品组合物，所述化妆品组合物包含发酵-酶处理的绿豆提取物。

[0013] 在本发明的组合物中用作活性成分的绿豆(即Mung bean)是属于豆科(Leguminosae family)的一年生植物。这种植物在温和的气候下，在壤质土(loamy soil)(黑土，其中沙和粘土适当混合)中生长。所述植物的高度为30-80cm。它具有细的茎杆(stalk)和垂直的脉(vein)。约有10个节(gnarl)。首先长出一对子叶和新叶，然后再长出三片小的复叶。

[0014] 与其他豆科成员不同，绿豆长期以来一直用于治疗皮肤病，并且用作退热药和解毒药。根据东医宝鉴(Dongeuibogam，一本古老的韩国医书的名字)，将绿豆粉末施用到脸上时，证实其具有化妆品的效果。时至今日，已将绿豆用作干粉(dried powder)或是与水或蜂蜜混合，从而用于脸部按摩。或者，将绿豆作为食品食用，例如：将绿豆粉末与水混合制作绿豆煎饼(Mung bean pan cake)，或将绿豆淀粉用于生产绿豆淀粉啫喱、绿豆煎饼、绿豆稀粥(Mung bean gruel)和绿豆芽(green bean sprouts)。

[0015] 在本申请文件中，绿豆指的是所述绿豆植物的所有器官(包括种子(果实)、叶、花、茎和根)，更优选指的是种子(果实)。

[0016] 在本申请文件中，术语“发酵-酶处理的绿豆提取物”指的是通过如下工序得到的提取物：用发酵生物(fermentative organism)将绿豆初步发酵(primary fermentation)，以得到经发酵的绿豆提取物；再用蛋白酶对前述提取物进行酶的二次处理。根据发酵生物的种类，将所述提取物分为酵母发酵-酶处理的绿豆提取物和乳酸菌发酵-酶处理的绿豆提取物。在本文中，优选将酵母或乳酸菌用作发酵生物。当将酵母用作发酵生物时，所述提取物被理解为酵母发酵-酶处理的绿豆提取物；当将乳酸菌用作发酵生物时，所述提取物被理解为乳酸菌发酵-酶处理的绿豆提取物。

[0017] 另一方面，术语“酶处理-发酵的绿豆提取物”指的是通过与上述发酵-酶处理的绿豆提取物的生产工序的相反工序得到的提取物，这意味着发酵步骤和酶处理步骤以相反的顺序进行。也就是说，将绿豆提取物首先用蛋白酶进行处理，然后再用发酵生物诱导发酵。

[0018] 本文中用于将绿豆发酵的酵母是真核微生物(细胞核和细胞质被核膜分开)的一种。它具有细胞器，如细胞壁、细胞膜、细胞核、线粒体和颗粒体。这种无性器官的生物通过出芽进行繁殖。存在各种类型的酵母。

[0019] 那些分离酵母中的一部分不具备发酵的能力，一部分通过分裂(fission)或芽分裂(bud-fission)而非出芽进行繁殖，它们中一部分形成掷孢子(ballistopores)而非子囊孢子，或一部分不形成孢子。其尺寸平均为5-10μm×5-12μm，这是细菌尺寸的5-10倍。对于它们最佳的pH是4.5-5.5，但是它们能在pH 1-10中生存。能在pH 1中存活约12小时的酵母在酸中比细菌更为强健。所以，如果将培养基的pH调节到3.5-3.8，那么就能防止由细菌造成的污染。

[0020] 虽然最优温度随菌株而变化，但酵母能在20-25℃生长良好。通常已知酵母在50℃以上被杀死，尽管这可通过向培养基中直接添加在该温度以上无法合成的生长因子来克服。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在40℃以上被杀死，但是当向培养基中添加麦角固醇和油酸时，它们就能存活。酵母细胞本身是单细胞植物，并含有大量蛋白质和矿物质。本文所优选的、用于将绿豆发酵的酵母是酿酒酵母。

[0021] 乳酸菌在本文中用作将绿豆发酵的发酵生物，它是一种通过分解碳水化合物(如葡萄糖或乳糖)而产生有机酸(如乳酸或乙酸)的有益微生物。通常，当乳酸菌由乳糖产生乳酸时，被称为发酵。发酵食品通过这样的发酵工序生产。用于本发明的乳酸菌例如乳杆菌(Lactobacillus)、链球菌(Streptococcus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、明串珠菌(Leuconostoc)、片球菌(Pediococcus)、乳球菌(Lactococcus)等，更优选乳杆菌。

[0022] 本发明所述的发酵-酶处理的绿豆提取物通过以下步骤制备：

[0023] (a)将绿豆磨成粉末；

[0024] (b)将步骤(a)中制得的绿豆粉末用纯净水(purified water)稀释，然后再将所得稀释液用酵母或乳酸菌进行发酵；

[0025] (c)将通过步骤(b)中的发酵作用得到的经发酵的绿豆进行过滤，再用蛋白酶处理所得滤液；以及

[0026] (d)通过将步骤(c)中经酶处理的溶液进行冷陈化(cold-aged)并过滤，制备发酵-酶处理的绿豆提取物。

[0027] 在发酵-酶处理的绿豆提取物的制备方法中，在步骤(a)中将绿豆磨成100-500目或更细的粉末，但并不总限于此。

[0028] 在步骤(b)中，发酵作用如下进行：将绿豆粉末与纯净水以1∶10的比率混合，在121℃进行灭菌，随后用乳杆菌属(Lactobacillus sp)或酵母菌属(Saccharomyces sp)接种，然后进行培养。

[0029] 用于发酵的酵母或乳酸菌优选的量是每1L总培养液(total culture solution)4 5
中有1×10 至1×10 个细胞。根据每种菌株，可使用常规的培养条件(需氧条件或兼性厌氧条件)。为了将发酵生物的培养激活，可添加额外的碳源和/或pH调节剂。优选的培养条件如下：30-37℃；pH为5-7；需氧条件或兼性厌氧条件；培养1-15天，优选1-7天，更优选1-5天，最优选2-4天。

[0030] 在步骤(c)中，初步过滤在步骤(b)中得到的发酵液。在这个步骤中，用蛋白酶处理所得滤液。此时，通过0.25-0.45μm的滤膜过滤所述的发酵液，以除去残留的绿豆粉末颗粒和发酵生物。用蛋白酶对用所述滤膜初步过滤的滤液进行处理，从而将通过用酵母或乳酸菌发酵没有降解或转化的成分进行二次蛋白水解或转化。此时所使用的蛋白酶是胃蛋白酶、胰蛋白酶、羧肽酶、氨肽酶、二肽酶等，并优选胃蛋白酶、胰蛋白酶、羧肽酶等，更优选胃蛋白酶。在步骤(d)中，将通过用蛋白酶进行生物转化得到的提取物进行冷陈化，从而保持稳定。用更细的滤膜进行二次过滤，随后进行浓缩和贮存。适当稀释所述的浓缩物供使用。酶处理-过滤-浓缩工序是制备更有效的绿豆发酵-酶处理提取物的步骤。此时，冷陈化优选进行5-10天，并且本文使用的滤膜的过滤孔径优选直至0.25μm。

[0031] 在本发明优选的实施方式中，将绿豆磨成300目或更细的粉末，将该粉末添加到培养液中(10g/L)。向其中添加50,000cfu/L的酵母或乳酸菌。将酵母或乳酸菌在发酵罐(fermentor)中分别在以下条件下培养1-7天：30℃(酵母)或37℃(乳酸菌)；pH为5-7，优选为5.5；需氧条件或兼性厌氧条件。所述培养一旦完成，用0.45μm的滤膜初步过滤所述发酵液。滤液用蛋白酶处理。将经蛋白酶处理的溶液冷陈化10天，随后用0.25μm的滤膜二次过滤。浓缩所得滤液，以得到本发明的发酵-酶处理的绿豆提取物。使用前，使最终固体粉末的浓度保持在10g/L。

[0032] 通过上述工序制备的发酵-酶处理的绿豆提取物显示出增加的异黄酮含量(试验例1)、增加的胶原生物合成(试验例2)、改善的细胞活性(试验例3)和减轻的皮肤细胞刺激性(试验例4)。所以，包含所述提取物的化妆品组合物具有改善皱纹(试验例5)和皮肤保湿(试验例6)的效果。因此，希望能将绿豆发酵-酶的提取物开发作为有效防止皮肤老化的化妆品组合物。

[0033] 在本发明中，绿豆发酵-酶提取物在总的化妆品组合物中的含量是0.0001-30.0％(v/v)，更优选0.001-20％(v/v)。如果发酵-酶处理的绿豆提取物的含量低于0.0001％(v/v)，无法预期具有改善皱纹和保护皮肤的效果。如果发酵-酶处理的绿豆提取物的含量超过30.0％(v/v)，即使增加所述含量，其效果也不显著，反而产生皮肤刺激性或是制剂的稳定性成为问题。

[0034] 本发明的发酵-酶处理的绿豆提取物的效果可通过将其在皮肤上局部施用或喷洒而实现。在本发明的优选实施方式中，可将本发明的组合物配制成诸如霜(cream)、露(lotion)或乳液(emulsion)的化妆品组合物，或配制成诸如喷雾剂(spray)或软膏(ointment)的药物组合物。

[0035] 除了发酵-酶处理的绿豆提取物(活性成分)，本发明所述的化妆品组合物可另外包含皮肤科学领域中常用的辅料(如抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、染料、着色剂或香料)和载体。

[0036] 本发明的化妆品组合物能以本领域通常接受的任何类型的制剂进行制备，例如溶液(solution)、悬浮液(suspension)、乳液、膏(paste)、啫喱(gel)、霜、露、粉(powder)、皂、含表面活性剂的清洁剂(cleansing)、油、粉状粉底(powdered foundation)、乳状粉底(emulsified foundation)、蜡状粉底(waxed foundation)和喷雾剂，但是并不总限于此。更具体地，可将所述组合物制备成柔肤露(soft lotion)(皮肤用)、滋养露(nutritionlotion)(牛奶露)、滋养霜(nutrition cream)、按摩霜、精华素(essence)、眼霜、清洁霜、清洁沫(cleansing foam)、清洁水、面膜(pack)、喷雾剂或粉。

[0037] 对于将所述化妆品组合物配制成膏、霜或啫喱的情况，合适的载体可选自于由动物油、植物油、蜡、石蜡(paraffin)、淀粉、黄蓍胶(tragacanth)、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅、膨润土、二氧化硅、滑石和氧化锌组成的组。

[0038] 对于将所述的化妆品组合物配制成粉或喷雾剂的情况，合适的载体可选自于由乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末组成的组；尤其是如果将本发明的组合物制成喷雾剂，那么可另外包含诸如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚的喷射剂(propellant)。

[0039] 对于将所述的化妆品组合物制配成溶液或乳液的情况，合适的载体可选自于由溶剂、增溶剂和乳化剂组成的组，例如水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇油(1，3-butyl glycol oil)、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇和脱水山梨醇脂肪酸酯。

[0040] 对于将所述的化妆品组合物配制成悬浮液的情况，合适的载体可选自于由以下物质组成的组：液态稀释剂，如水、乙醇或丙二醇；悬浮剂，如乙氧基化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯和聚氧乙烯脱水山梨醇酯；微晶纤维素；氢氧化铝氧化物(aluminum methahydroxide)；膨润土；琼脂；以及黄蓍胶。

[0041] 对于将所述化妆品组合物配制成含表面活性剂的清洁剂的情况，合适的载体可选自于由以下物质组成的组：脂肪醇硫酸盐/酯、脂肪醇醚硫酸盐/酯、硫代琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐/酯、咪唑啉鎓盐(imidazolinum)衍生物、甲基牛磺酸盐/酯(methyltaurate)、肌氨酸盐/酯、脂肪酸酰胺醚硫酸盐/酯、烷基酰胺基甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物和乙氧基化甘油脂肪酸酯。

[0042] 本发明还提供了一种化妆方法，其特征在于：将含发酵-酶处理的绿豆提取物的化妆品组合物施用到人的皮肤上，从而改善因老化引起的各种皮肤问题(如：增加细胞活性和胶原的生物合成、减轻皮肤细胞刺激性、使皮肤保湿等)。

[0043] 本发明的化妆方法指的是涂抹(put on)化妆品的一切方法，所述方法包括将化妆品组合物施用到人的皮肤上的步骤。也就是说，本领域技术人员已知的、将所述化妆品组合物施用到皮肤上的一切方法均包括在本发明的标准中。

[0044] 本发明所述的化妆品组合物可被施用一次或多次，或与其他化妆品组合物共同给予。具有优异的皮肤保护作用的化妆品组合物可根据常规的方法使用，给予的频率随个人的皮肤条件或喜好而变化。

[0045] 如果将本发明的化妆品组合物配制成皂、含表面活性剂的清洁剂或不含表面活性剂的清洁剂，首先将其施用到皮肤上，然后再用水将其擦净或洗去。此时，所述的皂可为液态皂、粉状皂、固态皂或油型皂(oil type soap)；含表面活性剂的清洁制剂例如清洁沫、清洁水、清洁巾(cleansing towel)和清洁面膜。不含表面活性剂的清洁制剂例如清洁霜、清洁露、清洁水和清洁啫喱，但并不总限于此。

[0046] 本发明所述的化妆方法将含发酵-酶处理的绿豆提取物的化妆品组合物施用到人的皮肤上，产生防止皮肤老化、改善皱纹和皮肤保湿的效果。

[0047] 实施例

[0048] 从对实施例进行的下列描述中，本发明的优点、特征及各方面将变得更清楚。然而，应当理解的是，这些实施例仅是说明性的，本发明的范围并不受限于此。

[0049] 对比制造例1：制备绿豆提取物

[0050] 用纯净水洗涤绿豆并干燥，随后进行碾磨(grinding)。将100g粉末添加到0.6L70％的乙醇水溶液中，随后用安装有冷却冷凝器的回流提取器进行加热提取4小时。然后，将得到的提取物用300目的滤布过滤，再用Whatman#5滤纸再次过滤。将所得滤液用旋转真空蒸发仪浓缩，以从中除去溶剂，并进行冻干。结果，得到5.5g(干重)的提取物。将所述提取物命名为“绿豆提取物”，并将最终浓度调节到1g/100mL供使用。

[0051] 对比制造例2：制备酵母发酵的绿豆料液(Phaseolus radiatus liquor)[0052] 用纯净水洗涤绿豆并干燥，随后进行碾磨，再用300目的滤布过滤以产生细粉。将绿豆粉末与纯净水以1∶10的比率混合，在121℃灭菌。用酵母接种所得混合物。此处使用的酵母是酿酒酵母，浓度为50,000cfu/L。在5L的发酵罐中，在30℃、pH 5.5下进行3天的培养。培养一旦完成，将所得培养液离心以初步去除酵母。用0.25μm的滤膜过滤所述培养液。将所得滤液进行浓缩。用合适的溶剂稀释所得浓缩物。将所制得的发酵液命名为“酵母发酵的绿豆料液”，并将最终浓度调节至1g/100mL供使用。

[0053] 对比制造例3：用乳杆菌制备乳酸菌发酵的绿豆料液

[0054] 用纯净水洗涤绿豆并干燥，随后进行碾磨，再用300目的滤布过滤以产生细粉。将绿豆粉末与纯净水以1∶10的比率混合，在121℃灭菌。用乳酸菌接种所得混合物，此处所使用的乳酸菌是乳杆菌属，浓度为50,000cfu/L。在5L的发酵罐中，在37℃、pH 5.5下进行3天的培养。培养一旦完成，将所得培养液离心以初步去除所述细菌。用0.25μm的滤膜过滤所述培养液。将所得滤液进行浓缩。用合适的溶剂稀释所得浓缩物。将所制得的发酵液命名为“乳酸菌发酵的绿豆料液”，并将最终浓度调节至1g/100mL供使用。

[0055] 对比制造例4：制备酶处理-酵母发酵的绿豆提取物

[0056] 用纯净水洗涤绿豆并干燥，随后进行碾磨，再用300目的滤布过滤以产生细粉。将绿豆粉末与纯净水以1∶10的比率混合，在121℃灭菌。将所得混合物用蛋白酶(胃蛋白酶，Sigma，USA)处理2小时，并用酵母进行接种。此处所使用的酵母是酿酒酵母，浓度为50,000cfu/L。在5L的发酵罐中，在30℃、pH 5.5下进行3天的培养。培养一旦完成，将所得培养液离心，随后初步过滤以除去酵母和残渣(debris)。然后，用0.25μm的滤膜进行二次过滤。然后将所得滤液浓缩，再用合适的溶剂进行稀释。将所制得的发酵液命名为“酶处理-酵母发酵的绿豆提取物”，并将最终浓度调节至1g/100mL供使用。

[0057] 对比制造例5：制备酶处理-乳酸菌发酵的绿豆提取物

[0058] 用纯净水洗涤绿豆并干燥，随后进行碾磨，再用300目的滤布过滤以产生细粉。将绿豆粉末与纯净水以1∶10的比率混合，在121℃灭菌。将所得混合物用蛋白酶(胃蛋白酶，Sigma，USA)处理2小时，并用乳酸菌进行接种。此处所使用的乳酸菌是乳杆菌属，浓度为50,000cfu/L。在5L的发酵罐中，在37℃、pH 5.5下进行3天的培养。培养一旦完成，将所得培养液离心，随后初步过滤以除去所述细菌和残渣。然后，用0.25μm的滤膜进行二次过滤。然后再将所得滤液离心，并用合适的溶剂进行稀释。将所制得的发酵液命名为“酶处理-乳酸菌发酵的绿豆提取物”，并将最终浓度调节至1g/100mL供使用。

[0059] 制造例1：制备酵母发酵-酶处理的绿豆提取物

[0060] 用纯净水洗涤绿豆并干燥，随后进行碾磨，再用300目的滤布过滤以产生细粉。将绿豆粉末与纯净水以1∶10的比率混合，再在121℃灭菌。用酵母接种所得混合物。此处所使用的酵母是酿酒酵母，浓度为50,000cfu/L。在5L的发酵罐中，在30℃、pH 5.5下进行3天的培养。培养一旦完成，将所得培养液离心以除去酵母，随后用0.45μm的滤膜初步过滤。将所得滤液用蛋白酶(胃蛋白酶，Sigma，USA)处理2小时，随后用0.25μm的滤膜进行二次过滤。然后再将所得滤液浓缩，并用合适的溶剂进行稀释。将所制得的发酵-酶提取物命名为“酵母发酵-酶处理的绿豆提取物”，并将最终浓度调节至1g/100mL供使用。

[0061] 制造例2：制备乳酸菌发酵-酶处理的绿豆提取物

[0062] 用纯净水洗涤绿豆并干燥，随后进行碾磨，再用300目的滤布过滤以产生细粉。将绿豆粉末与纯净水以1∶10的比率混合，在121℃灭菌。用乳酸菌接种所得混合物。此处使用的乳酸菌是乳杆菌属，浓度为50,000cfu/L。在5L的发酵罐中，在30℃、pH 5.5下进行3天的培养。培养一旦完成，将所得培养液离心以除去所述细菌，随后用0.45μm的滤膜初步过滤。将所得滤液用蛋白酶(胃蛋白酶，Sigma，USA)处理2小时，随后用0.25μm的滤膜二次过滤。再将所得滤液浓缩，并用合适的溶剂进行稀释。将所制得的发酵-酶提取物命名为“乳酸菌发酵-酶处理的绿豆提取物”，并将最终浓度调节至1g/100mL供使用。

[0063] 试验例1：发酵-酶处理的绿豆提取物中异黄酮含量的分析

[0064] 为了测定异黄酮的含量，通过高效液相色谱(HPLC)分析各制造例中制得的样品。所得结果如表1中所示。

[0065] 表1 异黄酮含量的比较

[0066]

[0067] 所得结果表明：与其他样品相比，制造例1和制造例2中的样品(发酵后用酶进行处理)中的异黄酮含量显著增加。

[0068] 试验例2：发酵-酶处理的绿豆提取物对于胶原生物合成的增加作用[0069] 在含DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Medium)的48-孔微板中，接种正常的6
人成纤维细胞(1×10 细胞/孔)，随后在37℃下培养24小时。将对比制造例1中制备的绿豆提取物、对比制造例2中的酵母发酵的绿豆料液、对比制造例3中制备的乳酸菌发酵的绿豆料液、对比制造例4中制备的酶处理-酵母发酵的绿豆提取物、对比制造例5中制备的酶处理-乳酸菌发酵的绿豆提取物、制造例1中制备的酵母发酵-酶处理的绿豆提取物以及制造例2中制备的乳酸菌发酵-酶处理的绿豆提取物作为试验组，其中相应的提取物或料液的最终浓度为1.0％，将培养基用无血清的DMEM培养基替换，随后进一步培养24小时。
将既不含提取物也不含料液的组作为对照，其中培养基用无血清的DMEM培养基替换，随后进一步培养24小时。在培养后，收集每个孔的上清液，用试剂盒(Takara，Japan)测定其中I型前胶原羧基端肽(PICP)的水平，以计算新合成的胶原的量。以ng/mL计算PICP水平。
将250μM的抗坏血酸用作阳性对照。根据下述数学图示1计算胶原生物合成的增加率，结果如表2中所示。

[0070] 数学图示1

[0071]

[0072] 表2对于胶原生物合成的增加作用

[0073]胶原生物合成的增加率(％)
阳性对照(抗坏血酸250μM) 72.8
对比制造例1 28.6
对比制造例2 35.5
对比制造例3 36.8
对比制造例4 56.4
对比制造例5 55.8
制造例1 96.8
制造例2 98.6

[0074] 由试验例2的结果证实，与对比制造例1的绿豆提取物、单纯的发酵液(对比制造例2的酵母发酵的绿豆料液和对比制造例3的乳酸菌发酵的绿豆料液)以及在酶处理后将绿豆提取物发酵得到的酶处理-发酵的绿豆提取物(对比制造例4和对比制造例5)相比，本发明制造例1和制造例2的发酵-酶处理的绿豆提取物对于胶原生物合成显示出更优异的增加作用。此外，与阳性对照抗坏血酸相比，本发明的发酵-酶处理的绿豆提取物显著增加了胶原的生物合成。

[0075] 试验例3：发酵-酶处理的绿豆提取物对于成纤维细胞增殖的提高作用[0076] 在含DMEM的96-孔微板中，接种正常的人成纤维细胞(1×104细胞/孔)，随后在37℃培养24小时。将在对比制造例1中制备的绿豆提取物、对比制造例2中制备的酵母发酵的绿豆料液、对比制造例3中制备的乳酸菌发酵的绿豆料液、对比制造例4中制备的酶处理-酵母发酵的绿豆提取物、对比制造例5中制备的酶处理-乳酸菌发酵的绿豆提取物、制造例1中制备的酵母发酵-酶处理的绿豆提取物以及制造例2中制备的乳酸菌发酵-酶处理的绿豆提取物作为试验组，其中相应的提取物或料液的最终浓度是1％，将培养基用无血清的培养基替换，随后进一步培养24小时。将既不含提取物也不含料液的组作为对照，其中将培养基用无血清的DMEM培养基替换，随后同样进一步培养24小时。培养一旦完成，对细胞的存活率进行比较。具体而言，向其中加入MTT(Sigma，USA)溶液(3mg/ml)，再用ELISA读数仪(Molecular Devices，USA)测定570nm处的吸光度。通过下面的数学图示2计算成纤维细胞的增殖率(％)，结果如表3中所示。将TGF-β用作阳性对照。

[0077] 数学图示2

[0078]

[0079] 表3对于成纤维细胞增殖的提高作用

[0080]成纤维细胞的增殖率(％)
阳性对照(TGF-β10ng/ml) 186.6
对比制造例1 120.8
对比制造例2 133.4
对比制造例3 138.6
对比制造例4 148.6
对比制造例5 142.6
制造例1 182.6
制造例2 188.6

[0081] 如表3中所示，与对比制造例1的绿豆提取物、单纯的发酵液(对比制造例2的酵母发酵的绿豆料液和对比制造例3的乳酸菌发酵的绿豆料液)以及在酶处理后将绿豆提取物进行发酵得到的酶处理-发酵的绿豆提取物(对比制造例4和对比制造例5)相比，本发明制造例1和制造例2的发酵-酶处理的绿豆提取物对于细胞增殖显示出更优异的提高作用。本发明的发酵-酶处理的绿豆提取物对细胞增殖的提高作用与TGF-β(阳性对照)的作用一样高。

[0082] 试验例4：发酵-酶处理的绿豆提取物对由乳酸引起的细胞刺激性的减轻作用[0083] 将人皮肤细胞(成纤维细胞)(KCTC，韩国典型菌种保藏中心，韩国)在T-75烧瓶4
(Falcon，USA)中培养，直到细胞汇合度达到80％。以3×10 个细胞/孔的密度将所述细胞转移到96孔板(Falcon，USA)，随后进一步培养24小时。培养后，在显微镜下观察所得细胞，看它们是否完全附着并生长良好。将乳酸(0.2％)用作对皮肤的刺激物。具体而言，向每个孔添加补充有0.2％乳酸的DMEM和不含乳酸的DMEM各200μl，另外以1.0％(v/v)的浓度向每个孔中分别添加所述绿豆提取物、酵母发酵的绿豆料液、乳酸菌发酵的绿豆料液、酶处理-酵母发酵的绿豆提取物、酶处理-乳酸菌发酵的绿豆提取物(对比制造例1-5)和发酵-酶处理的绿豆提取物(制造例1和制造例2)。此时，既不用乳酸、绿豆提取物、发酵的绿豆料液、酶处理-发酵的绿豆提取物处理对照组，也不用发酵-酶处理的绿豆提取物处理对照组。仅用乳酸处理对比组。用试样处理12小时后，对细胞的存活率进行比较。具体而言，向其中加入MTT(Sigma，USA)溶液(3mg/ml)，再用ELISA读数仪(Molecular Devices，USA)测定570nm处的吸光度。通过下面的数学图示3计算细胞的存活率(％)，结果如表4中所示。

[0084] 数学图示3

[0085]

[0086] 表4发酵-酶处理的绿豆提取物对细胞刺激性的减轻作用

[0087]成纤维细胞的增殖率(％)
对照 98.8
对比对照(乳酸0.2％) 0.0
对比制造例1(1％) 98.6
对比制造例1(1％)+乳酸0.2％ 56.4
对比制造例2(1％) 100.2
对比制造例2(1％)+乳酸0.2％ 60.2
对比制造例3(1％) 100.0
对比制造例3(1％)+乳酸0.2％ 60.4
对比制造例4(1％) 98.8
对比制造例4(1％)+乳酸0.2％ 66.8
对比制造例5(1％) 98.8
对比制造例5(1％)+乳酸0.2％ 64.8
制造例1(1％) 98.8
制造例1(1％)+乳酸0.2％ 72.6
制造例2(1％) 100.0
制造例2(1％)+乳酸0.2％ 74.6

[0088] 如表4中所示，相比于对比制造例1的绿豆提取物，本发明制造例1和2中制得的发酵-酶处理的绿豆提取物对于细胞存活率显示出更优异的提高效果，表明它们对于由乳酸处理引起的细胞毒性具有优异的减轻作用；并且相比于单纯发酵的绿豆料液(对比制造例2的酵母发酵的绿豆料液和对比制造例3的乳酸发酵的绿豆料液)和在酶处理后将绿豆提取物发酵得到的酶处理-发酵的绿豆提取物(对比制造例4和对比制造例5)，本发明制造例1和制造例2中制得的发酵-酶处理的绿豆提取物对于细胞存活率显示出更优异的提高效果，表明它们具有优异的减轻细胞刺激的作用。

[0089] 基于上述结果，下文中提供了含本发明的发酵-酶处理的绿豆提取物的化妆品组合物。尽管如此，本发明所述的组合物不限于下列实例。包含在所述组合物中的发酵-酶处理的绿豆提取物可以是酵母发酵-酶处理的绿豆提取物或乳酸菌发酵-酶处理的绿豆提取物。

[0090] 配方1：柔肤露

[0091] 基于如下组成，制备含发酵-酶处理的绿豆提取物的柔肤露。

[0092] 表5

[0093]成分 含量(单位：重量％)
发酵-酶处理的绿豆提取物 0.5
甘油 5.0
1，3-丁二醇 3.0
尿囊素 0.1
DL-泛醇 0.3
E.D.T.A-2Na 0.02
二苯甲酮-9 0.04
透明质酸钠 5.0
Nicol HCO 60 0.4
对羟基苯甲酸甲酯 0.2
香料(fragrant) 0.01
蒸馏水 余量
总量 100

[0094] 配方2：滋养露

[0095] 基于如下组成，制备含发酵-酶处理的绿豆提取物的滋养露。

[0096] 表6

[0097]成分 含量(单位：重量％)
发酵-酶处理的绿豆提取物 2.0
甘油硬脂酸酯SE 1.5
硬脂醇 1.5
羊毛脂 1.5
聚山梨酯60 1.3
脱水山梨醇硬脂酸酯 0.5
氢化植物油 1.0
矿物油 5.0
角鲨烷 3.0
三辛酸甘油酯(trioctanoin) 2.0
二甲硅油(dimethicone) 0.8
醋酸生育酚 0.5
羧乙烯基聚合物 0.12
甘油 5.0
1，3-丁二醇 3.0
透明质酸钠 5.0
三乙醇胺 0.12
对羟基苯甲酸甲酯 0.2
香料 0.02
蒸馏水 余量
总量 100

[0098] 配方3：滋养霜

[0099] 基于如下组成，制备含发酵-酶处理的绿豆提取物的滋养霜。

[0100] 表7

[0101]成分 含量(单位：重量％)
发酵-酶处理的绿豆提取物 3.0
单硬脂酸甘油酯(亲脂性的) 2.0
鲸蜡硬脂醇 2.2
硬脂酸 1.5
蜡 1.0
聚山梨酯60 1.5
脱水山梨醇硬脂酸酯 0.6
氢化植物油 1.0
角鲨烷 3.0
矿物油 5.0
三辛酸甘油酯 5.0
二甲硅油 1.0
硅酸镁钠 0.1
甘油 5.0
甜菜碱(Betain) 3.0
三乙醇胺 1.0
透明质酸钠 4.0
对羟基苯甲酸甲酯 0.2
香料 0.05
蒸馏水 余量
总量 100

[0102] 试验例5：含发酵-酶处理的绿豆提取物的化妆品皱纹改善效果的评价[0103] 进行临床试验，以研究本发明的化妆品组合物的皱纹改善效果。本试验采用：配方3的滋养霜，该滋养霜含有3％(v/v)制造例2的乳酸菌发酵-酶处理的绿豆提取物；对比