本发明涉及一种制备多肽或其医药上可接受盐的方法，所述方法包含使包含L-丙氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸和经保护基保护的L-赖氨酸的L-赖氨酸经保护多肽在水中与四烷基氢氧化铵反应以去除所述保护基。
1.一种制备多肽或其医药上可接受盐的方法，其中所述多肽包含L-丙氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸和L-赖氨酸，并且所述方法包含使包含L-丙氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸和经第一保护基保护为酰胺基的L-赖氨酸的L-赖氨酸经保护多肽在水中与四烷基氢氧化铵反应以去除所述第一保护基。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述四烷基氢氧化铵是四C1-C8烷基氢氧化铵。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述四烷基氢氧化铵选自由以下组成的群组:四甲基氢氧化铵、四乙基氢氧化铵、四丁基氢氧化铵和其组合。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述四烷基氢氧化铵是四丁基氢氧化铵。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述第一保护基选自由以下组成的群组:烷羰基、烷氧羰基、芳羰基和芳氧羰基。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述第一保护基是三氟乙酰基。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述L-赖氨酸经保护多肽是通过包含以下的方法来制备: a)使L-丙氨酸的N-羧基酸酐、L-酪氨酸的N-羧基酸酐、经第二保护基保护的L-谷氨酸的N-羧基酸酐与经所述第一保护基保护的L-赖氨酸的N-羧基酸酐的混合物在溶剂中聚合以获得经保护多肽;和 b)去除所述第二保护基以获得所述L-赖氨酸经保护多肽。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述第二保护基是通过使步骤a)中的所述经保护多肽与氢溴酸在乙酸中反应来去除。
9.如权利要求8所述的方法，其包含用C5-C12烷烃洗涤在所述经保护多肽与氢溴酸在乙酸中的所述反应期间形成的所述反应混合物的另一步骤。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述C5-C12烷烃是庚烷。
11.如权利要求7所述的方法，其中所述第二保护基选自由以下组成的群组:苄基和叔丁基。
12.如权利要求7所述的方法，其中所述第二保护基是苄基。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述多肽或其医药上可接受盐是乙酸格拉默(glatirameracetate)。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述四烷基氢氧化铵碱的量相对于所述经所述第一保护基保护的L-赖氨酸小于10摩尔当量。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述四烷基氢氧化铵碱的量相对于所述经所述第一保护基保护的L-赖氨酸为1.5至6摩尔当量。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述四烷基氢氧化铵碱的量相对于所述经所述第一保护基保护的L-赖氨酸为3摩尔当量。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包含在任何另一纯化并分离所述多肽的步骤之前通过透析来纯化并分离所述多肽的步骤。
18.如权利要求1所述的方法，其中第一保护基选自如下构成的群组:甲氧基羰基、乙氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基、三氟乙酰基、2，2，2-三氯乙氧基羰基、三氯乙酰基、甲代吡啶基和其组合。
19.如权利要求1所述的方法，其中所述反应在20-25℃进行24小时。
乙酸格拉默(GLATIRAMER ACETATE)的合成
[0001] 相关申请案交叉参考
[0002] 本申请案主张在2008年8月7日申请的美国临时专利申请案第61/188,216号的优先权。此临时申请案的全部内容是以引用方式并入本文中。
技术领域
[0003] 本申请案涉及合成多肽的方法，所述多肽在结构中包含以下氨基酸单元，即L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-赖氨酸和L-酪氨酸。乙酸格拉默(glatiramer acetate)还称作共聚物-1，其为本发明的代表性多肽。
背景技术
[0004] 乙酸格拉默是已批准用于治疗多发性硬化症的多肽混合物。其是化学合成多肽的乙酸盐的混合物，所述多肽含有四种天然氨基酸：L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-赖氨酸和L-酪氨酸，其平均摩尔比通常分别为0.392-0.462、0.129-0.159、0.300-0.374和0.086-01000。乙酸格拉默的平均分子量为4,700-11,000道尔顿。
[0005] 在化学上，指明乙酸格拉默为L-谷氨酸与L-丙氨酸、L-赖氨酸和L-酪氨酸的聚合物的乙酸盐(盐)。其结构式为：(Glu，Ala，Lys，Tyr)x.xCH3COOH。其CAS编号为147245-9-2-9。
[0006] 制备包括乙酸格拉默在内的此类多肽的方法已阐述于以下文献中：美国专利第3,849,550号和第5,800,808号；美国专利公开案第2006/0172942号、第2006/0154862号和第2007/0141663号。这些专利和专利公开案的全部内容是以引用方式并入本文中。此类多肽的制备方法是基于酪氨酸的N-羧基酸酐、L-丙氨酸的N-羧基酸酐、经保护L-谷氨酸的N-羧基酸酐与经保护L-赖氨酸的N-羧基酸酐的共聚合以形成经保护共聚物。经保护L-谷氨酸的解封闭是通过酸解或氢解来实现(第一去保护)并且随后通过碱裂解自L-赖氨酸去除保护基(第二去保护)。
[0007] 通常，通过三氟乙酰基来保护L-赖氨酸，并使用诸如哌啶等具有弱碱性的含氮碱来去除L-赖氨酸的保护基。含氮碱通常具有超过1M的浓度且数量超过L-赖氨酸的35摩尔当量。所述方法既不经济也不环保。
[0008] 因此，业内期望改良诸如乙酸格拉默等多肽的生产。
发明内容
[0009] 本申请案提供制备多肽或其医药上可接受盐的方法。多肽包含L-丙氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸和L-赖氨酸。所述方法包含使L-赖氨酸经保护多肽(其包含L-丙氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸和经第一保护基保护的L-赖氨酸)在水中与四烷基氢氧化铵反应以去除第一保护基。
[0010] 优选地，四烷基氢氧化铵是四C1-C8烷基氢氧化铵。更优选地，四烷基氢氧化铵是四甲基氢氧化铵、四乙基氢氧化铵或四丁基氢氧化铵，尤其是四丁基氢氧化铵。
[0011] 第一保护基可为可防止赖氨酸发生不期望反应并且随后可易于去除的任何基团。例如，可通过烷氧羰基或芳氧羰基和/或烷羰基或芳羰基、更优选地通过选自以下的基团以氨基甲酸酯和/或酰胺形式来保护赖氨酸：甲氧基羰基、乙氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基、三氟乙酰基、2，2，2-三氯乙氧基羰基、三氯乙酰基、甲代吡啶基和其组合。更具体来说，第一保护基是三氟乙酰基。
[0012] L-赖氨酸经保护多肽可通过任何适宜方法来制备。优选地，其可通过包含以下步骤的方法来制备：
[0013] a)使L-丙氨酸的N-羧基酸酐、L-酪氨酸的N-羧基酸酐、经第二保护基保护的L-谷氨酸的N-羧基酸酐与经第一保护基保护的L-赖氨酸的N-羧基酸酐的混合物在溶剂中聚合以获得经保护多肽；和
[0014] b)去除第二保护基以获得L-赖氨酸经保护多肽。
[0015] 或者，聚合步骤中所用氨基酸中至少一者可呈N-硫代羧基酸酐形式，而非N-羧基酸酐形式(参见美国专利申请公开案第2009/0035816号，其全部内容是以引用方式并入本文中)。
[0016] 第二保护基可为可防止L-谷氨酸发生不期望反应并且随后可易于去除的任何适宜基团。例如，可通过烷基和/或芳香族基团、优选地通过选自以下的基团以酯形式来保护L-谷氨酸：环己基、苄基、叔丁基、烯丙基酯、金刚烷基、9-芴基甲基和其组合。更优选地，第二保护基选自由以下组成的群组：苄基和叔丁基，尤其是苄基。
[0017] 去除第二保护基的步骤(即去保护)可通过(例如)碱裂解、酸解、硫解、氢化或酶催化水解来完成。
[0018] 根据本发明一实施例，去保护步骤包含向经保护多肽添加酸。酸可为(例如)存于选自乙酸、二噁烷、乙酸乙酯和其混合物的溶剂介质中的氢溴化物、三氟乙酸或氯化氢。作为优选实施例，酸是溶于乙酸中的氢溴酸。优选地，所述方法包含用C5-C12烷烃、尤其庚烷洗涤在去保护步骤期间形成的反应混合物的另一步骤。
[0019] 根据本申请案的方法制备的多肽或其医药上可接受盐优选地为乙酸格拉默。
[0020] 四烷基氢氧化铵碱的浓度优选地为约0.5M。四烷基氢氧化铵碱的量相对于经第一保护基保护的L-赖氨酸的摩尔量小于10摩尔当量，优选地为1.5至6摩尔当量，更优选地为约3摩尔当量。
[0021] 优选地，在去除第一保护基并合成多肽后，所述方法包含通过透析纯化并分离多肽的步骤。更优选地，此纯化和分离是在任何另一纯化与分离步骤(若存在)之前实施。可通过对水的单一透析来分离或纯化多肽。
[0022] 作为优选实施例，本发明中使用的四烷基氢氧化铵碱可具有约40％(以重量计)的水溶液浓度。四烷基氢氧化铵碱相对于经第一保护基保护的赖氨酸的摩尔量可为1.5-6。在去除第一保护基期间使用的水量相对于赖氨酸经保护多肽的量可为约10重量份。去除第一保护基的其它反应条件可包括：反应温度：20至25℃，反应时间：24小时，和反应压力：标准大气压。
[0023] 根据另一实施例，本申请案提供根据上述方法产生的新颖多肽。
[0024] 与其它方法相比，本申请案中的方法具有以下优点：
[0025] 申请人发现碱性稍强于具有弱碱性的含氮碱(例如哌啶)的含氧碱可使第一保护基去除保护。为去除第一保护基，本申请案中所用碱相对于经第一保护基保护的赖氨酸的摩尔量可远小于其它公开案中所述方法中所用含氮碱的摩尔量。本申请案中所用含氧碱的浓度也可远小于其它方法中所用含氮碱的浓度。在上述反应中获得的多肽聚合物的浓度高于通过申请人已知的其它方法获得者。因此，本发明方法比所报导其它方法更加经济并且更易于处理。另外，由于可在处理后实施透析而不是如其它公开案所述在透析后处理，因此本申请案的方法可节省产物制备的处理时间。
[0026] 在形成本揭示内容一部分的随附权利要求书中特别指明表征本发明的各种新颖性特征。为更好地理解本发明、其操作优点和通过其使用达成的具体目标，应参照阐释并描述本发明优选实施例的说明性内容。
具体实施方式
[0027] 提供以下实例来阐释而非限制本发明各实施例。根据本发明一实施例，并且如下文各实例所述，制备共聚物的方法涉及通过L-丙氨酸的N-羧基酸酐、L-谷氨酸γ-苄酯的N-羧基酸酐、N-三氟乙酰基赖氨酸的N-羧基酸酐与L-酪氨酸的N-羧基酸酐的聚合来制备经保护共聚物。通过在水中依次与33％HBr/HOAc和四烷基氢氧化铵反应来去除保护基以获得格拉默。
[0028] 乙酸格拉默可通过经由透析纯化共聚物，之后用乙酸处理以形成乙酸盐来获得。作为一实施例，所述方法因此可涉及四种N-羧基酸酐的聚合、两个纯化步骤和一个乙酸盐形成步骤。
[0029] 实例1
[0030] 经保护共聚物的制备
[0031] 将L-丙氨酸的N-羧基酸酐(4.0g，34.78mmol)、L-谷氨酸γ-苄酯的N-羧基酸酐(3.0g，11.39mmol)、N-三氟乙酰基赖氨酸的N-羧基酸酐(7.47g，mol)和L-酪氨酸的N-羧基酸酐(1.6g，7.73mmol)置于具有磁性搅拌器的单颈烧瓶中。通过添加无水二噁烷(289mL)溶解此混合物。添加蒸馏二乙胺(60μL)。在室温下将所得混合物以机械方式搅拌24小时。将丙酮(116mL)添加至混合物中并将溶液缓慢倾倒至丙酮(173mL)与水(578mL)的混合物中。搅拌并过滤悬浮液。在真空和NMT 45℃下干燥固体以获得12.02g经保护共聚物(产率为94.7％)。
[0032] 实例2
[0033] 自聚[L-Ala，5-苄基-L-Glu，N6-TFA-L-Lys，L-Tyr]去除苄基保护基以形成聚[L-Ala，L-Glu，N6-TFA-L-Lys，L-Tyr]
[0034] 使12.02g如实例1中所述合成的经保护共聚物悬浮于72mL 33％HBr/HOAc中。在室温下将混合物搅拌17小时且溶液变澄清。用正庚烷(190mL)萃取并洗涤混合物。将混合物下层转移至水(240mL)与正庚烷(120mL)的混合物中。过滤沉淀并干燥以获得呈白色固体形式之三氟乙酰基-格拉默。
[0035] 实例3
[0036] 自聚[L-Ala，L-Glu，N6-TFA-L-Lys，L-Tyr]去除三氟乙酰基保护基以形成聚[L-Ala，L-Glu，L-Lys，L-Tyr]
[0037] 在室温下使9.5g在实例2中合成的三氟乙酰基-格拉默与水(120.2mL)和40％
