包含合成佐剂的疫苗组合物

摘要

基于合成的吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)的有益免疫学佐剂特性的发现，本申请公开了包括用于诱导或增强免疫应答的疫苗和药物组合物的组合物和方法，所述合成的吡喃葡萄糖基脂佐剂以基本上同质的形式提供。化学定义的合成的GLA提供了批次之间一致的疫苗组分而没有沾染物或活性的波动，该波动损害天然产物佐剂。还提供了包括抗原、钟样受体(TLR)激动剂、辅佐剂和诸如药物载体的载体中的一种或多种以及GLA的疫苗和药物组合物。

权利要求

1.用于治疗过敏状况的包含药学上可接受的载体和GLA的组合物，其中所述GLA具有以下通式：其中：

1 3 5 6

所述R、R、R 和R 是十一烷基，且

2 4

所述R 和R 是十三烷基。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述GLA存在于水包油型乳剂中。

3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述过敏状况是季节性鼻炎。

4.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述组合物还包含过敏原。

5.如权利要求4所述的组合物，其中所述治疗包括给予逐渐增加剂量的包含过敏原和GLA的组合物。

6.如权利要求3所述的组合物，其中所述组合物还包含过敏原。

7.如权利要求6所述的组合物，其中所述治疗包括给予逐渐增加剂量的包含过敏原和GLA的组合物。

8.包含药学上可接受的载体和GLA的组合物在制备用于治疗过敏状况的药物中的用途，其中所述GLA具有以下通式：其中：

所述R1、R3、R5和R6是十一烷基，且所述R2和R4是十三烷基。

9.如权利要求8所述的用途，其中所述GLA存在于水包油型乳剂中。

10.如权利要求8或9所述的组合物或用途，其中所述过敏状况是季节性鼻炎。

11.如权利要求8或9所述的组合物或用途，其中所述组合物还包含过敏原。

12.如权利要求11所述的组合物或用途，其中所述治疗包括给予逐渐增加剂量的包含过敏原和GLA的组合物。

13.如权利要求10所述的组合物或用途，其中所述组合物还包含过敏原。

14.如权利要求13所述的组合物或用途，其中所述治疗包括给予逐渐增加剂量的包含过敏原和GLA的组合物。

说明书

包含合成佐剂的疫苗组合物

[0001] 政府权益声明

[0002] 本发明的完成部分依赖于国立卫生研究院授予的AI-25038基金的政府资助。政府享有该发明的某些权利。

[0003] 相关申请的交叉引用

[0004] 本申请是2009年1月9日提交的、目前未决的美国专利申请第12/351,710号的部分继续申请；本申请是2008年6月5日提交的、目前已放弃的美国专利申请第12/134,127号的继续申请；本申请是2008年5月22日提交的、目前已放弃的美国申请第12/154,663号的部分继续申请；并且本申请是2007年9月26日提交的、目前未决的美国申请第11/862,122号的部分继续申请，美国申请第11/862,122号根据35U.S.C.§119(e)要求
2006年9月26日提交的美国临时专利申请第60/847,404号的优先权；通过引用的方式将全部这些申请的整体并入本文。

[0005] 发明背景发明领域

[0006] 本发明涉及药物和疫苗组合物领域。更具体地，本文描述的实施方案涉及药物和疫苗组合物，以及相关的预防和治疗方法，其中所述组合物包含吡喃葡萄糖基脂佐剂(glucopyranosyl lipid adjuvant，GLA)。

[0007] 相关领域描述

[0008] 高级生物体的免疫系统被表征为区分外源物质(或“非己”物质)和亲近的或“自身”组分，这使得外源物质引发免疫应答而“自身”组分被忽略或耐受。免疫应答传统上被表征为体液应答或细胞介导的应答，其中在体液应答中由称为浆细胞的分化的B淋巴细胞产生抗原特异性抗体，在细胞介导的应答中不同类型的T淋巴细胞作用通过多种机制清除抗原。例如，能识别特异性抗原的CD4+辅助T细胞可以通过释放诸如细胞因子的可溶性的介质募集免疫系统的其它细胞来作出应答以参与免疫应答。同样，也能识别特异性抗原的CD8+细胞毒T细胞可以通过结合到携带抗原的细胞或颗粒并破坏或损伤所述细胞或颗粒来作出应答。通常为诱导宿主理想的免疫应答，提供根据多种不同制剂的某些疫苗，这在免疫学领域是已知的。

[0009] 通过给予宿主疫苗来引发特异性免疫应答的几种策略包括用诸如病毒、细菌或某些真核病原体的热灭活的或者活的减毒的感染性病原体进行免疫；用能够指导遗传物质表达的无毒力转染原进行免疫，其中所述遗传物质编码免疫应答所针对的一种或多种抗原；以及用包含来自特定病原体的分离的免疫原(诸如蛋白)的亚单位疫苗进行免疫，以产生针对所述病原体的免疫。(参见，例如，Liu，1998 Nature Medicine 4(5suppl.)：515.)对于某些抗原，可有一种或多种类型的理想免疫，这些方法中没有一种对所述免疫特别有效，包括疫苗的开发，所述疫苗在免疫学上保护宿主抗人免疫缺陷病毒或其它感染性病原体、癌症、自体免疫疾病或其它临床病症中是有效的。

[0010] 长期认为肠细菌脂多糖(LPS)是免疫系统的有效刺激物，尽管它在佐剂中的使用已经由于其毒性效应被缩减。LPS的无毒衍生物，单磷酰脂质A(MPL)已被Ribi等(1986，Immunology and lmmunopharmacology of Bacterial Endotoxins(细菌内毒素的免疫学和免疫药物学)，Plenum Publ.Corp.，NY，p407-419)描述，所述单磷酰脂质A是通过从葡糖胺的还原端移除核心糖基团和磷酸产生的。

[0011] MPL的另一种去毒形式是从二糖骨架的3-位去除酰基链后得到，其被称为3-O-脱酰基单磷酰脂质A(3D-MPL)。它可以通过GB 2122204B中教导的方法来纯化和制备，GB2122204B参考文献也公开了双磷酰脂质A和其3-O-脱酰基变体的制备。例如，已经以具有直径小于0.2μm的小粒度的乳剂的形式制备了3D-MPL，且其制备方法在WO 94/21292中被公开。包含单磷脂酰脂质A和表面活性剂的水制剂已在WO9843670A2中被描述。

[0012] 可以从细菌来源中纯化和加工欲被配制在佐剂组合物中的细菌脂多糖来源的佐剂，或可选择地，它们可以是合成的。例如，在Ribi等，1986(上述)中描述了纯化的单磷酰脂质A，在GB 2220211和美国专利第4,912,094号中描述了衍生自沙门氏菌属(Salmonella sp.)的3-O-脱酰基单磷酰脂质A或3-O-脱酰基双磷酰脂质A。3D-MPL和β(1-6)二糖葡糖胺以及其它纯化的和合成的脂多糖已被描述(WO 98/01139；美国专利第6,005,099号和EP 0 729 473 B1，Hilgers et al.，1986 Int.Arch.Allergy Immunol.，79(4)：392-6；Hilgers et at.，1987，Immunology，60(1)；141-6；和EP 0 549 074 B1)。3D-MPL和来自智利皂荚树(Quillaja Saponaria Molina)树皮的皂苷佐剂的组合物在EP 0761231B中被描述。WO 95/17210公开了佐剂乳化系统，其基于与免疫刺激物QS21配制的鲨烯、α-生育酚TM
和聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯(TWEEN -80)，任选地包括3D-MPL。尽管这种组合物易得到，但使用来自天然产物的佐剂伴随着高生产成本、批次之间的不一致、大规模生产的困难，以及杂质在任何给定的制剂的组合构成中存在的不确定性。

[0013] 很明显，对改良的疫苗存在需要，特别是对有益地包含高纯度、化学定义的佐剂组分的疫苗存在需要，所述疫苗显示了不同批次之间的一致性，可以被以工业规模有效制备而不引入不必要的或结构不确定的沾染物。本发明提供了用于这种疫苗的组合物和方法，并提供了其它相关的优势。

[0014] 发明简述

[0015] 本发明在其几个实施方案中涉及组合物和方法，所述组合物和方法有利地使用了合成的吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)作为佐剂和疫苗组分。依照本文描述的本发明的一个实施方案，提供了包含抗原和吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)的疫苗组合物。

[0016] 在另一个实施方案中，提供了包含(a)抗原、吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)和钟样受体(toll-like receptor，TLR)激动剂的疫苗组合物，其中在某些另外的实施方案中，所述TLR激动剂选自脂多糖、肽聚糖、聚肌胞(poly I:C)、CpG、3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a(LeIF)的利什曼虫(Leishmania)同源体以及单链RNA。在另一个实施方案中，提供了包含抗原、吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)和选自皂苷和皂苷类似物的至少一种辅佐剂的疫苗组合物。在另一个实施方案中，提供了包含抗原、吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)和TM载体的疫苗组合物，所述载体包含油和ISCOMATRIX 的至少一种。在另一个实施方案中，提供了包含抗原、吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)以及下述的一种或多种的疫苗组合物：(i)至少一种辅佐剂，(ii)至少一种TLR激动剂，(iii)至少一种咪唑并喹啉(imidazoquinoline)免疫应答调节剂，以及(iv)至少一种双茎环免疫调节剂(dSLIM)。在某些另外的实施方案中，(i)所述辅佐剂当存在时选自明矾、植物碱和去垢剂，其中所述植物碱选自番茄素，且所述去垢剂选自皂苷、聚山梨醇酯80、司盘85(Span 85)和硬脂酰酪氨酸(Stearyl tyrosine)；(ii)所述TLR激动剂当存在时选自脂多糖、肽聚糖、聚肌胞、CpG、3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a(LeIF)的利什曼虫同源体；以及(iii)所述咪唑并喹啉免疫应答调节剂当存在时选自雷西莫特(resiquimod)(R848)、咪喹莫特(imiquimod)和噶德莫特(gardiquimod)。在另一个实施方案中，提供了包含抗原、吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)、以及辅佐剂和药学上可接受载体中至少一种的疫苗组合物，其中：所述辅佐剂选自细胞因子、去垢剂和嵌段共聚物或生物可降解聚合物，且所述药学上可接受的载体包含选自如下的载体：磷酸钙、水包油型乳剂、油包水型乳剂、脂质体、新体(novasome)、非离子表面活性剂囊泡(例如，类脂质体(noisome))和微粒。在特别的实施方案中，其中使用了脂质体或类似的载体，GLA位于脂质体的层状结构，或被包裹。在另一个特别的实施方案中，其中使用了微粒，所述微粒是基于或包含聚合物脂肪脂质(fat lipids)的一种。

[0017] 在某些另外的实施方案中，细胞因子选自GM-CSF、IL-2、IL-7、IL-12、TNF-α和IFN-γ，嵌段聚合物或生物可降解聚合物选自普流罗尼克L121(Pluronic L121)、CRL1005、PLGA、PLA、PLG和聚肌胞，去垢剂选自皂苷、聚山梨醇酯80、司盘85和硬脂酰酪氨酸。

[0018] 在另一个实施方案中，提供了包含至一种重组表达构建体和吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)的疫苗组合物，所述构建体包含可操作连接于编码靶病原体或恶性肿瘤相关抗原的核酸序列的启动子。在一个实施方案中，所述重组表达构建体存在于细菌、酵母或病毒载体中，该构建体在某些另外实施方案中存在于选自腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、慢病毒、痘病毒、逆转录酶病毒和α病毒的病毒中。

[0019] 依照上述所有实施方案中的某些，GLA没有3′-脱-O-酰化。依照上述所有实施方案中的某些，GLA包含(i)双葡糖胺骨架，其具有通过非还原末端葡糖胺的1位氨基己醣和还原末端葡糖胺的6位氨基己醣之间的醚键连接于非还原末端葡糖胺的还原末端葡糖胺；(ii)连接于非还原末端葡糖胺的4位氨基己醣的O-磷酰基团；以及(iii)至多6个的脂酰链，其中一个脂酰链通过酯键连接于还原末端葡糖胺的3羟基，其中一个脂酰链通过酰胺键连接于非还原末端葡糖胺的2-氨基，并包含通过酯键与多于12个碳原子的烷酰基链连接的十四酰链，以及其中一个脂酰链通过酯键连接于非还原末端葡糖胺的3-羟基并包含通过酯键与多于12个碳原子的烷酰基链连接的十四酰链。

[0020] 依照包括TLR激动剂的上述所有实施方案中的某些，TLR激动剂能够通过与选自TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-6、TLR-7、TLR-8和TLR-9中的至少一种TLR相互作用来递送生物信号。在某些另外的实施方案中，所述TLR激动剂选自脂多糖、肽聚糖、聚肌胞、CpG、3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a(LeIF)的利什曼虫同源体。在特别的实施方案中，其中使用了TLR-7和/或TLR-8激动剂，TLR-7和/或TLR-8激动剂被诱陷于囊泡中。

[0021] 依照上述所有实施方案中的某些，GLA具有下式：

[0022]

[0023] 其中：R1、R3、R5和R6是C11-C20烃基；且R2和R4是C12-C20烃基。

[0024] 依照上述所有实施方案中的某些，疫苗组合物能够在宿主体内引发免疫应答。在某些另外的实施方案中，免疫应答是对抗原特异的。依照上述所有实施方案中的某些，所述抗原能够在宿主体内引发免疫应答，所述免疫应答选自体液应答和细胞介导的应答。依照上述所有实施方案中的某些，疫苗组合物能够在宿主体内引发至少一种免疫应答，所述应答选自TH1-型T淋巴细胞应答、TH2-型T淋巴细胞应答、细胞毒T淋巴细胞(CTL)应答、抗体应答、细胞因子应答、淋巴因子应答、趋化因子应答以及炎症应答。依照上述所有实施方案中的某些，疫苗组合物能够在宿主体内引发至少一种免疫应答，所述应答选自(a)一种或多种细胞因子的产生，其中所述细胞因子选自干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；(b)一种或多种白介素的产生，其中所述白介素选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-16、IL-18和IL-23；(c)一种或多种趋化因子的产生，其中所述趋化因子选自MIP-1α、MIP-1β、RANTES、CCL4和CCL5、MCP-1；以及(d)选自记忆性T细胞应答、记忆性B细胞应答、效应T细胞应答、细胞毒T细胞应答以及效应B细胞应答的淋巴细胞应答。

[0025] 依照上述所有实施方案中的某些，抗原来自选自细菌、病毒和真菌的至少一种感染性病原体，或可选择地来自恶性肿瘤细胞。

[0026] 在某些另外的实施方案中，细菌是放线细菌(Actinobacterium)，且仍在某些另外的实施方案中，所述放线细菌是分支杆菌(mycobacterium)。在某些其它相关的实施方案中，所述分支杆菌选自肺结核分支杆菌(M.tuberculosis)和麻风分支杆菌(M.leprae)。在某些其它的实施方案中，所述细菌选自沙门氏菌(Salmonella)、淋球菌(Neisseria)、螺旋体(Borrelia)、衣原体(Chlamydia)和博德特氏菌(Bordetella)。

[0027] 在某些其它相关的实施方案中，病毒选自单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、巨细胞病毒(cytomegalovirus)、水痘-带状疱疹病毒(Varicella Zoster Virus)、肝炎病毒、爱泼斯坦-巴尔氏病毒(Epstein Barr Virus，EBV)、呼吸道合胞病毒、人乳头瘤病毒(HPV)和巨细胞病毒。依照上述所有实施方案中的某些，抗原来自人类免疫缺陷病毒，其在某些另外的实施方案中选自HIV-1和HIV-2。

[0028] 在某些其它相关的实施方案中，真菌选自曲霉菌(Aspergillus)、芽生菌(Blastomyces)、球孢菌(Coccidioides)和肺孢子菌(Pneumocystis)。在某些其它相关的实施方案中，所述真菌是酵母，其在某些另外相关的实施方案是假丝酵母(Candida)，其中仍在某些另外的实施方案中，假丝酵母选自白色念珠菌(C.albicans)、光滑念珠菌(C.glabrata)、克柔念珠菌(C.kruseii)、葡萄牙念珠菌(C.lusitaniae)、热带念珠菌(C.tropicalis)、近平滑念珠菌(C.parapsilosis)。

[0029] 依照上述所有实施方案中的某些，抗原来自寄生虫，所述寄生虫在某些另外的实施方案中是原生动物，其在某些另外的实施方案中是疟原虫(Plasmodium)，其仍在某些另外的实施方案中选自恶性疟原虫(P.falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、三日疟原虫(P.malariae)和卵圆疟原虫(P.ovale)。在某些其它实施方案中，寄生虫选自棘阿米巴(Acanthamoeba)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、管圆线虫(Angiostrongylus)、曼氏血吸虫(Schistosoma mansonii)、埃及血吸虫(Schistosoma haematobium)、日本血吸虫(Schistosoma japonicum)、湄公河血吸虫(Schistosoma mekongi)、隐孢子虫(Cryptosporidium)、钩口线虫(Ancylostoma)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、结肠内阿米巴(Entamoeba coli)、迪斯帕内阿米巴(Entamoeba dispar)、哈特曼内阿米巴(Entamoeba hartmanni)、波氏内阿米巴(Entamoeba polecki)、班氏吴策线虫(Wuchereria bancrofti)、贾第虫(Giardia)、利什曼虫(Leishmania)、蠕形住肠蛲虫(Enterobius vermicularis)、人蛔虫(Ascaris lumbricoides)、毛首鞭形线虫(Trichuris trichuria)、美洲板口线虫(Necator americanus)、十二指肠钩虫(Ancylostoma duodenale)、马来丝虫(Brugia malayi)、旋盘尾丝虫(Onchocerca volvulus)、麦 地 那 龙 线 虫(Dracanculus medinensis)、旋 毛 线 虫 (Trichinella spiralis)、粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)、中华后睾吸虫(Opisthorchis sinensis)、并殖吸虫属(Paragonimus sp)、肝片形吸虫(Fasciola hepatica)、姜片吸虫(Fasciola magna)、大片吸虫(Fasciola gigantica)、牛肉绦虫(Taenia saginata)和猪肉绦虫(Taenia solium)。

[0030] 在本发明的另外的实施方案中，抗原来自弹状病毒，包括以下的任何一种：短暂热病毒属成员，例如牛流行热病毒；狂犬病病毒属成员，例如狂犬病病毒；和水泡病毒属成员，例如水泡口炎病毒(VSV)。

[0031] 依照上述所有实施方案中的某些，抗原来自至少一种癌细胞。在某些另外的实施方案中，所述癌细胞源自原发性实体肿瘤，且在某些其它另外的实施方案中，所述癌细胞源自为转移性或继发性实体肿瘤的癌，以及在某些其它的实施方案中，所述癌细胞源自为循环肿瘤或腹水肿瘤的癌。在某些相关的实施方案中，所述癌细胞源自选自下述的癌：宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮细胞肉瘤、淋巴管肉瘤、腹膜假黏液瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤(Ewing′s tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、磷状上皮细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管肺癌(bronchogenic carcinoma)、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌和肾母细胞瘤(Wilms’tumor)。在某些其它相关的实施方案中，癌细胞源自选自下述的癌：睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星细胞瘤、髓母细胞瘤(medulloblastoma)、颅咽管瘤、室管膜瘤(ependymoma)、松果体瘤、血管母细胞瘤(hemangioblastoma)、听神经瘤、少突胶质细胞瘤(oliodendroglioma)、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom′s macroglobulinemia)和重链病。

[0032] 依照上述所有实施方案中的某些，抗原来自与自身免疫疾病相关的至少一个抗原决定部位、生物分子、细胞或组织，或者与其在免疫学上交叉反应。在某些另外的实施方案中，与自身免疫疾病相关的抗原决定部位、生物分子、细胞或组织选自snRNP(当所述自身免疫疾病是系统性红斑狼疮时)，甲状腺球蛋白、促甲状腺素受体和甲状腺上皮细胞中的至少一种(当所述自身免疫疾病是格雷夫斯病(Graves’disease)时)，血小板(当所述自身免疫疾病是血小板减少性紫癜时)，天疱疹抗原、桥粒芯糖蛋白-3(desmoglein-3)、桥粒斑蛋白(desmoplakin)、包斑蛋白(envoplakin)和大疱性类天疱疮抗原1中的至少一种(当所述自身免疫疾病是天疱疮时)，髓磷脂碱性蛋白(当所述自身免疫疾病是多发性硬化时)，胰岛β细胞(当所述自身免疫疾病是1型糖尿病时)以及乙酰胆碱受体(当所述自身免疫疾病是重症肌无力(myasthenia gravis)时)。

[0033] 在另一个实施方案中，提供了诱导或增强免疫应答的药物组合物，其包含吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)，以及药学上可接受的载体或赋形剂。在另一个实施方案中，提供了诱导或增强免疫应答的药物组合物，其包含抗原、吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)以及药学上可接受的载体或赋形剂。在另一个实施方案中，提供了诱导或增强免疫应答的药物组合物，其包含抗原、吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)、钟样受体(TLR)激动剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。在另外的实施方案中，TLR激动剂选自脂多糖、肽聚糖、聚肌胞、CpG、3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a(LeIF)的利什曼虫同源体。在另一个实施方案中，提供了诱导或增强免疫应答的药物组合物，其包含抗原、吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)、选自皂苷和皂苷类似物的至少一种辅佐剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。在另一个实施方案中，提供了诱导或增强免疫应答的药物组合物，其包含抗原、吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)以TM及药学上可接受的载体，所述载体包含油和ISCOMATRIX 中的至少一种。在另一个实施方案中，提供了诱导或增强免疫应答的药物组合物，其包含(a)抗原，(b)吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)，(c)下述中的一种或多种：(i)至少一种辅佐剂、(ii)至少一种TLR激动剂、(iii)至少一种咪唑并喹啉免疫应答调节剂和(iv)至少一种双茎环免疫调节剂(dSLIM)，以及(d)药学上可接受的载体或赋形剂。在某些另外的实施方案中，(i)辅佐剂当存在时选自明矾、植物碱和去垢剂，其中所述植物碱是番茄素，所述去垢剂选自皂苷、聚山梨醇酯80、司盘
85和硬脂酰酪氨酸；(ii)TLR激动剂当存在时选自脂多糖、肽聚糖、聚肌胞、CpG、3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a(LeIF)的利什曼虫同源体；以及(iii)所述咪唑并喹啉免疫应答调节剂当存在时选自雷西莫特(R848)、咪喹莫特和嘎德莫特。

[0034] 在另一个实施方案中，提供了诱导或增强免疫应答的药物组合物，其包含抗原、吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)以及至少一种辅佐剂和药学上可接受的载体，其中：所述辅佐剂选自细胞因子、嵌段共聚物或生物可降解的聚合物以及去垢剂，并且所述药学上可接受的载体包含选自磷酸钙、水包油型乳剂、油包水型乳剂、脂质体以及微粒的载体。在某些另外的实施方案中，所述细胞因子选自GM-CSF、IL-2、IL-7、IL-12、TNF和IFN-γ，所述嵌段共聚物或生物可降解聚合物选自普流罗尼克 L121、CRL1005、PLGA、PLA、PLG和聚肌胞，且所述去垢剂选自皂苷、聚山梨醇酯80、司盘85和硬脂酰酪氨酸。

[0035] 在另一个实施方案中，提供了药物组合物，其包含至少一种重组表达构建体、吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)以及药学上可接受的载体或赋形剂，所述构建体包含可操作连接于编码抗原的核酸序列的启动子。在某些另外的实施方案中，所述重组表达构建体存在于病毒载体，该构建体在某些另外实施方案中存在于选自腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、慢病毒、诸如辛德毕斯病毒、VEE或SFV的α病毒、痘病毒和逆转录酶病毒的病毒中。

[0036] 依照上述药物组合物的某些另外的实施方案，抗原和GLA彼此接触；而依照上述药物组合物的某些其它另外的实施方案，抗原和GLA彼此并不接触。在某些另外的实施方案中，其中所述抗原和GLA彼此不接触，它们存在与分离的容器内。在其它实施方案中，提供了诱导或增强免疫应答的药物组合物，其包含含有抗原和第一药学上可接受的载体或赋形剂的第一结合物；以及含有吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)和第二药学上可接受的载体或赋形剂的第二结合物，其中所述抗原和GLA彼此并不接触。在另外的实施方案中，所述抗原和GLA存在于分离的容器内。在某些相关的实施方案中，所述第一药学上可接受的载体或赋形剂不同于所述第二药学上可接受的载体或赋形剂。在其它相关的实施方案中，所述第一药学上可接受的载体或赋形剂与所述第二药学上可接受的载体或赋形剂并无不同。

[0037] 在另一个实施方案中，提供了治疗或预防个体感染性疾病的方法，所述个体具有或疑似有患感染性疾病的危险，所述方法包括给予所述个体包含(a)抗原和(b)吡喃糖脂佐剂(GLA)的疫苗组合物，其中所述抗原来自至少一种与所述感染性疾病相关的感染性病原体，或与其在免疫学上交叉反应，并由此治疗或预防所述感染性疾病。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防个体感染性疾病的方法，所述个体具有或疑似有患感染性疾病的危险，所述方法包括给予个体包含(a)抗原、(b)吡喃糖脂佐剂(GLA)和(c)钟样受体(TLR)激动剂的疫苗组合物，其中所述抗原来自至少一种与所述感染性疾病相关的感染性病原体，或与其在免疫学上交叉反应，并由此治疗或预防所述感染性疾病。在另外的实施方案中，所述TLR激动剂选自脂多糖、肽聚糖、聚肌胞、CpG、3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a(LeIF)的利什曼虫同源体。在另一个实施方案中，提供了治疗和预防个体感染性疾病的方法，所述个体具有或疑似有患感染性疾病的危险，所述方法包括给予所述个体包含(a)抗原、(b)吡喃葡糖脂佐剂(GLA)和(c)选自皂苷和皂苷类似物的至少一种辅佐剂的疫苗组合物，其中所述抗原来自与感染性疾病相关的至少一种感染性病原体，或者与其在免疫学上交叉反应，并由此治疗或预防所述感染性疾病。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防个体感染性疾病的方法，所述个体具有或疑似有患感染性疾病的危险，所述方法包括TM给予个体包含(a)抗原、(b)吡喃葡糖脂佐剂(GLA)以及(c)包含油和ISCOMATRIX 中的至少一种的载体的疫苗组合物，其中所述抗原来自与感染性疾病相关的至少一种感染性病原体，或者与其在免疫学上交叉反应，并由此治疗或预防所述感染性疾病。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防个体中感染性疾病的方法，所述个体具有或疑似有患感染性疾病的危险，所述方法包括给予个体疫苗组合物，所述组合物包含(a)抗原，(b)吡喃葡糖脂佐剂(GLA)，以及(c)下述中的一种或多种：(i)至少一种辅佐剂、(ii)至少一种TLR激动剂、(iii)至少一种咪唑并喹啉免疫应答调节剂和(iv)至少一种双茎环免疫调节剂(dSLIM)，其中所述抗原来自与感染性疾病相关的至少一种感染性病原体，或者与其在免疫学上交叉反应，并由此治疗或预防所述感染性疾病。在某些另外的实施方案中，(i)所述辅佐剂当存在时选自明矾、植物碱和去垢剂，其中所述植物碱是番茄素，且所述去垢剂选自皂苷、聚山梨醇酯80、司盘85和硬脂酰酪氨酸；(ii)所述TLR激动剂当存在时选自脂多糖、肽聚糖、聚肌胞、CpG、3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a(LeIF)的利什曼虫同源体；以及(iii)所述咪唑并喹啉免疫应答调节剂当存在时选自雷西莫特(R848)、咪喹莫特和嘎德莫特。

[0038] 在另一个实施方案中，提供了治疗或预防个体感染性疾病的方法，所述个体具有或疑似有患感染性疾病的危险，所述方法包括给予所述个体包含(a)抗原、(b)吡喃糖脂佐剂(GLA)和(c)辅佐剂和药学上可接受的载体中的至少一种的疫苗组合物，其中：所述辅佐剂选自细胞因子、嵌段共聚物或生物可降解聚合物和去垢剂，且所述药学上可接受的载体包括选自磷酸钙、水包油型乳剂、油包水型乳剂、脂质体和微粒的载体，其中所述抗原来自与所述感染性疾病相关的至少一种感染性病原体或与其在免疫学上交叉反应，并由此治疗或预防所述感染性疾病。在某些另外的实施方案中，所述细胞因子选自GM-CSF、IL-2、IL-7、IL-12、NF-α和IFN-γ，所述嵌段共聚物或生物可降解聚合物选自普流罗尼克L121、CRL1005、PLGA、PLA、PLG和聚肌胞，并且所述去垢剂选自皂苷、聚山梨醇酯80、司盘85和硬脂酰酪氨酸。

[0039] 在另一个实施方案中，提供了治疗或预防个体感染性疾病的方法，所述个体具有或疑似有患所述转染性疾病的危险，所述方法包括给予所述个体包含(a)至少一种重组表达载体和(b)吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)的疫苗组合物，所述构建体包含可操作连接于编码抗原的核酸序列的启动子，其中所述抗原来自与所述感染性疾病相关的至少一种感染性病原体，或者与其在免疫学上交叉反应，并由此治疗或预防所述感染性疾病。在另外的实施方案中，所述重组表达构建体存在于病毒载体，其在某些另外的实施方案中存在于选自腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、慢病毒、痘病毒和逆转录酶病毒的病毒。依照与上述方法相关的某些实施方案，所述抗原来自选自细菌、病毒和真菌的至少一种感染性病原体。

[0040] 在另一个实施方案中，提供了治疗或预防个体自身免疫疾病的方法，所述个体具有或疑似有患自身免疫疾病的危险，所述方法包括给予所述个体包含(a)抗原和(b)吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)的疫苗组合物，其中所述抗原来自与自身免疫疾病相关的至少一种抗原决定部位、生物分子、细胞或组织，或者与其在免疫学上交叉反应，并由此治疗或预防所述自身免疫疾病。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防个体自身免疫疾病的方法，所述个体具有或疑似有患自身免疫疾病的危险，所述方法包括给予所述个体包含(a)抗原、(b)吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)和(c)钟样受体(TLR)激动剂的疫苗组合物，其中所述抗原来自与自身免疫疾病相关的至少一种抗原决定部位、生物分子、细胞或组织，或者与其在免疫学上交叉反应，并由此治疗或预防自身免疫疾病。在某些另外的实施方案中，所述TLR激动剂选自脂多糖、肽聚糖、聚肌胞、CpG、3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a(LeIF)的利什曼虫同源体。在另一个实施方案中，提供了治疗和预防个体自身免疫疾病的方法，所述个体具有或疑似有患自身免疫疾病的危险，所述方法包括给予所述个体包含(a)抗原、(b)吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)和(c)至少一种选自皂苷和皂苷类似物的辅佐剂的疫苗组合物，其中所述抗原来自与自身免疫疾病相关的至少一种抗原决定部位、生物分子、细胞或组织，或者与其在免疫学上交叉反应，并由此治疗或预防自身免疫疾病。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防个体中自身免疫疾病的方法，所述个体具有或疑似有患自身免疫疾病的危险，所述方法包括给予个体包含(a)抗原、(b)吡喃葡萄糖基脂佐剂TM(GLA)以及(c)包含油和ISCOMATRIX 中的至少一种的载体的疫苗组合物，其中所述抗原来自与自身免疫疾病相关的至少一种抗原决定部位、生物分子、细胞或组织，或者与其在免疫学上交叉反应，并由此治疗或预防自身免疫疾病。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防个体免疫性疾病的方法，所述个体具有或疑似有患自身免疫疾病的危险，所述方法包括给予个体疫苗组合物，所述组合物包含(a)抗原，(b)吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)，(c)下述中的一种或多种：(i)至少一种辅佐剂、(ii)至少一种TLR激动剂、(iii)至少一种咪唑并喹啉免疫应答调节剂、(iv)至少一种双茎环免疫调节剂(dSLIM)，其中所述抗原来自与自身免疫疾病相关的至少一种抗原决定部位、生物分子、细胞或组织，或者与其在免疫学上交叉反应，并由此治疗或预防自身免疫疾病。在某些另外的实施方案中，(i)所述辅佐剂当存在时选自明矾、植物碱和去垢剂，其中所述植物碱是番茄素，所述去垢剂选自皂苷、聚山梨醇酯80、司盘85和硬脂酰酪氨酸；(ii)所述TLR激动剂当存在时选自脂多糖、肽聚糖、聚肌胞、CpG、3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a(LeIF)的利什曼虫同源体；以及(iii)所述咪唑并喹啉免疫应答调节剂当存在时选自雷西莫特(R848)、咪喹莫特和嘎德莫特。

[0041] 在另一个实施方案中，提供了治疗或预防个体自身免疫疾病的方法，所述个体具有或疑似有患自身免疫疾病的危险，所述方法包括给予个体疫苗组合物，所述组合物包含(a)抗原、(b)吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)以及(c)辅佐剂和药学上可接受的载体中的至少一种，其中：所述辅佐剂选自细胞因子、嵌段共聚物或生物可降解的聚合物，以及去垢剂，并且所述药学上可接受的载体包括选自磷酸钙、水包油型乳剂、油包水型乳剂、脂质体以及微粒的载体，其中所述抗原来自与自身免疫疾病相关的至少一种抗原决定部位、生物分子、细胞或组织，或者与其在免疫学上交叉反应，并由此治疗或预防所述自身免疫疾病。在另外的实施方案中，所述细胞因子选自GM-CSF、IL-2、IL-7、IL-12、TNFα和IFN-γ，所述嵌段共聚物或生物可降解聚合物选自普流罗尼克L121、CRL1005、PLGA、PLA、PLG和聚肌胞，且所述去垢剂选自皂苷、聚山梨醇酯80、司盘85和硬脂酰酪氨酸。

[0042] 在另一个实施方案中，提供了治疗或预防个体自身免疫疾病的方法，所述个体具有或疑似有患自身免疫疾病的危险，所述方法包括给予个体包含(a)至少一种重组表达构建体和(b)吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)的疫苗组合物，所述构建体包含可操作连接于编码抗原的核酸序列的启动子，其中所述抗原来自与自身免疫疾病相关的至少一种抗原决定部位、生物分子、细胞或组织，或者与其在免疫学上交叉反应，并由此治疗或预防自身免疫疾病。在另外的实施方案中，所述重组表达构建体存在于病毒载体，该构建体在某些另外实施方案中存在于选自腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、慢病毒、痘病毒和逆转录酶病毒的病毒中。

[0043] 在上述与治疗或预防自身免疫疾病相关的某些实施方案中，所述自身免疫疾病选自1型糖尿病、风湿性关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮、重症肌无力、克罗恩氏病(Crohn′s disease)、格雷夫斯病、血小板减少性紫癜和天疱疹。在上述与治疗或预防自身免疫疾病相关的的某些其它实施方案中，与自身免疫疾病相关的抗原决定部位、生物分子、细胞或组织选自snRNP(当所述自身免疫疾病是系统性红斑狼疮时)，甲状腺球蛋白、促甲状腺素受体和甲状腺上皮细胞中的至少一种(当所述自身免疫疾病是格雷夫斯病时)，血小板(当所述自身免疫疾病是血小板减少性紫癜时)，天疱疹抗原、桥粒芯糖蛋白-3、桥粒斑蛋白、包斑蛋白和大疱性类天疱疮抗原1中的至少一种(当所述自身免疫疾病是天疱疹时)，髓磷脂碱性蛋白(当所述自身免疫疾病是多发性硬化时)，胰岛β细胞(当所述自身免疫疾病是1型糖尿病时)以及乙酰胆碱受体(当所述自身免疫疾病是重症肌无力时)。

[0044] 依照其它实施方案，提供了治疗或预防个体癌症的方法，所述个体具有或疑似有患癌症的危险，所述方法包括给予个体包含(a)抗原和(b)吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)的疫苗组合物，其中所述抗原来自与癌症相关的至少一种抗原决定部位、生物分子、细胞或组织，或者与其在免疫学上交叉反应，并由此治疗或预防所述癌症。依照其它的实施方案，提供了治疗或预防个体癌症的方法，所述个体具有或疑似有患癌症的危险，所述方法包括给予所述个体包含(a)抗原、(b)吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)和(c)钟样受体(TLR)激动剂的疫苗组合物，其中所述抗原来自与癌症相关的至少一种抗原决定部位、生物分子、细胞或组织，或者与其在免疫学上交叉反应，并由此治疗或预防所述癌症。在某些另外的实施方案中，所述TLR激动剂选自脂多糖、肽聚糖、聚肌胞、CpG、3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a(LeIF)的利什曼虫同源体。依照其它的实施方案，提供了治疗和预防个体癌症的方法，所述个体具有或疑似有患癌症的危险，所述方法包括给予个体包含(a)抗原、(b)吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)和(c)选自皂苷和皂苷类似物的至少一种辅佐剂的疫苗组合物，其中所述抗原来自与癌症相关的至少一种抗原决定部位、生物分子、细胞或组织，或者与其在免疫学上交叉反应，并由此治疗或预防所述癌症。

[0045] 依照其他的实施方案，提供了治疗或预防个体癌症的方法，所述个体具有或疑似有患癌症的危险，所述方法包括给予所述个体包含(a)抗原、(b)吡喃葡萄糖基脂佐剂TM(GLA)以及(e)包含油和ISCOMATRIX 中的至少一种的载体的疫苗组合物，其中所述抗原来自与癌症相关的至少一种抗原决定部位、生物分子、细胞或组织，或者与其在免疫学上交叉反应，并由此治疗或预防所述癌症。依照其它的实施方案，提供了治疗或预防个体癌症的方法，所述个体具有或疑似有患癌症的危险，所述方法包括给予所述个体疫苗组合物，所述组合物包含(a)抗原，(b)吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)，以及(c)下述中的一种或多种：(i)至少一种辅佐剂、(ii)至少一种TLR激动剂、(iii)至少一种咪唑并喹啉免疫应答调节剂和(iv)至少一种双茎环免疫调节剂(dSLIM)，其中所述抗原来自与癌症相关的至少一种抗原决定部位、生物分子、细胞或组织，或者与其在免疫学上交叉反应，并由此治疗或预防所述癌症。在某些另外的实施方案中，(i)所述辅佐剂当存在时选自明矾、植物碱和去垢剂，其中所述植物碱是番茄素，所述去垢剂选自皂苷、聚山梨醇酯80、司盘85和硬脂酰酪氨酸；
(ii)所述TLR激动剂当存在时选自脂多糖、肽聚糖、聚肌胞、CpG、3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a(LeIF)的利什曼虫同源体；以及(iii)所述咪唑并喹啉免疫应答调节剂当存在时选自雷西莫特(R848)、咪喹莫特和嘎德莫特。依照其它的实施方案，提供了治疗或预防个体癌症的方法，所述个体具有或疑似有患癌症的危险，所述方法包括给予个体疫苗组合物，所述组合物包含(a)抗原、(b)吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)以及(c)辅佐剂和药学上可接受的载体中的至少一种，其中所述辅佐剂选自细胞因子、嵌段共聚物或生物可降解的聚合物以及去垢剂，并且所述药学上可接受的载体包括选自磷酸钙、水包油型乳剂、油包水型乳剂、脂质体以及微粒的载体，其中所述抗原来自与癌症相关的至少一种抗原决定部位、生物分子、细胞或组织，或者与其在免疫学上交叉反应，并由此治疗或预防所述癌症。在另外的实施方案中，所述细胞因子选自GM-CSF、IL-2、IL-7、IL-12、TNFα和IFN-γ，所述嵌段共聚物或生物可降解聚合物选自普流罗尼克L121、CRL1005、PLGA、PLA、PLG和聚肌胞，且所述去垢剂选自皂苷、聚山梨醇酯80、司盘85和硬脂酰酪氨酸。依照其它的实施方案，提供了治疗或预防个体癌症的方法，所述个体具有或疑似有患癌症的危险，所述方法包括给予个体包含(a)至少一种重组表达构建体和(b)吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)的疫苗组合物，所述构建体包含可操作连接于编码抗原的核酸序列的启动子，其中所述抗原来自与癌症相关的至少一种抗原决定部位、生物分子、细胞或组织，或者与其在免疫学上交叉反应，并由此治疗或预防所述癌症。在另外的实施方案中，所述重组表达构建体存在于病毒载体中，该构建体在某些另外实施方案中存在于选自腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、慢病毒、痘病毒和逆转录酶病毒的病毒中。

[0046] 在上述治疗或预防癌症的方法的某些另外的实施方案中，抗原来自至少一种癌细胞，所述癌细胞在某些另外的实施方案中源自原发性实体肿瘤，且其在某些其它另外的实施方案中，源自为转移性或继发性实体肿瘤的癌，以及在某些其它另外的实施方案中，源自为循环肿瘤或腹水肿瘤的癌。在某些实施方案中，所述癌细胞源自选自下述的癌：宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮细胞肉瘤、淋巴管肉瘤、腹膜假黏液瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜肉瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、磷状上皮细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管肺癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌和肾母细胞瘤。在某些其它的实施方案中，癌细胞源自选自下述的癌：睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和重链病。

[0047] 依照上述治疗或预防感染性疾病或自身免疫疾病或癌症的方法的任一种的某些另外实施方案，给药步骤进行一次；而在这些方法的某些其它另外实施方案中，给药步骤至少进行两次；且在某些其它另外的实施方案中，给药步骤至少进行三次；在某些其它另外的实施方案中，给药步骤进行四次或更多次。依照上述治疗或预防感染性疾病或自身免疫疾病或癌症的方法中的任一种的某些另外的实施方案，在给药步骤前，个体用引发剂预处理，所述引发剂选自细菌提取物、活病毒疫苗、包含可操作连接于编码抗原的核酸序列的启动子的至少一种重组表达构建体和包含可操作连接于编码抗原的核酸序列的启动子的病毒载体。在另外的实施方案中，所述细菌提取物来自卡介菌(Bacillus Calmet-Guerin，BCG)。

[0048] 在另一个实施方案中，提供了引发或增强个体体内期望的抗原特异性免疫应答的方法，其包括给予个体包含(a)抗原和(b)吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)的疫苗组合物。在另一个实施方案中，提供了引发或增强个体体内期望的抗原特异性免疫应答的方法，其包括给予个体包含(a)抗原、(b)吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)和(c)钟样受体(TLR)激动剂的疫苗组合物。在某些另外的实施方案中，TLR激动剂选自脂多糖、肽聚糖、聚肌胞、CpG、3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a(LeIF)的利什曼虫同源体。在另一个实施方案中，提供了引发或增强个体体内期望的抗原特异性免疫应答的方法，其包括给予个体包含(a)抗原、(b)吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)和(c)选自皂苷和皂苷类似物的至少一种辅佐剂的疫苗组合物。在另一个实施方案中，提供了引发或增强个体体内期望的抗原特异性免疫应答的方法，其包括给予个体包含(a)抗原、(b)吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)以及(c)TM
包含油和ISCOMATRIX 中的至少一种的载体的疫苗组合物。在另一个实施方案中，提供了引发或增强个体体内期望的抗原特异性免疫应答的方法，其包括给予个体疫苗组合物，所述组合物包含(a)抗原，(b)吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)以及(c)下述中的一种或多种：(i)至少一种辅佐剂、(ii)至少一种TLR激动剂、(iii)至少一种咪唑并喹啉免疫应答调节剂、(iv)至少一种双茎环免疫调节剂(dSLIM)。在某些另外的实施方案中，所述辅佐剂当存在时选自明矾、植物碱和去垢剂，其中所述植物碱选自番茄素，且所述去垢剂选自皂苷、聚山梨醇酯80、司盘85和硬脂酰酪氨酸；(ii)所述TLR激动剂当存在时选自脂多糖、肽聚糖、聚肌胞、CpG、3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a(LeIF)的利什曼虫同源体；以及(iii)所述咪唑并喹啉免疫应答调节剂当存在时选自雷西莫特(R848)、咪喹莫特和嘎德莫特。

[0049] 在另一个实施方案中，提供了引发或增强个体体内期望的抗原特异性免疫应答的方法，其包括给予个体包含(a)抗原、(b)吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)以及(c)辅佐剂和药学上可接受的载体中的至少一种的疫苗组合物，其中：所述辅佐剂选自细胞因子、嵌段共聚物或生物可降解聚合物以及去垢剂，并且所述药学上可接受的载体包括选自磷酸钙、水包油型乳剂、油包水型乳剂、脂质体以及微粒的载体。在某些另外的实施方案中，所述细胞因子选自GM-CSF、IL-2、IL-7、IL-12、TNF-α和IFN-γ，所述嵌段共聚物或生物可降解聚合物选自普流罗尼克L121、CRL1005、PLGA、PLA、PLG和聚肌胞，且所述去垢剂选自皂苷、聚山梨醇酯80、司盘85和硬脂酰酪氨酸。

[0050] 在另一个实施方案中，提供了引发或增强个体体内期望的抗原特异性的免疫应答的方法，其包括给予个体包含(a)至少一种重组表达构建体和(b)吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)的疫苗组合物，所述构建体包含可操作连接于编码抗原的核酸序列的启动子。在某些另外的实施方案中，所述重组表达构建体存在于病毒载体中，该构建体在某些另外实施方案中存在于选自腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、慢病毒、痘病毒和逆转录酶病毒的病毒中。

[0051] 在上述引发或增强个体体内期望的抗原特异性应答的方法的某些实施方案中，GLA没有被3′-脱-O-酰化。在上述引发或增强个体体内期望的抗原特异性应答的方法的某些其它的实施方案中，GLA包含：(i)双葡糖胺骨架，其具有通过非还原末端葡糖胺的1位氨基己醣和还原末端葡糖胺的6位氨基己醣之间的醚键连接于非还原末端葡糖胺的还原末端葡糖胺；(ii)连接于非还原末端葡糖胺的4位氨基己醣的O-磷酰基团；以及(iii)至多6个的脂酰链，其中一个脂酰链通过酯键连接于还原末端葡糖胺的3羟基，其中一个脂酰链通过酰胺键连接于非还原末端葡糖胺的2-氨基，并包含通过酯键与多于12个碳原子的烷酰基链连接的十四酰链，以及其中一个脂酰链通过酯键连接于非还原末端葡糖胺的
3-羟基并包含通过酯键与多于12个碳原子的烷酰基链连接的十四酰链。在某些相关的另外实施方案中，TLR激动剂当存在时能够通过与选自TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-6、TLR-7、TLR-8和TLR-9的至少一种TLR相互作用来递送生物信号。在某些另外的实施方案中，所述TLR激动剂选自脂多糖、肽聚糖、聚肌胞、CpG、3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a(LeIF)的利什曼虫同源体。

[0052] 在上述引发或增强个体体内期望的抗原特异性应答的方法的某些另外的实施方案中，GLA具有下式：

[0053]

[0054] 其中：

[0055] R1、R3、R5和R6是C11-C20烃基；且

[0056] R2和R4是C12-C20烃基。

[0057] 在一方面，GLA具有如下文所示的确定的立体化学，其中R1、R3、R5和R6是C11-C202 4
烃基；且R 和R 是C12-C20烃基。

[0058]

[0059] 在上述引发或增强个体体内期望的抗原特异性应答的方法的某些另外的实施方案中，疫苗组合物能够在宿主体内引发免疫应答。在某些另外的实施方案中，免疫应答对所述抗原是特异的。在上述引发或增强个体体内期望的抗原特异性应答的方法的某些另外的实施方案中，所述抗原能够在宿主体内引发免疫应答，所述免疫应答选自体液应答或细胞介导的应答。在上述引发或增强个体体内期望的抗原特异性应答的方法的某些另外的实施方案中，疫苗组合物能够在宿主体内引发至少一种免疫应答，所述应答选自TH1-型T淋巴细胞应答、TH2-型T淋巴细胞应答、细胞毒T淋巴细胞(CTL)应答、抗体应答、细胞因子应答、淋巴因子应答、趋化因子应答以及炎症应答。在上述引发或增强个体体内期望的抗原特异性应答的方法的某些另外的实施方案中，疫苗组合物能够在宿主体内引发至少一种免疫应答，所述应答选自(a)一种或多种细胞因子的产生，其中所述细胞因子选自干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；(b)一种或多种白介素的产生，其中所述白介素选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-16、IL-18和IL-23；(c)一种或多种趋化因子的产生，其中所述趋化因子选自MIP-1α、MIP-1β、RANTES、CCL4和CCL5；以及(d)选自记忆性T细胞应答、记忆性B细胞应答、效应T细胞应答、细胞毒T细胞应答以及效应B细胞应答的淋巴细胞应答。

[0060] 依照某些其它的实施方案，提供了制备疫苗组合物的方法，其包括将(a)抗原和(b)吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)混合。依照某些其它的实施方案，提供了制备疫苗组合物的方法，其包括将(a)抗原、(b)吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)以及(c)钟样受体(TLR)激动剂混合。在某些其它的实施方案中，所述TLR激动剂选自脂多糖、肽聚糖、聚肌胞、CpG、3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a(LeIF)的利什曼虫同源体。依照某些其它的实施方案，提供了制备疫苗组合物的方法，其包括将(a)抗原、(b)吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)以及(c)选自皂苷和皂苷类似物的至少一种辅佐剂混合。依照某些其它的实施方案，提供了制备疫苗组合物的方法，其包括将(a)抗原、(b)吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)以及(c)包TM含油和ISCOMATRIX 中的至少一种的载体混合。依照某些其它的实施方案，提供了制备疫苗组合物的方法，其包括将(a)抗原，(b)吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)以及(c)下述中的一种或多种混合：(i)至少一种辅佐剂、(ii)至少一种TLR激动剂、(iii)至少一种咪唑并喹啉免疫应答调节剂和(iv)至少一种双茎环免疫调节剂(dSLIM)。在某些另外的实施方案中，(i)辅佐剂当存在时选自明矾、植物碱和去垢剂，其中所述植物碱选自番茄素，所述去垢剂选自皂苷、聚山梨醇酯80、司盘85和硬脂酰酪氨酸；(ii)TLR激动剂当存在时选自脂多糖、肽聚糖、聚肌胞、CpG、3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a(LeIF)的利什曼虫同源体；以及(iii)咪唑并喹啉免疫应答调节剂当存在时选自雷西莫特(R848)、咪喹莫特和嘎德莫特。依照某些其它的实施方案，提供了制备疫苗组合物的方法，其包括将(a)抗原、(b)吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)以及(c)辅佐剂和药学上可接受的载体中的至少一种混合，其中：所述辅佐剂选自细胞因子、嵌段共聚物或生物可降解聚合物以及去垢剂，并且所述药学上可接受的载体包含选自磷酸钙、水包油型乳剂、油包水型乳剂、脂质体以及微粒的载体。在某些另外的实施方案中，所述细胞因子选自GM-CSF、IL-2、IL-7、IL-12、TNF-α和IFN-γ，所述嵌段共聚物或生物可降解聚合物选自普流罗尼克L121、CRL1005、PLGA、PLA、PLG和聚肌胞，且所述去垢剂选自皂苷、聚山梨醇酯80、司盘85和硬脂酰酪氨酸。

[0061] 依照某些其它的实施方案，提供了制备疫苗组合物的方法，其包括将(a)至少一种重组表达构建体和(b)吡喃葡萄糖基脂佐剂混合，所述构建体包含可操作连接于编码抗原的核酸序列的启动子。在某些另外的实施方案中，所述重组表达构建体存在于病毒载体中，该构建体在某些另外实施方案中存在于选自腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、慢病毒、痘病毒和逆转录酶病毒的病毒中。在某些实施方案中，GLA没有3′-脱-O-酰化。在某些实施方案中，GLA包含：(i)双葡糖胺骨架，其具有通过非还原末端葡糖胺的1位氨基己醣和还原末端葡糖胺的6位氨基己醣之间的醚键连接于非还原末端葡糖胺的还原末端葡糖胺；(ii)连接于非还原末端葡糖胺的4位氨基己醣的O-磷酰基团；以及(iii)至多6个的脂酰链，其中一个脂酰链通过酯键连接于还原末端葡糖胺的3羟基，其中一个脂酰链通过酰胺键连接于非还原末端葡糖胺的2-氨基，并包含通过酯键与多于12个碳原子的烷酰基链连接的十四酰链，以及其中一个脂酰链通过酯键连接于非还原末端葡糖胺的3-羟基并包含通过酯键与多于12个碳原子的烷酰基链连接的十四酰链。在某些实施方案中，TLR激动剂能够通过与选自TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-6、TLR-7、TLR-8和TLR-9的至少一种TLR相互作用来递送生物信号。在某些另外的实施方案中，所述TLR激动剂选自脂多糖、肽聚糖、聚肌胞、CpG、3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a(LeIF)的利什曼虫同源体。

[0062] 依照上述制备疫苗组合物的方法的某些实施方案，GLA具有下式：

[0063]

[0064] 其中R1、R3、R5和R6是C11-C20烃基；且R2和R4是C12-C20烃基。如前文所述，GLA会具有立体专一(stereodefined)的结构。

[0065] 在某些另外的实施方案中，混合步骤包括乳化，且在某些其它另外的实施方案中，混合步骤包括形成颗粒，所述颗粒在某些另外的实施方案中包括微粒。在某些其它另外的实施方案中，混合步骤包括形成沉淀物，所述沉淀物包含全部或部分抗原以及全部或部分GLA。

[0066] 在某些其它的实施方案中，提供了免疫佐剂药物组合物，其包含吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)以及药学上可接受的载体或赋形剂。在某些其它的实施方案中，提供了包含吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)以及钟样受体(TLR)激动剂的免疫佐剂组合物。在某些另外的实施方案钟，TLR激动剂选自脂多糖、肽聚糖、聚肌胞、CpG、3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a(LeIF)的利什曼虫同源体。在某些其它的实施方案中，提供了包含吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)以及选自皂苷和皂苷类似物的至少一种辅佐剂的免疫佐剂组合物。在某些其它的实施方案中，提供了免疫佐剂药物组合物，其包含吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)TM TM
以及包含油和免疫刺激复合物基质 (ISCOMATRIX )中的至少一种的药学上可接受的载体。在某些其它的实施方案中，提供了免疫佐剂组合物，其包含(a)吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)，以及(b)下述中的一种或多种：(i)至少一种辅佐剂、(ii)至少一种TLR激动剂、(iii)至少一种咪唑并喹啉免疫应答调节剂和(iv)至少一种双茎环免疫调节剂(dSLIM)。

[0067] 在某些另外的实施方案中，(i)辅佐剂当存在时选自明矾、植物碱和去垢剂，其中所述植物碱是番茄素，所述去垢剂选自皂苷、聚山梨醇酯80、司盘85和硬脂酰酪氨酸；(ii)TLR激动剂当存在时选自脂多糖、肽聚糖、聚肌胞、CpG、3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a(LeIF)的利什曼虫同源体；以及(iii)咪唑并喹啉免疫应答调节剂当存在时选自雷西莫特(R848)、咪喹莫特和嘎德莫特。

[0068] 在某些其它的实施方案中，提供了包含吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)以及辅佐剂和药学上可接受的载体的至少一种的免疫佐剂组合物，其中：所述辅佐剂选自细胞因子、嵌段共聚物或生物可降解聚合物以及去垢剂，并且所述药学上可接受的载体包含选自磷酸钙、水包油型乳剂、油包水型乳剂、脂质体以及微粒的载体。在某些另外的实施方案中，所述细胞因子选自GM-CSF、IL-2、IL-7、IL-12、TNF-α和IFN-γ，所述嵌段共聚物或生物可降解聚合物选自普流罗尼克L121、CRL1005、PLGA、PLA、PLG和聚肌胞，且所述去垢剂选自皂苷、聚山梨醇酯80、司盘85和硬脂酰酪氨酸。

[0069] 在某些其它实施方案中，提供了改变宿主免疫应答的方法，其包括：给予宿主包含吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)和药学上可接受的载体或赋形剂的免疫佐剂药物组合物，并由此改变宿主的免疫应答。在某些其它的实施方案中，提供了改变宿主免疫应答的方法，其包括：给予宿主包含吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)和(b)钟样受体(TLR)激动剂的免疫佐剂组合物，并由此改变宿主的免疫应答。在某些另外的实施方案中，TLR激动剂选自脂多糖、肽聚糖、聚肌胞、CpG、3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a(LeIF)的利什曼虫同源体。在其它另外的实施方案中，提供了改变宿主免疫应答的方法，其包括：给予宿主包含吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)以及选自皂苷和皂苷类似物的至少一种辅佐剂的免疫佐剂组合物，并由此改变宿主的免疫应答。在某些其它的实施方案中，提供了改变宿主免疫应答的方法，其包括：给予宿主包含吡喃葡萄糖基脂佐剂GLA)以及药学上可接受的载体的免疫佐TM剂组合物，并由此改变宿主的免疫应答，所述载体包含油和ISCOMATRIX 中的至少一种。在某些其它的实施方案中，提供了改变宿主免疫应答的方法，其包括：给予宿主免疫佐剂组合物，并由此改变宿主的免疫应答，所述组合物包含吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)和下述的一种或多种：(i)至少一种辅佐剂、(ii)至少一种TLR激动剂、(iii)至少一种咪唑并喹啉免疫应答调节剂和(iv)至少一种双茎环免疫调节剂(dSLIM)。

[0070] 在某些其它的实施方案中，辅佐剂当存在时选自明矾、植物碱和去垢剂，其中所述植物碱是番茄素，所述去垢剂选自皂苷、聚山梨醇酯80、司盘85和硬脂酰酪氨酸；TLR激动剂当存在时选自脂多糖、肽聚糖、聚肌胞、CpG、3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a(LeIF)的利什曼虫同源体；以及咪唑并喹啉免疫应答调节剂当存在时选自雷西莫特(R848)、咪喹莫特和嘎德莫特。

[0071] 在某些其它的实施方案中，提供了改变宿主体内免疫应答的方法，其包括给予宿主免疫佐剂组合物，并由此改变宿主的免疫应答，所述组合物包含吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)以及辅佐剂和药学上可接受的载体的至少一种，其中：所述辅佐剂选自细胞因子、嵌段共聚物或生物可降解聚合物以及去垢剂，并且所述药学上可接受的载体包含选自磷酸钙、水包油型乳剂、油包水型乳剂、脂质体以及微粒的载体。在某些另外的实施方案中，所述细胞因子选自GM-CSF、IL-2、IL-7、IL-12、TNF-α和IFN-γ，所述嵌段共聚物或生物可降解聚合物选自普流罗尼克L121、CRL1005、PLGA、PLA、PLG和聚肌胞，且所述去垢剂选自皂苷、聚山梨醇酯80、司盘85和硬脂酰酪氨酸。

[0072] 在上述改变宿主免疫应答的方法的某些另外的实施方案中，给药步骤进行一次、两次、三次、四次或更多次。在上述改变宿主免疫应答的某些其它另外的实施方案中，改变宿主免疫应答包括诱导或增强免疫应答。在上述改变宿主免疫应答的某些其它另外的实施方案中，改变宿主的免疫应答包括下调免疫应答。在上述改变宿主应答的某些另外的实施方案中，所述方法还包括同时或以任一顺序连续地给予抗原，所述抗原来自与诱导的或增强的免疫应答所针对的感染性疾病相关的至少一种感染性病原体，或者与其在免疫学上交叉反应。在某些另外的此类实施方案中，给予抗原的步骤进行一次、两次、三次、四次或更多次。在上述改变宿主免疫应答的方法的某些其它另外的实施方案中，所述方法包括同时给予或以任一顺序连续给予抗原，所述抗原来自与下调的免疫应答所针对的自身免疫疾病相关的至少一种抗原决定部位、生物分子、细胞或组织，或者与其在免疫学上交叉反应。在某些另外的此类实施方案中，给予抗原的步骤进行一次、两次、三次、四次或更多次。在上述改变宿主免疫应答的方法的某些其它另外的实施方案中，所述方法包括同时给予或以任一顺序连续给予抗原，该抗原来自与诱导的或增强的免疫应答所针对的癌症相关的至少一种抗原决定部位、生物分子、细胞或组织，或者与其在免疫学上交叉反应。在某些另外的此类实施方案中，给予抗原的步骤进行一次、两次、三次、四次或更多次。

[0073] 在另一个实施方案中，提供了试剂盒，其包含：在第一容器内的上述免疫佐剂组合物，以及在第二容器内的抗原，其中所述免疫佐剂组合物不与所述抗原接触。在另一个实施方案中，提供了试剂盒，其包含：在第一容器内的上述的免疫佐剂组合物，以及在第二容器内的包含可操作连接于编码抗原的核酸序列的启动子的至少一种重组表达构建体，其中所述免疫佐剂组合物不与所述重组表达构建体接触。在刚描述的试剂盒的某些另外的实施方案中，所述抗原来自选自细菌、病毒、酵母和原生动物中的至少一种感染性病原体。在刚描述的试剂盒的某些其它另外的实施方案中，抗原来自至少一种癌细胞。在刚描述的试剂盒的某些其它另外的实施方案中，抗原来自与自身免疫疾病相关的至少一种抗原决定部位、生物分子、细胞或组织，或者与其在免疫学上交叉反应。

[0074] 参照下面的详细描述和附图，本发明的这些和其它方面会被容易地理解。此外，本文提及的、更为详细地描述本发明的某些方面的各种参考文献都以其整体通过引用的方式并入本文。

[0075] 附图简述

[0076] 图1显示了HPLC数据，表明了MPL-AF和GLA-AF中的沾染物的数目和含量。使用安捷伦1100(Agilent 1100)系统和ESA电雾式检测器(Corona CAD detector)采集这些层析谱。该方法在Waters Atlantis C18柱上采用甲醇到氯仿梯度来执行。注射液分别包括2.5μg的GLA和MPL，以及作为助溶剂的0.27μg的合成磷酸胆碱(POPC)。

[0077] 图2显示了表明细胞因子和趋化因子水平的ELISA数据，所述细胞因子和趋化因子是由Mono Mac 6细胞系的人巨噬细胞(图a-e)以及PBMC来源的树突状细胞(DC)(图5
f-h)应答GLA刺激时表达的。细胞以每孔1x10 个细胞用GSK Biologicals MPL 的水制剂(MPL-AF)、GLA的水制剂(GLA-AF)或单独的AF媒介物培养24小时。通过夹心ELISA测量上清中的MIP-1b、IP-10、IL-6、IL-23和IL-1b的水平。

[0078] 图3显示了ELISA数据，表明了使用与GLA-AF或GLA-SE配制的两种不同剂量的Fluzone疫苗每次免疫后一周(即，在第7天，图A；以及在第28天，图B)，与单独使用Fluzone相比，在小鼠体内诱导的抗Fluzone抗体产生的水平。图A和B显示了第一次(A)或第二次(B)注射后一周，小鼠的ELISA抗体滴度，所述小鼠在3周时间内被用在含有GLA-AF、GLA-SE或没有佐剂的制剂中的20ml(1.8μg)或2ml(0.18mg)Fluzone(Flu)疫苗免疫了两次。图C显示了第二次免疫后的小鼠血清中的中和抗体(HAI)的滴度。

[0079] 图4显示了ELISA数据，表明了使用单独的或与GLA-SE配制的SMT抗原进行第三次免疫后一周，在小鼠体内诱导的抗-SMT抗体产生的水平。在三周时间内用配制在含有GLA(GLA-SE，每次免疫每只动物20μg)的稳定乳剂中的SMT抗原(每次免疫每只动物10μg)免疫或者用单独的SMT蛋白注射C57BL/6小鼠三次。每次免疫后一周通过放血采集血清，通过ELISA检测SMT特异性的IgG1和IgG2c抗体的血清水平。显示了倒数终点滴度的平均值和标准误。

[0080] 图5显示了ELISA数据，表明了使用与不同量的GLA(40，20，5或1μg)配制的利什(Leish)-110f抗原进行首次免疫后1周，与盐水对照相比，在小鼠体内诱导的抗利什-110f抗体产生的水平。在两周时间内，用利什-110f抗原(每次免疫每只动物10μg)免疫或用盐水注射Balb/c小鼠三次，所述抗原配制于含有40、20、5或1mg的GLA的稳定乳剂(GLA-SE)中。每次免疫后一周通过放血采集血清，通过ELISA检测利什-110f特异性IgG1和IgG2a抗体的血清水平。显示了首次免疫后7天采集的血清的倒数终点滴度的平均值和标准误。

[0081] 图6显示了ELISA数据，表明了使用与不同量的GLA配制的利什-110f抗原进行第三次免疫后1周，与盐水对照相比，在小鼠体内诱导的抗利什-110f IFN-γ细胞因子产生的水平。来自Balb/c小鼠的脾细胞在单独的培养基中，或在含有10mg/ml的利什-110f或3mg/ml的伴刀豆球蛋白A(ConA)的培养基中体外培养3天，所述小鼠在两周时间内被用配制于含有40、5或1μg的MPL的稳定乳剂(MPL-SE)或含有40、5或1μg的GLA的稳定乳剂(GLA-SE；)内的利什-110f抗原(10μg)免疫三次，或用盐水溶液注射。通过ELISA检测了上清中的IFN-g水平。显示了平均值和标准误。

[0082] 图7显示了ICS数据，表明了进行第三次免疫后一周在小鼠体内诱导的产生ID83特异性的IFN-γ、IL-2和TNF细胞因子的CD4+和CD8+T细胞的频数(frequencies)，所述免疫是使用单独的ID83或由含有GLA(GLA-SE)、GLA+CpG(GLA/CpG-SE)或GLA+GDQ(GLA/GDQ-SE)的制剂作为佐剂的ID83进行的。来自C57BL/6小鼠的脾细胞在含有10mg/ml ID83的培养基中体外培养12小时，所述小鼠在三周的时间内被用与GLA-SE、GLA/CpG-SE、GLA/嘎德莫特(GDQ)-SE配制的肺结核分支杆菌ID83融合蛋白(8μg)免疫三次或者用盐水注射。通过细胞内染色检测以及通过在BD LSRII FACS上进行流式细胞计数测量CD3+CD4+或CD3+CD8+设门T细胞内的IL-2、TNF和IFN-g的细胞水平。

[0083] 图8，图A显示了ICS数据，表明了使用ML0276抗原进行第三次免疫后一周，与盐水和空白对照相比，在小鼠体内诱导的产生ML0276特异性IFN-γ细胞因子的CD4+T细胞的频数，所述ML0276抗原用含有CpG或咪喹莫特(IMQ)的水制剂、或含有GLA的稳定油乳剂(GLA-SE)、或混合在一起的上述三者配制。来自C57BL/6小鼠的脾细胞在含有10mg/ml的ML0276的培养基中体外培养12小时，所述小鼠在三周时间内被用与CpG、咪喹莫特(IMQ)、GLA-SE、上述三者的组合配制的麻风分支杆菌ML0276抗原(10μg)免疫三次或用盐水注射。图A显示了通过细胞内染色检测以及通过在BD LSRII FACS上进行流式细胞计数测量的CD3+CD4+T细胞内的IFN-g的细胞水平。图B显示了作为保护相关的引流淋巴结的细胞性。

[0084] 图9显示了在GLA刺激的情况下CD86的表面表达。将供体N003CD14+单核细胞来源的原代树突状细胞与10,000ng/ml、1000ng/m、100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml或0.01ng/ml GLA(图A)或MPL(图B)孵育44小时。将PGE2、IL-1β、TNFα和IL-6制成的细胞因子混合物作为阳性对照运行。协同刺激分子CD86在DC表面的表达水平被用作细胞活化的标志并且在LSRII装置上的流式细胞仪(BD Biosciences，San Jose，CA)上、使用CD86特异性荧光染料标记的抗体(eBiosciences，San Diego，CA)进行检测。

[0085] 图10显示了用GLA进行刺激使来自三个供体的培养的人树突状细胞(DC)表现出增加的成熟。将来自三个正常供体的PBMC进行纯化以获取人CD 14+单核细胞来源的原代树突状细胞并用GLA(图A-C)或MPL(图D-F)进行刺激。将未刺激作为阴性对照并且将PEG2、IL-1β、TNFα和IL-6的标准细胞因子成熟混合物作为阳性对照运行。在LSRII装置的流式细胞仪(BD Biosciences，San Jose，CA)上，使用CD86特异性荧光染料标记的抗体(eBiosciences，San Diego，CA)的最大表达的百分比来监测DC成熟。

[0086] 图11显示了硕大利什曼虫(L.major)激发的情况下，用利什-110f+GLA-SE接种的小鼠中病变的发展。用盐水或配制在稳定乳剂中的利什-110f抗原(每次免疫给予每只动物10μg)对每个处理组的4只Balb/c小鼠免疫三次，每次间隔两周，所述稳定乳剂包含20μg的(i)GLA(Avanti Polar Lipids，Inc.，Alabaster，AL；产品号699800；GLA-SE)，或(ii)由生产商供应的MPL 乳剂(″MPL-SE″，GSK Biologicals，Rixensart，Belgium)。
3
最后一次注射后三周，将2×10 纯化的利什曼虫主要克隆V1(MOHM/IL/80/Friedlin)亚循环前鞭毛体在小鼠双耳的pinea中进行皮内激发。在注射后六周，每周监测皮肤病变的发展。

[0087] 图12显示了在硕大利什曼虫激发的情况下，用利什-110f+GLA-SE接种的小鼠中的寄生虫负荷。用盐水或配制在稳定乳剂中的利什-110f抗原(每次免疫给予每只动物10μg)对每个处理组中的4只Balb/c小鼠免疫三次，每次间隔两周，所述稳定乳剂包含
20μg的(i)GLA(Avanti Polar Lipids，Inc.，Alabaster，AL；产品号699800；GLA-SE)，或(ii)由生产商供应的MPL 乳剂(″MPL-SE″，GSK Biologicals，Rixensart，Belgium)。
3
最后一次注射后三周，将2×10 纯化的利什曼虫主要克隆V1(MOHM/IL/80/Friedlin)亚循环前鞭毛体在小鼠双耳的pinea中进行皮内激发。注射后六周，测定感染的小鼠的耳和引流淋巴结中的寄生虫负荷。显示了每组的个体计数和平均值。进行Student t检验并且当p＜0.05时，认为组间差异是统计学上显著的。

[0088] 图13显示了对OVA特异性T细胞的流式细胞仪分析。显示了产生单种、二种或三种Th1型细胞因子的OVA特异性CD8+和CD4+T细胞的单细胞分析。通过流式细胞仪评价了CD8+(图A-C)和CD4+(图D-F)T细胞响应于介质、P/I或OVA的体外刺激而产生的IFN-γ、IL-2和TNF-α。从注射了盐水、慢病毒疫苗或慢病毒疫苗加GLA-SE的小鼠中纯化脾细胞并且在添加了介质或OVA的抗-CD28和抗-CD49d的存在下进行孵育。

[0089] 图14显示了通过伴有和不伴有佐剂的Fluzone(两种剂量；2μg和0.2μg)的皮内(i.d.)给予进行增强免疫之后七天的抗Fluzone IgG抗体水平。图A显示了Fluzone特异性IgG抗体应答；图B显示了Fluzone特异性IgG2a应答；图C显示了Fluzone特异性IgG1应答；以及图D显示了IgG1∶IgG2a的比(结果＜1.0表示IgG2a主要应答；结果＞1.0表示IgG1主要应答)。星号表示统计学显著性，p＜0.05。

[0090] 图15A-D显示了用Fluzone(0.2μg)加GLA-SE(5μg)肌肉内(i.m.)增强免疫后3周，离体刺激的脾细胞中IFN-γ(15A)、IL-10(15B)、IL-2(15C)和IL-5(15D)的细胞因子水平。显示了来自每个处理组三只个体Balb/c小鼠的细胞因子水平的平均值±标准偏差。

[0091] 图16显示了2006-2007疫苗株A/Wisconsin/67/2005和研究的漂变A/H3N2流感病毒间的抗原距离。基于血凝素蛋白(HA1单元)的球状头区域的序列分析，使用邻接法(Neighbor-Joining method)推断系统进化树。进化距离的单位是每个位点的氨基酸取代的数目。分析的株表示自2001年以来季节性流感疫苗的A/H3N2组分。

[0092] 图17A-B表明GLA增强对于疫苗中A/H3N2组分和抗原漂变的A/H3N2流感株的HI滴度。血清HI抗体应答来自首次免疫一周(A)、增强后一周(B)的免疫的小鼠。单独使用2006-2007 Fluzone流感疫苗(-)或将其与水包油型乳剂(EM)或GLA(EM005)配制来免疫Balb/c小鼠。显示了针对疫苗株Wis/05和抗原漂变的Bris/07、Wyo/03和Pan/99流感株的HI滴度的几何平均滴度(GMT)和95％置可信区间。一个星号表示相对于单独Fluzone的显著更高的应答(p＜0.05)。两个星号表示相对于Fluzone+EM的显著更高的应答(p＜0.05)。10的HI滴度被指定为代表低于测试检测限的应答。

[0093] 图18表明GLA增强HI抗体的交叉反应性。显示了针对Wis/05疫苗株和漂变的Bris/07和Wyo/03株的HI GMT应答超过由Fluzone单独产生的应答的增加倍数的量级。根据使用与GLA(EM005)或EM配制的或不与GLA(EM005)或EM配制的Fluzone增强后一周的HIGMT抗体应答来确定结果。因为Fluzone抗Pan/99HI滴度低于测定检测线，所以未计算针对Pan/99株的增加倍数。

[0094] 图19表明增强后五周GLA提高分泌病毒特异性IgG的骨髓浆细胞(BMPC)的水平。单独使用2006-2007 Fluzone流感疫苗(-)或将其与油与水乳剂(EM)或GLA(EM005)配制来免疫Balb/c小鼠两次，之间间隔三周。显示了以每百万细胞应答标准化的病毒特异性IgG BMPC的组平均值±标准偏差。对疫苗株Wis/05和抗原漂变的Bris/07和Pan/99流感株的应答进行定量。一个星号表示相对于单独Fluzone显著更高的应答(p＜0.05)。两个星号表示相对于Fluzone+EM显著更高的应答(p＜0.05)。

[0095] 图20A-B表明将GLA添加到FLuzone疫苗产生强力的并且交叉反应性的TH1介导的免疫应答。(A)：单独使用2006-2007 Fluzone流感疫苗(-)或将其与油与水乳剂(EM)或GLA(EM005)配制进行增强后七周，病毒特异性细胞因子应答。从每组的4只小鼠收集脾细胞并且用5HAU的灭活Wis/05、Bris/07、Wyo/03或Pan/99流感病毒株培养。培养后72小时收集上清并且通过ELISA分析。值表示培养物中测定的病毒特异性细胞因子应答的平均值+标准偏差。一个星号表示相对于单独Fluzone显著更高的应答(p＜0.05)。
两个星号表示相对于Fluzone+EM显著更高的应答(p＜0.05)。三个星号表示相对于Fluzone+GLA(EM005)显著更高的应答(p＜0.05)。(B)：与单独Fluzone或Fluzone+EM相比，来自Fluzone+GLA(EM005)免疫的小鼠的IFN γ：IL-10比值增加。结果表示来自4只小鼠/组的平均IFN γ：IL-10比。

[0096] 图21表示季节性流感疫苗中GLA的剂量节约效应。Balb/c小鼠(3只/组)接受标明的疫苗注射(从左到右)：不含佐剂的2μg的Fluzone抗原，2μg的Fluzone抗原与GLA佐剂组合，不含佐剂的0.2μg的Fluzone抗原，0.2μg的Fluzone抗原与GLA佐剂组合，不含佐剂的0.02μg的Fluzone抗原和0.02μg的Fluzone与GLA佐剂组合。免疫后一周检测Fluzone特异性抗体应答(IgG)。星号表示统计学显著性(p＜0.05)。

[0097] 图22表示重组流行性H5蛋白中GLA的剂量节约效应。Balb/c小鼠(5只/组)接受两次标明的疫苗的注射(从左到右)，之间间隔为3周：安慰剂、1μg rHA(X轴上列出的每种组合物上方的两个柱表示注射后21天(左柱)和42天(右柱)的HAI滴度)、5μg rHA、10μg rHA、50μg rHA、1μg rHA与无GLA乳剂组合、5μg rHA与无GLA乳剂组合、1μg rHA与含GLA的乳剂组合、5μg rHA与含GLA的乳剂组合。每次免疫后一周，通过血凝抑制实验(HAI)检测由重组H5蛋白(Viet NAM 1203)引发的中和抗体。GMT代表几何平均滴度。最初的(起始)注射在第0天给予，在第21天从小鼠取血以提供在每个x轴标题上方左柱显示的HAI滴度结果。在第21天用增强注射注射小鼠，在第42天从小鼠取血以提供在每个x轴标题上方右柱显示的HAI滴度结果。

[0098] 发明详述

[0099] 本发明在其几个实施方案中提供了疫苗组合物、佐剂组合物以及包括使用合成的吡喃葡萄糖基脂佐剂(GLA)的相关方法。GLA提供了合成免疫佐剂，其优于现有技术的佐剂，且特别优于天然产物佐剂，能够以基本上均一的形态制备。而且，与天然产物来源的佐剂不同，GLA可以通过大规模的合成化学生产被有效经济地制备。作为合成佐剂，其从限定的起始物质以化学方式合成来获得化学定义的产物，具有质和量的批次之间的一致性，因此GLA提供了包括改良的产品质量控制的先前未有的益处。令人惊喜地，尽管3-酰基单磷酸脂质A与某些毒性有关，但是已发现当它的2氨基位含有单酰基链时，该分子保留可接受的安全谱(safety profile)。此外，这类化合物的合成是简化的，因为3位特异的脱乙酰作用具有技术挑战。因此，本发明还提供了安全和易于合成方面的优势。

[0100] 如本文所描述的，含有GLA的组合物和它们应用的方法在一些实施方案中包括GLA本身与药学上可接受的载体或赋形剂用于免疫佐剂活性(包括“辅佐”)的用途，其中给予个体GLA可以完全独立于给予个体一种或多种抗原，和/或在时间上和/或空间上与其分离，所述抗原是个体免疫应答(例如，抗原特异性应答)的引发或增强所针对的。其它的实施方案包括GLA在疫苗组合物中的应用，所述组合物也包括一种或多种由所述疫苗引发或增强的免疫应答所针对的抗原。如本文所述的，在某些相关的实施方案中，这些疫苗组合物也包括一种或多种钟样受体(TLR)激动剂和/或一种或多种辅佐剂、咪唑并喹啉免疫应答调节剂与双茎环免疫调节剂(dSLIM)中的一种或多种。在其它相关的实施方案中，本文提供的疫苗组合物可以包含GLA和一种或多种重组表达构建体，每一个构建体都包含可操作连接于编码抗原的核酸序列的启动子，所述抗原是个体免疫应答的引发或增强所针对的。

[0101] GLA

[0102] 如上文所提及的，作为以化学方法合成的佐剂，GLA可以以基本上均一的形态制备，其指就GLA分子而言，至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％以及仍更优选至少96％、97％、98％或99％纯化的GLA制剂。

[0103] 在某些实施方案中，GLA包含(i)双葡糖胺骨架，其具有通过非还原末端葡糖胺的1位氨基己醣和还原末端葡糖胺的6位氨基己醣之间的醚键连接于非还原末端葡糖胺的还原末端葡糖胺；(ii)连接于非还原端葡糖胺的4位氨基己醣的O-磷酰基团；以及(iii)至多6个的脂酰链，其中一个脂酰链通过酯键连接于还原末端葡糖胺的3羟基，其中一个脂酰链通过酰胺键连接于非还原末端葡糖胺的2-氨基，并包含通过酯键与多于12个碳原子的烷酰基链连接的十四酰链，以及其中一个脂酰链通过酯键连接于非还原末端葡糖胺的3-羟基并包含通过酯键与多于12个碳原子的烷酰基链连接的十四酰链。给定的GLA制剂的纯度测定可以由熟悉适当的分析化学方法学的技术人员容易地完成，诸如通过气相层析法、液相层析法、质谱法和/或核磁共振分析。

[0104] 在某些实施方案中，本文所使用的GLA可以具有下述通用结构式：

[0105]

[0106] 其中R1、R3、R5和R6是C11-C20烃基；且R2和R4是C12-C20烃基。

[0107] 在更具体的实施方案中，GLA具有上述通式，其中R1、R3、R5和R6是C11-C14烃基；且R2和R4是C12-15烃基。

[0108] 在更具体的实施方案中，GLA具有上述通式，其中R1、R3、R5和R6是C11烃基；且R2和R4是C13烃基。

[0109] 在更具体的实施方案中，GLA具有如下所示的确定的立体化学

[0110]

[0111] 其中R1、R3、R5和R6是C11-C20烃基；且R2和R4是C12-C20烃基。在更具体的实施方1 3 5 6 2 4
案中，GLA具有上述通式，其中R、R、R 和R 是C11-C14烃基；且R 和R 是C12-15烃基。在更
1 3 5 6 2 4
具体的实施方案中，GLA具有上述通式，其中R、R、R 和R 是C11烃基；且R 和R 是C13烃基。

[0112] 如本文所用，确定立体化学的GLA意指超过50％，或在本发明的不同方面中，超过60％，或超过75％，或超过90％，或超过95％的具有结构

[0113]

[0114] 的分子将会具有结构

[0115]

[0116] 如本文所示，意外地发现GLA相对于MPL具有惊人优秀的免疫刺激活性同时保持类似或降低的毒性。例如，在某些实施方案中，GLA有效地诱导强于使用基本上相同或相似的浓度的MPL所诱导的免疫应答至少2倍、至少3倍、至少5倍或至少10倍的免疫应答。在其他具体实施方案中，GLA在低于MPL至少5倍、至少10倍、至少25倍或至少100倍的浓度下具有与MPL基本上相同或相似的活性。

[0117] 可以使用领域内已知的和/或本文所述的多种已知免疫测定或参数中的任何一种来测定免疫应答。例如，可以通过多种公知参数中的任意一种测定免疫应答，所述参数包括但不限于以下的体内或体外检测：可溶性免疫球蛋白或抗体；诸如细胞因子、淋巴因子、趋化因子、激素、生长因子等的可溶性介体以及其它可溶性小肽、碳水化合物、核苷和/或脂质介体；通过免疫系统细胞的改变的功能或结构特性所确定的细胞活化状态的变化，例如细胞增殖、改变的运动性、诸如特异性基因表达或溶胞行为的特定活性的诱导；通过免疫系统细胞的细胞分化，包括改变的表面抗原表达谱或凋亡的启动(程序性细胞死亡)；或者可以检测免疫应答存在的任何其它标准。在具体实施方案中，通过检测诸如细胞因子和/或趋化因子(例如，IFN-γ、IL-2、TNF、IL-1β等)可溶性介体的产生来测定免疫应答。在另一具体实施方案中，通过检测合适的动物模型中对疾病的体内保护来测定免疫应答。在另一具体实施方案中，CD4细胞被用作免疫应答的标准。在另一具体实施方案中，抗体被用作免疫应答的标准。在另一具体实施方案中，T细胞被用作免疫应答的标准，其中可以通过Elispot或ICS检测T细胞。

[0118] GLA可以例如从Avanti Polar Lipids，Inc.(Avanti极性脂质公司)(Alabaster，1 3 5 6 2 4
AL(阿拉巴马)；产品号699800，其中R、R、R 和R 是十一烃基，且R 和R 是十二烃基)商购。

[0119] “烃基”指直链或支链的、无环或环状的、不饱和的或饱和的脂肪烃，其含有1至20个碳原子，在某些优选的实施方案中，含有11至20个碳原子。代表性的饱和直链烃基包括甲基、乙基、正-丙基、正-丁基、正-戊基、正-己基等，包括十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基等；而饱和的支链烃基包括异丙基、仲丁基、异丁基、叔-丁基、异戊基等。代表性的饱和环状烃基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等；而不饱和的环状烃基包括环戊烯基、环己烯基等。环状烃基在本文也被称为“同素环(homocycles)”或“同素环(homocyclic rings)”。不饱和的烃基在相邻的碳原子之间包含至少一个双键或三键(分别被称为“烯基”或“炔基”)。代表性的直链和支链烯基包括乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2，3-二甲基-2-丁烯基等；代表性的直链和支链炔基包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基等。

[0120] 因此，在本文涉及的某些实施方案中，GLA可以具有上述任一种结构，且在某些实施方案中，特别涉及GLA可以具有在下述专利申请的一个或多个中公开的脂质佐剂的任一结构，而在某些其它的实施方案中，特别涉及GLA可以不具有在下述专利申请的一个或多个中公开的脂质佐剂的任一结构：美国专利第6,544,518号、EP 1531158、WO2001/036433、WO 97/11708、WO 95/14026、U.S.4,987,237、JP63010728、JP 07055906、WO 2000/013029、U.S.5,530,113、U.S.5,612,476、U.S.5,756,718、U.S.5,843,918、WO96/09310、U.S.Pub.2004/161776、美国公布第2003/170249号、美国公布第2002/176867号、WO 2002/032450、WO 2002/028424、WO 2002/016560、WO2000/042994、WO 2000/025815、WO 2000/018929、JP 10131046、WO93/12778、EP 324455、DE 3833319、U.S.4,844,894、U.S.4,629,722。依照某些实施方案，GLA没有3′-脱-O-酰化。

[0121] 抗原

[0122] 用于本文描述的疫苗组合物和应用GLA的方法的某些实施方案中的抗原可以是个体内免疫反应的引发或增强所针对的任一靶抗原决定部位、分子(包括生物分子)、分子复合物(包括含有生物分子的分子复合物)、亚细胞集群、细胞或组织。通常，术语抗原指所关注的多肽抗原。然而，如本文所使用的，抗原也可以指编码所关注的多肽抗原的重组构建体(例如，表达构建体)。在某些优选的实施方案中，所述抗原可以是或可以来自与感染、癌症、自身免疫疾病、过敏症、哮喘症或任何其它的状态(其中，抗原特异性免疫应答的激活是理想的或有益的)相关的感染性病原体和/或抗原决定部位、生物分子、细胞或组织，或者与其在免疫学上交叉反应。

[0123] 优选地，在某些实施方案中，本发明的疫苗制剂含有能够引发针对人类或其它哺乳动物病原体的免疫应答的抗原或抗原成分，所述抗原或抗原成分可以包括来自病毒的成分，诸如来自HIV-1(如tat，nef，gp120或gp160)、人类疱疹病毒(如gD或其衍生物或如来自HSV1或HSV2、HSU、UL47、UL25或UL19的ICP27的即刻早期蛋白)、巨细胞病毒(特别是人类)(如gB或其衍生物)、轮状病毒(Rotavirus)(包括活力减弱病毒)、爱泼斯坦-巴尔氏病毒(如gp350或其衍生物)、水痘带状疱疹病毒(诸如gpI，II和IE63)或者来自诸如乙型肝炎病毒(例如乙型肝炎表面抗原或其衍生物)、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒以及戊型肝炎病毒(例如E1和E2蛋白)的肝炎病毒，或者来自其它的病毒病原体，诸如副粘病毒：呼吸道合胞病毒(如F和G蛋白或其衍生物)、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳头瘤病毒(例如HPV6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52或56等)、虫媒病毒(例如黄热病毒(Yellow Fever Virus)、登革热病毒(Dengue Virus)、蜱传脑炎病毒(Tick-bome encephalitis virus)、日本脑炎病毒或流感病毒(全活或灭活病毒、接种在鸡胚或MDCK细胞内的裂解流感病毒，或完整流感病毒体(如由Gluck，Vaccine，1992，10，915-920所描述的)或者是其纯化的或重组的蛋白，诸如HA，NP，NA或M蛋白或者其组合)。

[0124] 在本发明的一个方面，与GLA组合使用的抗原包括可溶性蛋白抗原，所述蛋白抗原经过修饰以使它们能够存在于主要组织相容性复合体I类分子(MHC I类)的环境中(参见，例如，美国专利第7,148,324号)。在这点上，可以通过与另外的肽序列的化学连接或融合来修饰所述可溶性蛋白抗原，其中所述另外的肽序列通常包含具有约20-25个氨基酸残基的肽，所述氨基酸残基包含lys和arg残基的组合，从而发生APC的增强的抗原提呈。在某些情况下，为了化学偶联的目的，该序列具有额外的N末端半胱氨酸残基。

[0125] 在本发明的另一方面，与GLA组合使用的抗原包括外来抗原，所述外来抗原可有效地引起针对关联人抗原或其他哺乳动物物种中关联抗原的适当的免疫应答。例如，美国专利第7,414,108号描述了小鼠前列腺酸性磷酸酶(mPAP)，其可被用作异种抗原来诱导包括人类个体在内的其他哺乳动物物种中的前列腺定向免疫。

[0126] 在某些其它优选的实施方案中，本发明的疫苗制剂含有能够引发针对人类或其它哺乳动物病原体的免疫应答的抗原或抗原成分，所述抗原或抗原成分可以包括来自一种或多种细菌病原体的成分，所述病原体例如奈瑟菌属某些种(Neisseria spp)，包括淋病奈瑟菌(N.gonorrhea)和脑膜炎奈瑟菌(N.meningitides)(例如荚膜多糖和其偶联物、转铁蛋白结合蛋白、乳铁蛋白结合蛋白、PiIC、黏附素)；化脓链球菌(S.pyogenes)(例如M蛋白或其片段、C5A蛋白酶、脂磷壁酸质)，无乳链球菌(S.agalactiae)，变异链球菌(S.mutans)：杜克雷嗜血杆菌(H.ducreyi)；莫拉菌属某些种(Moraxella spp)，包括粘膜炎莫拉菌(Mcatarrhalis)，也称为粘膜炎布兰汉球菌(Branhamella catarrhalis)(例如高和低分子量的黏附素及透明质酸酶)；博德特菌属某些种(Bordetella spp)，包括百日咳博德特菌(B.pertussis)(例如百日咳杆菌粘附素、百日咳毒素或其衍生物、丝状血凝素、腺苷酸环化酶、菌毛)，副百日咳博德特菌(B.parapertussis)和支气管败血症博德特菌(B.bronchiseptica)；分枝杆菌属某些种(Mycobacterium spp)，包括肺结核分枝杆菌(例如ESAT6，抗原85A、-B或-C)、牛型分枝杆菌(M.bovis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、鸟分枝杆菌(M.avium)、副结核分枝杆菌(M.paratuberculosis)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)；军团病杆菌属某些种(Legionella spp)，包括嗜肺军团菌(L.pneumophila)；埃希氏菌属某些种(Escherichia spp)，包括肠毒素性大肠埃希菌(enterotoxic E.coli)(例如定居因子、不耐热毒素或其衍生物、耐热毒素或其衍生物)、肠出血性大肠埃希菌(enterohemorragic E.coli)、肠致病性大肠埃希菌(enteropathogenic E.coli)(例如志贺(Shiga)毒素样毒素或其衍生物)；弧菌属某些种(Vibrio spp)，包括霍乱弧菌(V.cholera)(例如霍乱毒素或其衍生物)；志贺菌属某些种(Shigella spp)，包括索氏志贺菌(S.sonnei)、痢疾志贺菌(S.dysenteriae)、弗氏志贺菌(S.flexnerii)；耶尔森菌属某些种(Yersinia spp)，包括小肠结肠炎耶尔森菌(Y.enterocolitica)(例如Yop蛋白)、鼠疫耶尔森菌(Y.pestis)、假结核耶尔森菌(Y.pseudotuberculosis)；弯曲杆菌属某些种(Campylobacter spp)，包括空肠弯曲杆菌(C.jejuni)(例如毒素、黏附素和透明质酸酶)和结肠弯曲杆菌(C.coli)；沙门菌属某些种(Salmonella spp)，包括伤寒沙门菌(S.typhi)、副伤寒沙门菌(S.paratyphi)、猪霍乱沙门菌(S.choleraesuis)，肠炎沙门菌(S.enteritidis)；利斯特菌属某些种(Listeria spp.)，包括单核细胞增生利斯特菌(L.monocytogenes)；螺杆菌属某些种(Helicobacter spp)，包括幽门螺杆菌(H.pylori)(例如尿素酶、过氧化氢酶、空泡素)；假单胞菌属某些种(Pseudomonas spp)，包括铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)；葡萄球菌属某些种(Staphylococcus spp.)，包括金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)；肠球菌属某些种(Enterococcus spp.)，包括粪肠球菌(E.faecalis)、屎肠球菌(E.faecium)；梭菌属某些种(Clostridium spp.)，包括破伤风梭菌(C.tetani)(例如破伤风毒素及其衍生物)、肉毒梭菌(C.botulinum)(例如肉毒菌毒素及其衍生物)、艰难梭菌(C.difficile)(例如梭菌毒素类A或B及其衍生物)；芽孢杆菌属某些种(Bacillus spp.)，包括炭疽杆菌(B.anthracis)(例如肉毒菌毒素及其衍生物)；棒杆菌属某些种(Corynebacterium spp.)，包括白喉棒杆菌(C.diphtheriae)(例如白喉毒素及其衍生物)；疏螺旋体属某些种(Borrelia spp.)，包括伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi)(例如OspA，OspC，DbpA，DbpB)、伽氏疏螺旋体(B.garinii)(例如OspA，OspC，DbpA，DbpB)、阿弗西尼疏螺旋体(B.afzelii)(例如OspA，OspC，DbpA，DbpB)、安德森疏螺旋体(B.Andersonii)(例如OspA，OspC，DbpA，DbpB)、赫姆斯疏螺旋体(B.hermsii)；埃里希体属某些种(Ehrlichia spp.)，包括马埃里希体(E.equi)和人类粒细胞埃里希体病(the Human Granulocytic Ehrlichiosis)的媒介；立克次体属某些种(Rickettsia spp)，包括立氏立克次体(R.rickettsii)；衣原体属某些种(Chlamydia spp.)包括沙眼衣原体(C.trachomatis)(例如MOMP，肝素结合蛋白)，肺炎衣原体
(C.pneumoniae)(例如MOMP，肝素结合蛋白)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)；钩端螺旋体属某些种(Leptospira spp.)，包括问号钩端螺旋体(L.interrogans)；密螺旋体属某些种(Treponema spp.)，包括苍白球密螺旋体(T.pallidum)(例如罕见的外膜蛋白)，齿垢密螺旋体(T.denticola)、猪痢疾密螺旋体(T.hyodysenteriae)；或其他细菌病原体。

[0127] 在某些其它优选的实施方案中，本发明的疫苗制剂含有能够引发针对人类或其它哺乳动物病原体的免疫应答的抗原或抗原成分，所述抗原或抗原成分可以包括来自一种或多种寄生虫的成分(参见，例如，John，D.T.and Petri，W.A.，Markell thand Voge′s Medical Parasitology-9 Ed.(Markell和Voge的医学寄生虫学-第
9 版 )，2006，WB Saunders，Philadelphia；Bowman，D.D.，Georgis ′ Parasitology th
for Veterinarians-8 Ed.(Georgis的兽医寄生虫学-第8版)，2002，WB Saunders，Philadelphia)，所述寄生虫例如疟原虫属某些种(Plasmodium spp.)，包括恶性疟原虫(P.falciparum)；弓形虫属某些种(Toxoplasma spp.)，包括人刚地弓形虫(T.gondii)(例如SAG2，SAG3，Tg34)；内阿米巴属某些种(Entamoeba spp.)，包括溶组织内阿米巴(E.histolytica)；巴贝虫属某些种(Babesia spp.)，包括田鼠巴贝虫(B.microti)；锥虫属某些种(Trypanosoma spp.)，包括克氏锥虫(T.cruzi)；贾第虫属某些种(Giardia spp.)，包括蓝氏贾第虫(G.lamblia)；利什曼虫某些种，包括硕大利什曼虫(L.major)；
肺囊虫属某些种(Pneumocystis spp.)，包括卡氏肺囊虫(P.carinii)；毛滴虫属某些种(Trichomonas spp.)，包括鞘毛滴虫(T.vaginalis)；或者来自能够感染哺乳动物的蠕虫，诸如：(i)线虫感染(包括，但不限于蠕形住肠蛲虫(Enterobius vermicularis)、人蛔虫(Ascaris lumbricoides)、毛首鞭形线虫(Trichuris trichuria)、美洲板口线虫(Necator americanus)、十二指肠钩虫(Ancylostoma duodenale)、班氏吴策线虫(Wuchereria bancrofti)、马来丝虫(Brugia malayi)、旋盘尾丝虫(Onchocerca volvulus)、麦地那龙线虫(Dracanculus medinensis)、旋毛线虫(Trichinella spiralis)和粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis))；(ii)吸虫感染(包括，但不限于曼森血吸虫(Schistosoma mansoni)、埃及血吸虫(Schistosoma haematobium)、日本血吸虫(Schistosoma japonicum)、湄公河裂体吸虫(Schistosoma mekongi)、中华后睾吸虫(Opisthorchis sinensis)、并殖吸虫属(Paragonimus sp)、肝片形吸虫(Fasciola hepatica)、姜片吸虫(Fasciola magna)、大片吸虫(Fasciola gigantica))；以及(iii)绦虫感染(包括但不限于牛肉绦虫和猪肉绦虫)。因此某些实施方案可以涉及包括来自血吸虫属某些种(Schistosoma spp.)或来自酵母的抗原的疫苗组合物，血吸虫属某些种如曼氏血吸虫、埃及血吸虫和/或日本血吸虫，酵母诸如假丝酵母属(Candida spp.)，包括白假丝酵母(C.albicans)；隐球菌属(Cryptococcus spp.)，包括新型隐球酵母(C.neoformans)。

[0128] 对于结核分枝杆菌，其它优选的特异性抗原例如Th Ra12、Tb H9、Tb Ra35、Tb38-1、Erd 14、DPV、MTI、MSL、mTTC2和hTCC1(WO 99/51748)。针对结核分枝杆菌的蛋白还包括融合蛋白及其变体，其中结核分枝杆菌的至少两种、优选三种多肽融合成较大的蛋白。优选的融合物包括Ra12-TbH9-Ra35、Erd14-DPV-MTI、DPV-MTI-MSL、Erd14DPV-MTI-MSL-mTCC2、Erd14-DPV-MTI-MSL、DPV-MTI-MSL-mTCC2、TbH9-DPV-MTI(WO99151748)。

[0129] 对于衣原体最优选的抗原包含例如高分子量蛋白(HWMP)(WO 99/17741)、ORF3(EP 366 412)以及推定的膜蛋白(Pmps)。疫苗制剂的其它衣原体抗原可以选自在WO 99128475中描述的组。优选的细菌疫苗包含来自包括肺炎链球菌的链球菌属某些种的抗原(例如荚膜多糖及其偶联物、PsaA、PspA、链球菌溶血素、胆碱结合蛋白)和蛋白抗原肺炎链球菌溶血素(Biochem Biophys Acta，1989，67，1007；Rubins et al.，Microbial Pathogenesis(微生物致病机理)，25，337-342)，以及其突变的去毒衍生物(WO 90/06951；WO 99/03884)。其它优选的细菌疫苗包含来自嗜血菌属(Haemophilus spp.)的抗原，包括流感嗜血杆菌B型(H.influenzae type B)(例如PRP及其偶联物)，不可分型流感嗜血杆菌，例如OMP26、高分子量黏附素、P5、P6、蛋白质D和脂蛋白D，以及丝束蛋白和丝束蛋白衍生肽(美国专利第5,843,464号)或多重拷贝变体或其融合蛋白。

[0130] 乙型肝炎表面抗原衍生物在本领域是公知的，其包括在欧洲专利申请EP-A414374、EP-A-0304 578和EP 198474中描述的那些PreS1、Pars2 S表面抗原等。在一个优选方面，本发明的疫苗制剂包含HIV-1抗原、gp120，特别是在CHO细胞中表达时。在另外的实施方案中，本发明的疫苗制剂包含本文上面限定的gD2t。

[0131] 在本发明的一个实施方案中，含有要求保护的佐剂的疫苗包含来源于弹状病毒的抗原，所述弹状病毒包括下述的任何一种：短暂热病毒属成员，例如牛流行热病毒；狂犬病病毒属成员，例如狂犬病病毒；和水泡病毒属成员，例如水泡口炎病毒(VSV)。

[0132] 在本发明优选的实施方案中，含有要求保护的佐剂的疫苗包含的抗原来自被认为是生殖器疣病因的人类乳头瘤病毒(HPV)(HPV 6或HPV 11及其它)，以及是宫颈癌病因的HPV病毒(HPV16、HPV18及其它)。生殖器疣预防或治疗性疫苗的特别优选形式包含L1颗粒和壳粒，以及包含选自HPV6和HPV11蛋白E6、E7、L1和L2的一个或多个抗原的融合蛋白。融合蛋白某些优选的形式包括WO 96/26277中公开的L2E7，以及GB 9717953.5(PCT/EP98/05285)中公开的蛋白D(1/3)-E7。优选的HPV宫颈感染或癌症的预防性或治疗性疫苗组合物可以包含HPV 16或18的抗原。例如，L1或L2抗原单体，或者作为病毒样颗粒(VLP)共同呈现的L1或L2抗原，或者在VLP或壳粒结构内单独呈现的单独的L1蛋白。这些抗原、病毒样颗粒和壳粒本身是已知的。参见例如WO94/00152，WO94/20137，WO94/05792和WO93/02184。

[0133] 其它早期蛋白可以单独地被包括或者作为诸如E7、E2或优选例如E5的融合蛋白；特别优选的实施方案包括包含L1E7融合蛋白的VLP(WO 96/11272)。特别优选的HPV16抗原包含与蛋白D载体融合的早期蛋白E6或E7以形成来自HPV16的蛋白D-E6或E7融合物，或其组合；或者包含E6或E7与L2的组合(WO 96/11272)。可选择地，HPV16或18的早期蛋白E6和E7可以呈现为单分子，优选蛋白D-E6/E7融合物。这类疫苗可任选地包含来自HPV18的E6和E7蛋白的任一者或两者，优选以蛋白D-E6或蛋白D-E7融合蛋白或蛋白DE6/E7融合蛋白的形式。本发明的疫苗另外还包含来自其它HPV菌株的抗原，优选来自HPV 31或33菌株。

[0134] 本发明的疫苗还包含来自导致疟疾的寄生虫的抗原。例如，来自恶性疟原虫的优选抗原包括RTS，S和TRAP。RTS是杂交蛋白，包含恶性疟原虫的环子孢子(CS)蛋白的基本上全部的C-末端部分，后者通过乙型肝炎表面抗原的preS2部分的四个氨基酸连接于乙型肝炎病毒表面(S)抗原。其完整结构在国际专利申请号PCT/EP92/02591中公开，该国际申请公布号为WO 93/10152，要求英国专利第9124390.7号申请的优先权。当在酵母中表达时，RTS作为脂蛋白颗粒产生，且当它与来自HBV的S抗原共表达时，它产生了称为RTS，S的混合颗粒。

[0135] 在以WO 90/01496公布的国际专利申请号PCT/GB89/00895中描述了TRAP抗原。本发明的优选实施方案是疟疾疫苗，其中抗原制剂包含RTS、S和TRAP抗原的组合。可能是多级疟疾疫苗的组分的候选物的其它疟原虫抗原是恶性疟原虫MSP1，AMA1，MSP3，EBA，GLURP，RAP1，RAP2，钳合蛋白(Sequestrin)，PfEMPI，Pf332，LSA1，LSA3，STARP，SALSA，PfEXP1，Pfs25，Pfs28，PFS27125，Pfs16，Pfs48/45，Pfs230，以及在疟原虫属某些种中的它们的类似物。

[0136] 因此，本文公开的某些实施方案涉及来自诸如细菌、病毒或真菌的至少一种感染型病原体的抗原，所述病原体包括放线细菌，诸如结核分支杆菌和麻风分支杆菌或另外的分支杆菌；细菌诸如沙门菌属、奈瑟球菌属、疏螺旋体属、衣原体属或博德特菌属的成员；病毒诸如单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、巨细胞病毒、水痘带状疱疹、肝炎病毒、爱泼斯坦-巴尔氏病毒(EBV)、呼吸道合胞病毒、人乳头状瘤病毒(HPV)以及巨细胞病毒；HIV诸如HIV-1或HIV-2；真菌诸如曲霉菌、芽生菌、球孢菌和肺孢子菌，或者酵母，包括假丝酵母属，诸如白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、葡萄牙念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌；寄生虫诸如原生动物，例如疟原虫属，包括恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵圆疟原虫；或者另外的寄生虫，诸如棘阿米巴、溶组织内阿米巴、管圆线虫、曼氏血吸虫、日本血吸虫、隐孢子虫(Cryptosporidium)、埃及吸血虫、钩虫线虫、溶组织内阿米巴、结肠内阿米巴、迪斯帕内阿米巴、哈特曼内阿米巴、波氏内阿米巴、班氏吴策线虫、贾第虫以及利什曼虫的一种或多种。

[0137] 例如，在含GLA的疫苗实施方案中含有来自疏螺旋体属的抗原，所述抗原可以包括核酸、病原体来源的抗原或抗原制剂、重组产生蛋白或肽，以及嵌合融合蛋白。一种这样的抗原是OspA。OspA借助其在宿主细胞内的生物合成可以是载脂形式的完全成熟的蛋白(Lipo-OspA)，或者可选择地可以是非载脂的衍生物。这种非载脂衍生物包括非载脂NS1-OspA融合蛋白，其具有流感病毒的非结构蛋白(NS1)的N-末端的前81个氨基酸，以及完整的OspA蛋白，且另一种MDP-OspA是携带3个附加的N-末端氨基酸的OspA的非载脂形式。

[0138] 鉴别具有或疑似有患本文所述感染性病原体感染的危险的个体的组合物和方法在本领域是已知的。

[0139] 例如，细菌结核分支杆菌导致肺结核(TB)。该细菌通常侵袭肺脏，但也可以侵袭肾脏、脊柱和脑。如果不能恰当治疗的话，TB疾病可以是致死性的。当感染的人打喷嚏或咳嗽时，这种疾病可以在人与人之间播散。在2003年，美国报道的TB病例超过了14,000例。

[0140] 尽管结核通常可以采用长期的抗生素治疗来控制，但这种治疗不足以预防该疾病的播散并引起了关于抗生素抗性菌株的潜在选择的担忧。感染的个体在一段时间内可以是无症状的，但有传染性。此外，尽管依从治疗方案是关键的，但患者行为难以监测。一些患者不能完成治疗过程，这导致了无效治疗和耐药性的发生(例如美国专利第7,087,713号)。

[0141] 目前，活细菌疫苗是诱导针对肺结核的保护性免疫的最有效的方法。用于这一目的的最常见的分支杆菌(Mycobacterium)是卡介菌(Bacillus Calmette-Guerin)(BCG)，牛型分支杆菌的无毒力株。然而，BCG的安全性和功效是争议的来源，且有些国家，如美国并不给全民接种。通常使用皮肤测试来完成诊断，其包括结核菌素PPD(蛋白纯化的衍生物)的皮内暴露。抗原特异性T细胞应答导致了注射后48、72小时在注射部位的可测量的硬结，这提示已暴露于分支杆菌抗原。但是敏感性和特异性一直是该测试的难题，并且接种了BCG的个体不能与受感染的患者区分开(例如，美国专利第7,087,713号)。

[0142] 尽管巨噬细胞一直作为肺结核杆菌免疫的主要效应器，但T细胞是所述免疫的优势诱导细胞。T细胞在保护肺结核杆菌感染中的重要作用在AIDS患者中被示例：由于与人类免疫缺陷病毒(HIV)感染有关的CD4T细胞的耗竭，AIDS患者体内通常会出现肺结核分支杆菌。已表明，分支杆菌反应性CD4T细胞是干扰素-γ(IFN-γ)强大的产生细胞，其也已被进一步表明触发小鼠体内巨噬细胞的抗分支杆菌效应。尽管IFN-γ在人体内的作用是不清楚的，但已有研究表明1，25-二羟基-维生素D3单独地或与IFN-γ或肿瘤坏死因子-α联用激活人巨噬细胞以抑制肺结核分支杆菌感染。此外，已知IFN-γ激活人巨噬细胞以产生1，25-二羟基-维生素D3。类似地，已表明，IL-12在激发对肺结核分支杆菌感染的抗性中发挥作用。对肺结核分支杆菌感染的免疫学的综述，参见Chan and Kaufmann，in Tuberculosis：Pathogenesis，Protection and Control(肺结核：发病机理、保护和控制)，Bloom(ed.)，ASM Press.Washington，D.C.(1994)。

[0143] 诊断肺结核或诱导抗肺结核的保护性免疫的现有的化合物和方法包括多肽和编码这种多肽的DNA分子的应用，所述多肽含有一种或多种分支杆菌蛋白的至少一种免疫原部分。含有这种多肽或DNA序列以及适当的检测试剂的诊断试剂盒可以用于检测患者和生物样本中的分支杆菌感染。也提供了针对这种多肽的抗生素。此外，这种化合物可以配制于疫苗和/或药物组合物中，用于抗分支杆菌感染的免疫。(美国专利第6,949,246号和第6,555,653号)。

[0144] 二十世纪60年代，在世界上很多地方都消灭了疟疾，但这种疾病仍持续存在，并出现了耐药的新致病株。疟疾在90多个国家是主要的公共卫生问题。10例疟疾中有9例出现在撒哈拉以南非洲(sub-Saharan Africa)。超过1/3的世界人口正面临危险，且每年有350至500百万的人感染疟疾。今年有45百万怀孕妇女面临感染疟疾的危险。在那些已经被感染的个体中，每年有超过1百万被感染个体死于可预防的疾病。那些死亡者中主要是非洲的儿童。

[0145] 疟疾通常是在人被受感染的雌疟蚊(Anopheles mosquito)叮咬时传播。蚊子必须通过汲取已经感染了疟疾的人的血被感染后才能传播疟疾。疟疾由寄生虫导致，且该病的临床症状包括发热和流感样不适，诸如寒战、头痛、肌肉疼痛和疲倦。这些症状可以伴有恶心、呕吐和腹泻。疟疾也可以导致由红细胞的损失引起的贫血和黄疸。一种类型的疟疾，恶性疟疾，如果不能及时治疗的话，可能导致肾衰、惊厥、意识模糊、昏迷和死亡。

[0146] 个体中疟疾的体外诊断方法是已知的，其包括将从个体采集的组织或生物学流体与分子或多肽组合物接触(在允许体外免疫反应在所述组合物和存在于组织或生物流体中的抗体之间发生的条件下)，以及形成的抗原抗体复合物的体外检测(参见，例如，美国专利第7,087,231号)，其中所述分子或多肽组合物包括一个或多个多肽序列，其携带由恶性疟原虫的感染活性导致的蛋白的一个或多个T抗原决定部位的全部或部分。

[0147] 已经描述了重组恶性疟原虫(3D7)AMA-1胞外区的表达和纯化。先前的方法已经产生了高纯化的蛋白，其保留了天然分子的折叠和二硫键。重组的AMA-1可以用作诊断试剂以及用于抗体制备，和作为蛋白单独用于或作为疫苗的一部分用于预防疟疾。(美国专利第7,029,685号)

[0148] 本领域已经描述了编码种属特异性的间日疟原虫疟疾肽抗原的多核苷酸，所述抗原是分泌入感染后的易感哺乳动物宿主血浆内的蛋白或蛋白片段，这样产生针对这些抗原的单克隆或多克隆抗体。所述肽抗原、单克隆抗体和/或多克隆抗体用于诊断疟疾的测定中被利用，以及用于确定是否间日疟原虫是导致感染的种属。(美国专利第6,706,872号)也已经报道了种属特异性的间日疟原虫疟疾肽抗原，其是分泌入感染后的敏感哺乳动物宿主血浆内的蛋白或蛋白片段，这样产生针对这些抗原的单克隆或多克隆抗体。所述肽抗原、单克隆抗体和/或多克隆抗体在用于诊断疟疾的测定中被利用，以及被用于确定是否间日疟原虫是导致感染的种属(参见，例如，美国专利第6,231,861号)。

[0149] 通过产生高纯度蛋白的方法也已经表达了重组的恶性疟原虫(3D7)AMA-1胞外区，其保留了天然分子的折叠和二硫键。所述重组的AMA-1用作诊断试剂，以及用作疫苗用于抗体产生(美国专利第7,060,276号)。同样已知的是重组恶性疟原虫(3D7)MSP-142的表达和纯化，其保留了天然分子的折叠和二硫键。重组的MSP-142用作诊断试剂以及用作疫苗用于抗体产生。(美国专利第6,855,322号)。

[0150] 因此根据这些和相关的公开内容，已知检测人类疟疾感染的诊断方法，以鉴定具有或疑似有患疟疾感染性病原体感染的危险的个体。具体地，例如，将血液样本与含有3-乙酰基嘧啶腺嘌呤二核苷酸(APAD)、底物(例如，乳酸盐或乳酸)以及缓冲液合并。该试剂被设计为检测由疟疾寄生虫产生的独特的糖分解酶的存在。已知该酶是寄生虫乳酸脱氢酶(PLDH)。使用上述试剂，很容易区别PLDH与宿主的LDH。所述试剂与寄生虫感染的血液样本合并导致了APAD的还原。但是APAD不被宿主LDH还原。然后可以通过多种技术，包括光谱、荧光测定、电泳或比色分析来检测还原的APAD。以上述方式检测还原的APAD提供了疟疾感染的阳性指示(例如美国专利第5,124,141号)。在另一种诊断疟疾的方法学中，包含特征性氨基酸序列的多肽源自恶性疟原虫抗原GLURP，并可在检测样本中被针对所述多肽或与其反应的特异性抗体所识别。(美国专利第5,231,168号)

[0151] 利什曼病是世界范围内的寄生虫病，在印度次大陆、非洲和拉丁美洲频繁流行，是世界卫生组织开发疫苗的优先考虑对象。不同疾病的复合，利什曼寄生虫导致了内脏器官的致命感染以及严重的皮肤病。利什曼病最具破坏性的形式中的一种是鼻和嘴的毁容感染。利什曼病例的数量越来越多，目前在许多地区以难于控制。作为HIV感染的结果，利什曼病在一些发达地区也处于上升状态，特别是在南欧。可利用的药物是有毒性的、昂贵的，并需要长期的每日注射。

[0152] 利什曼虫是定居于免疫系统的巨噬细胞或白血细胞的原生动物寄生虫。这种寄生虫通过小的吸血昆虫(沙蝇)的叮咬传播，所述昆虫由于定居于地球上的广大地区，难以控制。

[0153] 内脏利什曼病是该病三种表现形式中最危险的。据估计每年发生约500,000例内脏形式(黑热病(kala-azar)或″致死疾病″)的新病例。超过200百万的人目前处于感染内脏利什曼病的危险中。超过90％的内脏利什曼病例发生在印度、孟加拉国、苏丹、巴西和尼泊尔。大多数死亡发生在儿童。患有皮肤形式的那些人通常是永久的毁容。

[0154] 利什曼虫感染难以诊断，并且通常涉及组织活检样本的组织病理学分析。然而已经开发了几种血清学和免疫学诊断测定。(美国专利第7,008,774号；Senaldi et al.，(1996)J.Immunol.Methods 193：95；Zijlstra，et al.，(1997)Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg.91：671673；Badaro，et al.，(1996)J.Inf.Dis.173：758 761；Choudhary，S.，et al.，(1992)J.Comm.Dis.24：3236；Badaro，R.，et al.，(1986)Am.J.Trop.Med.Hyg.35：7278；Choudhary，A.，et al.，(1990)Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg.84：363366；和Reed，S.G.，et al.，(1990)Am.J.Trop.Med.Hyg.43：632639)。前鞭毛体释放代谢产物进入培养基以产生条件培养基。这些代谢产物是宿主免疫原性的。参见Schnur，L.F.，et al.，(1972)Isrl.J.Med.Sci.8：932942；Sergeiev，V.P.，et al.，(1969)Med.Parasitol.38：208212；El-On，J.，et al.，(1979)Exper.Parasitol.47：254269；和Bray，R.S.，et al.，(1966)Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg.60：605609；美国专利第6,846,648号、美国专利第5,912,166号、美国专利第5,719,263号、美国专利第5,411,865号)。

[0155] 世界范围内大约有40百万人感染导致AIDS的病毒HIV。每年约3百万人死于该病，他们中的95％是在发展中国家。每年有接近5百万的人感染HIV。目前在撒哈拉以南非洲，该病的负担最重，但它正在向诸如印度、中国和俄罗斯的其它国家快速传播。这种流行病在少数民族人口中蔓延最快。在美国，从1981年起，已经报道了超过950,000例的AIDS。AIDS袭击处于多产的年纪的人。由于生物学和社会原因，妇女患HIV/AIDS的危险增加。

[0156] AIDS由人类免疫缺陷病毒(HIV)导致，所述病毒杀死和破坏人体免疫系统的细胞，并且进行性破坏人体对抗感染和某些癌症的能力。HIV最普遍的传播是通过与受感染的伴侣进行无保护的性交。对这一问题最有力的解决方案是预防病毒的播散。实现这一目的的一条途径是制备安全、有效和负担得起的HIV疫苗。在世界范围内，处于HIV感染高危险中的5个患者中不到1个采取了有效的预防。

[0157] 诊断HIV感染的方法是已知的，包括通过患者样本的病毒培养、确定的核酸序列的PCR，以及检测患者血清中抗-HIV抗体的存在的抗体测试(参见例如，美国专利第6,979,535号、第6,544,728号、第6,316,183号、第6,261,762号、第4,743,540号)。

[0158] 根据本文公开的某些其它实施方案，疫苗组合物和相关的制剂以及应用方法可以包括来自癌细胞的抗原，其可以用于癌症的免疫治疗学治疗。例如，佐剂制剂可以利用肿瘤排斥抗原，诸如前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、肾癌或黑色素瘤癌的排斥抗原。示例性的癌症或癌细胞来源的抗原包括MAGE 1、3和MAGE 4或其它MAGE抗原如在WO99/40188中公开的那些、PRAME、BAGE、Lage(也被称为NY ESO 1)SAGE和HAGE(WO99/53061)或GAGE(Robbins and Kawakami，1996 Current Opinions in Immunology 8，pps 628-636；Van den Eynde et al.，International Journal of Clinical & Laboratory Research(1997&1998)；Correale et al.(1997)，Journal of the National Cancer Institute 89，p.293。癌抗原的这些非限定性实例表达于诸如黑色素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌的多种肿瘤类型中。参见，例如美国专利第6,544,518号。

[0159] 依照某些本文公开的实施方案，适于与GLA一起使用的其它肿瘤特异性抗原包括但不限于肿瘤特异性或肿瘤相关性神经节苷脂类，如GM2和GM3或其与载体蛋白的偶联物；或者在GLA疫苗组合物中使用的用于引发或增强抗癌症免疫应答的抗原可以是自身肽激素，诸如用于许多癌症的治疗的全长促性腺激素释放激素(GnRH，WO 95/20600)，一种10个氨基酸长的短肽。在另一个实施方案中，使用了前列腺抗原，诸如前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、PSCA(例如，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 95(4)1735-17401998)、PSMA或在优选的实施方案中的称为前列腺酶(Prostase)的抗原。(例如，Nelson，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)96：3114-3119；Ferguson，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999.96，
3114-3119；WO 98/12302；美国专利第5,955,306号；WO 98/20117；美国专利第5,840,871号和第5,786,148号；WO/004149。从WO98/137418和WO/004149中可知其它的前列腺特异性抗原。另一种是STEAP(PNAS 96 14523 14528 7-12 1999)。

[0160] 用于本发明的背景下的其它肿瘤相关抗原包括：Plu-1(J Biol.Chem274(22)15633-15645，1999)、HASH-1、HasH-2、Cripto(Salomon et al Bioessays 199，21：
61-70，美国专利第5,654,140号)和Criptin(美国专利第5,981,215号)。此外与癌症治疗疫苗特别相关的抗原也包括酪氨酸酶和存活蛋白。

[0161] 本文公开的涉及包含癌抗原的含有GLA的疫苗组合物的实施方案可以用于对抗特征为肿瘤相关抗原表达的任何癌症，所述肿瘤相关抗原表达诸如HER-2/neu表达或其他癌症特异性或癌症相关的抗原。示例性的癌症相关抗原包括，但不限于，来源于或包含以下的一个或多个的癌抗原：p53、Ras、c-Myc、细胞质丝氨酸/苏氨酸激酶(例如，A-Raf、B-Raf、和C-Raf，细胞周期蛋白依赖性激酶)、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、MART-1、BAGE、DAM-6、DAM-10、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC2、磷酸肌醇3-激酶(PI3Ks)、TRK受体、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、肾母细胞瘤抗原(WT1)、AFP、β-连环蛋白/m、Caspase-8/m、CEA、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、BCR-ABL、干扰素调节因子4(IRF4)、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、肿瘤相关钙信号转导蛋白1(TACSTD1)、TACSTD2、受体酪氨酸激酶(例如，表皮生长因子受体(EGFR)(特别是EGFRvIII)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、胞质酪氨酸激酶(例如，src家族、syk-ZAP70家族)、整合素连接激酶(ILK)、信号转导蛋白和转录激活因子STAT3、STAT5和STAT6、缺氧诱导型因子(例如，HIF-1α)、核因子-κB(NF-κB)、Notch受体(例如，Notch1-4)、c-Met、雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)、WNT、细胞外信号调节激酶(ERKs)及它们的调节亚基、PMSA、PR-3、MDM2、间皮蛋白、STEAD和TEL/AML1。

[0162] 本文公开的涉及包含癌抗原的含有GLA的疫苗组合物的实施方案可以用于对抗特征为肿瘤相关抗原表达的任何癌症，所述肿瘤相关抗原表达诸如HER-2/neu表达或其他癌症特异性或癌症相关的抗原。

[0163] 诊断具有或疑似有患癌症危险的个体中的癌症可以通过众多本领域公认的方法学中的任一种来完成，这可以依赖于包括临床表现、癌症的进展程度、癌症类型或其它因素而变化。癌症诊断学的实例包括患者样本(例如，血液、皮肤活检、其它组织活检、手术样本等)的组织病理学检测、组织细胞化学检测、免疫组织细胞化学检测和免疫组织病理学检测，对限定的遗传(例如，核酸)标志物的PCR检测，对循环中的癌相关抗原或携带所述抗原的细胞的血清学检测，或对限定的特异性抗体的血清学检测，或者本领域技术人员熟悉的其它方法学。参见，例如，美国专利第6,734,172号、第6,770,445号、第6,893,820号、6,979,730号、第7,060,802号、第7,030,232号、第6,933,123号、第6,682,901号、第6,587,792号、第6,512,102号、第7,078,180号、第7,070,931号；JP5-328975；Waslylyk et al.，1993Eur.J Bioch.211(7)：18。

[0164] 本发明的某些实施方案的疫苗组合物和方法可以用于预防或治疗自身免疫疾病，其包括疾病、状态或病症，其中宿主或个体的免疫系统不利地介导针对“自身”组织、细胞、生物分子(例如，肽、多肽、蛋白、糖蛋白、脂蛋白、蛋白脂质、脂质、糖脂、诸如RNA和DNA的核酸、低聚糖、多聚糖、蛋白聚糖、糖胺聚糖等等，以及个体细胞和组织的其它分子组分)或抗原决定部位(例如，特异性的免疫限定识别结构，诸如被抗体可变区互补决定区(CDR)或被T细胞受体CDR识别的那些)的免疫应答。

[0165] 因此自身免疫疾病的特征在于涉及细胞或抗体的异常免疫应答，其在任一种情形下都针对正常的自组织。哺乳动物的自身免疫疾病通常分类为两种不同类型中的一种：细胞介导的疾病(即T-细胞)或抗体介导的病症。细胞介导的自身免疫疾病的非限定性实例包括多发性硬化、风湿性关节炎、桥本甲状腺炎、I型糖尿病(青少年型糖尿病)和自身免疫性葡萄膜视网膜炎(uvoretinitis)。抗体介导的自身免疫病症包括但不限于重症肌无力、系统性红斑狼疮(或SLE)、格雷夫斯病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、自身免疫性哮喘、冷球蛋白血症、血栓性血小板减少性紫癜、原发性胆管纤维硬化和恶性贫血。与系统性红斑狼疮有关的抗原是小核核糖核酸蛋白(snRNP)；与格雷夫斯病有关的抗原是促甲状腺激素受体、甲状腺球蛋白和甲状腺上皮细胞的其它组分(Akamizu et al.，1996；Kellerman et al.，1995；Rajuet al.，1997和Texier et al.，1992)；与天疱疮有关的抗原是类钙粘蛋白(cadherin-like)天疱疮抗原，诸如桥粒芯糖蛋白3和其它黏附分子(Memar et al.，1996：Stanley，1995；Plott et al.，1994；and Hashimoto，1993)；以及与血栓性血小板减少性紫癜有关的抗原是血小板抗原。(参见，例如，美国专利第6,929,796号；Gorski et al.(Eds.)，Autoimmunity(自身免疫)，2001，Kluwer Academic Publishers，Norwell，MA；Radbruch and Lipsky，P.E.(Eds.)Current Concepts in Autoimmunity and Chronic Inflammation(自身免疫和慢性炎症的现代观点)(Curr.Top.Microbiol，and Immunol.(微生物学和免疫学的现代观点))2001，Springer，NY.)[0166] 自身免疫参与80多种不同的疾病，包括1型糖尿病、多发性硬化、狼疮、风湿性关节炎、硬皮病和甲状腺疾病。对于大多数自身免疫疾病缺乏有关发病率的有力的量化评估。
20世纪90年代末完成的最新研究表明自身免疫疾病是美国第三位最常见的主要疾病；且最常见的自身免疫疾病影响了超过8.5百万美国人。该疾病流行的目前估值是美国人口的
5％到8％。大多数自身免疫疾病倾向于侵袭女性。可能获得自身免疫疾病的女性是男性的
2.7倍多。女性更易感自身免疫疾病；男性看起来比女性具有更高水平的天然杀伤细胞活性。(Jacobsen et al，Clinical Immunology and Immunopathology，84：223-243，1997.)[0167] 当免疫系统将自身组织错认为异物而启动不恰当的攻击时，就发生了自身免疫疾病。机体可受到自身免疫疾病不同方式的侵袭，包括，例如肠道(克罗恩氏疾病)和脑(多发性硬化)。已知自身抗体攻击自身细胞或自身组织以损伤它们的功能，并由此导致自身免疫疾病，并且已知在自身免疫疾病真正发生(例如，临床体征和症状出现)之前就可以在患者的血清中检测出自身抗体。因此自身抗体的检测可以早期发现或识别自身免疫疾病的存在或发展为自身免疫疾病的风险。基于这些发现，已经发现了针对自身抗原的多种自身抗体，并且在临床检验中已经测量了针对自身抗原的自身抗体(例如，美国专利第6,919,210号、第6,596,501号、第7,012,134号、第6,919,078号)，而其它的自身免疫诊断学可能涉及相关代谢产物的检测(例如，美国专利第4,659,659号)或免疫学活性(例如，美国专利第4,614,722和5,147,785，4,420,558，5,298,396，5,162,990，4,420,461，4,595,654，
5,846,758，6,660,487号)。

[0168] 在某些实施方案中，本发明的组合物特别适用于治疗老人和/或免疫低下患者，包括肾透析个体、化疗和/或放疗个体、接受移植者等。这些个体通常显示对疫苗的减弱的免疫应答，因此使用本发明的组合物能够增强这些个体达到的免疫应答。

[0169] 在其它实施方案中，用于本发明的组合物中的一种抗原或多种抗原包括与呼吸系统疾病有关的抗原，诸如由细菌感染(例如，肺炎球菌感染)导致或加剧的那些疾病，用于预防和治疗诸如慢性阻塞性肺疾病(COPD)的状态。COPD的生理学定义是在患慢性支气管炎和/或肺气肿的患者存在不可逆的或部分可逆的呼吸道阻塞(Am J Respir Crit Care Med.1995 Nov；152(5Pt 2)：S77-121)。COPD的恶化经常是由细菌(例如，肺炎球菌)感染引起的(Clin Microbiol Rev.2001 Apr；14(2)：336-63)。在具体实施方案中，本发明的组合物包含如本文所述的GLA佐剂与肺炎链球菌疫苗Prevnar 的组合(Wyeth)。

[0170] 在仍然另一实施方案中，包含本文所述的GLA的本发明的组合物被用于治疗过敏状况。例如，在具体实施方案中，所述组合物被用于过敏症脱敏治疗。这类治疗涉及用逐渐增加剂量的使人过敏的物质刺激免疫系统，其中所述物质配制在包含GLA的组合物中。在具体实施方案中，所述组合物用于治疗对食物产品、花粉(树、草)、螨虫、猫或有刺昆虫(例如，蜜蜂、大黄蜂、小黄蜂、胡蜂、蚁蜂、火蚁)的过敏症。已经证实GLA制剂优先诱导保护免疫应答相关的Th1免疫应答，并且下调过敏应答相关的Th2应答(在小鼠流感中，特征显示为高IL2、IFN-g，低IL-5、IL-10)。给予过敏原与GLA-SE预期会下调已有的过敏(TH2)应答。在另一实施方案中，可以将GLA制剂给予过敏个体无需共同给予过敏原。在该情况下，在具有症状的过敏个体中存在内源过敏原，并且GLA制剂与内源过敏原相互作用，从而将过敏应答转换为保护应答。因此，在一个实施方案中，本发明提供以下方法，包括选择具有症状的过敏个体，将包含GLA的组合物以能有效降低或消除症状量给予个体。

[0171] 在本发明的另一实施方案中，在本发明的背景下使用的抗原包括可溶性蛋白抗原，所述蛋白抗原经过修饰以使它们能够存在于主要组织相容性复合体I类分子(MHC I类)的环境中(参见，例如，美国专利第7,148,324号)。在这点上，可以通过与另外的肽序列的化学连接或融合来修饰所述可溶性蛋白抗原，其中所述另外的肽序列通常包含具有约20-25个氨基酸残基的肽，所述氨基酸残基包含lys和arg残基的组合，从而发生APC的增强的抗原提呈。在某些情况下，为了化学偶联的目的，该序列具有额外的N末端半胱氨酸残基。

[0172] 在某些实施方案中，本发明的抗原是外来抗原，所述外来抗原可有效地引起针对关联人抗原或其他哺乳动物物种中关联抗原的适当的免疫应答。例如，美国专利第7,414,108号描述了小鼠前列腺酸性磷酸酶(mPAP)，其可被用作异种抗原来诱导包括人类个体在内的其他哺乳动物物种中的前列腺定向免疫。

[0173] TLR

[0174] 如本文描述的，本发明的某些实施方案涉及疫苗组合物和免疫佐剂组合物，包括药物组合物，所述组合物包括一种或多种钟样受体激动剂(TLR激动剂)。钟样受体(TLR)包括天然免疫系统的细胞表面跨膜受体，其赋予宿主细胞早期识别多种保守的微生物分子结构的能力，所述分子结构可以存在于众多感染性病原体内或表面。(例如，Armant et al.，2002 Genome Biol.3(8)：reviews(综述)3011.1-3011.6；Fearon et al.，1996 Science 272：50；Medzhitov et al.，1997Curr.Opin.Immunol.9：4；Luster 2002 Curr.Opin.Immunol.14：129；Lien et al.2003Nat.Immunol.4：1162；Medzhitov，2001 Nat.Rev.Immunol.1：135；Takeda et al.，2003 Ann Rev Immunol.21：335；Takeda et al.2005 Int.Immunol.17：1；Kaisho et al.，2004 Microbes Infect.6：1388；Datta et al.，2003 J.Immunol.170：4102)。

[0175] 诱导TLR-介导的信号转导以促进通过天然免疫系统的免疫应答的启动可以通过TLR激动剂来实现，所述TLR激动剂与细胞表面的TLR结合。例如，脂多糖(LPS)可以是通过TLR2或TLR4的TLR激动剂(Tsan et al.，2004 J.Leuk.Biol.76：514；Tsan et al.，2004 Am.J.Physiol.Cell Phsiol.286：C739；Lin et al.，2005Shock 24：206)；聚(肌苷-胞苷)(聚肌胞)可以是通过TLR3的TLR激动剂(Salem et al.，2006 Vaccine 24：5119)；CpG序列(含有未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤或“CpG”二核苷酸基序的寡聚脱氧核苷酸，例如，CpG 7909，Cooper et al.，2005 AIDS 19：1473；CpG 10101Bayes et al.Methods Find Exp Clin Pharmacol 27：193；Vollmer et al.Expert Opinion on Biological Therapy
5：673；Vollmer et al.，2004 Antimicrob.Agents Chemother.48：2314；Deng et al.，
2004 J.Immunol.173：5148)可以是通过TLR9的TLR激动剂(Andaloussi et a.，2006 Glia
54：526；Chen et al.，2006 J.Immunol.177：2373)；肽聚糖可以是TLR2和/或TLR6的激动剂(Soboll et al.，2006 Biol.Reprod.75：131；Nakao et al.，2005 J.Immunol.174：
1566)；3M003(4-氨基-2-(乙氧甲基)-α，α-二甲基-6，7，8，9-四氢-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-乙醇水合物，分子量318Da，来自3M Pharmaceuticals，St.Paul，MN，其也是相关化合物3M001和3M002的来源；Gorden et al.，2005 J.Immunol.174：1259)可以是TLR7激动剂(Johansen 2005 Clin.Exp.Allerg.35：1591)和/或TLR8激动剂(Johansen 2005)；鞭毛蛋白可以是TLR5激动剂(Feuillet et al.，2006Proc.Nat.Acad.Sci.USA 103：12487)；
且丙肝抗原可以作为通过TLR7和/或TLR9的TLR激动剂(Lee et al.，2006 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 103：1828；Horsmans et al.，2005 Hepatol.42：724)。其它的TLR抗原是已知的(例如，Schirmbeck et al.，2003 J.Immunol.171：5198)，且依照本文描述的某些实施方可以使用其它的TLR抗原。

[0176] 例如，借助于背景知识(参见，例如，美国专利第6,544,518号申请)，已知含有未甲基化的CpG二核苷酸(″CpG″)的免疫激活型寡核苷酸可以作为通过全身和粘膜两种途径给药时的佐剂(WO 96/02555，EP 468520，Davis et al.，J.Immunol，1998.160(2)：870-876；McCluskie and Davis，J.Immunol.，1998，161(9)：4463-6)。CpG是存在于DNA中的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸基序的缩写。CG基序在免疫激活中的重要作用由Krieg，Nature
374，p546 1995阐明。详细的分析已经表明CG基序必须是在某一序列背景下，且这些序列在细菌DNA中是常见的，但在脊椎动物DNA中罕见。所述免疫激活序列通常是：嘌呤、嘌呤、C、G、嘧啶、嘧啶；其中所述二核苷酸CG基序不是甲基化的，但已知其它未甲基化CpG序列具有免疫激活性，且可以用于本发明的某些实施方案中。当CpG配制于疫苗中时，它可以在游离的溶液中与游离的抗原(WO 96/02555；McCluskie and Davis，见上述)一起给药，或与抗原共价偶联(PCT公布号WO 98/16247)，或者与诸如氢氧化铝的载体配制(例如，Davis et al.见上述，Brazolot-Millan et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1998，95(26)，
15553-8)。

[0177] 用于本发明的佐剂或疫苗的优选寡核苷酸优选包含由至少三个、更优选至少6个或多个核苷酸分开的两个或多个二核苷酸CpG基序。本发明的寡核苷酸通常是脱氧核苷酸。在优选的实施方案中，寡核苷酸中的核苷酸间是二硫代磷酸酯或更优选硫代磷酸键，尽管磷酸二酯和其它的核苷酸间键都在包括带有混合核苷酸间键合的寡核苷酸的本发明的范围内。在U.S.Pat.Nos.5,666,153，5,278,302和WO95/26204中描述了产生硫代磷酸寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法。

[0178] 优选的寡核苷酸的实例具有在下述公开文献中公开的序列；对于某些本文公开的实施方案，所述序列优选含有硫代磷酸修饰的核苷酸间键合：

[0179] CPG 7909：Cooper et al.， ″ CPG 7909 adjuvant improves hepatitis B virus vaccine seroprotection in antiretroviral-treated HIV-infected adults.(CPG 7909佐剂在抗逆转录病毒治疗的HIV感染的成年人中改善乙型肝炎病毒疫苗的血清保护).″AIDS，2005Sep 23；19(14)：1473-9。

[0180] CpG 10101：Bayes et al.，″Gateways to clinical trials(临床试验途径).″Methods Find.Exp.Clin.Pharmacol.2005 Apr；27(3)：193-219。

[0181] Vollmer J.，″Progress in drug development of immunostimula-tory CpG oligodeoxynucleotide ligands for TLR9(TLR9的免疫激活性CpG寡聚脱氧核苷酸配体的药物开发进展).″Expert Opinion on Biological Therapy.2005May；5(5)：673-682。

[0182] 可选择的CpG寡核苷酸可以包括上文引用的公开文献中描述的优选序列变体，其不同在于具有无意义(inconsequential)的核苷酸序列置换、插入、删除和/或添加。本发明的某些实施方案中使用的CpG寡核苷可以通过本领域已知的任何方法合成(例如EP468520)。可以利用自动合成仪方便地合成这些寡核苷酸。所述寡核苷酸通常是脱氧核苷酸。在优选的实施方案中，寡核苷酸中的核苷酸间键是二硫代磷酸酯，或更优选地是硫代磷酸键，尽管磷酸二酯也在本发明涉及的实施方案范围内。也涉及包含不同核苷酸间键合的寡核苷酸，例如，混合的硫代磷酸磷酸二酯。也可以使用稳定寡核苷酸的其它核苷酸间键。

[0183] 辅佐剂

[0184] 本文提供的某些实施方案包括疫苗组合物和免疫佐剂组合物，包括药物组合物，所述组合物除了GLA，含有至少一种辅佐剂，该辅佐剂指这种组合物中具有不同于GLA的佐剂活性的组分。具有所述佐剂活性的辅佐剂包括一种成份，其在给予诸如人类(例如人类患者)、非人类的灵长类、哺乳动物或具有公认的免疫系统的另一种高等真核生物体的个体时能够改变(即，以统计学上显著的方式增加或降低；以及在某些优选的实施方案中，增强或增加)免疫应答的能力和寿命。(参见，例如，Powell and Newman，″Vaccine design-The Subunit and Adjuvant Approach(疫苗设计-亚单位和佐剂方法)″，1995，Plenum Press，New York)。在本文公开的某些实施方案中，GLA和期望的抗原，以及任选地一种或多种辅佐剂可以因此改变，例如引发或增强针对期望的抗原的免疫应答，所述抗原可以与GLA同时给药，或者可以在时间和/或空间上(例如，在不同的解剖学部位)分开给药。但某些发明实施方案并不限制于此，还涉及在不包括指定抗原的组合物中的GLA的给药，但所述组合物还可以包括一种或多种TLR激动剂、辅佐剂、咪唑并喹啉免疫应答调节剂以及双茎环免疫调节剂(dSLIM)。

[0185] 因此如上所述，辅佐剂包括除了GLA之外具有佐剂作用的成分，诸如皂苷和皂苷类似物，包括QS21和QS21类似物(参见，例如，U.S.Pat.No.5,057,540；EP 0 362 279 B1；WO 95/17210)、明矾、诸如番茄素的植物碱、诸如(但不限于)皂苷、聚山梨醇酯80、司盘85和硬脂酰酪氨酸的去垢剂、一种或多种细胞因子(例如，GM-CSF，IL-2，IL-7，IL-12，TNF-α，IFN-γ)、咪唑并喹啉免疫应答调节剂以及双茎环免疫调节剂(dSLIM，例如，Weeratna et al.，2005 Vaccine 23：5263)。

[0186] 在 例 如 美 国 专 利 6,544,518，Lacaille-Dubois，M and Wagner H.(1996 Phytomedicine 2：363-386)，美国专利第5,057,540号，Kensil，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst，1996，12(1-2)：1-55和EP 0 362 279 B1中讲述了包括皂苷的去垢剂。包含Quil A部分(皂苷)的称为免疫激活复合物(ISCOMS)的微粒结构是溶血的，且已经用于疫苗的制备中(Morein，B.，EP 0 109 942 B1)。据报道，这些结构具有佐剂活性(EP 0109 942 B1；WO 96/11711)。这些溶血皂苷QS21和QS17(Quil A的HPLC纯化部分)已经作为有效的系统佐剂被描述，且在U.S.Pat.No.5,057,540和EP 0 362 279 B1中公开了它们的制备方法。这些参考文献中也描述了QS7(Quil-A的非溶血部分)作为系统疫苗的有效佐剂的用途。在Kensil et al.(1991.J.Immunology 146：431-437)中还描述了QS21的用途。QS21和聚山梨醇酯或环式糊精的组合也是已知的(WO 99/10008)。在WO 96/33739和WO 96/11711中描述了包含诸如QS21和QS7的QuilA部分的微粒佐剂系统。已经用于系统接种疫苗研究的其它皂苷包括来自诸如丝石竹属(Gypsophila)和肥皂草属(Saponaria)的其它植物品种的那些(Bomford et al.，Vaccine，10(9)：572-577，1992)。

[0187] 七叶树皂角素(Escin)是与用于本文公开的实施方案的佐剂组合物中的皂苷有关的另一种去垢剂。七叶树皂角素在默克索引(第12版：第3737条目)中被描述为皂苷的混合物，存在于马栗树(horse chestnut tree)，欧洲七叶树(Aesculus hippocastanum)的籽中。描述了它通过层析和纯化(Fiedler，Arzneimittel-Forsch.4，213(1953))，以及通过离子交换树脂(Erbring et al.，U.S.Pat.No.3,238,190)的分离。七叶树皂角素部分(也称为七叶皂甙)已经被纯化并已显示出具有生物学活性(Yoshikawa M，et al.(Chem Pharm Bull(Tokyo)1996August；44(8)：1454-1464))。毛地黄皂苷是另一种去垢剂，也在默克索引(第12版，第3204条目)中被描述为皂苷，其来自毛地黄(Digitalis purpurea)的籽，并依照Gisvold et al.，J.Am.Pharm.Assoc，1934，23，664和Rubenstroth-Bauer，Physiol.Chem.，1955，301，621描述的方法被纯化。

[0188] 用于本文公开的某些实施方案中的其它辅佐剂包括嵌段共聚物或生物可降解聚合物，其涉及本领域相关技术人员熟悉的一类聚合化合物。可以包括在GLA疫苗组合物内或GLA免疫佐剂内的嵌段共聚物或生物可降解聚合物的实例包括普流罗尼克 L121(BASF Corp.，Mount Olive，NJ；参见，例如，Yeh et al.，1996Pharm.Res.13：1693；美国专利第5,565,209号)、CRL 1005(例如，Triozzi et al.，1997 Clin Canc.Res.3：2355)、聚(乳酸-乙醇酸共聚物)(PLGA)、聚(乳酸)(PLA)、聚-(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)、以及聚肌胞。(参见，例如，Powell and Newman，″Vaccine design-The Subunit and Adjuvant Approach(疫苗设计-亚单位和佐剂方法)″，1995，Plenum Press，New York)

[0189] 某些实施方案涉及包括油的GLA疫苗和GLA免疫佐剂，所述油在某些此类实施方案中可以促进辅佐剂活性，在其它的此类实施方案中可以附加地或选择地提供药学上可接受的载体或赋形剂。已知许多合适的油，基于本发明公开内容其可以被选择包含在疫苗组合物和免疫佐剂组合物中。举例来说，此类油的实例包括但不限于角鲨烯、角鲨烷、矿物油、橄榄油、胆固醇和二缩甘露醇单油酸酯。

[0190] 诸如咪唑并喹啉免疫应答调节剂的免疫应答调节剂在本领域也是已知的，并可以作为辅佐剂包括在本发明公开的某些实施方案中。某些优选的咪唑并喹啉免疫应答调节剂包括(作为非限定性实例)雷西莫特(R848)、咪喹莫特和嘎德莫特(Hemmi et al.，2002Nat.Immunol.3：196；Gibson et al.，2002 Cell.Immunol.218：74；Gorden et al.，
2005 J.Immunol.174：1259)；这些和其它的咪唑并喹啉免疫应答调节剂在适当的条件下，也可以具有本文描述的TLR激动剂活性。其它的免疫应答调节剂是基于核酸的双茎环免疫调节剂(dSLIM)。可以在Schmidt et al.，2006 Allergy 61：56；Weihrauch et al.2005Clin Cancer Res.11(16)：5993-6001；Modern Biopharmaceuticals，J. (Editor).John Wiley & Sons，December 6，2005.(183至约200页讨论了
dSLIM)中，以及从Mologen AG(Berlin，FRG：[2006年8月18日在http://www.mologen.com/English/04.20-dSLIM.shtml的在线检索]中发现被涉及用于本发明公开的某些实施方案中的dSLIM的具体实例。

[0191] 如上文所述，与本文所述的GLA一起使用的一种辅佐剂可以是铝辅佐剂，其通常被称为“明矾”。明矾辅佐剂基于下述：羟基氧化铝、磷酸羟铝，或各种专利盐(proprietary salts)。使用明矾辅佐剂的疫苗可以包括用于破伤风菌株、HPV、甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒的疫苗以及本文描述的其它抗原。铝辅佐剂是有优势的，因为它们具有良好的安全记录、能放大抗体应答、稳定抗原并且用于大规模生产相对简单。(Edelman 2002 Mol.Biotechnol.21：129-148；Edelman，R.1980 Rev.Infect.Dis.2：370-383.)

[0192] 可以与GLA结合用于有效的免疫刺激的其它辅佐剂包括皂苷和皂苷类似物，包括QS21以及在本文被称为QS21类似物的产生相似作用的结构相关化合物。QS21已经被公认为是优选的辅佐剂。QS21可以包含来自智利皂荚树(Quillaja Saponaria Molina)的树皮、经HPLC纯化的非毒性部分。在U.S.Pat.No.5,057,540中公开了QS21的制备。(还可参见美国专利第6,936,255，7,029,678和6,932,972号)

[0193] 在某些实施方案中，GLA也可以与被称为ISCOMS的“免疫激活复合物”(例如美国专利第6,869,607，6,846,489，6,027,732，4,981,684号)结合，包括皂苷来源的ISCOMATRIX ，其可以从例如Iscotec(Stockholm，Sweden)和CSL Ltd.(Parkville，Victoria，Australia)商购。

[0194] 在仍然另一实施方案中，佐剂/递送系统可以与GLA组合使用，所述GLA是包含诸如带正电的聚阳离子脂质的脂质组装(脂质体和其他制剂)。示例性地，这类系统可包括合成的生物相容性的聚阳离子鞘脂(例如，氘代-赤式-N-棕榈酰鞘胺醇-1-0-氨基甲酰-精胺；也被称为CCS；可购自NasVax Ltd.)或除所述CCS脂质之外还可以包含胆固醇(C)(被称为CCS/C或Vaxisome ；可购自NasVax Ltd.)。例如，可以通过将CCS或CCS/C的干粉与疫苗蛋白或多核苷酸(抗原)在诸如水性悬浮液中混合来形成疫苗脂质体制剂。然后，例如，可以将装载抗原的脂质体喷雾入鼻(i.n.)或肌内注射(i.m.)或皮下注射(s.c.)。

[0195] 在另一实施方案中，被称为类脂质体的由单层或多层囊泡组成的囊泡佐剂/递送系统可以与GLA组合使用。在该情况下，通常将水性溶液封装入由非离子表面活性剂制成的、具有或不具有胆固醇和双十六烷基磷酸酯的、高度有序的双分子层，并且在体内表现出与脂质体相似的行为。双分子层囊泡结构是表面活性剂单体的疏水尾部与亲水头部基团的组装，所述疏水尾部与位于中心的水性空间隔开，所述亲水头部基团与所述水性空间接触。添加胆固醇导致有序脂相的形成，这给予双分子层刚性，并产生有较少漏隙的类脂质体。已知双十六烷基磷酸酯能增加囊泡的尺寸，向囊泡提供电荷并且因此表现出增加的捕获效率。其他电荷诱导物是硬脂酰胺和甘油二酯，其也有助于囊泡的静电稳定性。

[0196] 类脂质体比脂质体具有独特的优势。类脂质体是相当稳定的结构，即使在乳化形式。它们不需要诸如用于保护或贮存的低温或惰性气体的特殊条件并且是化学上稳定的。材料的相对低成本使其适合于工业生产。多种非离子表面活性剂已被用于制备囊泡，例如聚甘油烷基醚、葡糖基二烷基醚、冠醚、酯连接的表面活性剂、聚氧乙烯烷基醚、Brij、以及各种司盘和吐温。

[0197] 类似于脂质体，有三种主要类型的类脂质体—多层囊泡(MLV，尺寸＞0.05μm)、小单层囊泡(SUV，尺寸为0.025-0.05μm)和大单层囊泡(LUV，尺寸＞0.10μm)。MLV囊泡表现出增加的捕获体积和平衡溶质分布，并且通常需要摇瓶法(hand-shaking method)。它们表现出脂质成分中的不同。通常通过声波处理和弗氏压碎器(French Press)工艺产生SUV。超声电毛细管乳化或溶剂稀释技术也可以用于制备SUV。将溶解于有机溶剂的脂质注射入水性缓冲液可以导致LUV的自发形成。制备LUV的另一方法是反相蒸发或通过去垢剂增溶法。

[0198] 重组表达构建体

[0199] 依照本文公开的某些实施方案，GLA疫苗组合物可以含有至少一种重组表达构建体，其包含可操作连接于编码抗原的核酸序列的启动子。在某些另外的实施方案中，所述重组表达构建体存在于诸如腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、慢病毒、α病毒、痘病毒或逆转录病毒载体、基于细菌的载体和基于酵母的载体的病毒载体中。制备和使用这些表达构建体和载体的组合物和方法是本领域已知的，例如依照Ausubel et al.(Eds.)，Current Protocols in Molecular Biology(新编分子生物学实验指南)，2006 John Wiley & Sons，NY，用于本文提供的多肽抗原的表达。通常可以在例如美国专利第6,844,192、7,037,712、7,052,904、7,001,770、6,106,824、5,693,531、6,613,892、6,875,610、7,067,310、
6,218,186、6,783,981、7,052,904、6,783,981、6,734,172、6,713,068、5,795,577 和
6,770,445号以及别处找到用于某些本发明公开的实施方案中的重组表达构建体的非限定性实例，以及适用于本文提供的多肽抗原表达的教导。

[0200] 免疫应答

[0201] 本发明因此提供了在能够启动免疫应答的宿主内改变(即，例如，相对于本领域的技术人员熟悉的适当对照，以统计学上显著的方式增强或降低)免疫应答的组合物。正如本领域的普通技术人员已知的，免疫应答可以是宿主免疫状态的任何积极的改变，其可以包括参与宿主免疫状态的维持和/或调节的一种或多种组织、器官、细胞或分子的结构或功能的任何改变。通常，可以通过多种公知的参数的任一种检测免疫应答，这些参数包括但不限于体内或体外的下述检测：可溶性免疫球蛋白或抗体的检测；诸如细胞因子、淋巴因子、趋化因子、激素、生长因子等可溶性介质以及其它可溶性小肽、碳水化合物、核苷和/或脂质介质的检测；由免疫系统中细胞改变的功能或结构特性确定的细胞激活状态的变化，例如细胞增殖、改变的运动性、诸如特异性基因表达或溶细胞行为的专门活性诱导；通过免疫系统的细胞的细胞分化，包括改变的表面抗原表达谱或凋亡的启动(程序性细胞死亡)；或者任何其它可以检测免疫应答存在的标准。

[0202] 免疫应答通常被认为是，例如，通过宿主免疫系统的细胞和组织在分子和细胞水平上区分自身结构和异已结构，但本发明不应局限于此。例如，免疫应答还可以包括由自身分子、细胞或组织的免疫识别导致的免疫系统状态变化，这可以伴随诸如免疫系统组分的典型调节的许多正常状态，或者可以存在于诸如在自身免疫和退行性疾病中观测到的不适当的自身免疫应答的病理状态。作为另一个实例，除了诱导特定免疫系统活性的上调(诸如抗体和/或细胞因子产生，或者细胞介导的免疫激活)外，免疫应答还可以包括可检测的免疫的抑制、消弱或任何其它的下调，这可以是由选择的抗原、抗原给药途径、特异耐受诱导或其它因素导致的。

[0203] 可以通过本领域的普通技术人员易于熟悉的许多公知的免疫学测定的任一种来建立由本发明的疫苗诱导的免疫应答的检测。这些测定包括，但不必限于体内或体外的下述检测：可溶性抗体的检测；诸如细胞因子、淋巴因子、趋化因子、激素、生长因子等可溶性介质以及其它可溶性小肽、碳水化合物、核苷和/或脂质介质的检测；由免疫系统中细胞改变的功能或结构特性来确定的细胞激活状态的变化，例如细胞增殖、改变的运动性、诸如特异性基因表达或溶细胞行为的专门活性诱导；通过免疫系统的细胞的细胞分化，包括改变的表面抗原表达谱或凋亡的启动(程序性细胞死亡)。进行这些和类似测定的操作步骤是公知的，并且可以在例如Lefkovits(Immunology Methods Manual：The Comprehensive Sourcebook of Techniques(免疫学方法手册：全面的技术读物资料)，1998；也可参见Current Protocols in Immunology(免疫学实验指南)；还可参见，例如，Weir，Handbook of Experimental Immunology(实验免疫学手册)，1986 Blackwell Scientific，Boston，MA；Mishell and Shigii(eds.)Selected Methods in Cellular Immunology(细胞免疫学方法精选)，1979 Freeman Publishing，San Francisco，CA；Green and Reed，1998 Science281：1309和其中引用的参考文件)中找到。

[0204] 抗原反应性T细胞增殖的检测可以通过多种已知的技术实现。例如，T细胞增殖可以通过测量DNA合成的速率来检测，且抗原特异性可以通过控制暴露于候选的抗原反应性T细胞的刺激物(诸如，例如，特异性期望的抗原-脉冲抗原提呈细胞或对照抗原-脉冲抗原提呈细胞)来测定。被刺激增殖的T细胞显示了增加的DNA合成速率。测量DNA合成速率的经典方式是，例如，通过用含氚的胸腺嘧啶脉冲标记T细胞培养物，所述含氚的胸腺嘧啶是掺入新合成的DNA的核苷前体。掺入的含氚胸腺嘧啶的量可以用液体闪烁谱仪来测2+
定。检测T细胞增殖的其它方式包括测量白介素-2(IL-2)产生的增加、Ca 流出或染料摄取，诸如3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-联苯-四唑。可选择地，可以测量淋巴因子(诸如干扰素-γ)的合成，或者可以定量应答特定抗原的T细胞的相对数目。

[0205] 例如，可以通过采用诸如放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、平衡透析或包括Western印迹的固相免疫印迹的体外方法学，测定来自用本发明的疫苗处理的宿主的样本(例如，包含免疫球蛋白的样本，诸如血清、血浆或血液)来检测抗原特异性抗体的产生。在优选的实施方案中，ELISA测定还可以包括用靶抗原特异性的固相单克隆抗体进行靶抗原的抗原捕获固定，例如，以增加该测定的敏感性。例如，使用商业途径容易得到的方法、装置和试剂(例如Sigma，St.Louis，MO；还参见R&D Systems 2006 Catalog，R&D Systems，Minneapolis，MN)，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)也可以容易地检测可溶性介质(例如，细胞因子、趋化因子、淋巴因子、前列腺等)的详细结果。

[0206] 许多其它的免疫学参数可以使用本领域公知的常规测定来监测。这些可以包括，例如，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)测定、继发性体外抗体应答、利用已确立的标志物抗原系统进行各种外周血细胞或淋巴样单核细胞亚群的流式免疫细胞荧光测定分析、免疫组织化学或其它相关的测定。例如，可以在Rose et al.(Eds.)，Manual thof Clinical Laboratory Immunology，5 Ed.(临床实验室免疫学手册，第5版)，1997 American Society of Microbiology，Washington，DC中找到这些和其它测定。

[0207] 因此，本发明涉及本文提供的疫苗和佐剂组合物能够引发或增强宿主的至少一种免疫应答，所述免疫应答选自TH1-型T淋巴细胞应答、TH2-型T淋巴细胞应答、细胞毒T淋巴细胞(CTL)应答、抗体应答、细胞因子应答、淋巴因子应答、趋化因子应答以及炎症应答。在某些实施方案中，免疫应答可以包含下述中的至少一种：一种或多种细胞因子的产生，其中所述细胞因子选自干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；一种或多种白介素的产生，其中所述白介素选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-16、IL-18和IL-23；一种或多种趋化因子的产生，其中所述趋化因子选自MIP-1α、MIP-1β、RANTES、CCL4和CCL5；以及选自记忆性T细胞应答、记忆性B细胞应答、效应T细胞应答、细胞毒T细胞应答以及效应B细胞应答的淋巴细胞应答。参见，例如WO94/00153；WO 95/17209；WO 96/02555；U.S.6,692,752；U.S.7,084,256；U.S.6,977,073；
U.S.6,749,856；U.S.6,733,763；U.S.6,797,276；U.S.6,752,995；U.S.6,057,427；
U.S.6,472,515；U.S.6,309,847；U.S.6,969,704；U.S.6,120,769；U.S.5,993,800；
U.S.5,595,888；Smith et al.，1987 J Biol Chem.262：6951；Kriegler et al.，1988 Cell 53：4553；Beutler et al.，1986Nature 320：584；U.S.6,991,791；U.S.6,654,462；
U.S.6,375,944。

[0208] 药物组合物

[0209] 药物组合物通常包含GLA(可从Avanti Polar Lipids，Inc.，Alabaster，AL购买；产品号699800)，且还可以包含本文提供的与药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂结合的一种或多种组分，其选自抗原、TLR激动剂、辅佐剂(任选地包括细胞因子、咪唑并喹啉免疫应答调节剂和/或dSLIM)和/或重组表达构建体。

[0210] 因此，在某些方面，本发明涉及GLA“单治疗”，其中如本文所述的，GLA被配制于基本上没有其它抗原的组合物中，并被给予个体以激活免疫应答，例如非特异性免疫应答，由此治疗或预防疾病或其它状态，例如用于治疗生物体导致的感染，用于治疗季节性鼻炎等。在一个实施方案中，例如，本发明的组合物和方法采用了单磷酰二糖用于激活个体的免疫应答。在另一特定实施方案中，所述组合物和方法使用脂质A的2-单酰形式来激活个体的免疫应答。在另一特定实施方案中，GLA采用了喷雾形式，任选地以试剂盒的形式提供。

[0211] GLA可以优选配制于稳定的乳剂中。在一个特定的实施方案中，例如，提供了在基本上没有其它抗原的稳定乳剂中包含脂质A衍生物的组合物。在另一个特定的实施方案中，提供了适用于哺乳动物的包含3-酰基单磷酸脂质A的衍生物的组合物，其中2位氨基具有单酰链，且该组合物基本上没有其它抗原。

[0212] 在某些其它实施方案中，药物组合物是包含GLA和抗原的疫苗组合物，另外还可以包含本文提供的与药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂结合的一种或多种组分，其选自TLR激动剂、辅佐剂(包括例如细胞因子、咪唑并喹啉免疫应答调节剂和/或dSLIM)等和/或重组表达构建体。

[0213] 示例性的载体在使用的剂量和浓度对受者无毒。对于基于GLA加核酸的疫苗，或者对于包含GLA和抗原的疫苗，每千克体重给予约0.01μg至约100mg，通常是通过皮内、皮下、肌肉内或静脉内途径或通过其它途径给予。

[0214] 优选的剂量是约1μg/kg至约1mg/kg，特别优选的是约5μg/kg至约200μg/kg。对本领域的技术人员显而易见的是，给药的数量和频率依赖于宿主的应答。用于治疗用途的“药学上可接受的载体”是药学领域公知的，且在例如Remingtons Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)中被描述。例如，可以使用生理学pH的无菌盐水和磷酸缓冲盐。防腐剂、稳定剂、染料以及甚至调味剂都可以提供在药物组合物中。例如，苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯可以作为防腐剂加入。同上在1449。此外，可以使用抗氧化剂和悬浮剂。同上。

[0215] “药学上可接受的盐”指本发明的化合物的盐，其来自所述化合物和有机酸或无机酸(酸加成盐)或者有机或无机碱(碱加成盐)的合并物。本发明的组合物可以以游离碱或盐的形式使用，两种形式都被认为是在本发明的范围内。

[0216] 药物组合物可以是允许该组合物给予患者的任何形式。例如，所述组合物可以是固体、液体或气体(气溶胶)的形式。给药的典型途径包括，但不限于，口部的、表面的、肠胃外的(例如舌下的或经颊的)、舌下的、直肠的、阴道的以及鼻内的(例如作为喷雾剂)。本文使用的术语肠胃外的包括电离子导入(例如U.S.7,033,598、7,018,345、6,970,739)、超 声 波 导 入 ( 例 如，U.S.4,780,212、4,767,402、4,948,587、5,618,275、5,656,016、
5,722,397、6,322,532、6,018,678)、热 的(例如U.S.5,885,211、6,685,699)、被动 透皮 ( 例 如 U.S.3,598,122、3,598,123、4,286,592、4,314,557、4,379,454、4,568,343、
5,464,387、UK Pat.Spec.No.2232892、U.S.6,871,477、6,974,588、6,676,961)、微针(例如U.S.6,908,453、5,457,041、5,591,139、6,033,928)给药，且还包括皮下注射、静脉内、肌肉内、胸骨内、海绵窦内(intracavernous)、鞘内(intrathecal)、外耳道内(intrameatal)、尿道内注射或输注方法。在特定的实施方案中，本文描述的组合物(包括疫苗和药物组合物)通过选自电离子导入、微气穴(microcavitation)、超声波导入或微针的技术皮内给药。

[0217] 如此配制药物组合物以使在将该组合物给予患者时，包含其中的活性成分是生物可利用的。给予患者的组合物采用一个或多个剂量单位的形式，其中，例如，药片可以是单一剂量单位，以气溶胶形式的本发明的一种或多种化合物的容器可以有多个剂量单位。

[0218] 对于口服给药，可以存在赋形剂和/或粘结剂。实例是蔗糖、高岭土、淀粉糊精、藻酸钠、羧甲基纤维素和乙基纤维素。着色剂和/或调味剂可以存在。可以使用涂层。

[0219] 组合物可以是液体形式，例如酏剂、糖浆、溶液、乳剂或悬浮剂。作为两个实例，所述液体可以口服给药或通过注射递送。当意欲口服给药时，优选的组合物包含甜味剂、防腐剂、染色/着色剂以及增味剂的一种或多种。在意欲通过注射给药的组合物中，可以包括表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲液、稳定剂和等渗剂的一种或多种。

[0220] 本文使用的液体药物组合物药物组合物，无论是以溶液、悬浮液的形式或其它相似的形式，都可以包括下述载体或赋形剂的一种或多种：诸如注射水、盐水溶液、优选生理盐水、林格液、等渗氯化钠的无菌稀释液，诸如角鲨烯、角鲨烷、矿物油、二缩甘露醇单油酸酯、胆固醇和/或合成的单和二甘油酯的可以作为溶剂或悬浮介质的不挥发性油，聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其它溶剂；诸如苯甲醇或尼泊金甲酯的抗菌剂；诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠的抗氧化剂；诸如乙二胺四乙酸的螯合剂；诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐的缓冲液以及诸如氯化钠或葡萄糖的张力调节剂。肠胃外制剂可以装入安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多次剂量瓶内。可注射的药物组合物优选是无菌的。

[0221] 在特别的实施方案中，本发明的药物或疫苗组合物包含小于0.2um的稳定水悬浮液，且进一步包含选自磷脂、脂肪酸、表面活性剂、去垢剂、皂苷、含氟脂(fluorodated lipids)等的至少一种组分。

[0222] 在另一个实施方案中，本发明的组合物以可以雾化的方式配制。

[0223] 在疫苗或药物组合物中包括诸如递送载体的其它组分也可以是理想的，所述递送载体包括但不限于铝盐、油包水型乳剂、生物可降解油载体、水包油型乳剂、生物可降解微胶囊以及脂质体。在上文也描述了用于所述载体中的另外免疫激活物质(辅佐剂)的实例，其可以包括N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸-D-异谷酰胺(MDP)、葡聚糖、IL-12、GM-CSF、γ干扰素和IL-12。

[0224] 尽管本发明的药物组合物可以使用本领域的技术人员已知的任何合适的载体，但载体的类型依赖给药方式和是否需要持续释放而变化。对于肠胃外给药，诸如皮下注射，载体优选包含水、盐水、乙醇、脂肪、蜡或缓冲液。对于口服给药，可以使用上述载体的任一种或固体载体，诸如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。也可以使用生物可降解的微球体(例如聚乳交酯(polylactic galactide))作为本发明的药物组合物的载体。例如在美国专利第4,897,268和5,075,109号中公开了合适的生物可降解的微球体。在这点上，大于约25微米的微球体是优选的。

[0225] 药物组合物(包括GLA疫苗和GLA免疫佐剂)也可以含有诸如缓冲液的稀释液，诸如抗坏血酸的抗氧化剂、低分子量(少于约10个残基)的多肽、蛋白质、氨基酸、包括葡萄糖、蔗糖或糊精的碳水化合物，诸如EDTA的螯合剂，谷胱甘肽和其它稳定剂和赋形剂。中性缓冲盐水或与非特异性血清白蛋白混合的盐水是示例性的适当的稀释液。优选地，使用适当的赋形剂溶液(例如，蔗糖)作为稀释液可以将产品配制成冷冻干产物。

[0226] 如上文所述，在某些实施方案中，本发明包括能够递送编码期望的抗原的核酸分子的组合物。这种组合物包括重组病毒载体(例如，逆转录病毒(参见WO 90/07936，WO 91/02805，WO 93/25234，WO 93/25698 和WO 94/03622)、腺病毒(参见Berkner，Biotechniques 6：616-627，1988；Li et al.，Hum.Gene Ther.4：403-409，1993；Vincent et al.，Nat.Genet.5：130-134，1993；和 Kolls et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：215-219，1994)，痘病毒(参见美国专利第4,769,330号；美国专利第5,017,487号；和WO
89/01973))、诸如辛德毕斯病毒、马脑炎病毒(VEE)、SFV的α病毒，络合到聚阳离子分子的重组表达构建体核酸分子(参见WO 93/03709)，以及与脂质体结合的核酸(参见Wang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7851，1987)。在某些实施方案中，DNA可以连接到杀死的或灭活的腺病毒(参见Curiel et al.，Hum.Gene Ther.3：147-154，1992；Cotton et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6094，1992)。其它合适的组合物包括DNA-配体(参见Wu et al.，J.Biol.Chem.264：16985-16987，1989)和脂质-DNA组合物(参见Felgner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-7417，1989)。

[0227] 除了直接的体内操作，也可以采用间接体内(离体)操作，其中将细胞从宿主取出，修饰并置入相同的宿主动物或另外的宿主动物。显然，本领域技术人员可以利用上述组合物的任一种将编码抗原的核酸分子导入间接体内环境中的组织细胞。用于病毒的、物理的和化学的摄取方法的操作是本领域公知的。

[0228] 在本发明的某些实施方案中，本发明的佐剂组合物可被用于活化和扩增T细胞的离体操作。在一个实施方案中，本发明的佐剂组合物被用于活化和扩增抗原特异性的T细胞的离体操作并可以与本文所述的任何抗原组合使用。在另一实施方案中，如本文进一步所述，所述佐剂组合物被用于活化和扩增多克隆T细胞的离体操作。

[0229] 例如，可以使用可商购的细胞分离系统，例如使用可购自Nexell Therapeutics，Inc.的IsolexTM系统(Irvine，CA；也可参见美国专利第5,240,856号；美国专利第5,215,926号；WO 89/06280；WO 91/16116和WO 92/07243)从患者的骨髓、外周血、或骨髓或外周血的组分中分离T细胞。可选择地，T细胞可以来自相关或不相关的人、非人哺乳动物、细胞系或培养物。

[0230] 可以在本文所述的佐剂组合物的存在下，用多肽抗原、编码多肽抗原的多核苷酸和/或表达这样的抗原的抗原提呈细胞(APC)刺激T细胞。在足以产生对目的多肽/抗原特异性的T细胞的条件和持续时间下进行该刺激。示例性的方法对于本领域技术人员是已知的并描述于，例如，Current Protocols in Immunology(免疫学实验指南)，由 John E.Coligan，Ada M.Kruisbeek，David H.Margulies，Ethan M.Shevach，Warren Strober编辑(2001 John Wiley & Sons，NY，NY)；Science.1992 Jul 10；257(5067)：166；J.Immunology，146：2795-2804，1991。在某些实施方案中，目的多肽/抗原或编码所述目的多肽/抗原的多核苷酸存在于诸如微球的递送囊泡中，以促进特异性T细胞的产生。

[0231] 如果T细胞特异性地增殖、分泌细胞因子或杀死被抗原包被的或表达编码抗原的多核苷酸的靶细胞，则认为T细胞对所述抗原是特异性的。可以使用多种标准技术中的任何一种评估T细胞特异性。例如，在铬释放检测或增殖检测中，与阴性对照相比，细胞溶解和/或增殖的大于两倍增加的刺激指数指示T细胞特异性。例如，可以按照Chen et al.，Cancer Res.54：1065-1070，1994.所描述的进行这类检测。可选择地，可以通过多种已知的技术实现T细胞增殖的检测。例如，可以通过检测DNA合成速率的增加(例如，通过用氚标记的胸苷对T细胞培养物进行脉冲标记并检测并入DNA的氚标记的胸苷的量)来检测T细胞增殖。与目的特定抗原(100ng/ml-100μg/ml，或在其他实施方案中，200ng/ml-25μg/ml)接触3-7天通常会导致T细胞增殖至少2倍的增加。按照使用标准细胞因子检测所测定的，如上文所述接触2-3小时应当会导致T细胞的活化，在所述检测中细胞因子释放(例如，TNF或IFN-γ)水平增加两倍指示T细胞活化(参见，Coligan et al.，Current Protocols inImmunology(免疫 学实验 指南)，vol.1，Wiley Interscience(Greene1998))。响应于抗原、多核苷酸或表达抗原的APC而被活化的T细胞可以是CD4+和/或CD8+。可以使用标准技术、在伴有或不伴有本发明的佐剂组合物的情况下进一步扩增抗原特异性T细胞。在某些实施方案中，T细胞来自患者、相关供体或不相关供体，并且在进行刺激和扩增之后被给予患者。

[0232] 对于治疗目的，可以在体内或体外在数量上进一步扩增响应于抗原、多核苷酸或APC而增殖的CD4+或CD8+细胞。可以通过多种方法完成这类T细胞的体外增殖。例如，可以在添加或不添加诸如白介素-2的T细胞生长因子的情况下，将所述T细胞再暴露于抗原，和/或在添加或不添加本文所述的佐剂组合物的情况下，将所述T细胞再暴露于合成所述抗原的刺激细胞。可选择的，在抗原的存在下增殖的一种或多种T细胞可以在首先被克隆之后再进行扩增。克隆细胞的方法公知于领域内，并且包括有限稀释法。在某些实施方案中，可以使用人工抗原提呈细胞扩增抗原特异性T细胞，所述人工抗原提呈细胞例如包含抗CD3和抗CD28抗体的珠，其中抗CD3和抗CD28抗体连接在珠上，所述的珠例如美国专利第6,905,874号、第6,867,041号、第6,352,694号中描述的那些；或基于细胞的人工APC，例如美国公开专利申请第2004/0101519号和第2006/0034810号描述的那些。在某些实施方案中，T细胞的多克隆扩增可能是所希望的。在这点上，本发明的佐剂组合物可以与这些人工APC系统一起使用而不添加抗原以活化和扩增多克隆T细胞群体。

[0233] 在某些实施方案中，本发明的佐剂可用于活化抗原提呈细胞的方法中，例如美国专利第5,976,546号；第6,080,409号；第6,210,662号；美国公开专利申请第20040161413号描述的那些方法，其中使用免疫刺激性多肽复合物活化抗原提呈细胞，然后将其用于体内或离体活化T细胞，所述免疫刺激性多肽复合物通过将树突状细胞结合蛋白和多肽抗原连接在一起来构建。在这点上，本发明的佐剂组合物可被用于活化抗原提呈细胞的离体方法并且也可以与活化的抗原提呈细胞一起配制用于体内给药以诱导体内抗原特异性T细胞应答。

[0234] 在这点上，使用免疫刺激性多肽复合物(例如，与树突状细胞结合蛋白GM-CSF融合的抗原(例如，PAP或本文所述的其他抗原))使得可以将外源添加的蛋白引入到成熟树突状细胞的I类途径。可以通过以下体外实现这类诱导：分离诸如树突状细胞的APC，将它们与多肽复合物“脉冲”或接触持续一段时间，然后使用脉冲的APC体外或体内刺激自体T细胞。本发明的佐剂可被用于体外增强APC的活化并且当体内给予时也可以提高产生对7
这些细胞的免疫应答的效果。在后一种情况下，将脉冲的APC(约10 细胞/注射)给予个体。利用本领域公知的方法，通过监测外周血单核细胞中对于抗原的细胞溶解T细胞应答，辅助T细胞应答和抗体应答的产生来检测个体的应答。

[0235] 在某些实施方案中，本发明的佐剂可被用于活化抗原提呈细胞的方法中，诸如美国专利第7,060,279号中所描述的那些方法，其中使用包含抗原和来源于HER-2蛋白细胞内结构域的序列组分的免疫刺激性融合蛋白来活化抗原提呈细胞。在某些实施方案中，示例性的融合蛋白包括，但不限于，包含与膜远侧细胞内HER-2结构域的217个氨基酸直接融合的癌抗原或本文所述的其他抗原的序列的那些融合蛋白。这类融合蛋白有效产生针对融合蛋白的抗原组分的保护性DC诱导的、T细胞介导的保护免疫应答。在这点上，本发明的佐剂组合物可被用于活化抗原提呈细胞的离体方法并且也可以与活化的抗原提呈细胞一起配制用于体内给药以诱导体内抗原特异性T细胞应答。

[0236] 术语“抗原提呈细胞”或“APC”是指能够活化T细胞的细胞，包括但不限于，某些巨噬细胞、B细胞并且最优选为树突状细胞(DC)。“强抗原提呈细胞”是在用抗原脉冲之后，可以在初次免疫应答中活化原初CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的细胞。“树突状细胞”或“DC”是发现于淋巴组织或非淋巴组织中的形态学类似的细胞类型的不同群体的成员。这些细胞特征在于它们独特的形态学和高水平的表面MHC II类表达。Steinman et al.，Ann.Rev.Immunol.9：271(1991)，通过引用将其并入本文。如本文所述，可以从多种组织来源中分离APC和DC，并且比较方便的是从外周血中分离。本发明的示例性的免疫治疗组合物利用从诊断为中度至良好分化级别的癌的癌症患者中分离的APC或DC。

[0237] 通过本领域中可容易获得的常规方法可以分离APC和DC。分离DC的示例性的合适方法公开于美国专利第5,976,546号，第6,080,409号和第6,210,662号，通过引用将这些专利中的每个并入本文。简而言之，可从外周血制备血沉棕黄层。可以从在离心管或装置中密度1.0770g/ml，pH 7.4，280mOsm/kg H2O的有机硅烷化硅胶(OCS)分离介质柱(按照Dorn在美国专利第4,927,749号中描述的进行制备，通过引用将该专利并入本文)上分层的白细胞分装(leukopacs)收集细胞。在某些实施方案中，通过使硅胶(约10-20nm直径的颗粒)的硅烷醇基团与烷基三甲氧基硅烷试剂反应并且从而封闭所述硅烷醇基团来制备OCS介质。

[0238] 在一个实施方案中，将OCS密度梯度材料在生理盐溶液中稀释至合适的特定密度，所述生理盐溶液添加了聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，诸如可购自Sigma Chemical Co.(St.Louis，Mo.)的PVP-10。将管离心并且收集存在于界面的外周血单核细胞(PBMC)。

[0239] 将PBMC再次重悬并离心以移除血小板，并且任选地通过OCS柱(密度1.0650g/ml，280mOsm/kg H2O)离心。在产生的截面收集T细胞团并通过离心用D-PBS洗涤细胞。将细胞团部分在细胞培养基中重悬并在潮湿的5％CO2培养箱中培养40小时。孵育之后，收集非贴壁的T细胞。可以通过FACS分析来定量界面部分中树突状细胞的纯度。

[0240] 可以使用光学显微镜评估细胞的形态。DC富集的部分包含大尺寸的面纱细胞，胞突从细胞表面伸出，这是DC的特征。

[0241] 因此，本发明用于增强或引发宿主、患者或细胞培养物的免疫应答。如本文使用的，术语“患者”指任何温血动物，优选人类。患者可以罹患传染性疾病、诸如乳腺癌的癌症或自身免疫疾病，或者可以是正常的(即，没有可检测的疾病和/或感染)。“细胞培养物”是含有免疫活性细胞或免疫系统的分离的细胞(包括，但不限于，T细胞、巨噬细胞、单核细胞、B细胞和树突状细胞)的任何制备物。所述细胞可以通过本领域普通技术人员公知的多种技术来分离(例如聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-hypaque)密度离心)。细胞可以(但不必须)从罹患癌症的患者中分离出，且可以重新导入治疗后的患者。

[0242] 在本发明的某些实施方案中，本发明的佐剂组合物可被用于活化和扩增T细胞的离体操作。在一个实施方案中，本发明的佐剂组合物被用于活化和扩增抗原特异性的T细胞的离体操作并可以与本文所述的任何抗原组合使用。在另一实施方案中，如本文进一步所述，所述佐剂组合物被用于活化和扩增多克隆T细胞的离体操作。

[0243] 例如，可以使用可商购的细胞分离系统，例如使用可购自Nexell Therapeutics，Inc.的IsolexTM系统(Irvine，CA；也可参见美国专利第5,240,856号；美国专利第5,215,926号；WO 89/06280；WO 91/16116和WO 92/07243)从患者的骨髓、外周血、或骨髓或外周血的组分中分离T细胞。可选择地，T细胞可以来自相关或不相关的人、非人哺乳动物、细胞系或培养物。

[0244] 可以在本文所述的佐剂组合物的存在下，用多肽抗原、编码多肽抗原的多核苷酸和/或表达这样的抗原的抗原提呈细胞(APC)刺激T细胞。在足以产生对目的多肽/抗原特异性的T细胞的条件和持续时间下进行该刺激。示例性的方法对于本领域技术人员是已知的并描述于，例如，Current Protocols in Immunology(免疫学实验指南)，由John E.Coligan，Ada M.Kruisbeek，David H.Margulies，Ethan M.Shevach，Warren Strober编辑(2001 John Wiley & Sons，NY，NY)；Science.1992Jul 10；257(5067)：166；J.Immunology，146：2795-2804，1991。在某些实施方案中，目的多肽/抗原或编码所述目的多肽/抗原的多核苷酸存在于诸如微球的递送囊泡中，以促进特异性T细胞的产生。

[0245] 如果T细胞特异性地增殖、分泌细胞因子或杀死被抗原包被的或表达编码抗原的多核苷酸的靶细胞，则认为T细胞对所述抗原是特异性的。可以使用多种标准技术中的任何一种评估T细胞特异性。例如，在铬释放检测或增殖检测中，与阴性对照相比，细胞溶解和/或增殖的大于两倍增加的刺激指数指示T细胞特异性。例如，可以按照Chen et al.，Cancer Res.54：1065-1070，1994.所描述的进行这类检测。可选择地，可以通过多种已知的技术实现T细胞增殖的检测。例如，可以通过检测DNA合成速率的增加(例如，通过用氚标记的胸苷对T细胞培养物进行脉冲标记并检测并入DNA的氚标记的胸苷的量)来检测T细胞增殖。与目的特定抗原(100ng/ml-100μg/ml，或在其他实施方案中，200ng/ml-25μg/ml)接触3-7天通常会导致T细胞增殖至少2倍的增加。按照使用标准细胞因子检测所测定的，如上文所述接触2-3小时应当会导致T细胞的活化，在所述检测中细胞因子释放(例如，TNF或IFN-γ)水平增加两倍指示T细胞活化(参见，Coligan et al.，Current Protocols in Immunology(免疫学实验指南)，vol.1，Wiley Interscience(Greene +1998))。响应于抗原、多核苷酸或表达抗原的APC而被活化的T细胞可以是CD4 和/或+
CD8。可以使用标准技术、在伴有或不伴有本发明的佐剂组合物的情况下进一步扩增抗原特异性T细胞。在某些实施方案中，T细胞来自患者、相关供体或不相关供体，并且在进行刺激和扩增之后被给予患者。

[0246] 对于治疗目的，可以在体内或体外在数量上进一步扩增响应于抗原、多核苷酸或+ +APC而增殖的CD4 或CD8 细胞。可以通过多种方法完成这类T细胞的体外增殖。例如，可以在添加或不添加诸如白介素-2的T细胞生长因子的情况下，将所述T细胞再暴露于抗原，和/或在添加或不添加本文所述的佐剂组合物的情况下，将所述T细胞再暴露于合成所述抗原的刺激细胞。可选择的，在抗原的存在下增殖的一种或多种T细胞可以在首先被克隆之后再进行扩增。克隆细胞的方法公知于领域内，并且包括有限稀释法。在某些实施方案中，可以使用人工抗原提呈细胞扩增抗原特异性T细胞，所述人工抗原提呈细胞例如包含抗CD3和抗CD28抗体的珠，其中抗CD3和抗CD28抗体连接在珠上，所述的珠例如美国专利第6,905,874号、第6,867,041号、第6,352,694号中描述的那些；或基于细胞的人工APC，例如美国公开专利申请第2004/0101519号和第2006/0034810号描述的那些。在某些实施方案中，T细胞的多克隆扩增可能是所希望的。在这点上，本发明的佐剂组合物可以与这些人工APC系统一起使用而不添加抗原以活化和扩增多克隆T细胞群体。

[0247] 在某些实施方案中，本发明的佐剂可用于活化抗原提呈细胞的方法中，例如美国专利第5,976,546号；第6,080,409号；第6,210,662号；美国公开专利申请第20040161413号描述的那些方法，其中使用免疫刺激性多肽复合物活化抗原提呈细胞，然后将其用于体内或离体活化T细胞，所述免疫刺激性多肽复合物通过将树突状细胞结合蛋白和多肽抗原连接在一起来构建。在这点上，本发明的佐剂组合物可被用于活化抗原提呈细胞的离体方法并且也可以与活化的抗原提呈细胞一起配制用于体内给药以诱导体内抗原特异性T细胞应答。

[0248] 在这点上，使用免疫刺激性多肽复合物(例如，与树突状细胞结合蛋白GM-CSF融合的抗原(例如，PAP或本文所述的其他抗原))使得可以将外源添加的蛋白引入到成熟树突状细胞的I类途径。可以通过以下体外实现这类诱导：分离诸如树突状细胞的APC，将它们与多肽复合物“脉冲”或接触持续一段时间，然后使用脉冲的APC体外或体内刺激自体T细胞。本发明的佐剂可被用于体外增强APC的活化并且当体内给予时也可以提高产生对7
这些细胞的免疫应答的效果。在后一种情况下，将脉冲的APC(约10 细胞/注射)给予个体。利用本领域公知的方法，通过监测外周血单核细胞中对于抗原的细胞溶解T细胞应答，辅助T细胞应答和抗体应答的产生来检测个体的应答。

[0249] 在某些实施方案中，本发明的佐剂可被用于活化抗原提呈细胞的方法中，诸如美国专利第7,060,279号中所描述的那些方法，其中使用包含抗原和来源于HER-2蛋白细胞内结构域的序列组分的免疫刺激性融合蛋白来活化抗原提呈细胞。在某些实施方案中，示例性的融合蛋白包括，但不限于，包含与膜远侧细胞内HER-2结构域的217个氨基酸直接融合的癌抗原或本文所述的其他抗原的序列的那些融合蛋白。这类融合蛋白有效产生针对融合蛋白的抗原组分的保护性DC诱导的、T细胞介导的保护免疫应答。在这点上，本发明的佐剂组合物可被用于活化抗原提呈细胞的离体方法并且也可以与活化的抗原提呈细胞一起配制用于体内给药以诱导体内抗原特异性T细胞应答。

[0250] 术语“抗原提呈细胞”或“APC”是指能够活化T细胞的细胞，包括但不限于，某些巨噬细胞、B细胞并且最优选为树突状细胞(DC)。“强抗原提呈细胞”是在用抗原脉冲之后，可以在初次免疫应答中活化原初CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的细胞。“树突状细胞”或“DC”是发现于淋巴组织或非淋巴组织中的形态学类似的细胞类型的不同群体的成员。这些细胞特征在于它们独特的形态学和高水平的表面MHC II类表达。Steinman et al.，Ann.Rev.Immunol.9：271(1991)，通过引用将其并入本文。如本文所述，可以从多种组织来源中分离APC和DC，并且比较方便的是从外周血中分离。本发明的示例性的免疫治疗组合物利用从诊断为中度至良好分化级别的癌的癌症患者中分离的APC或DC。

[0251] 通过本领域中可容易获得的常规方法可以分离APC和DC。分离DC的示例性的合适方法公开于美国专利第5,976,546号，第6,080,409号和第6,210,662号，通过引用将这些专利中的每个并入本文。简而言之，可从外周血制备血沉棕黄层。可以从在离心管或装置中密度1.0770g/ml，pH 7.4，280mOsm/kg H2O的有机硅烷化硅胶(OCS)分离介质柱(按照Dorn在美国专利第4,927,749号中描述的进行制备，通过引用将该专利并入本文)上分层的白细胞分装(leukopacs)收集细胞。在某些实施方案中，通过使硅胶(约10-20nm直径的颗粒)的硅烷醇基团与烷基三甲氧基硅烷试剂反应并且从而封闭所述硅烷醇基团来制备OCS介质。

[0252] 在一个实施方案中，将OCS密度梯度材料在生理盐溶液中稀释至合适的特定密度，所述生理盐溶液添加了聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，诸如可购自Sigma Chemical Co.(St.Louis，Mo.)的PVP-10。将管离心并且收集存在于界面的外周血单核细胞(PBMC)。

[0253] 将PBMC再次重悬并离心以移除血小板，并且任选地通过OCS柱(密度1.0650g/ml，280mOsm/kg H2O)离心。在产生的截面收集T细胞团并通过离心用D-PBS洗涤细胞。将细胞团部分在细胞培养基中重悬并在潮湿的5％CO2培养箱中培养40小时。孵育之后，收集非贴壁的T细胞。可以通过FACS分析来定量界面部分中树突状细胞的纯度。

[0254] 可以使用光学显微镜评估细胞的形态。DC富集的部分包含大尺寸的面纱细胞，胞突从细胞表面伸出，这是DC的特征。

[0255] 在某些实施方案中，意欲肠胃外或口服给药的液体组合物应该含有一定量的GLA疫苗组合物以达得合适的剂量。通常，该量是组合物中抗原重量的至少0.01％。当意欲口服给药时，该量可以在组合物重量的0.1％至约70％变动。优选的口服组合物含有约4％至约50％的抗原。优选的组合物和制剂如下制备：使肠胃外剂量单位含有0.01％至1％重量比的活性成分。

[0256] 有时的情况是突然出现疫苗的需求并且需求超过供应。本发明的GLA佐剂可与抗原组合使用，从而允许在制剂中提供较低量的抗原，并且与包含相同量的抗原而没有GLA佐剂的制剂相比仍然能提供相同的或更高的功效。换而言之，本发明的GLA佐剂可以提供剂量节约效应。本发明的该方面的示例见于图21，其中包含2μg Fluzone抗原而没有GLA的制剂提供约3.5(log 10数量级)的终点滴度，而相同量的Fluzone与GLA的组合提供约5.0的终点滴度。当使用减少10倍的Fluzone抗原，即0.2μg抗原，重新进行该实验时，观察到没有GLA时终点滴度减少至约2.8(同样，log 10数量级)，而GLA存在时终点滴度不变，即终点滴度仍为约5.0。因此，添加GLA佐剂允许制备包含更少疫苗抗原并同时提供与在较高浓度抗原时所观察到的免疫原性相同的免疫原性的疫苗制剂。

[0257] 因此，在一方面，本发明提供了同时具有GLA佐剂和抗原的组合物，其中所述组合物提供至少与参考组合物所提供的免疫遗传效果相同的免疫遗传效果，其中所述参考组合物没有GLA佐剂但具有的抗原浓度高于本发明的组合物中存在的抗原浓度。应当添加到疫苗制剂中的GLA的精确的量会取决于期望达到的剂量节约效应。在不同方面，本发明提供了包含抗原和GLA的疫苗的可注射制剂，其中制剂中GLA的量任选为以下：约50μg至约0.025μg、50μg至0.1μg、50至1.0μg、约25μg至约0.025μg、25至0.1μg、20至0.02μg、20至0.2μg、20至1μg、10至0.1μg、10至1μg、5至0.5μg、5至1μg。应当理解，这些剂量范围可以与本文公开的任何抗原或抗原类型相匹配，并且得到的组合物可以任选地包含本文公开的任何制剂成分，例如磷脂酰胆碱。应当理解，在优选实施方案中，抗原-GLA组合物包含本文公开的水包油型乳剂。

[0258] 本发明还提供试剂盒，其包含(a)容纳第一组合物的第一容器，所述第一组合物包含至少一种流感抗原和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的至少一种；和(b)容纳第二组合物的第二容器，所述第二组合物包含纯化形式的GLA和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的至少一种，其中所述GLA的剂量如上文所示，例如约0.1μg至50μg。此外，在实施方案中，GLA配制在水包油型乳剂中，其中优选的乳剂在水中具有以重量计
1-5％，优选1.5-3％的油。

[0259] 本发明的GLA佐剂的剂量节约效应的另一示例示于图22。Balb/c小鼠(5只小鼠/组)接受安慰剂、1μg rHA、5μg rHA、10μg rHA或50μg rHA，所有剂量均没有GLA。在第21天，从小鼠采血并且将血液用于获得HAI滴度值。同时在第21天给予小鼠与第0天给予每只小鼠的浓度相同的rHA额外“增强”注射。在第42天，从小鼠采血并且获得HAI滴度值。图22中的数据显示在第21天和第42天观察到的滴度。使用无GLA和含GLA的乳剂制剂重复这些实验，疫苗浓度为1μg rHA和5μg rHA。如图22所示，观察到无GLA的乳剂的存在增加第42天检测的HAI滴度。然而，当将含GLA的乳剂加到rHA时，观察到显著更高的HAI滴度。该数据表明，在乳剂形式中添加GLA可提供对于流行病蛋白疫苗免疫原性的显著增加。此外，GLA乳剂的存在允许用低剂量的流行病蛋白达到即使单独使用数倍更高浓度的流行病蛋白也不能达到的HAI滴度(伴有GLA的1μg rHA的HAI滴度高于使用无GLA的10μg rHA的HAI滴度5倍以上，参见图22)。

[0260] 药物组合物可以用于表面给药，在这种情况下，载体可以适宜地包括溶液、乳剂、药膏或凝胶基质。所述基质，例如，可以包括下述中的一种或多种：矿脂、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、诸如水和乙醇的稀释液，以及乳化剂和稳定剂。增稠剂可以存在于用于表面给药的药物组合物中。如果计划透皮给药，组合物可以包括透皮贴片或电离子导入装置。表面制剂可以含有来自约0.1％至约10％w/v(每单位体积的重量)的抗原(例如GLA-抗原疫苗组合物)或GLA(例如免疫佐剂组合物；GLA可以从Avanti Polar Lipids，Inc.，Alabaster，AL处得到；例如产品号699800)的浓缩物。

[0261] 意欲直肠给药的组合物，可以采用例如栓剂的形式，其在直肠内溶化并释放出药物。用于直肠给药的组合物可以含有作为合适的无刺激赋形剂的油脂性基质。这种基质包括，但不限于，羊毛脂、可可油和聚乙二醇。在本发明的方法中，疫苗组合物/佐剂可以通过使用插入物、珠子、延时释放制剂、贴片或快速释放制剂来给药。

[0262] 某些实施方案也涉及包含本文描述的GLA疫苗组合物和/或GLA免疫佐剂组合物的试剂盒，其可以以一种或多种容器提供。在一个实施方案中，GLA疫苗组合物和/或GLA免疫佐剂组合物的所有组分共同存在于单个容器内，但本发明的实施方案并不限制于此，还可以涉及两个或多个容器，其中，例如，GLA免疫佐剂组合物与抗原组分分离，互不接触。通过非限定的理论，认为在一些情况下，GLA免疫佐剂组合物的单独给药是有益的，而在另一些情况下，这种给药与抗原的给药在时间上和/或空间(例如在不同的解剖部位)上分开是有益的，仍在另一些情况下，个体的给药是有益地给予本文所述的GLA疫苗组合物，其包含抗原和GLA，以及任选地，最好还是本文所述的其它组分。

[0263] 所述试剂盒实施方案的容器可以是任何合适的容器，器皿、小瓶、安瓿、管子、杯子、盒子、瓶子、长颈瓶、罐、盘、单孔或多孔器械的孔、槽、桶等等，或者其它装置，本文公开的组合物可以在其中放置、储存和/或转运，并易于移走其中的内容物。通常，这种容器可以由与目的用途相兼容的材料制造，从中可以容易地实现包含的内容物的回收。这种容器的优选实例包括玻璃和/或塑料密封的或可重新密封的管子和安瓿，包括具有橡胶隔膜的那些或其他密封的装置，其使用针和注射器与内容物的回抽兼容。例如，这样的容器可以由玻璃或化学兼容的塑料或树脂制成，该玻璃或化学兼容的塑料或树脂可以由一种材料制成，也可以是涂覆由这种材料，该材料允许容器中的物质的有效回收和/或保护这种物质免受例如诸如紫外线或温度极限的降解条件的影响，或防止包括微生物污染物的不必要的沾染物进入。容器优选地为无菌的或可灭菌的，并且由可与任何载体、赋形剂、溶剂、媒介物等兼容的材料制成，这样可被用于悬浮或溶解本文所描述的疫苗组合物和/或免疫佐剂组合物和/或抗原和/或重组表达构建体等等。

[0264] 乳剂系统还可以用于配置本发明的组合物。例如，许多单相或多相乳剂系统已经被描述。已经证明，水包油乳剂佐剂本身作为一种辅助成分是有用的(EP 0 399 843B)。此外，水包油乳剂和其他活性剂的合并物作为疫苗佐剂也已经被描述(WO 95/17210；
WO 98/56414；WO 99/12565；WO 99/11241)。已描述了其他油乳剂佐剂，诸如油包水乳剂(U.S.Pat.No.5,422,109；EP 0 480 982 B2)和水包油包水乳剂(U.S.Pat.No.5.424,067；
EP 0 480 981 B)。用于本发明的油乳剂佐剂可以是天然的或合成的，可以是矿物的的或有机的。矿物油和有机油的实例很容易为本领域的技术人员所理解。

[0265] 在一个特别的实施方案中，本发明的组合物包含水包油乳剂，其中GLA掺入油相中。在另一个实施方案中，本发明组合物物包含水包油乳剂，其中GLA掺入油相中，并存在另外的组分，诸如本文所描述的辅佐剂、TLR激动剂等。

[0266] 为了使任何水包油组合物适合对人类的给药，乳剂系统的油相优选包含一种可代谢油。术语可代谢油的含义为本领域所熟知。可代谢可以被定义为“能够通过新陈代谢被转化”(Dorland′s illustrated Medical Dictionary(道兰氏图解医学词典)，W.B.Saunders Company，25th edition(1974))。所述油可以是任何植物油、鱼油、动物油或合成油，其对受体无害且能够通过新陈代谢被转化。坚果(例如花生油)、种子和谷物是植物油最通常的来源。合成油也是本发明中的一部分，可以包括商用油，例如NEOBEE 及其他。

[0267] 例如角鲨烯(2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯)，是一种不饱和油，在鲨鱼肝油中大量存在，在橄榄油、麦芽油、米糠油和发酵粉中含量较少，它是用于本发明的特别优选的油。考虑到角鲨烯是胆固醇生物合成中的中间物(默克索引，第10版，第8619条目)，因此它是可代谢的油。特别优选的油乳剂是水包油乳剂，尤其是水包角鲨烯乳剂。另外，本发明中最优选的油乳剂佐剂包含一种抗氧化剂，其优选地为α生育酚油(维生素E，EP 0 382 271 B1)。WO95/17210和WO 99/11241公开了任选地与免疫刺激剂QS21和/或3D-MPL(上文已经讨论过)配制的基于角鲨烯、α生育酚、吐温 80(TWEEN
80)的乳剂佐剂。WO 99/12565公开了通过在油相中加入固醇，对这些角鲨烯乳剂的改进。
另外，甘油三酯，诸如三辛精(C27H50O6)可以被加入油相中，以便稳定乳剂(WO 98/56414)。

[0268] 存在于稳定的水包油乳剂中的油滴的大小优选直径小于1微米，可以在基本上30-600nm的范围内，优选直径基本上约30-500nm，且最优选直径基本上为150-500nm，特别是直径约为150nm，所述直径是用光子相关光谱法测量的。在这一点上，数目为80％的油滴应在优选的范围内，数目更优选超过90％和最优选地超过95％的油滴位于限定的大小范围内。存在于本发明中的油乳剂中的组分的量常规是2％至10％的诸如角鲨烯的油；2％至
10％的α生育酚(如果存在时)；以及0.3％至3％的表面活化剂，诸如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。优选地，油：α生育酚的比例等于或少于1，这样能提供更稳定的乳剂。司盘
85也可以以约1％的水平存在。在某些情况下，本发明中的疫苗另外含有稳定剂是有益处的。

[0269] 水包油乳剂的制备方法为本领域的技术人员所熟知。通常，该方法包括将油相与如PBS/吐温80 溶液的表面活性剂混合，随后用均质器均质化。例如，包括将混合物通过注射器针头一次、两次或更多次的方法适合均质化少量的液体。同样地，在微射流均质器(microfluidiser)(M110S微流体仪，最大50个通道，在6帕的最大输入压(约为850帕的输出压)下作用2分钟时间)中的乳化过程适合制备较小或较大体积的乳剂。可以通过包括测量产生的乳剂的常规试验来进行这种调整，直至制备出所需直径的油滴。

[0270] 下面提供的实施例用于说明而非限制。实施例

[0271] 实施例1

[0272] GLA水制剂

[0273] 本实施例描述了含有GLA的佐剂水制剂的制备。该GLA水制剂(GLA-AF)含有注射水(WFI)、GLA(Avanti Polar Lipids，Inc.，Alabaster，AL；产品号699800)和1-棕榈酰-2-油酰-胆碱磷酸(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphochline，POPC)。通过将乙醇和POPC溶液添加到预称重量的GLA中制备所述制剂。将润湿的GLA超声10分钟以尽可能地分散GLA。然后将GLA在氮气中干燥。干燥的GLA和POPC用WFI重新水化以达到恰当的体积。将该溶液在60℃下超声15-30分钟，直至所有的GLA和POPC都溶解。对于长期的保存，GLA-AF制剂必须冻干。冻干过程包括将甘油添加到溶液中，直到达到总体积的2％。然后将溶液置于1-10mL量的小瓶中。随后使小瓶经历冻干过程，该过程包括冰冻溶液及随后将其置于真空中通过升华抽走冻结的水份。

[0274] 实施例2

[0275] GLA HPLC分析

[0276] 本实施例描述了含GLA的佐剂水制剂的HPLC分析。将该制剂生产出后(参见，上述实施例1)，要进行某些放行和稳定性检验以确保产品质量和重现性。所有的制剂都要使用高效液相层析(HPLC)、动态光散射(DLS)和视觉检测来进行放行和长期稳定性检验。使用Agilent 1100系统和ESA电雾式检测器采集HPLC层析谱。该方法在Waters Atlantis C18柱上采用甲醇到氯仿梯度来执行。注射液分别包括2.5μg的GLA(Avanti Polar Lipids，Inc.，Alabaster，AL；产品号699800，GLA-AF)或MPL (GSK Biologicals，Rixensart，Belgium，MPL-AF)，和作为助溶剂的0.27μg的合成磷酸胆碱(POPC)。

[0277] 图1显示了表明MPL-AF和GLA-AF中的沾染物质的数目和含量的HPLC数据。

[0278] HPLC谱显示了GLA-AF比MPL-AF更纯。也就是说，GLA-AF中的沾染物峰少于MPL-AF佐剂制剂中的沾染物峰。较纯的起始产物对研究者来说益处巨大，因为获得的生物应答来自用于GLA制剂中的单一的主要组分。

[0279] 实施例3

[0280] GLA油制剂

[0281] 本实施例描述了1毫升含有GLA的佐剂油制剂的制备。将GLA(100微克；Avanti Polar Lipids，Inc.，Alabaster，AL；产品号699800)与溶于25毫摩尔磷酸铵缓冲液(pH＝5.1)中的甘油(22.7mg)、磷脂酰胆碱或卵磷脂(7.64mg)、普流罗尼克 F-68(BASF Corp.，Mount Olive，NJ)或类似的嵌段共聚物(0.364mg)在角鲨烯(34.3mg)中乳化，使用0.5mgD，L-α-生育酚作为抗氧化剂。在高压下处理该混合物，直至形成不分散的且具有小于180nm的平均粒度的乳剂。然后将乳剂无菌过滤至玻璃单位剂量瓶中并加盖以储存较长时间。该制剂在2-8℃下储存时，可以使用至少三年。

[0282] 实施例4

[0283] GLA对鼠巨噬细胞和树突状细胞的刺激

[0284] 本实施例描述了表明GLA的佐剂作用的体外模型。采用标准的组织培养方法学和试剂。按照供应商的建议，维持鼠J774和RAW267.4巨噬细胞系的细胞(American Type Culture Collection，Manassas，VA)，并将其在多孔器皿中以粘附的细胞单层培养。遵循Xiong et al.(J.Biol.Chem 2004，279，pp10776-83)的实验方案，树突状细胞源自骨髓祖细胞。通过在细胞培养基(含有10％胎牛血清的DMEM)中稀释水性佐剂制剂获得合成GLA(Avanti Polar Lipids，Inc.，Alabaster，AL；产品号699800)的多种佐剂浓度，并在收集无细胞培养物上清前，将细胞在含有5％CO2的湿润空气中于37℃维持24小时。使用特异性的夹心ELISA测定试剂盒(细胞因子试剂盒来自eBiosciences，San Diego，CA，趋化因子试剂盒来自R&D Systems，Minneapolis，MN)，按照生产商的说明书，测定上清液中诸如IL-12、IL-6和TNF的可溶性鼠细胞因子，以及诸如RANTES的趋化因子。

[0285] GLA-AF在小鼠巨噬细胞系和原代鼠树突状细胞(DC)中诱导剂量依赖性免疫应答，这由诸如IL-12p40、IL-6和TNF的细胞因子以及如RANTES的趋化因子分泌所表征。

[0286] 实施例5

[0287] GLA对人巨噬细胞和树突状细胞的刺激

[0288] 本实施例描述了表明GLA的佐剂作用的体外模型。使用了标准的组织培养方法学和试剂。

[0289] 按照供应商的建议，维持人Mono Mac 6巨噬细胞系(美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA)的细胞，并将其在多孔板中以粘附的细胞单层培养。遵循标准的实验方案，树突状细胞源自外周血单核细胞(PBMC)。通过将水性佐剂制剂稀释于细胞培养基(对于MonoMac 6，是含有10％的胎牛血清的DMEM；对于DC，是含有10％人血清的DMEM)中，得到合成GLA(Avanti Polar Lipids，Inc.，Alabaster，AL；产品号699800)或天然产物MPL(GSK Biologicals，Rixensart，Belgium)的多种佐剂浓度，并在收集无细胞培养物上清之前，将细胞在含有5％CO2的湿润空气中于37℃维持24小时。使用特异性的夹心ELISA测定试剂盒(细胞因子试剂盒来自eBiosciences，San Diego，CA，以及趋化因子试剂盒来自R&D Systems，Minneapolis，MN)，按照生产商的说明书，测定上清液中诸如IL-1β、IL-23和IL-6的可溶性人细胞因子，以及诸如IP-10、RANTES和MIP-1β的趋化因子。

[0290] 图2显示了表明细胞因子和趋化因子的水平的ELISA数据，所述细胞因子和趋化因子是由Mono Mac 6细胞系的巨噬细胞(图a-e)以及单核细胞来源的树突状细胞(图f-h)应答GLA刺激时表达的。

[0291] GLA-AF在人巨噬细胞系Mono Mac 6(图2，图a-e)以及原代DC(图2，图f-h)中诱导了剂量依赖性免疫应答，这由诸如IL-1β、IL-6、IL-23的细胞因子和诸如RANTES、IP-10、MIP-1β的趋化因子的分泌所表征。对于测试的所有细胞因子和趋化因子，浓度在5-500的GLA-AF的活性低于MPL-AF。

[0292] 实施例6

[0293] GLA对人血细胞的刺激

[0294] 本实施例描述了表明GLA的佐剂作用的体外模型。使用了标准的组织培养方法学和试剂。

[0295] 用合成GLA(Avanti Polar Lipids，Inc.，Alabaster，AL；产品号699800)或天然产物MPL (GSK Biologicals，Rixensart，Belgium)的多种佐剂浓度培养人全血细胞，所述佐剂浓度是通过将水性佐剂制剂溶于细胞培养基(含有10％胎牛血清的DMEM)中得到的。在收集无细胞培养物上清之前，将血细胞在含有5％CO2的湿润空气中于37℃维持16小时。
使用特异性的夹心ELISA测定试剂盒(eBiosciences，San Diego，CA)，按照生产商的说明书，测定上清液中可溶性人细胞因子IL-1β。

[0296] GLA-AF在人全血细胞中诱导了剂量依赖性的免疫应答，这由IL-1β细胞因子的分泌所表征。在该测定中，92nM的GLA在功效方面等价于57,000nM的MPL-AF。

[0297] 实施例7

[0298] 含有GLA疫苗的体内应用

[0299] 本实施例描述了表明GLA在流感疫苗中的佐剂作用的体内模型。采用了标准的免疫方法学和试剂(Current Protocols in Immunology(免疫学实验指南)，Coligan et al.(Eds.)2006 John Wiley & Sons，NY)。

[0300] 在三周时间内，用人类剂量的1/25(20μl)和1/250(2μl)的Fluzone疫苗(Sanofi-Aventis，Swiftwater，PA)免疫小鼠(每组3只Balb/c动物)两次，所述疫苗单独使用，或配制于(i)依照上述实施例1使用的操作步骤的含有GLA(Avanti Polar Lipids，Inc.，Alabaster，AL；产品号699800；每次免疫每只动物给予20μg)的水性乳剂(″GLA-AF″)中，或者配制于(ii)依照上述实施例3使用的操作步骤的含有GLA(Avanti Polar Lipids，Inc.，Alabaster，AL；产品号699800；每次免疫每只动物给予20μg)的稳定乳剂(″GLA-SE″)中。每次免疫后一周，通过给动物放血采集血清，并依照发表的方法(同上)通过ELISA检测特异针对Fluzone的总IgG抗体血清水平。依照发表的方法，通过血凝抑制实验(HAI)也检测了病毒中和抗体的血清水平。

[0301] 图3显示了ELISA数据，表明了使用两种不同剂量的与GLA-AF或GLA-SE配制的Fluzone疫苗每次免疫后一周(即，在第7天，图A；以及在第28天，图B)，与单独使用Fluzone相比，在小鼠体内诱导的抗Fluzone抗体产生的水平。显示了每组/时间点中的倒数终点滴度的平均值和标准误。图3的图C显示了HAI数据，表明了使用两种不同剂量的与GLA-AF或GLA-SE配制的Fluzone疫苗进行第二次免疫后一周，与单独使用Fluzone相比，在小鼠体内诱导的病毒中和抗体产生的水平。显示了每组/时间点中的倒数终点滴度的平均值和标准误。

[0302] 应答Fluzone疫苗的总IgG和中和抗体滴度通过在水制剂或稳定油制剂中添加GLA而增强。与2μl剂量Fluzone疫苗一起使用的GLA的佐剂作用更为显著，诱导的抗原特异性体液应答与单独使用20μlFluzone疫苗相似(GLA-AF)或更强(GLA-SE)。这些结果提示通过用含有GLA的制剂辅佐，降低Fluzone疫苗的剂量，且仍诱导高水平的IgG和中和抗体滴度是可能的。这在诸如禽流感的世界性传染病的情形下特别重要。

[0303] 实施例8

[0304] 含有GLA疫苗的体内应用

[0305] 本实施例描述了表明GLA在含有特异性利什曼虫抗原疫苗中的佐剂作用的体内模型。采用了标准的免疫方法学和试剂(Current Protocols in Immunology(免疫学实验指南)，Coligan et al.(Eds.)2006 John Wiley & Sons，NY)。

[0306] 在3周时间内，用单独使用的SMT抗原(每次免疫每只动物给予10μg)或用配制于依照上述实施例3使用的操作步骤的含GLA(Avanti Polar Lipids，Inc.，Alabaster，AL；产品号699800；每次免疫每只动物给予20μg)的稳定乳剂(GLA-SE)中的SMT抗原免疫小鼠(每组三只C57BL/6动物)三次。第三次免疫后一周，通过给动物放血采集血清，且依照发表的方法，通过ELISA检测特异性针对SMT抗原的IgG1和lgG2c抗体的血清水平。

[0307] 图4显示了ELISA数据，表明了单独使用SMT抗原或使用与GLA-SE配制的SMT抗原第三次免疫后一周，在小鼠体内诱导的抗-SMT抗体产生的水平。显示了每组的倒数终点滴度的平均值和标准误。

[0308] IgG1或lgG2c抗体同种型分别主要与TH2或TH1应答有关。已经表明，TH1应答对于抗利什曼虫感染的保护是必需的。单独接种SMT主要诱导SMT特异性的IgG1抗体。接种SMT+GLA-SE诱导较高的抗体滴度，并将显型逆转到主要是lgG2c抗原特异性的抗体应答，其与抗该疾病的保护有关。

[0309] 实施例9

[0310] 含有GLA疫苗的体内应用

[0311] 本实施例描述了表明GLA在含有特异性利什曼虫抗原疫苗中的佐剂作用的体内模型。采用了标准的免疫方法学和试剂(Current Protocols in Immunology(免疫学实验指南)，Coligan et al.(Eds.)2006John Wiley & Sons，NY)。

[0312] 在2周时间内，用配制于依照上述实施例3中使用的操作步骤的含不同量的GLA(Avanti Polar Lipids，Inc.，Alabaster，AL；产品号699800；每次免疫每只动物给予40，20，5或1μg)的稳定乳剂(GLA-SE)中的利什-110f抗原(每次免疫每只动物给予10μg)免疫小鼠(每组三只Balb/c动物)三次。第一次免疫后一周，通过给动物放血采集血清，且依照发表的方法(同上)，通过ELISA检测特异性针对利什-110f的IgG1和lgG2a抗体的血清水平。

[0313] 图5显示了ELISA数据，表明了使用与不同量的GLA(40，20，5或1μg)配制的利什-110f抗原第一次免疫后一周，与盐水对照相比，在小鼠体内诱导的抗利什-110f抗体产生的水平。显示了每组的倒数终点滴度的平均值和标准误。

[0314] 利什-110f特异性的IgG1和lgG2a抗体滴度是GLA剂量依赖性的。在测试的所有GLA的浓度都观测了TH1相关的IgG2a抗体的优势。

[0315] 实施例10

[0316] 含有GLA疫苗的体内应用

[0317] 本实施例描述了表明GLA在含有特异性利什曼虫抗原疫苗中的佐剂作用的体内模型。采用了标准的免疫方法学和试剂(Current Protocols in Immunology(免疫学实验指南)，Coligan et al.(Eds.)2006 John Wiley & Sons，NY)。

[0318] 在3周时间内，用盐水或配制于依照上述实施例3中使用的操作步骤的含有GLA(Avanti Polar Lipids，Inc.，Alabaster，AL；产品号699800；每次免疫每只动物给予20μg)的稳定乳剂(GLA-SE)中的利什-111f抗原(每次免疫每只动物给予10μg)免疫小鼠(每组三只Balb/c动物)三次。最后一次免疫后2周，处死小鼠，收集脾脏，依照发表的方法，通过ELISA分析T细胞依赖性的IFN-γ和IL-4细胞因子对体外抗原刺激的应答。

[0319] IL-4或IFN-γ细胞因子分别主要与TH2或TH1应答有关。我们和其它人已经表明TH1应答对于抗利什曼虫感染是必需的。所有的动物对伴刀豆球蛋白A(一种有效的有丝分裂原)应答良好。接种利什-111f+GLA-SE诱导了利什-111f抗原特异性的细胞应答，而在盐水对照组没有这种应答。当与伴刀豆球蛋白A比较时，接种利什-111f+GLA-SE诱导了远超过IL-4的IFN-γ，其是与抗该疾病的保护有关的TH1∶TH2比率或显型。

[0320] 实施例11

[0321] 含有GLA疫苗的体内应用

[0322] 本实施例描述了表明GLA在含有特异性利什曼虫抗原疫苗中的佐剂作用的体内模型。采用了标准的免疫方法学和试剂(Current Protocols in Immunology(免疫学实验指南)，Coligan et al.(Eds.)2006John Wiley & Sons，NY)。

[0323] 在2周时间内，用盐水或配制于稳定乳剂中的利什-110f抗原(每次免疫每只动物给予10μg)免疫小鼠(每组三只Balb/c动物)三次，所述乳剂含有不同量的(i)依照上述实施例3中使用的操作步骤的GLA(Avanti Polar Lipids，Inc.，Alabaster，AL；产品号699800；每次免疫每只动物给予40，5或1μg)(GLA-SE)，或者(ii)由生产商供应的乳剂(″MPL-SE″，GSK Biologicals，Rixensart，Belgium)中的MPL (每次免疫每只动物给予40，5或1μg)。最后一次注射后一周，处死小鼠并收集脾脏，依照发表的方法(同上)，通过ELISA分析T细胞依赖性的IFN-γ细胞因子对体外抗原刺激的应答。IFN-γ细胞因子应答与抗利什曼虫感染的TH1保护显型有关。

[0324] 图6显示了ELISA数据，表明了使用与不同量的GLA配制的利什-110f抗原进行第三次免疫后1周，与盐水对照相比，在小鼠体内诱导的抗利什-110f的IFN-γ细胞因子产生的水平。显示了每组中的平均值和标准误。

[0325] 所有的动物都对伴刀豆球蛋白A(一种细胞活化剂和有丝分裂原)应答良好。接种利什-110f+GLA-SE以剂量依赖性方式诱导了利什-110f抗原特异性的细胞因子应答，而在盐水对照组没有观测到这种应答。在所有测试的浓度下，GLA-SE比MPL-SE更有效，诱导了更高水平的IFN-γ，所述IFN-γ是由抗原特异性T细胞分泌的。

[0326] 总之，将稳定油制剂中的GLA添加到利什曼虫疫苗抗原候选物利什-110f中主要诱导了与保护性TH1显型有关的抗原特异性的细胞型(T细胞)免疫应答。此外，GLA-SE在诱导保护相关的细胞因子如IFN-γ方面比MPL-SE更有效。

[0327] 实施例12

[0328] 含有GLA疫苗的体内应用

[0329] 本实施例描述了表明GLA在含有特异性利什曼虫抗原疫苗中的佐剂作用的体内模型。采用了标准的免疫方法学和试剂(Current Protocols in Immunology(免疫学实验指南)，Coligan et al.(Eds.)2006John Wiley & Sons，NY)。

[0330] 在2周时间内，用盐水或配制于稳定乳剂中的利什-110f抗原(每次免疫每只动物给予10μg)免疫小鼠(每组三只Balb/c动物)三次，所述乳剂含有不同量的(i)依照上述实施例3中使用的操作步骤的GLA(Avanti Polar Lipids，Inc.，Alabaster，AL；产品号699800；每次免疫每只动物给予20μg或5μg)(GLA-SE)，或者(ii)由生产商供应的乳剂(″MPL-SE″，GSK Biologicals，Rixensart，Belgium)中的MPL (每次免疫每只动物给予20或5μg)。最后一次注射后一周，处死小鼠并收集脾脏，依照发表的方法(同上)，通过细胞内细胞染色(ICS)和流式细胞术分析T细胞依赖性的IFN-γ、IL-2和TNF细胞因子对体外抗原刺激的应答。这三种细胞因子与抗利什曼虫感染的TH1保护显型有关。

[0331] 当在单细胞水平分析时，与利什-110f+MPL-SE组相比，在利什-110f+GLA-SE组中，表达所有三种细胞因子IFN-γ、IL-2和TNF或IFN-γ和IL-2组合的CD4+T细胞的频数更高，且在20和5μg剂量都观测到了这一结果。据报道(Seder et al.)，表达所有三种细胞因子IFN-γ、IL-2和TNF的CD4+T细胞的高频数与抗利什曼虫感染的保护相关。

[0332] 总之，将稳定油制剂中的GLA添加到利什曼虫疫苗抗原候选物利什-110f中主要诱导了与保护性TH1显型有关的抗原特异性的细胞型(T细胞)免疫应答。此外，GLA-SE在诱导保护相关的细胞因子如IFN-γ、IL-2和TNF方面比MPL-SE更有效。

[0333] 实施例13

[0334] 含有GLA疫苗的体内应用

[0335] 本实施例描述了表明GLA在含有特异性肺结核分支杆菌抗原疫苗中的佐剂作用的体内模型。采用了标准的免疫方法学和试剂(Current Protocols in Immunology(免疫学实验指南)，Coligan et al.(Eds.)2006John Wiley & Sons，NY)。

[0336] 在3周时间内，用单独的或配制于依照上述实施例3中使用的操作步骤的含GLA(Avanti Polar Lipids，Inc.，Alabaster，AL；产品号699800；每次免疫每只动物给予20μg)的稳定乳剂(GLA-SE)中的ID83抗原(每次免疫每只动物给予8μg)免疫小鼠(每组三只C57BL/6动物)三次。第三次免疫后一周，通过给动物放血采集血清，且依照发表的方法(同上)，通过ELISA检测特异性针对ID83的IgG1和lgG2c抗体的血清水平。IgG1或lgG2c抗体同种型分别主要与TH2或TH1应答有关。已经表明，TH1应答对于抗肺结核分支杆菌感染的保护是必需的。

[0337] 单独接种ID83主要诱导抗原特异性的IgG1抗体。相比之下，接种ID83+GLA-SE诱导更高的抗体滴度，并将显型逆转到主要是lgG2c抗原特异性的抗体应答，其与抗该疾病的保护有关。

[0338] 实施例14

[0339] 含有GLA疫苗的体内应用

[0340] 本实施例描述了表明GLA在含有特异性肺结核分支杆菌抗原疫苗中的佐剂作用的体内模型。采用了标准的免疫方法学和试剂(Current Protocols in Immunology(免疫学实验指南)，Coligan et al.(Eds.)2006John Wiley & Sons，NY)。

[0341] 在3周时间内，用单独的或配制于含有GLA(GLA-SE)、GLA+CpG(CpG1826，Coley Pharmaceuticals，25μg)(GLA/CpG-SE)或GLA+嘎德莫特(GDQ)(Invivogen，20μg)(GLA/GDQ-SE)的稳定乳剂中的ID83抗原(每次免疫每只动物给予8μg)免疫小鼠(每组三只C57BL/6动物)三次。最后一次注射后3周，处死小鼠并收集脾脏，依照发表的方法，通过ICS和流式细胞术分析CD4+和CD8+T细胞依赖性的IFN-γ、IL-2和TNF细胞因子对体外ID83抗原刺激的应答。IFN-γ、IL-2和TNF细胞因子的表达与抗肺结核分支杆菌感染的保护性TH1应答有关。

[0342] 图7显示了ICS数据，表明了进行第三次免疫后一周在小鼠体内诱导的产生ID83特异性的IFN-γ、IL-2和TNF细胞因子的CD4+和CD8+T细胞的频数，所述免疫是使用单独的ID83或由含有GLA(GLA-SE)、GLA+CpG(GLA/CpG-SE)或GLA+GDQ(GLA/GDQ-SE)的制剂辅佐的ID83进行的。

[0343] 产生ID83特异性细胞因子的CD4+或CD8+T细胞的频数在盐水或单独的ID83疫苗组处于背景水平。产生ID83抗原特异性细胞因子的T细胞，CD4+和CD8+两者都由ID83+GLA-SE的接种所诱导，且它们的频数通过添加如GDQ(TLR7/8)或CpG(TLR9)的另一种TLR配体被进一步增加。表达IFN-γ+TNF或IFN-γ+IL-2的T细胞是优势群。

[0344] 总之，用GLA-SE辅佐针对肺结核分支杆菌的抗原大大增强了抗原特异性的细胞应答(T细胞)，如通过表达IFN-γ、IL-2和/或TNF细胞因子的T细胞的频数所测量的。将GLA-SE与另一种TLR配体合并进一步增加了产生抗原特异性细胞因子的细胞的频数，所述细胞是与抗该疾病的保护有关的显型。

[0345] 实施例15

[0346] 含有GLA疫苗的体内应用

[0347] 本实施例描述了表明GLA在含有特异性麻风分支杆菌抗原疫苗中的佐剂作用的体内模型。采用了标准的免疫方法学和试剂(Current Protocols in Immunology(免疫学实验指南)，Coligan et al.(Eds.)2006John Wiley&Sons，NY)。

[0348] 在3周时间内，用由水制剂辅佐的ML0276抗原(每次免疫每只动物给予10μg)免疫小鼠(每组三只C57BL/6动物)三次，所述制剂含有CpG(CpG1826，Coley Pharmaceutical，每次免疫每只动物给予25μg)、或咪喹莫特(IMQ)(3M Pharma，每次免疫每只动物给予25μg)或GLA(Avanti Polar Lipids，Inc.，Alabaster，AL；产品号699800；每次免疫每只动物给予25μg，根据上述实施例3中使用的实验操作，GLA-SE)、所述三者的混合物，或是作为阴性对照的盐水。第二次免疫后3周，通过给动物放血采集血清，且依照发表的方法(同上)，通过ELISA检测特异性针对ML0276的IgG抗体的血清水平。

[0349] 来自盐水对照组的动物没有显示出ML0276特异性的IgG，且来自ML0276+CpG和ML0276+IMQ组的动物显示了极低水平的抗原特异性抗体。相比之下，ML0276+GLA-SE诱导了显著水平的ML0276特异性的IgG，其在三种佐剂一起使用时可被进一步增强。

[0350] 总之，这些数据支持GLA-SE和/或GLA-SE与另外的TLR配体的组合当与抗原ML0276一起使用时对于诱导抗原特异性抗体的辅佐作用。

[0351] 实施例16

[0352] 含有GLA疫苗的体内应用

[0353] 本实施例描述了表明GLA在含有特异性麻风分支杆菌抗原疫苗中的佐剂作用的体内模型。采用了标准的免疫方法学和试剂(Current Protocols in Immunology(免疫学实验指南)，Coligan et al.(Eds.)2006John Wiley & Sons，NY)。

[0354] 在3周时间内，用由水制剂辅佐的ML0276抗原(每次免疫每只动物给予10μg)免疫小鼠(每组三只C57BL/6动物)三次，所述制剂含有CpG(CpG1826，Coley Pharmaceutical，每次免疫每只动物给予25μg)、或咪喹莫特(IMQ)(3M Pharma，每次免疫每只动物给予25μg)或GLA(Avanti Polar Lipids，Inc.，Alabaster，AL；产品号699800；每次免疫每只动物给予25μg，根据上述实施例3中使用的实验操作，GLA-SE)、所述三者的混合物，或是作为阴性对照的盐水。最后一次注射后3周，处死小鼠并收集脾脏，依照发表的方法，通过ICS和流式细胞术分析CD4+T细胞依赖性的IFN-γ细胞因子对体外ML0276抗原刺激的应答。IFN-γ细胞因子的表达与抗麻风分支杆菌感染的保护性TH1应答有关。

[0355] 图8的图A显示了ICS数据，表明了相比于盐水和空白对照，使用ML0276抗原进行第三次免疫后一周，在小鼠体内诱导的产生ML0276特异性IFN-γ细胞因子的CD4+T细胞的频数，所述抗原是用含有CpG或咪喹莫特(IMQ)的水制剂或含有GLA(GLA-SE)的稳定油乳剂，或混合在一起的所述三者配制的。显示了每组的平均值。图8的图B显示的数据表明了与盐水和空白对照相比，在用ML0276抗原免疫的小鼠体内，引流麻风分支杆菌感染部位的淋巴结的细胞性，所述ML0276抗原用含有CpG、或咪喹莫特(IMQ)的水制剂或含有GLA(GLA-SE)的稳定油乳剂或上述三者的混合物配制。显示了每组的平均值和标准误。

[0356] 来自生理盐水对照组的动物没有显示出ML0276特异性的IFN-γ应答，背景频数是阳性细胞的0.04％。来自CpG和IMQ组的动物显示了产生抗原特异性细胞因子的细胞的频数轻度增加，分别是0.17％和0.11％。相比之下，当使用GLA-SE作为佐剂时，观测到了ML0276特异性的IFN-γ+CD4+T细胞显著增加的数目(0.66％)，当三种佐剂混合在一起时，频数进一步增加(2.14％)。

[0357] 随后使小鼠的子集感染麻风分支杆菌，发现小鼠受到ML0276+GLA-SE的保护，这通过与注射了盐水的对照相比，引流感染部位的淋巴结内的细胞数目降低被测量。接种ML0276+CpG和ML0276+IMQ与盐水相比，仅诱导了细胞数目的中度降低。

[0358] 总之，这些数据支持GLA-SE和/或GLA-SE与另外的TLR配体的组合当与抗原ML0276一起使用时对于诱导抗原特异性细胞应答的辅佐作用。

[0359] 实施例17

[0360] 人树突状细胞的GLA刺激

[0361] 本实施例描述了表明GLA佐剂作用的体外模型。使用了标准组织培养方法和试剂。

[0362] 树突状细胞来源于根据公开的流程得到的纯化的血液CD14+单核细胞。通过将水性佐剂制剂在细胞培养基(含有10％人血清的RPMI)中稀释得到合成GLA(Avanti Polar Lipids，Inc.，Alabaster，AL；产品号699800)或天然产物MPL (GSK Biologicals，Rixensart，Belgium)的不同佐剂浓度。在收集和分析活化标志物表达之前，在含有5％CO2的湿润空气中、于37℃下将细胞保持44小时。协同刺激分子CD86在DC表面的表达水平被用作细胞活化的标志并且在LSRII装置上的流式细胞仪(BD Biosciences，San Jose，CA)上、使用CD86特异性荧光染料标记的抗体(eBiosciences，San Diego，CA)根据生产商的使用说明进行检测。

[0363] 图9显示了通过流式细胞仪获得的数据，这些数据表明响应于10,000ng/ml至0.010ng/ml GLA(图A)或MPL(图B)刺激44小时的人DC表面表达的CD86分子水平。还包括了由PGE2、IL-1β、TNF和IL-6组成的阳性刺激对照。

[0364] 在人原代DC中，GLA-AF诱导了剂量依赖性免疫应答(图9中的图A)，其特征在于增加的CD86表达。在10,000ng/ml、1000ng/ml和100ng/ml的GLA时，观察到最大CD86表达，而MPL仅在10,000ng/ml和1000ng/mL时、在产生自供体N003的DC中具有最大表达。另外三个供体被用于产生DC培养物并且以相似的方式，在1000ng/ml至1ng/mL的GLA和MPL刺激下进行评估，参见图10。来自这些供体的树突状细胞表现出不同的敏感度水平，但是对于来自每个供体的树突状细胞，都是较低剂量的GLA达到高于MPL的CD86的表达。这表明对于人树突状细胞成熟，GLA在低于MPL至少10倍的浓度下是有活性的。

[0365] 实施例18

[0366] 含GLA的疫苗的体内应用

[0367] 本实施例描述了表明含有特异性利什曼虫抗原的疫苗中GLA的佐剂作用的体内模型。采用了标准的免疫学方法和试剂(Current Protocols in Immunology(免疫学实验指南)，Coligan et al.(Eds.)2006John Wiley & Sons，NY)。

[0368] 用盐水或配制在稳定乳剂中的利什-110f抗原(每次免疫给予每只动物10μg)对每个处理组的4只Balb/c小鼠免疫三次，每次间隔两周，所述稳定乳剂包含20μg的(i)GLA(Avanti Polar Lipids，Inc.，Alabaster，AL；产品号699800；每次免疫给予每只动物)按照上文实施例3中使用的步骤(GLA-SE)，或(ii)由生产商供应的MPL 乳剂(″MPL-SE″，GSK Biologicals，Rixensart，Belgium；每次免疫给予每只动物)。最后一次3
注射后三周，按照公开的方法(Id.)，将2×10 纯化的利什曼虫主要克隆V1(MOHM/IL/80/Friedlin)亚循环前鞭毛体在小鼠双耳的pinea中进行皮内激发。在注射后六周，每周监测皮肤病变的发展。

[0369] 图11显示了相对于盐水对照，使用与GLA-SE或MPL-SE配制的利什-110f抗原免疫的小鼠中病变的直径。显示了每组的平均值。

[0370] 盐水对照组中所有动物发展出进行性未愈合病变。在用利什-110f+GLA-SE免疫的小鼠中，在前两周中开始发展的耳部病变在第3周得到控制，并且到第4周最终得到解决。相对于盐水组，用利什-110f+MPL-SE免疫的小鼠的病变减少但并未得到解决。在预防病变的发展中，GLA-SE比MPL-SE更有效。

[0371] 总之，将稳定油制剂中的GLA添加到利什曼虫疫苗抗原候选物利什-110f中阻止了由于硕大利什曼虫寄生虫激发引起的皮肤病变的发展。此外，在控制病变发展中，GLA-SE比MPL-SE更有效。

[0372] 实施例19

[0373] 含GLA的疫苗的体内应用

[0374] 本实施例描述了表明含有特异性利什曼虫抗原的疫苗中GLA的佐剂作用的体内模型。采用了标准的免疫学方法和试剂(Current Protocols in Immunology(免疫学实验指南)，Coligan et al.(Eds.)2006John Wiley & Sons，NY)。

[0375] 用盐水或配制在稳定乳剂中的利什-110f抗原(每次免疫给予每只动物10μg)对每个处理组的4只Balb/c小鼠免疫三次，每次间隔两周，所述稳定乳剂包含20μg的(i)GLA(Avanti Polar Lipids，Inc.，Alabaster，AL；产品号699800；每次免疫给予每只动物)按照上文实施例3中使用的步骤(GLA-SE)，或(ii)由生产商供应的MPL 乳剂(″MPL-SE″，GSK Biologicals，Rixensart，Belgium；每次免疫给予每只动物)。最后一次3
注射后三周，按照公开的方法(Id.)，将2×10 纯化的利什曼虫主要克隆V1(MOHM/IL/80/Friedlin)亚循环前鞭毛体在小鼠双耳的pinea中进行皮内激发。注射后六周测定感染的小鼠的耳和引流淋巴结中的寄生虫负荷。

[0376] 图12表明相对于盐水对照，从使用与GLA-SE或MPL-SE一起配制的利什-110f抗原免疫的小鼠的耳和引流淋巴结中收集的寄生虫的数目。显示了个体器官中寄生虫的数目和每组平均值。使用Student t检验评估组间寄生虫数目差异的统计学显著性。当p值＜0.05时，认为差异是显著的。

[0377] 盐水对照组中的动物显示耳和引流淋巴结中平均寄生虫负荷分别为105和4
5×10。在用利什-110f+GLA-SE免疫的小鼠中，在8/8的耳和6/8的引流淋巴结中没有检测到寄生虫。相比之下，在用利什-110f+MPL-SE免疫的小鼠中，在4/8的耳和2/8的引流淋巴结中没有检测到寄生虫。在控制硕大利什曼虫感染中，GLA-SE比MPL-SE更有效。

[0378] 总之，将稳定油制剂中的GLA添加到利什曼虫疫苗抗原候选物利什-110f中控制了由于硕大利什曼虫寄生虫激发引起的耳和引流淋巴结中的寄生虫负荷。此外，在控制从感染的组织收集的寄生虫的数目中，GLA-SE比MPL-SE更有效。

[0379] 实施例20

[0380] 含GLA的疫苗的体内应用

[0381] 本实施例描述了表明含有OVA抗原的慢病毒疫苗中GLA的佐剂作用的体内模型。采用了标准的免疫学方法和试剂(Current Protocols in Immunology(免疫学实验指南)，Coligan et al.(Eds.)2006John Wiley & Sons，NY)。

[0382] 用盐水、慢病毒疫苗或作为稳定乳剂同时给予的慢病毒疫苗对每处理组的五只C57BL/6小鼠免疫一次，所述稳定乳剂含有20μg的GLA(Avanti Polar Lipids，Inc.，Alabaster，AL；产品号699800；每次免疫给予每只动物)，按照上文实施例3中所用的步骤(GLA-SE)。注射后两周，移除脾细胞并且通过多参数流式细胞仪评估T细胞免疫原性(表型和效应功能)。

[0383] 将脾细胞接种于24孔板中并且用2μg/ml抗-CD28(eBioscience，San Diego，CA)、抗-CD49d(eBioscience)和作为抗原的20μg/ml OVA(或伴有PMA/离子霉素，或不伴有抗原作为阴性对照)的完全培养液于37℃离体刺激过夜。在37℃孵育2小时后，将布雷菲德菌素A(GolgiPlug：BD Biosciences，San Jose，CA)加入到孔中然后恢复37℃孵育，再持续12小时。用50μl中1∶50的抗-CD16/32(eBioscience)封闭细胞，然后用AlexaFluor 700-抗-CD3(eBioscience)，PerCP-抗-CD4(BDBiosciences)，和PE-抗-CD8(BD Biosciences)染色。使用Cytofix/Cytoperm试剂盒(BD Biosciences)固定细胞并且按照BDBiosciences手册进行细胞内染色。用抗-CD16/32封闭细胞
并 用 FITC- 抗 -TNF-α(eBioscience)、Pacific Blue- 抗 -IL-2(eBioscience) 和PE-Cy7-抗-IFN-γ(BD Biosciences)进行 细胞内 染色。用LSRII FACS装 置(BD Biosciences)和DIVA软件分析细胞，以对产生IFN-γ、IL-2和TNF-α的CD4+T细胞进行定量。

[0384] 图13显示了在存在和不存在GLA-SE的情况下，相对于盐水对照，用表达OVA抗原的慢病毒疫苗免疫的小鼠中CD8(图A-C)和CD4(图D-F)应答。显示了每组的平均值。

[0385] 来自慢病毒载体疫苗加GLA-SE的动物中的脾细胞比来自接受单独慢病毒疫苗的动物的脾细胞具有更高的CD8+CD44+以及CD4+CD44+细胞因子分泌细胞的百分比。将GLA-SE添加到慢病毒疫苗免疫导致产生抗原特异性三重细胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2)的T细胞的频数增加。

[0386] 总之，将稳定油制剂中的GLA添加到慢病毒载体疫苗中提高了在针对多种感染的保护中可能起重要作用的效应T细胞的数量和质量。

[0387] 实施例21

[0388] 含GLA的疫苗的体内应用

[0389] 本实施例描述了表明在针对流感的疫苗中GLA-SE的佐剂作用的体内模型。采用了标准的免疫学方法和试剂(Current Protocols in Immunology(免疫学实验指南)，Coligan et al.(Eds.)2006John Wiley & Sons，NY)。

[0390] 利用微针(NanoPass Technologies Ltd.，Nes Ziona，Israel)，使用i)包含GLA的稳定乳剂“GLA-SE”(Avanti Polar Lipids，Inc.，Alabaster，AL；产品号699800；每次免疫给予每只动物5μg)和Fluzone (Sanofi Pasteur，Stillwater PA；2μg和0.2μg处理组)；ii)稳定乳剂(SE)加Fluzone或iii)单独Fluzone i.d.免疫每处理组3只Balb/c小鼠两次，每次间隔3周(总体积为100μl；每条后腿50μl)。使用包含来自A/New Caledonia/20/99(H1N1)、A/Wisconsin/67/2005(H3N2)和B/Malaysia/2506/2004的组分的2006-2007商业Fluzone配方免疫小鼠。第二次免疫后一周从小鼠取血，血清用于分析对Fluzone的抗体应答。

[0391] 在使用Fluzone与GLA-SE的组合免疫的小鼠中，IgG2a应答是主要的。增强免疫后一周，在该处理组中诱导显著更高的抗Fluzone抗体(总IgG和IgG2a)水平(参见图14中的图A-B)。在所有处理组中，IgG1抗体水平是相似的(参见图14中的图C)。与接受单独Fluzone疫苗增强免疫的小鼠相比，在接受Fluzone加GLA-SE增强免疫的小鼠中可观察到终点抗体滴度显著增加(例如，图14，将“GLA-SE”处理组(Fluzone加GLA-SE)与“(-)”处理组(Fluzone)进行比较)。与接受单独Fluzone疫苗增强免疫的小鼠相比，在接受Fluzone与稳定乳剂(SE)的组合的增强免疫的小鼠中未观察到抗体滴度的差异(例如，图14，将“SE”处理组(Fluzone加SE)与“(-)”处理组(Fluzone)进行比较)。

[0392] 响应于Fluzone疫苗与GLA-SE的组合的总IgG和IgG2a抗体滴度得到增强。对于2μg和0.2μg剂量的Fluzone疫苗与GLA-SE的组合，GLA-SE的辅助效果相似。这些结果提示通过用GLA-SE辅助Fluzone疫苗，可以降低Fluzone疫苗的剂量，并且仍诱导高水平的IgG和IgG2a抗体滴度。

[0393] 实施例22

[0394] 含GLA的疫苗的体内应用

[0395] 本实施例描述了表明在针对流感的疫苗中GLA-SE的佐剂作用的体内模型。采用了标准的免疫学方法和试剂(Current Protocols in Immunology(免疫学实验指南)，Coligan et al.(Eds.)2006John Wiley & Sons，NY)。

[0396] 使用i)包含GLA的稳定乳剂“GLA-SE”(Avanti Polar Lipids，Inc.，Alabaster，AL；产品号699800；每次免疫给予每只动物5μg)和Fluzone (Sanofi Pasteur，Stillwater PA；0.2μg)；ii)稳定乳剂(SE)加Fluzone或iii)单独Fluzone i.m.免疫每处理组3只Balb/c小鼠两次，每次间隔3周(总体积为100μl；每条后腿50μl)。
使 用 包 含 来 自A/New Caledonia/20/99(H1N1)、A/Wisconsin/67/2005(H3N2) 和 B/Malaysia/2506/2004的组分的2006-2007商业Fluzone配方免疫小鼠。在使用盐水、单独Fluzone、Fluzone加SE或Fluzone加GLA-SE i.m.增强后三周，收获脾。

[0397] 将脾细胞接种在48孔板中并用H1N1抗原(流感病毒A H1N1，New Caledonia，Fitzgerald Industries，Concord MA)或培养基(例如，阴性对照)离体刺激，72小时后收集上清。按照生产商的说明书，使用特异性夹心ELISA分析试剂盒(eBiosciences，San Diego，CA)分析上清的可溶性鼠细胞因子，包括IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-5。

[0398] 与未刺激的对照相比，在用H1Nl抗原刺激脾细胞之后，使用Fluzone(0.2μg)加GLA-SE(5μg)免疫的小鼠具有显著更高的IFN-γ和IL-2细胞因子水平(图15)。此外，在H1N1抗原刺激后，处理组ii-iv未能表现出IFN-γ和IL-2的显著增加。相比之下，用Fluzone(0.2μg)和SE免疫的小鼠表现出不同的细胞因子谱，例如，与其他处理组相比显著更高的IL-5和IL-10水平。

[0399] 这些结果表明与其他处理组相比，用Fluzone加GLA-SE免疫的小鼠产生显著的TH1型T细胞细胞因子应答。Th1细胞因子应答被认为在针对多种感染的保护中起重要作用。

[0400] 实施例23

[0401] USP兔致热原测试

[0402] 使用美国药典(USP)兔致热原测试方法评估了GLA和MPL的致热源性/毒性。在与通常用于MPL的相同剂量和条件下测试GLA。在评估的剂量下，GLA和MPL均通过了USP<151>对于无致热原的要求。这些数据表明GLA与MPL相比的意外的高功效与毒性增加不相关。因此，较低剂量的GLA可被用于实现相对于MPL相同或提高的功效，并同时由于需要的剂量较低而具有相应降低的致热原性。

[0403] 实施例24

[0404] 用Fluzone +GLA免疫后对于A/H3N2漂变流感病毒的交叉保护体液和细胞免疫应答

[0405] 目前批准的流感疫苗很少刺激辅助T细胞1(Th1)抗流感细胞应答并且针对疫苗中未包含的漂变流感株提供微弱的血清学保护。本实施例评价了配制在水包油型乳剂中的GLA对Fluzone 流感疫苗的辅助能力。与单独Fluzone或与单独乳剂配制的Fluzone的接种相比，GLA增强Fluzone疫苗的功效并且拓宽其针对漂变A/H3N2流感变体的血清学保护。此外，GLA辅佐的疫苗诱导了对所有评估的A/H3N2株交叉反应的Th1细胞应答。

[0406] 材料和方法

[0407] 1.小鼠：

[0408] 雌性Balb/c小鼠购自Charles River Laboratories(Wilmington，MA)并保持在传染病研究院(Infentious Disease Research Institute)动物中心中的特定无病原体的条件下。使用六至七周龄的小鼠。

[0409] 2.免疫：

[0410] 包 含 来 自 A/New Caledonia/20/99(H1N1)、A/Wisconsin/67/2005(H3N2)和B/Malaysia/2506/2004的 抗原 的2006-2007 Fluzone 流 感 疫苗 获自 Sanofi Pasteur(Swiftwater，PA)。用水包油型乳剂EM001(EM)或包含20μg GLA的水包油型乳剂辅佐Fluzone。在第0天(首次免疫)和第21天(增强)，单独用0.2μg 2006-2007 Fluzone流感疫苗或用佐剂制剂肌肉内免疫小鼠。在初步实验(数据未显示)中，0.2μg剂量被确定为次优的。用单独盐水注射阴性对照小鼠。

[0411] 3.流感株和抗原：

[0412] 将 纯 化 的 A/Wisconsin/67/2005(Wis/05)、A/Brisbane/10/2007(Bris/07)、A/Wyoming/03/2003(Wyo/03)和A/Panama/2007/1999(Pan/99)株用于血细胞凝集抑制检测、ELISPOTS和脾细胞培养。对于血细胞凝集抑制检测和脾细胞刺激，Wis/05、Wyo/03和Pan/99株由疾病控制与预防中心(Atlanta，GA)提供并且Bris/07株购自ProSpec(Rehovot，Israel)。所有使用的病毒都在胚蛋的尿囊腔生长并且在-80℃保存直至使用。对于ELISPOT，纯化的并浓缩的Wis/05、Bris/07和Wyo/03病毒抗原购自ProSpec。

[0413] 4.血细胞凝集抑制检测：

[0414] 在首次免疫后一周和增强后一周收集血清。通过用受体破坏酶(RDE，来自霍乱弧菌(Vibrio cholera)，Denka-Seiken，Tokyo，Japan)处理血清以去除非特异性抑制剂来测定血细胞凝集抑制(HI)抗体活性。通过已建立的手段，使用4血凝单位(HAU)的病毒和0.5％火鸡红细胞(Rockland Immunochemicals，Gilbertsville，PA)评价了血清中对于2006-2007 Fluzone A/H3N2组分Wis/05特异性的和对包括Bris/07、Wyo/03和Pan/99流感株在内的自2001年以来其他季节性流感疫苗的A/H3N2组分特异性的抗血细胞凝集抗体的存在(Kendal AP SJ，Pereira MS.In：Concepts and procedures for laboratory-based influenza surveillance.(基于实验室方法的流感监控的设计与操作)Atlanta：CDC，
1982：B17-35)。HI滴度定义为完全抑制火鸡红细胞凝集的血清最大稀释度的倒数。10的HI滴度被指定为代表低于测试检测限的应答。对来自每疫苗组的七只小鼠的血清进行HI测试并且一式两份测试每个个体血清样品。

[0415] 5.骨髓浆细胞ELISPOT：

[0416] 通过ELISPOT定量抗原特异性骨髓浆细胞。第二次免疫后五周，收集骨髓并制备7 6
单细胞悬浮液。将细胞以1×10 细胞/ml至1×10 细胞/ml接种在用50μg/ml纯化的病毒抗原包被的MultiScreen HA96孔板(Millipore，Bedford，MA)中。将细胞在37℃孵育
4小时，然后冲洗并与HRP结合的羊抗小鼠IgG(H+L)(SouthernBiotech，Birmingham，AL)在4℃孵育过夜。用PBS-0.1％吐温20和PBS冲洗板，并使用Vectastain AEC底物试剂盒(Vector Laboratories，Burlingame，VA)，按照生产商的手册进行显影。通过用去离子水冲洗板来停止显影，将板干燥并在自动ELISPOT读数仪(C.T.L.Serie3A Analyzer，cellular Technology Ltd，Cleveland，OH)计数斑点，并用Immunospot 软件(CTL Analyzer LLC)分析。

[0417] 6.细胞因子分析：

[0418] 第二次免疫后七周，将小鼠无痛处死并收集脾脏(每疫苗组n＝4)和制备单细胞悬浮液。在用RBC裂解缓冲液(eBioscience，San Diego，CA)裂解红细胞之后，将细胞调整7
为1×10 活细胞/ml。在5HAU的灭活的Wis/05、Bris/07、Wyo/03或Pan/99流感病毒的
6
存在下，将细胞悬浮液以5 细胞/孔接种在24孔板中。按照从Lu et al.(Lu X，Vaccine
2002；20(7-8)：1019-29)调整的方法将细胞在5％CO2中、37℃下培养72小时。收集培养上清并通过ELISA(eBioscience，San Diego，CA)测定IFN-γ、IL-2、IL-5和IL-10水平。

[0419] 7.统计学分析：

[0420] 使用适用于Windows系统的GraphPad Prism version 4.00(GraphPad Software，San Diego，CA)，通过标准单因素方差分析使用组件图基多重比较测试进行数据的统计学分析。

[0421] 结果

[0422] 1.Fluzone+GLA的制剂增强和拓宽血细胞凝集抑制抗体活性。

[0423] 拓宽流感疫苗诱导的抗体应答可以潜在地提供针对季节性疫苗接种的组合物确定之后产生的抗原漂变流感株的覆盖范围。为评估EM和GLA与2006-2007 Fluzone流感疫苗配制时增强针对抗原漂变流感病毒的血清抗体活性的能力的佐剂活性，我们比较了在实验性疫苗接种之后针对漂变A/H3N2流感变体所诱导的HI滴度。首次免疫之后一周和增强后一周，测定了针对疫苗株和包含在自2001年以来的季节性流感疫苗中的三种抗原漂变A/H3N2株的HI滴度。根据编码血细胞凝集素蛋白的球状头部区的序列推测A/H3N2株之间的系统发生关系并且在图16示出(Tamura et al.，MEGA4：Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA)software version 4.0(MEGA4：分子演化遗传学分析(MEGA)软件版本4.0)4ed，2007)。

[0424] Fluzone+GLA引起超过单独使用Fluzone免疫的针对疫苗和漂变的A/H3N2株的HI滴度的最大增加。在第一次免疫之后，与用Fluzone单独免疫相比，只有与GLA配制的疫苗显著增加针对疫苗和漂变的A/H3N2株的HI滴度。此外，与用与EM配制的Fluzone免疫相比，Fluzone+GLA还显著增加针对漂变的Bris/07、Wyo/03和Pan/99株的HI抗体滴度。图17A-B显示了来自首次免疫一周(A)和增强后一周(B)的免疫的小鼠的血清HI抗体应答。尽管Fluzone+EM刺激高于Fluzone单独的针对疫苗株的HI滴度，但是增强能诱导更高的滴度。有趣的是，Fluzone+EM同等地增强针对疫苗和漂变的Bris/07和Wyo/03株的HI滴度(分别超过单独Fluzone 16、16和15倍)(图18)。相比之下，Fluzone+GLA增加针对疫苗株的HI滴度，超过单独Fluzone 22倍，并且显著地增加针对漂变的Bris/07和Wyo/03株的HI滴度，分别超过单独Fluzone 48倍和35倍。这些数据表明流感疫苗与GLA的组合不仅增强疫苗功效，还能诱导具有更宽的针对抗原漂变流感株的活性的抗体。

[0425] 2.Fluzone+GLA提供长期体液应答

[0426] 疫苗的重要性质是提供针对感染的持久保护。为了检测EM和GLA在与Fluzone配制时诱导长期体液免疫相关细胞的效果，我们计算了针对Wis/05、Bris/07和Pan/99流感株的抗原特异性骨髓浆细胞(BMPC)。与用单独Fluzone疫苗接种相比，仅Fluzone+GLA疫苗显著增加针对评估的所有三种A/H3N2株的病毒特异性IgG分泌BMPC水平，所述三种A/H3N2株包括疫苗株Wis/05(～11倍；P＜0.001)和漂变的Bris/07(～16倍；P＜0.01)和Pan/99(～10倍；P＜0.01)(图19)。GLA辅佐的Fluzone疫苗还产生显著多于用Fluzone+EM免疫的Wis/05特异性BMPC(～2倍；P＜0.01)。这些数据表明将Fluzone与GLA配制可以诱导不仅针对疫苗株还针对抗原漂变的流感变体的持久体液应答。

[0427] 3.Fluzone+GLA引起有效的和交叉反应性的Th1主导的细胞应答

[0428] Th1主导的细胞应答在动物模型中流感病毒的清除中起重要作用并且与保护老年人群免受流感相关疾病是有关的。因此，我们评估了GLA和EM配制的Fluzone疫苗引起病毒特异性细胞因子应答的能力。用疫苗株或抗原漂变的A/H3N2流感病毒刺激来自用单独或伴有EM或GLA的Fluzone免疫的小鼠的脾细胞。对于用于刺激脾细胞的所有A/H3N2株的细胞因子应答是相当的，这提示细胞应答最可能是针对于抗原混合物中的保守蛋白(图20A)。与来自于用Fluzone+EM或单独Fluzone免疫的小鼠的细胞相比，Fluzone+GLA接种的小鼠诱导显著更高的IFN-γ和IL-2水平。与GLA成鲜明对比，与EM配制的疫苗诱导强的病毒特异性Th2细胞因子应答，其特征在于与单独Fluzone或Fluzone+GLA相比的显著更高的IL-10和IL-5水平。

[0429] 脾细胞培养物上清中的IFN-γ水平与IL-10水平的比较表明GLA明确地引导朝向IFN-γ主导的Th1应答的应答。结果表明，将GLA添加到水包油型乳剂中通过选择性地增强Th1细胞应答而显著地转变细胞因子谱。这些数据提示，通过制备Fluzone可以调节病毒特异性记忆应答：引入水包油型乳剂引导Th2应答，而添加GLA驱动Th1应答。

[0430] 本说明书中引用的和/或申请数据表中列出的所有上述美国专利、美国专利申请公布、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物都通过引用的方式将其整体并入本文。

[0431] 通过上述，应当理解，尽管为了说明的目的在本文中描述了本发明的具体实施方案，但可以进行各种变化，而不脱离本发明的实质和范围。因此，本发明仅受所附的权利要求书的限制。