本发明公开了一种四环素类药物选择性电极及其制备方法，该电极由内含吸入有电活性物质的分子印迹整体柱的石英玻璃管、内充液、内参比电极、电极杆、环氧树脂组合构成。本发明通过采用增加敏感膜的厚度、使用多孔整体柱材料、高效绑定电活性物质中的四环素类药物于敏感膜中、优化内充液组成，降低电极检测限至10-9mol/L数量级；又因分子印迹整体柱对模板分子四环素类药物具有特异性识别作用，故选择性较高，常见干扰物质对电极的电位测量均无影响。以本发明中提出的四环素类药物选择性电极为指示电极，饱和甘汞电极或Pt电极为参比电极，采用电位分析方法，可高灵敏度、高选择性地检测四环素类药物，而且设备简单，分析成本低廉，可实现四环素类药物残留分析。
1.一种四环素类药物选择性电极，其特征在于：该电极包括内含吸入有电活性物质的分子印迹整体柱的石英玻璃管(1)、内充液(2)、内参比电极(3)、电极杆(4)和环氧树脂(5)；将内含吸入有电活性物质的分子印迹整体柱的石英玻璃管(1)的外壁中段粘在电极杆(4)下端，并密封，电极杆(4)内加入有内充液(2)，内参比电极(3)插入电极杆(4)并浸没于内充液(2)中，用环氧树脂(5)固定内参比电极(3)并将电极杆(4)上端部封口；制备-6 -8的电极置于10 ～10 mol/L的盐酸四环素类药物溶液中活化；
所述的内充液(2)为：含10 ～10 mol/L的盐酸四环素类药物、10 ～10 mol/L的-1 -3NaCl和10 ～10 mol/L的CaCl2的混合溶液；
所述电活性物质是由以下方法获得的：将0.005～0.02mol/L盐酸四环素类药物溶液与0.005～0.02mol/L磷钨酸溶液按摩尔比3～4∶1或0.005～0.02mol/L盐酸四环素类药物溶液与0.005～0.02mol/L四苯硼钠溶液按摩尔比1∶1～1.5搅拌下混合，静置
10～12h，过滤，沉淀物用浓度为0.01～0.05mol/L的盐酸洗涤5～8次后，45～60℃烘干，即得干燥的电活性物质。
2.根据权利要求1所述的四环素类药物选择性电极，其特征在于：所述的四环素类药物包括四环素(TC)、土霉素(OTC)、金霉素(CTC)或强力霉素(DC)。
3.根据权利要求1所述的四环素类药物选择性电极，其特征在于：所述的内参比电极为Pt电极或Ag/AgCl电极。
4.根据权利要求1所述的四环素类药物选择性电极，其特征在于：所述内含吸入有电活性物质的分子印迹整体柱的石英玻璃管(1)是通过以下方法获得：①将模板分子四环素类药物、功能单体甲基丙烯酸溶解在甲醇和丙酮的混合溶液中，超声溶解，加入致孔剂，搅拌6～8h后，加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯和引发剂偶氮二异丁腈，继续搅拌至溶解；其中，模板分子为0.1mmol时，甲醇和丙酮的混合溶液体积为
0.5～1.5mL，甲醇所占混合溶液的体积为：45～100％；模板分子四环素类药物、功能单体、交联剂的摩尔比为1∶2～10∶20～50；功能单体、交联剂的总体积与致孔剂的体积比为1～2∶3～4；致孔剂为甲苯和十二醇的混合溶液，其中甲苯所占体积为10～20％；引发剂用量为功能单体质量的8～20％；
②将上述混合物通氮气5～10min后，置入内径为1～3mm、长度为2～5cm的石英玻璃管中，在氮气保护下将石英玻璃管封口，置于紫外灯下聚合3～8h，得到内含四环素类药物分子印迹整体柱的石英玻璃管；
③截取长度为0.5～1cm的上述制得的内含四环素类药物分子印迹整体柱的石英玻璃管，索式提取除去模板分子四环素类药物，45～60℃干燥12～36h，即得内含洗脱四环素类药物后的分子印迹整体柱的石英玻璃管；其中索式提取所用萃取剂为纯甲醇；
④将上述内含洗脱四环素类药物后的分子印迹整体柱的石英玻璃管一端浸入溶有电活性物质的均匀混合物中，快速吸入该均匀混合物，待四氢呋喃挥发后，即形成内含吸入有电活性物质的分子印迹整体柱的石英玻璃管(1)；
所述溶有电活性物质的均匀混合物的合成步骤为：取干燥的电活性物质、PVC、四氢呋喃和增塑剂加入到试管中，密封后，混成均匀混合物；其中，电活性物质、PVC和增塑剂的质量比为0.5～10∶30～35∶30～70；当PVC的质量为1mg时，四氢呋喃的体积为30～
80μL；增塑剂为以下增塑剂之一种：邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二辛酯(DOP)、邻苯二甲酸二壬酯(DNP)、癸二酸二异辛酯(DOS)或邻硝基苯基辛基醚(o-NPOE)。
5.一种四环素类药物选择性电极的制备方法，其特征在于：将内含吸入有电活性物质的分子印迹整体柱的石英玻璃管(1)的外壁中段粘在电极杆(4)下端，并密封粘接处，电极杆(4)内加入内充液(2)，将内参比电极(3)插入电极杆(4)并浸没于内充液(2)中，用环氧树脂(5)固定内参比电极(3)并将电极杆(4)上端封口，最后将新制备的电极置于浓度-6 -8为10 ～10 mol/L的盐酸四环素类药物溶液中活化48～96h，从而获得基于分子印迹整体柱的四环素类药物选择性电极；
将0.005～0.02mol/L盐酸四环素类药物溶液与0.005～0.02mol/L磷钨酸溶液按摩尔比3～4∶1或0.005～0.02mol/L盐酸四环素类药物溶液与0.005～0.02mol/L四苯硼钠溶液按摩尔比1∶1～1.5搅拌下混合，静置10～12h，过滤，沉淀物用浓度为0.01～
0.05mol/L的盐酸洗涤5～8次后，45～60℃烘干，即得干燥的电活性物；
所述内充液(2)为：含10 ～10 mol/L的盐酸四环素类药物、10 ～10 mol/L的NaCl-1 -3和10 ～10 mol/L的CaCl2的混合溶液。
6.根据权利要求5所述的四环素类药物选择性电极的制备方法，其特征在于：所使用的内含吸入有电活性物质的分子印迹整体柱的石英玻璃管(1)的制备方法，步骤如下：①将模板分子四环素类药物、功能单体甲基丙烯酸溶解在甲醇和丙酮的混合溶液中，超声溶解，加入致孔剂，搅拌6～8h后，加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯和引发剂偶氮二异丁腈，继续搅拌至溶解；其中，模板分子为0.1mmol时，甲醇和丙酮的混合溶液体积为
0.5～1.5mL，甲醇所占混合溶液的体积为：45～100％；模板分子四环素类药物、功能单体、交联剂的摩尔比为1∶2～10∶20～50；功能单体、交联剂的总体积与致孔剂的体积比为1～2∶3～4；致孔剂为甲苯和十二醇的混合溶液，其中甲苯所占体积为10～20％；引发剂用量为功能单体质量的8～20％；
②将上述混合物通氮气5～10min后，置入内径为1～3mm、长度为2～5cm的石英玻璃管中，在氮气保护下将石英玻璃管封口，置于紫外灯下聚合3～8h，得到内含四环素类药物分子印迹整体柱的石英玻璃管；
③截取长度为0.5～1cm的上述制得的内含四环素类药物分子印迹整体柱的石英玻璃管，索式提取除去模板分子四环素类药物，45～60℃干燥12～36h，即得内含洗脱四环素类药物后的分子印迹整体柱的石英玻璃管；其中索式提取所用萃取剂为纯甲醇；
④将上述内含洗脱四环素类药物后的分子印迹整体柱的石英玻璃管一端浸入溶有电活性物质的均匀混合物中，快速吸入该均匀混合物，待四氢呋喃挥发后，即形成内含吸入有电活性物质的分子印迹整体柱的石英玻璃管(1)。
7.根据权利要求6所述的四环素类药物选择性电极的制备方法，其特征在于：所述溶有电活性物质的均匀混合物的制备方法，步骤依次为：取干燥的电活性物质、PVC、四氢呋喃和增塑剂加入到试管中，密封后，混成均匀混合物；其中，电活性物质、PVC和增塑剂的质量比为0.5～10∶30～35∶30～70；当PVC的质量为1mg时，四氢呋喃的体积为30～80μL；增塑剂为以下增塑剂之一种：邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二辛酯(DOP)、邻苯二甲酸二壬酯(DNP)、癸二酸二异辛酯(DOS)或邻硝基苯基辛基醚(o-NPOE)。
一种四环素类药物选择性电极及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及电分析化学、化学传感器技术领域，具体涉及一种四环素类药物选择性电极的制备方法。
背景技术
[0002] 四环素类药物(Tetracycline，TCs)是一类广谱抗菌药物，具有十二氢化并四苯基结构，临床上主要用于治疗革兰氏阳性和阴性菌、支原体、衣原体、立克次体和螺旋体等致病原引起的感染。TCs主要包括两大类，即天然四环素类包括四环素(TC)、土霉素(OTC)、金霉素(CTC)、去甲金霉素(DMC)等，和半合成四环素类包括甲烯土霉素(MTC)、强力霉素(DC)、二甲胺四环素(MNC)等，其中最常用的TCs为TC、OTC、CTC、DC。其以价格低、抗菌谱广等优点，在养殖业被广泛用作饲料添加剂，以预防、控制和治疗动物疾病。长期摄入的TCs在人体内逐渐蓄积，可引起急慢性中毒，最终导致多种器官的病变，故许多国家对TCs残留实施严格的例行监控，我国规定动物源性食品中TCs的最大残留量为0.1mg/kg。
[0003] 目前检测TCs的常用方法有：高效液相色谱法、毛细管电泳法、酶联免疫法、微生物法等。①高效液相色谱法(HPLC)：是应用最广泛的定量检测TCs的方法，具有高效分离及高灵敏度检测的特性。该方法不足之处是样品前处理复杂、需要专业的操作人员、仪器价格昂贵、分析成本高昂、分析速度慢、不适宜于现场检测。②毛细管电泳法(CE)：具有分析速度快、样品量少的特点，但仪器价格昂贵、需要专业的操作人员、稳定性和精密度有待提高。③酶联免疫法(ELISA)：在快速筛查中应用最为广泛，灵敏度较高(约0.001～0.005mg/
kg)，适用于现场分析和工业化检测，目前已有检测TCs残留的试剂盒在售。主要不足之处在于：不适用于有色、混浊、粘稠液，易出现假阳性结果。④微生物法：是广泛应用的初筛TCs的方法，操作简单、成本低廉、适合大批样品分析、可反映生物效价，但灵敏度低(检出限＞3mg/kg)、选择性差、存在交叉反应。
[0004] 基于离子选择性电极的电位分析法，具有众多优点：所需设备简单，便于现场检测；分析速度较快；能用于有色、混浊、粘稠液，一般不需进行化学分离，操作简单迅速；-6 -5
有较高的选择性。主要缺点是：检测限偏高(10 ～10 mol/L)，不能用于极低浓度样品
分析，大大限制了其应用范围。采用离子选择性电极测定四环素类药物，已有前人报道
(Microchem.J.，1987，36(1)：107，海峡医学，1994，4(3)：23.)，但灵敏度均较低，检测限仅约相当于0.9～2.2mg/kg，难以达到分析要求。
[0005] 分子印迹技术是结合了酶与底物作用的“锁与钥匙模型”、抗体形成学说以及“专一性吸附理论”而发展起来的一项新型制备技术。该技术制备的分子印迹聚合物
(Molecular Imprinting Polymers，MIPs)，具有亲和性与选择性好、抗恶劣环境能力强、稳定性好、使用寿命长和应用范围广等优点，已广泛用于色谱分离、模拟酶催化、临床药物分析、传感技术、膜分离和固相萃取等领域。整体柱通常是指通过反应试剂原位聚合而得到的棒状整体聚合物，具有高通透性、多孔性和大的比表面积。将高选择性的分子印迹技术与高通透性的整体柱分离技术相结合，制备四环素类药物分子印迹整体柱已有相关报道(Talanta 2009，79：926；中国专利，申请号：200810052541.3)，但均用作固相萃取材料或液相色谱填料。Pretsch等基于整体柱制备了高灵敏度的金属离子选择性电极，检测限达-9
10 mol/L(Anal.Chem.2005，77：3966)。目前尚未见基于分子印迹整体柱的选择性电极的制备方法及其应用的相关报道。
[0006] 针对上述几种测定TCs方法各自的不足，本发明提出了一种基于分子印迹整体柱的四环素类药物选择性电极的制备方法，基于该选择性电极，采用电位分析法，可以高灵敏度地检测样品中的四环素类药物。传统的四环素类药物选择性电极的敏感膜为溶解有电活性物质(四环素类药物-磷钨酸钠缔合物或四环素类药物-四苯硼钠缔合物)的聚氯乙烯-6
(PVC)膜，当样品浓度极低时(一般＜10 mol/L)，出现四环素类药物从敏感膜向待测样品溶液中扩散的离子通量，导致敏感膜表面的待测离子浓度高于本体浓度而无法进一步降低检测限。本发明提出的四环素类药物选择性电极，采用如下三个技术手段抑制上述的扩散离子通量：①在直径为1～3mm的石英玻璃管中合成四环素类药物分子印迹整体柱，洗脱模板分子四环素类药物后，将溶解有电活性物质的PVC溶液吸入该分子印迹整体柱，挥干溶剂后形成敏感材料。因敏感膜的厚度实质性增加至传统敏感膜的10倍以上，且整体柱的多孔结构限制了四环素类药物在膜中的扩散迁移行为，故大大降低了离子扩散系数；②洗脱模板分子后的分子印迹整体柱内部含有四环素类药物的特异性结合位点，可高效绑定电活
2+
性物质中的四环素类药物；③内充液中加入可与四环素类药物络合的Ca ，降低了其游离浓度，有效抑制四环素类药物与内充液中亲水性对离子的共传输造成的跨膜离子通量。故-9
将四环素类药物选择性电极的检测限降低至10 mol/L数量级，低于0.005mg/L(mg/kg)，灵敏度较高；由于分子印迹整体柱对模板分子的特异性识别，故选择性较高，常见干扰物质对-8 -3
电位测量均无影响；线性范围较宽，为1×10 ～1×10 mol/L；可直接检测有色溶液；检测速度较快，低浓度样品可于2小时内完成；所需设备简单，便于现场检测。上述基于分子印迹整体柱的四环素类药物选择性电极的制备方法在其他文献或专利中均未见报道。
发明内容
[0007] 本发明所要解决的首要技术问题是克服上述现有检测样品中四环素类药物含量的几种方法之不足，包括：样品前处理复杂，需要专业的操作人员，仪器价格昂贵，分析成本高昂，分析速度慢，检测时间长，不适宜于现场检测，稳定性和精密度不佳，对样品本身要求较高，不适用于有色、混浊、粘稠液，易出现假阳性，结果灵敏度较低(检出限＞3mg/kg)，特异性不强等，提供一种基于分子印迹整体柱的四环素类药物选择性电极，其灵敏度高、选择性高，可直接检测有颜色溶液，检测速度较快；精密度和准确度较高；所使用仪器简单，分析成本低廉。
[0008] 本发明所要解决的另一个技术问题是提供相关的制备方法。
[0009] 为实现上述发明目的，本发明为解决首要技术问题而所提出的技术方案是：
[0010] 一种基于分子印迹整体柱的四环素类药物选择性电极，其特征在于：该电极包括内含吸入有电活性物质的分子印迹整体柱的石英玻璃管、内充液、内参比电极、电极杆、环氧树脂；将内含吸入有电活性物质的分子印迹整体柱的石英玻璃管的外壁中段粘在电极杆下端，并密封粘接处，电极杆内加入有内充液，内参比电极插入电极杆并浸没于内充液中，-6 -8用环氧树脂固定内参比电极并密封电极杆上端；新制备的电极置于10 ～10 mol/L盐酸
四环素类药物溶液中活化。
[0011] 所述的四环素类药物包括四环素(TC)、土霉素(OTC)、金霉素(CTC)或强力霉素(DC)。
[0012] 所述的内参比电极为Pt电极或Ag/AgCl电极。
[0013] 所述的内含吸入有电活性物质的分子印迹整体柱的石英玻璃管是通过以下方法制备的：
[0014] ①将模板分子四环素类药物、功能单体甲基丙烯酸溶解在甲醇和丙酮的混合溶液中，超声溶解，加入致孔剂，搅拌6～8h后，加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯和引发剂偶氮二异丁腈，继续搅拌至溶解；其中，模板分子为0.1mmol时，甲醇和丙酮的混合溶液体积为0.5～1.5mL，甲醇所占混合溶液的体积为：45～100％；模板分子四环素类药物、功能单体、交联剂的摩尔比为1∶2～10∶20～50；功能单体、交联剂的总体积与致孔剂的体积比为1～2∶3～4；致孔剂为甲苯和十二醇的混合溶液，其中甲苯所占体积为10～20％；
引发剂用量为功能单体质量的8～20％；
[0015] ②将上述混合物通氮气5～10min后，置入内径为1～3mm、长度为2～5cm的石英玻璃管中，在氮气保护下将石英玻璃管封口，置于紫外灯下聚合3～8h，得到内含四环素类药物分子印迹整体柱的石英玻璃管；
[0016] ⑧截取长度为0.5～1cm的上述制得的内含四环素类药物分子印迹整体柱的石英玻璃管，索式提取除去模板分子四环素类药物，45～60℃干燥12～36h，即得内含洗脱四环素类药物后的分子印迹整体柱的石英玻璃管；其中索式提取所用萃取剂为纯甲醇；
[0017] ④将上述内含洗脱四环素类药物后的分子印迹整体柱的石英玻璃管一端浸入溶有电活性物质的均匀混合物中，快速吸入该均匀混合物，待四氢呋喃挥发后，即形成内含吸入有电活性物质的分子印迹整体柱的石英玻璃管。
[0018] 所述的溶有电活性物质的均匀混合物的合成方法，步骤如下：
[0019] 取干燥的电活性物质、PVC、四氢呋喃和增塑剂加入到试管中，密封后，用涡旋振荡器混成均匀混合物；其中，电活性物质、PVC和增塑剂的质量比为0.5～10∶30～35∶30～70；当PVC的质量为1mg时，四氢呋喃的体积为30～80μL；增塑剂为以下增塑
剂之一种：邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二辛酯(DOP)、邻苯二甲酸二壬酯(DNP)、癸二酸二异辛酯(DOS)、邻硝基苯基辛基醚(o-NPOE)。
[0020] 所述的电活性物质的制备方法，步骤为：
[0021] 将0.005～0.02mol/L盐酸四环素类药物溶液与0.005～0.02mol/L磷钨酸溶液按摩尔比3～4∶1或0.005～0.02mol/L盐酸四环素类药物溶液与0.005～0.02mol/
L四苯硼钠溶液按摩尔比1∶1～1.5搅拌下混合，静置10～12h，过滤，沉淀物用浓度为
0.01～0.05mol/L的盐酸洗涤5～8次后，45～60℃烘干，即得干燥的电活性物质。
[0022] 所述的内充液(2)为：含10-3～10-6mol/L的盐酸四环素类药物、10-1～10-3mol/L-1 -3的NaCl和10 ～10 mol/L的CaCl2的混合溶液。
[0023] 本发明为解决第二个技术问题所采取的技术方案为：一种基于分子印迹整体柱的四环素类药物选择性电极的制备方法，其特征在于：将内含吸入有电活性物质的分子印迹整体柱的石英玻璃管的外壁中段粘在电极杆下端，并密封粘接处，电极杆内加入内充液，将内参比电极插入电极杆并浸没于内充液中，用环氧树脂固定内参比电极并将电极杆上端-6 -8
封口，最后将新制备的电极置于浓度为10 ～10 mol/L的盐酸四环素类药物溶液中活化
48～96h，从而获得基于分子印迹整体柱的四环素类药物选择性电极；
[0024] 所使用的内含吸入有电活性物质的分子印迹整体柱的石英玻璃管的制备方法，步骤如下：
[0025] ①将模板分子四环素类药物、功能单体甲基丙烯酸溶解在甲醇和丙酮的混合溶液中，超声溶解，加入致孔剂，搅拌6～8h后，加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯和引发剂偶氮二异丁腈，继续搅拌至溶解；其中，模板分子为0.1mmol时，甲醇和丙酮的混合溶液体积为0.5～1.5mL，甲醇所占混合溶液的体积为：45～100％；模板分子四环素类药物、功能单体、交联剂的摩尔比为1∶2～10∶20～50；功能单体、交联剂的总体积与致孔剂的体积比为1～2∶3～4；致孔剂为甲苯和十二醇的混合溶液，其中甲苯所占体积为10～20％；
引发剂用量为功能单体质量的8～20％；
[0026] ②将上述混合物通氮气5～10min后，置入内径为1～3mm、长度为2～5cm的石英玻璃管中，在氮气保护下将石英玻璃管封口，置于紫外灯下聚合3～8h，得到内含四环素类药物分子印迹整体柱的石英玻璃管；
[0027] ③截取长度为0.5～1cm的上述制得的内含四环素类药物分子印迹整体柱的石英玻璃管，索式提取除去模板分子四环素类药物，45～60℃干燥12～36h，即得内含洗脱四环素类药物后的分子印迹整体柱的石英玻璃管；其中索式提取所用萃取剂为纯甲醇；
[0028] ④将上述内含洗脱四环素类药物后的分子印迹整体柱的石英玻璃管一端浸入溶有电活性物质的均匀混合物中，快速吸入该均匀混合物，待四氢呋喃挥发后，即形成内含吸入有电活性物质的分子印迹整体柱的石英玻璃管。
[0029] 所述溶有电活性物质的均匀混合物的制备方法，步骤依次为：
[0030] 取干燥的电活性物质、PVC、四氢呋喃和增塑剂加入到试管中，密封后，用涡旋振荡器混成均匀混合物；其中，电活性物质、PVC和增塑剂的质量比为0.5～10∶30～35∶30～70；当PVC的质量为1mg时，四氢呋喃的体积为30～80μL；增塑剂为以下增塑
剂之一种：邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二辛酯(DOP)、邻苯二甲酸二壬酯(DNP)、癸二酸二异辛酯(DOS)、邻硝基苯基辛基醚(o-NPOE)。
[0031] 所述电活性物质是由以下方法合成：
[0032] 将0.005～0.02mol/L盐酸四环素类药物溶液与0.005～0.02mol/L磷钨酸溶液按摩尔比3～4∶1或0.005～0.02mol/L盐酸四环素类药物溶液与0.005～0.02mol/
L四苯硼钠溶液按摩尔比1∶1～1.5搅拌下混合，静置10～12h，过滤，沉淀物用浓度为
0.01～0.05mol/L的盐酸洗涤5～8次后，45～60℃烘干，即得干燥的电活性物质。
[0033] 所述内充液为：含10-3～10-6mol/L的盐酸四环素类药物、10-1～10-3mol/L的NaCl-1 -3和10 ～10 mol/L的CaCl2的混合溶液。
[0034] 与现有技术相比，本发明的优点在于具有下列技术效果：
[0035] (1)本发明中提出的四环素类药物选择性电极，通过增加敏感膜的厚度、使用多孔整体柱材料、高效绑定电活性物质中的四环素类药物于敏感膜中、优化内充液组成，有效抑-9制了四环素类药物的扩散离子通量，降低电极检测限至10 mol/L数量级，低于0.005mg/
L(mg/kg)，灵敏度较高。
[0036] (2)因分子印迹整体柱对模板分子四环素类药物具有特异性识别作用，故选择性较高，常见干扰物质对电极的电位测量均无影响。
[0037] (3)以本发明中提出的四环素类药物选择性电极为指示电极，采用电位分析方法，可以高灵敏度、高选择性地检测四环素类药物，检测速度较快，能检测有色溶液，所需设备简单，分析成本低廉，可实现四环素类药物的现场检测。
附图说明
[0038] 图1为基于分子印迹整体柱的四环素类药物选择性电极示意图；
[0039] 图2a-i为一系列不同制备方法获得的四环素类药物选择性电极的工作曲线图。
具体实施方式
[0040] 下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不仅限于下述实施例。
[0041] 实施例1
[0042] 第一步：内含洗脱四环素后的分子印迹整体柱的石英玻璃管的制备，步骤如下：
[0043] ①将四环素0.1mmol、甲基丙烯酸0.6mmol加入1.0mL甲醇和丙酮(1∶1)的混合溶液中，超声溶解，加入0.16mL甲苯和1.44mL十二醇，搅拌6h后，加入4.5mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯和8mg偶氮二异丁腈，继续搅拌至溶解，通氮10min。
[0044] ②在氮气保护下，将上述混合物加入内径为2mm、长度为3cm的石英玻璃管中，并将其封口，置于紫外灯下聚合6h，得到内含四环素分子印迹整体柱的石英玻璃管。
[0045] ③截取长度为0.5cm的上述制得的内含四环素分子印迹整体柱的石英玻璃管，甲醇为萃取剂，索式提取除去四环素，60℃干燥24h，即得内含洗脱四环素后的分子印迹整体柱的石英玻璃管。
[0046] 第二步：内含吸入有电活性物质的分子印迹整体柱的石英玻璃管的制备方法，步骤如下：
[0047] ①电活性物质的制备方法：将65mL 1.0×10-2mol/L盐酸四环素溶液和20mL-2
1.0×10 mol/L磷钨酸溶液搅拌下混合，静置12h，过滤，沉淀物用浓度为0.01mol/L的盐酸洗涤5～8次后，60℃烘干，即得干燥的电活性物质。
[0048] ②取上述干燥的电活性物质35mg、PVC 157.5mg、DBP 157.5mg、四氢呋喃6mL加入到试管中，密封后，用涡旋振荡器混成均匀混合液。
[0049] ③将第一步中制得的内含洗脱四环素后的分子印迹整体柱的石英玻璃管一端浸入上述的均匀混合物中，快速吸入该均匀混合物，待四氢呋喃挥发后，即形成内含吸入有电活性物质的分子印迹整体柱的石英玻璃管。
[0050] 第三步：四环素选择性电极的制备，步骤如下：
[0051] ①将上述制得的吸入有电活性物质的分子印迹整体柱的石英玻璃管外壁中段粘在电极杆下端，并密封粘接处。
[0052] ②内充液的配制：配制含10-4mol/L的盐酸四环素、10-2mol/L的NaCl和10-2mol/L的CaCl2的混合溶液。
[0053] ③取内充液0.8mL加入电极杆中，将Ag/AgCl电极插入电极杆，并浸没于内充液液面以下，用环氧树脂固定之并封口，即制得四环素选择性电极，如图1。
[0054] ④将上述制得的电极置入10-8mol/L的盐酸四环素溶液中活化60h。
[0055] 第四步：工作曲线的绘制。
[0056] ①标准溶液的配制：精确称取盐酸四环素0.1205g，用少量水溶解，加入50.00mL Michaelis缓冲溶液(酒石酸-酒石酸钠缓冲溶液，pH 2.8)，去离子水定容至250mL棕色容-3 -4 -9量瓶，得10 mol/L标准溶液。再逐级稀释成10 ～10 mol/L盐酸四环素标准溶液系列。
[0057] ②以上述制得的四环素选择性电极为指示电极，饱和甘汞电极为参比电极，按照浓度从低到高的顺序，用电位差计依次测量两支电极形成的原电池电动势E。以四环素浓度的对数值(lgc)为横坐标，以电动势E为纵坐标，绘制工作曲线，如图2-a。
[0058] 第五步：电极选择性系数的测定。
[0059] K+、Na+、NH4+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Ba2+、Mg2+、Sr2+、Fe2+、Fe3+、托普霉素、甘氨酸、丙胺酸、赖氨酸、葡萄糖、麦芽糖、乳糖等常见干扰物质对电极电位测量无影响。
[0060] 实施例2
[0061] 模板分子为土霉素，其他同实施例1，如图2-b。
[0062] 实施例3
[0063] 模板分子为金霉素，其他同实施例1，如图2-c。
[0064] 实施例4
[0065] 模板分子为强力霉素，其他同实施例1，如图2-d。
[0066] 实施例5
[0067] 第一步：内含洗脱四环素后的分子印迹整体柱的石英玻璃管的制备。
[0068] ①将四环素0.1mmol、甲基丙烯酸0.4mmol加入1.0mL甲醇和丙酮(8∶2)的混合溶液中，超声溶解，加入0.24mL甲苯和1.36mL十二醇，搅拌6h后，加入3mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯和6mg偶氮二异丁腈，继续搅拌至溶解，通氮气10min。
[0069] ②在氮气保护下，将上述混合物加入内径为2mm、长度为3cm的石英玻璃管中，并将其封口，置于紫外灯下聚合4h，得到内含模板分子四环素分子印迹整体柱的石英玻璃管。
[0070] ③截取长度为0.5cm的上述制得的内含模板分子四环素分子印迹整体柱的石英玻璃管，甲醇为萃取剂，索式提取除去四环素，60℃干燥24h，即得内含洗脱四环素后的分子印迹整体柱的石英玻璃管。
[0071] 其他同实施例1，如图2-e。
[0072] 实施例6
[0073] 第一步：内含洗脱四环素后的分子印迹整体柱的石英玻璃管的制备。
[0074] ①将四环素0.1mmol、甲基丙烯酸0.8mmol加入1.0mL甲醇中，超声溶解，加入0.16mL甲苯和1.44mL十二醇，搅拌6h后，加入2mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯和10mg偶氮
二异丁腈，继续搅拌至溶解，通氮气10min。
[0075] ②在氮气保护下，将上述混合物加入内径为2mm、长度为3cm的石英玻璃管中，并将其封口，置于紫外灯下聚合4h，得到内含模板分子四环素分子印迹整体柱的石英玻璃管。
[0076] ③截取长度为0.5cm的上述制得的内含模板分子四环素分子印迹整体柱的石英玻璃管，甲醇为萃取剂，索式提取除去四环素，60℃干燥24h，即得内含洗脱四环素后的分子印迹整体柱的石英玻璃管。
[0077] 其他同实施例1，如图2-f。
[0078] 实施例7
[0079] 电活性物质的制备方法：将20mL 1.0×l0-2mol/L盐酸四环素溶液和25mL-2
1.0×10 mol/L四苯硼钠溶液搅拌下混合，静置12h，过滤，沉淀物用浓度为0.01mol/L的盐酸洗涤5～8次后，60℃烘干，即得干燥的电活性物质。
[0080] 其他同实施例1，如图2-g。
[0081] 实施例8
[0082] 内含吸入有电活性物质的分子印迹整体柱的石英玻璃管的制备方法，步骤如下：
[0083] ①电活性物质的制备方法：将65mL 1.0×10-2mol/L盐酸四环素溶液和20mL-2
1.0×10 mol/L磷钨酸溶液搅拌下混合，静置12h，过滤，沉淀物用浓度为0.01mol/L的盐酸洗涤5～8次后，60℃烘干，即得干燥的电活性物质。
[0084] ②取上述干燥的电活性物质0.5mg、PVC 31.5mg、DOP 68mg、四氢呋喃2.5mL加入到试管中，密封后，用涡旋振荡器混成均匀混合液。
[0085] ③将第一步中制得的内含洗脱四环素后的分子印迹整体柱的石英玻璃管一端浸入上述的均匀混合物中，快速吸入该均匀混合物，待四氢呋喃挥发后，即形成内含吸入有电活性物质的分子印迹整体柱的石英玻璃管。
[0086] 其他同实施例1，如图2-h。
[0087] 实施例9
[0088] 内充液的配制：配制含10-5mol/L的盐酸四环素、10-3mol/L的NaCl和10-3mol/L的CaCl2的混合溶液。
[0089] 其他同实施例1，如图2-i。
[0090] 应用实施例10
[0091] 第一步：样品处理：
[0092] 准确称取5.0g搅碎的鳗鱼干制品于50ml聚四氟乙烯离心管中，加入25mLMcllvaine′s缓冲液，振荡10min后，加入5mL三氯乙酸水溶液，以2000r/min的速度离心2min，等静置分层后，5000r/min离心20min，上清液用过滤头过滤，再加入10mL缓冲液、2mL三氯乙酸溶液，经超声波振荡提取10min，5000r/min离心10min过滤，重复一次，合并过滤液，将其置于自动蒸发浓缩仪上45℃氮吹浓缩至0.5mL，用0.01mol/L柠檬酸溶液定容至10mL。
[0093] 第二步：样品测量：
[0094] 取上述处理好的样品溶液1mL，加入2.00mL Michaelis缓冲溶液，去离子水定容至10mL容量瓶中。取上述溶液置于测量池中，以本发明制得的四环素类药物选择性电极为指示电极，饱和甘汞电极为参比电极，用电位差计测量两支电极形成的原电池电动势E。根据工作曲线可得样品中各种四环素类药物的浓度。
[0095] 采用本方法和水产行业标准测定方法《水产品中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定高效液相色谱荧光检测法》(DB33T 691-2008)，同时测定10份加标样品，结果如下表1。结果表明：经t检验，本方法测定结果与加标量、标准方法测定结果之间无显-8 -3著性差异(P＜0.05)，故本方法可用于含量在1×10 ～1×10 mol/L范围的水产品中四
环素类药物残留的检测。
[0096] 表1本方法测定结果与加标量、标准方法测定结果之比较
[0097]
