鲑鱼肾杆菌实时荧光RT-PCR检测方法和试剂盒

摘要

本发明建立了检测鲑鱼肾杆菌的Taq Man实时荧光定量PCR，优化反应条件，经特异性、敏感性及临床应用试验，表明该方法特异性强，敏感度高，适于鲑鱼肾杆菌的快速诊断和口岸检疫，也为鲑科鱼类的疫病调查、鲑鱼肾杆菌的流行病学研究提供了一种可靠方法。

权利要求

1.鲑鱼肾杆菌(Renibacterium salmoninarum)的实时荧光RT-PCR非诊断目的的检测方法，所述方法包括利用特异性探针和引物对，以细菌DNA为模板进行实时荧光RT-PCR反应，其特征在于：所述引物对分别为Seq ID No.1和Seq IDNo.2所示的序列；

Seq ID No.1：5’—CCG AAG AGC CCA CCAATG AC—3’Seq ID No.2：5’—GAC TTA GAC GAC GCC GTA GC—3’所述探针为能与鲑鱼肾杆菌的基因组DNA位于所述引物对之间的序列相同或互补、且长度为15~30bp的寡核苷酸序列，并且所述探针的5’端和3’端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团；

所述探针为Seq ID No.3所示的序列,

Seq ID No.3：5’—CGG ATT GCC GTC GCC GCA GC—3’。

2.根据权利要求1所述的非诊断目的的检测方法，其特征在于：所述探针5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。

3.根据权利要求1或2所述的非诊断目的的检测方法，其特征在于：所述RT-PCR反应的引物终浓度为0.9～1.1μmol/L，探针终浓度为0.09~0.11μmol/L。

4.根据权利要求1或2所述的非诊断目的的检测方法，其特征在于：所述RT-PCR的反应的退火温度为53℃~57℃。

5.根据权利要求4所述的非诊断目的的检测方法，其特征在于：所述RT-PCR的反应条件包括：50℃，2min；94℃，10min；40循环：94℃20s，55℃40s。

6.鲑鱼肾杆菌(Renibacterium salmoninarum)的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有能扩增出鲑鱼肾杆菌的基因片段的引物对，所述引物对分别为Seq ID No.1和Seq ID No.2所示的序列,Seq ID No.1：5’-CCG AAG AGC CCA CCA ATG AC3’Seq ID No.2：5’-GAC TTA GAC GAC GCC GTA GC3’；

所述检测试剂盒用于实时荧光RT-PCR检测，并且所述试剂盒还含有能与鲑鱼肾杆菌的基因组DNA位于所述引物对之间的序列相同或互补、且长度为15~30bp的寡核苷酸探针，并且所述探针的5’端和3’端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团；

所述探针为Seq ID No.3所示的序列,

Seq ID No.3：5’-CGG ATT GCC GTC GCC GCA GC3’。

7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于：所述探针5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。

说明书

鲑鱼肾杆菌实时荧光RT-PCR检测方法和试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物的检测方法和检测试剂盒，特别是涉及鲑鱼肾杆菌实时荧光RT-PCR检测法和试剂盒。

背景技术

[0002] 细菌性肾病(Bacterial Kidney Disease，BKD)又称Dee病，是由鲑鱼肾杆菌(Renibacterium salmoninarum)引起鲑科鱼类的一种慢性传染病。1930年首次报道BKD在棕鲑、虹鳟和溪鳟中发生。此后，在加拿大、智利、英国、法国、德国、冰岛、意大利、西班牙、南斯拉夫等地养殖的14种鲑科鱼类均有发生(Austin，B.Austin，D.A.Baterial Fish Pathogens：Disease ofFarmed and Wild Fish[M].Praxis Publishing Ltd，Chichester，1999，17-18.)。鲑鱼肾杆菌属于革兰氏阳性细菌，对人工养殖和天然的许多种鲑科鱼类，尤其是大麻哈鱼造成巨大的经济损失。Evenden等报道，BKD可对太平洋鲑鱼(Oncorhynchus spp.)和大西洋鲑鱼(Salmo salar)的野生种群造成80％和40％的损失(Evenden，AJ，Grayson TH，Gilpin ML，et al.Renibacterium salmoninarum and bacterial kidney disease-the unfinishediigsaw[J].Annu Rev Fish Dis，1993，3：87-104)。BKD潜伏期长，常呈慢性感染，此时，病鱼没有任何外部症状，或者仅仅出现体表变黑、腹水、贫血、轻度溃疡等症状，但在适宜温度(13～18℃)下，鲑鱼肾杆菌能引起鲑科鱼类急性发病，大量死亡。

[0003] 鲑鱼肾杆菌的生长条件苛刻，生长速度缓慢，造成对该病的诊断十分困难。目前的诊断方法主要依靠常规的细菌分离鉴定和免疫学技术(直接荧光抗体试验、间接荧光抗体试验和酶联免疫吸附试验)。但这些方法费时费力，灵敏度低，特异性较差，难以满足鲑鱼肾杆菌的流行病学调查、现场诊断和口岸快速检测的需要。因此，迫切需要建立检测周期短、灵敏度高、特异性强的检测方法。

[0004] 实时荧光技术，是近年来新问世的一种高敏感性的检测技术，它融合了PCR技术的核酸高效扩增，探针技术的高特异性，光谱技术的高敏感性和高精确定量等优点，直接探测PCR过程中荧光信号的变化以获得定量的结果，它可以做到每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，做到真正意义上的定量。同时该技术在密闭系统内完成检测，不需要常规PCR的电泳观察环节，减少了对工作环境的污染，降低假阳性结果发生。因此，自从该技术建立以来，迅速、广泛地应用于植物、动物和人类的寄生虫，病毒和细菌等病原的检测研究中。

发明内容

[0005] 本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种能够快速、高灵敏度的鲑鱼肾杆菌实时荧光RT-PCR检测方法。

[0006] 本发明的另一目的在于提供一种鲑鱼肾杆菌的检测试剂盒。

[0007] 为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

[0008] 本发明公开了鲑鱼肾杆菌(Renibacterium salmoninarum)的实时荧光RT-PCR检测方法，所述方法包括利用特异性探针和引物对，以细菌DNA为模板进行实时荧光RT-PCR反应，所述引物对分别含有Seq ID No.1和Seq ID No.2所示的序列；

[0009] Seq ID No.1：5’-CCG AAG AGC CCA CCA ATG AC-3’

[0010] Seq ID No.2：5’-GAC TTA GAC GAC GCC GTA GC-3’

[0011] 所述探针为能与鲑鱼肾杆菌的基因组DNA位于所述引物对之间的序列相同或互补、且长度为15～30bp的寡核苷酸序列，并且所述探针的5’端和3’端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。

[0012] 优选的，所述探针含有Seq ID No.3所示的序列，

[0013] Seq ID No.3：5’-CGG ATT GCC GTC GCC GCA GC-3’。

[0014] 在本发明的具体实施方式中，所述探针5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。

[0015] 所述RT-PCR反应的引物终浓度优选为0.9～1.1μmol/L，更优选1.0μmol/L；探针终浓度为0.09～0.11μmol/L，更优选0.1μmol/L。

[0016] 所述RT-PCR的反应的退火温度优选为53℃～57℃，更优选55℃。

[0017] 在本发明一个具体的实施方式中，所述RT-PCR的反应条件包括：50℃，2min；94℃，10min；40循环：94℃20s，55℃40s。

[0018] 本发明还公开了鲑鱼肾杆菌(Renibacterium salmoninarum)的检测试剂盒，所述试剂盒含有能扩增出鲑鱼肾杆菌的基因片段的引物对，所述引物对分别含有Seq ID No.1和Seq ID No.2所示的序列，

[0019] Seq ID No.1：5’-CCG AAG AGC CCA CCA ATG AC-3’

[0020] Seq ID No.2：5’-GAC TTA GAC GAC GCC GTA GC-3’。

[0021] 优选的，所述检测试剂盒用于实时荧光RT-PCR检测，并且所述试剂盒还含有能与鲑鱼肾杆菌的基因组DNA位于所述引物对之间的序列相同或互补、且长度为15～30bp的寡核苷酸探针，并且所述探针的5’端和3’端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。

[0022] 所述探针优选含有Seq ID No.3所示的序列，

[0023] Seq ID No.3：5’-CGG ATT GCC GTC GCC GCA GC-3’。

[0024] 进一步的，所述探针5’端标记的荧光报告基团优选为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团优选为TAMRA

[0025] 由于采用了以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于：

[0026] 本发明建立了检测鲑鱼肾杆菌的Taq Man实时荧光定量PCR，优化反应条件，经特异性、敏感性及临床应用试验，表明该方法特异性强，敏感度高，可以为BKD的诊断和口岸检测提供一种快速、特异、敏感，且能定量的检测方法，也为鲑科鱼类的疫病调查、鲑鱼肾杆菌的流行病学研究提供了一种可靠方法。结果表明，该方法的检测灵敏度为5个细菌/反应；通过SDS软件分析，细菌数量(X)与Ct值的关系为：Ct＝-3.30lgX+43.75，相关系数R2＝0.970；对鲑鱼肾杆菌具有较好的特异性，而与其它15种常见鱼类致病菌均无交叉反应。另外，若是分离的细菌，可直接经煮沸法和反复冻融处理后直接作模板，从而在不影响检测灵敏度的前提下，缩短了检测时间，一般2个小时就可以得到结果。另外，本方法在检测鲑鱼肾杆菌过程中，采用闭管操作，避免开管电泳和反转录，进一步减少污染的可能性，且不需要PCR后处理，即可直接读取结果，进一步缩短了检测时间，一般2个小时就可以得到结果。TaqMan探针实时荧光PCR能够快速、准确检测鲑鱼肾杆菌，适合于BDK的诊断、口岸检测和流行病学研究。

附图说明

[0027] 图1为鲑鱼肾杆菌不同稀释度(10-1-10-7)的灵敏度试验结果图；

[0028] 图2为实时荧光RT-PCR检测鲑鱼肾杆菌的特异性实验结果图。

具体实施方式

[0029] 实时荧光技术，是近年来新问世的一种高敏感性的检测技术，它融合了PCR技术的核酸高效扩增，探针技术的高特异性，光谱技术的高敏感性和高精确定量等优点，直接探测PCR过程中荧光信号的变化以获得定量的结果，它可以做到每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，做到真正意义上的定量。同时该技术在密闭系统内完成检测，不需要常规PCR的电泳观察环节，减少了对工作环境的污染，降低假阳性结果发生。因此，自从该技术建立以来，迅速、广泛地应用于植物、动物和人类的寄生虫，病毒和细菌等病原的检测研究中。目前已经进行该项研究的鱼类病毒有ISAV(Munir and Kibenge，2004)、KHV(Gilad et al.，2004)、Betanodavirus(Valle et al.，2005)、SVCV(张利峰等，2005；Yue et al.，2007)、VHSV(Chico et al.，2006)、IHNV(Dhar et al.，2008)、IPNV(Bowers et al.，2008)和VNNV(罗卫等，2008)。而本发明则建立了实时荧光RT-PCR方法检测鲑鱼肾杆菌。

[0030] 本发明选取鲑鱼肾杆菌编码57kDa主要可溶性蛋白基因中的保守序列，利用Primer Express2.0软件设计引物和TaqMan探针，以标准株(Rs PlymLea 223Ds)作外标准品进行定量分析，并优化反应体系，检测其灵敏度和特异性，制作标准曲线，建立了检测鲑鱼肾杆菌的实时荧光定量PCR，并进行临床应用。结果表明，该方法的检测灵敏度为5个细菌/反应；通过SDS软件分析，细菌数量(X)与Ct值的关系为：Ct＝-3.30lgX+43.75，相关系数R2＝0.970；对鲑鱼肾杆菌具有较好的特异性，而与其它15种常见鱼类致病菌均无交叉反应。TaqMan探针实时荧光PCR能够快速、准确检测鲑鱼肾杆菌，适合于BDK的诊断、口岸检测和流行病学研究。

[0031] 实施例1

[0032] 1材料与方法

[0033] 1.1材料

[0034] 1.1.1试验菌株

[0035] 鲑鱼肾杆菌由英国Weymouth的OIE参考实验室B.J.Hill博士赠送(编号：Rs Plym Lea 223Ds)；其它15种常见鱼类致病菌菌株由东京大学鱼病学研究室提供，菌株名称及培养方法见表1。

[0036] 表1实验中使用的菌株及其培养方法

[0037]菌株名称 菌株编号 培养基 温度
Rs Plym Lea
鲑鱼肾杆菌Renibacterium salmoninarum KDM2 15℃
223dS
嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila IAM12460 BHIA 25℃
杀鲑产气单胞菌Aeromonas salmonicida ATCC14174 BHIA 25℃
柱状嗜纤维菌Cytophaga columaris ATCC43622 TYE 25℃
迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda ATCC1594T BHIA 25℃
嗜冷屈桡杆菌Flavobacterium psychrophilum FPC832 TYE 18℃
嗜冷屈桡杆菌Flavobacterium psychrophilum FPC832 TYE 18℃
绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis IAM12354 TBHIA(0.5％NaCl) 15℃
荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens IAM12022 BHIA 25℃
恶臭假单胞菌Pseudomonas putida IAM12354 TBHIA 25℃
金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus IAM1011 BHIA 25℃
表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis IAM12012 BHIA 25℃
鳗弧菌Vibrio anguillarum N℃IMB829 BHIA(2％NaCl) 25℃
病海鱼弧菌Vibrio ordalii ATCC33509 BHIA(2％NaCl) 25℃
海弧菌Vibrio pelagius ATCC25916 TBHIA(2％NaCl) 25℃
鲁克氏耶尔森氏菌Yersinia ruckeri ATCC29473 BHIA 25℃

[0038] 1.1.2试剂

[0039] 1.1.2.1细菌培养基：肾病血清增菌培养基(简称KDM2，L-半胱氨酸0.1g，胰蛋白胨1g，酵母提取物0.05g，琼脂1.5g，蒸馏水90mL)，用NaOH调整pH至6.5～6.8，121℃高压灭菌20min，培养前加入10％胎牛血清和1.5％已培养过鲑鱼肾杆菌的KDM2灭菌肉汤。

[0040] 1.1.2.2反应试剂盒：Taqman Universal PCR Master Mix为美国ABI公司产品。

[0041] 1.1.2.3引物和探针的设计与合成：

[0042] 根据鲑鱼肾杆菌编码57kDa主要可溶性蛋白基因序列，利用PrimerExpress2.0软件设计引物和探针，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

[0043] 序列为：

[0044] 正向引物：5’-CCG AAG AGC CCA CCA ATG AC-3’ Seq ID No.1

[0045] 反向引物：5’-GAC TTA GAC GAC GCC GTA GC-3’ Seq ID No.2

[0046] 探针：5’-FAM-CGG ATT GCC GTC GCC GCA GC-TAMRA-3’ Seq ID No.3[0047] 1.2方法

[0048] 1.2.1鲑鱼肾杆菌的增菌培养

[0049] 将鲑鱼肾杆菌接种于KDM2中，15℃培养15天。

[0050] 1.2.2细菌DNA的提取

[0051] 煮沸法提取细菌DNA。将菌液100℃煮5min，反复冻融后直接作为模板。

[0052] 或使用CTAB-酚氯仿方法抽提核酸，或其他等效方法。

[0053] 1.2.3细菌计数与定量标准品的制备

[0054] 取培养的鲑鱼肾杆菌1mL，作10倍系列稀释，并取连续三个稀释度用血球计数板计数，每个稀释度取三个样品计数，求每个稀释度的平均值。同时取500μL作为定量标准品。

[0055] 1.2.4实时荧光PCR扩增

[0056] 取10倍系列稀释的菌液为模板，在ABI7500实时荧光PCR仪进行PCR扩增，其反应体系为：模板2μL，Taqman Universal PCR Master Mix 5μL，引物各1μL，探针0.2μL，运行程序：50℃，2min；94℃，10min；40循环：94℃20s，60℃40s。使用SDS软件对结果进行分析。

[0057] 1.2.5灵敏度试验

[0058] 将鲑鱼肾杆菌菌液进行10-1-10-7稀释，经血球计数板计数后，对每一稀释度用煮沸的方法抽取核酸后，按照1.2.4进行实时定量PCR扩增，检测引物的灵敏度。以出现特征S曲线的最大稀释倍数对应的绝对菌数为检测极限。

[0059] 1.2.6特异性试验

[0060] 将鲑鱼肾杆菌与恶臭假单胞菌(P.putide)、鳗弧菌(V.anguillarum)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、嗜水气单胞菌(AeromonasHydrophila)、耶尔森氏菌(Y.ruckeri)、灿烂弧菌(Vibrio splendidius)、鮰鱼爱德华氏菌(Edardsiella ictaluri)、迟缓爱德华氏菌(E.tarda)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、病海鱼弧菌(Vibrio ordalii)、绿针假单胞菌(P.chlororaphis)分别为模版，同时设立阴性对照和空白对照，其他组分一样，同时放入ABI7500实时定量PCR仪进行反应，检测引物和探针的特异性。

[0061] 1.2.7数据分析

[0062] 实时定量PCR结束后，利用ABI7500SDS软件进行数据分析，包括查看扩增曲线、Ct值、形成相对定量和绝对定量标准曲线，用于扩大实验的数据分析。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，阴性对照和空白对照应无Ct值并且无扩增曲线，阳性对照的Ct值应≤40.0，并出现特定的扩增曲线。否则实验无效。样品的Ct值≤40个循环并且出现特定的扩增曲线，结果判定为阳性；Ct值≥40个循环，结果判定为阴性。

[0063] 1.2.8临床应用

[0064] 对2006年送检的鱼类样品18份样品，取肾组织分别进行细菌培养和抽提核酸。进行实时定量PCR检测，同时设阳性和阴性对照。根据扩增曲线和Ct值综合判定：以出现S型扩增曲线，且Ct≤40判为阳性，否则为阴性。同时比较两种方法检测结果的一致性。

[0065] 2结果

[0066] 2.1实时定量PCR最佳反应条件

[0067] 在ABI7500实时定量PCR仪上设定激发光为FAM，淬灭基团为TAMRA，使用美国ABI公司提供的Taqman Universal PCR Master Mix(含Gold DNAPolymerase，Amp Erase UNG，dNTP，buffer)，将引物浓度和探针浓度(终浓度)分别从0.2-2.0μmol/L(级差0.2μmol/L)、0.025-0.5μmol/L(级差0.025μmol/L)，互相组合后进行扩增，根据扩增结果，优化出其10μL反应体系中各个组分的最佳用量见表2。

[0068] 表2实时定量PCR最佳反应体系的组分及浓度

[0069]组分 数量 试剂浓度 终浓度
Mixture 5μL 2x 1x
引物 各1μL 10μmol/L 各1μmol/L
探针 0.2μL 5μmol/L 0.1μmol/L
模板 1μL
dH2O 1.8μL

[0070] 同时，从50℃-65℃不断调整其退火和荧光收集的温度，根据结果，确定最佳反应程序为：50℃，2min；94℃，10min；40循环：94℃20s，55℃40s。

[0071] 2.2实时定量PCR的灵敏度

[0072] 将鲑鱼肾杆菌菌液作10-1-10-7稀释后进行实时定量PCR扩增，其中10-1-10-5稀释度有典型的S型扩增曲线，见图1。根据细菌数量(X)对应的Ct值的相关性，利用分析软件得到标准曲线：Ct＝-3.30lgX+43.75，相关系数R2＝0.970，其最小稀释度对应的灵敏度为5个细菌/反应。表明该方法的灵敏度高。

[0073] 2.3特异性试验

[0074] 将鲑鱼肾杆菌与其他15种鱼类常见病原菌一起进行实时定量PCR，结果表明，只有鲑鱼肾杆菌有典型的S型扩增曲线(见图2)。表明实验所设计的引物和探针特异性强。

[0075] 2.4临床应用

[0076] 分别使用已建立的鲑鱼肾杆菌实时荧光定量PCR和普通PCR以及细菌分离的方法对2006年送检的18份鱼类样品进行检测，其结果完全一致。

[0077] 3讨论

[0078] 细菌性肾病是危害鲑科鱼类的重要传染病之一，其病原为鲑鱼肾杆菌。自1930年首次在美国报道以来，已在英国、法国、德国、意大利等国家人工养殖或野生的14种鲑科鱼类时有发生，而我国还没该病的报道，但怀疑牙鲆有可能感染鲑鱼肾杆菌，从而影响牙鲆鱼的出口。因此，建立特异性强，灵敏度高、快速检测鲑鱼肾杆菌的方法，势在必行。本发明建立了检测鲑鱼肾杆菌的Taq Man实时荧光定量PCR，优化反应条件，经特异性、敏感性及临床应用试验，表明该方法特异性强，敏感度高，适于鲑鱼肾杆菌的快速诊断和口岸检疫，也为鲑科鱼类的疫病调查、鲑鱼肾杆菌的流行病学研究提供了一种可靠方法。

[0079] 鲑鱼肾杆菌对生长条件要求苛刻，生长速度缓慢，且多呈慢性感染，这给该病的诊断和检测造成困难。当前的检测方法主要有细菌的分离鉴定、免疫学及分子生物学方法。鲑鱼肾杆菌虽能在人工培养基KDM2中可缓慢生长，但由于KDM2培养基不是选择性培养基，在自然环境中和粪便中分离的样品，有可能会造成污染。另外，细菌分离的灵敏度低，易漏检。Paclibare等研究表明该培养基的灵敏度为300个细菌/mL肾组织匀浆。免疫荧光技术灵敏度低，且存在交叉方法，也限制该方法的使用。根据p57蛋白的抗原位点设计的ELISA虽适于多个组织样品和大量样品的检测，但该方法只能检出感染严重的鱼类，而不能检测无症状的鱼类，不能区分死菌和活菌。2002年，刘荭等建立了快速检测鲑鱼肾杆菌的
5 -1
Nested-PCR，其灵敏度为1.8×10CFU.mL ，与其它15种常见的鱼类致病菌没有交叉反应，PCR方法虽然具有高度的特异性和敏感性，但不能很好的实现鲑鱼肾杆菌的定量检测。上述方法从灵敏度、特异性、实用性及快速简便等方面考察，各有利弊，不能满足快速且准确的口岸检疫和临床诊断。

[0080] 本发明建立的Taq Man实时荧光定量PCR，少至5个细菌即可检出，灵敏度高；对其它15种常见的鱼类致病菌进行检测，均无交叉反应，说明该方法特异性强；另外，若是分离的细菌，可直接经煮沸法和反复冻融处理后直接作模板，从而在不影响检测灵敏度的前提下，缩短了检测时间，一般2个小时就可以得到结果。另外，本方法在检测鲑鱼肾杆菌过程中，采用闭管操作，避免开管电泳和反转录，进一步减少污染的可能性，且不需要PCR后处理，即可直接读取结果，进一步缩短了检测时间，一般2个小时就可以得到结果。另外，本试验采用FAM和TERAM标记的Taqman探针，增加了体系的特异性，避免了交叉反应，实现了真正意义上的实时定量，从而对病原检测和检验检疫工作有重要的参考价值，显示了良好的应用前景。

[0081] 实时定量PCR也存在一定的假阳性和假阴性，故要严格控制反应污染，优化反应条件，选择适当的退火温度，设立严格的阳性和阴性对照。本实验优化了反应体系和反应条件，提高了反应的特异性和敏感性。

[0082] 实施例2

[0083] 一种的检测试剂盒，用于鲑鱼肾杆菌的实时荧光RT-PCR检测。所述试剂盒含有以下引物和探针：

[0084]引物 序列5’--3’ Seq ID No.
正向引物F CCG AAG AGC CCA CCA ATG AC 1
反向引物R GAC TTA GAC GAC GCC GTA GC 2
FAM-CGG ATT GCC GTC GCC GCA
探针Probe 3
GC-TAMRA

[0085] 其中，探针5’端标记的FAM为荧光报告基团，3’端标记的TAMRA为荧光淬灭基团。

[0086] 所述试剂盒还包括使用说明书。

[0087] 以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

[0088] 序列表

[0089] <110>深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心

[0090] <120>鲑鱼肾杆菌实时荧光RT-PCR检测方法和试剂盒

[0091] <130>DHC0910510

[0092] <160>3

[0093] <170>PatentIn version 3.3

[0094] <210>1

[0095] <211>20

[0096] <212>DNA

[0097] <213>人工序列

[0098] <400>1

[0099] ccgaagagcc caccaatgac 20

[0100] <210>2

[0101] <211>20

[0102] <212>DNA

[0103] <213>人工序列

[0104] <400>2

[0105] gacttagacg acgccgtagc 20

[0106] <210>3

[0107] <211>20

[0108] <212>DNA

[0109] <213>人工序列

[0110] <400>3

[0111] cggattgccg tcgccgcagc 20