半滑舌鳎三倍体鱼苗批量化诱导方法

摘要

一种半滑舌鳎三倍体鱼苗批量化诱导方法，包括三倍体鱼苗的诱导方法和鉴定方法；诱导方法包括未受精卵的采集及授精；三倍体诱导起始时间的确定、静水压休克压力和处理时间的确定；鉴定方法包括倍性测定仪鉴定和染色体分析鉴定。该方法首次建立了采用静水压诱导批量化生产半滑舌鳎三倍体鱼苗的方法，筛选到三倍体诱导的适宜起始时间和静水压休克条件，建立了三倍体鱼苗批量化诱导的方法。本发明方法获得的三倍体鱼苗诱导率高达95％以上。本发明建立的方法具有先进、高效、准确、可靠的特点，在半滑舌鳎三倍体诱导和不育苗种生产中具有重要应用价值，在鱼类养殖和育种上具有广阔的推广应用前景。

权利要求

1. 一种半滑舌鳎三倍体鱼苗批量化诱导方法，其特征在于它的方法包括二个方面： 1)、半滑舌鳎三倍体鱼苗的诱导；幻、半滑舌鳎三倍体鱼苗的鉴定；1)、半滑舌鳎三倍体鱼苗的诱导：它的技术内容包括：(1)、半滑舌鳎未受精卵的采集及授精；(2)、三倍体诱导起始时间 的确定；C3)、诱导半滑舌鳎三倍体静水压休克压力和处理时间的确定；(1)、半滑舌鳎未受精卵的采集及授精：选择性成熟的半滑舌鳎雌鱼，采用人工挤压腹部法采卵，将采集的鱼卵置于20-24°C的 干燥烧杯中；将采集的新鲜半滑舌鳎精液加入未受精卵中，精液和卵的授精最小体积比为 500 μ L :50-100ml，干法授精，轻轻摇动混勻，加入2倍于卵量体积温度为20_24°C的海水完 成授精过程；(2)、三倍体诱导起始时间的确定：在授精后不同时间（1，2，3，4，5，6，7，8!^11)，将授精卵放入静水压机的压力缸中进行 静水压休克处理，采用34-36Mpa的静水压处理4-5min后，将授精卵分别移入21_23°C海 水中培养；根据三倍体诱导率的高低，确定半滑舌鳎三倍体诱导的最佳起始时间为授精后 4. 5-5. 5min ；(3)、诱导半滑舌鳎三倍体静水压休克压力和处理持续时间的确定：在授精后4. 5-5. 5min,将授精卵分别置于观，32，36，40或44MPa静水压下处理3_4分 钟后分别移入21-23°C海水中培养，根据三倍体诱导率的高低，确定半滑舌鳎三倍体诱导的 最佳静水压休克压力为36-40Mpa ；在授精后4. 5-5. 5min,将授精卵置于36_40MPa静水压下分别处理2，4，6或8分钟，根 据三倍体诱导率的高低，确定半滑舌鳎三倍体诱导的最佳静水压休克处理时间为4分钟；2)、半滑舌鳎三倍体鱼苗的鉴定：它的技术内容包括：（1).通过DNA含量鉴定半滑舌鳎三倍体鱼苗；（¾.通过染色体分 析鉴定三倍体鱼苗；(1).通过DNA含量鉴定半滑舌鳎三倍体鱼苗：采用PARTEC倍性测定仪（PA)及一步法染色试剂进行三倍体胚胎或鱼苗的倍性鉴定； 采用正常二倍体胚胎或鱼苗作对照，通过分析胚胎或鱼苗细胞DNA含量，确定二倍体胚胎 或鱼苗细胞DNA含量绝大多数集中在沈-观处，而三倍体鱼苗绝大多数细胞中的DNA含量 在39-42处，是二倍体鱼苗的1. 5倍，从而确定细胞DNA含量在39-42的胚胎或鱼苗为三倍 体；(2).通过染色体分析鉴定三倍体鱼苗：半滑舌鳎二倍体鱼苗的染色体数目为2n = 42条；而三倍体鱼苗的染色体数目应该为 3n = 63，在授精后4. 5-5. 5min，将授精卵置于36_40MPa静水压下处理4分钟，产生的鱼苗 中95%以上的个体含有63条染色体，这些鱼苗即为三倍体鱼苗。

说明书

半滑舌鳎三倍体鱼苗批量化诱导方法

技术领域：

[0001] 本发明属于水产遗传育种技术，是一种采用物理学方法诱导半滑舌鳎三倍体的方 法。背景技术：

[0002]半滑舌鳎（Cynoglossus semiliaevis)属鲽形目（Pleuronectiformes)、舌鳎科 (Cynoglossidae)、舌鳎属（Cynoglossus)，俗名鳎米、舌头鱼、龙利等，是我国特有的名贵经 济海水鱼类，属于近海温水性底层鱼类。其味道鲜美、肉质细嫩、营养丰富，深受广大消费者 欢迎，其市场价值极高。半滑舌鳎养殖已在我国沿海地区普遍开展起来，其养殖业年产值达 15-20亿元人民币。但是，由于半滑舌鳎雌雄大小差异悬殊，雄性生长速度缓慢，而雌性个体 在性成熟后又因为腹部性腺隆起、影响了大规格商品鱼的外观和质量，影响了其商业价值， 因而严重影响了渔民养殖的积极性以及半滑舌鳎养殖产业的发展。

[0003] 三倍体鱼因染色体组成不平衡，性腺不能发育成熟，属于不育的鱼类。因此，采用 现代生物技术手段，研究半滑舌鳎多倍体诱导技术，研制出三倍体鱼，抑制其性腺发育，将 生殖腺发育消耗的能量用于生长，克服性腺发育时期的生长停滞和鱼肉质量下降等不利影 响。这样既可以解决雌鱼性腺发育影响商品鱼质量的问题，又可以解决雄鱼生长过慢的问 题。这对于缩短半滑舌鳎养殖周期，提高半滑舌鳎养殖产量、提高养殖的经济效益，推动半 滑舌鳎养殖产业的发展，具有重要的现实意义和重大的应用价值。

[0004] 鉴于鱼类不育技术在遗传育种、渔业生产、水环境保护和水生生物遗传多样性保 护上的重要意义和应用价值，国际上也非常重视鱼类等水产养殖动物不育技术的研究。而 制作不育鱼类的主要途径是生产三倍体。因为三倍体鱼类具有性腺不能发育、不能过度繁 殖、促进生长以及提高鱼肉品质等优点，因而受到普遍的重视。鱼类多倍体的绝大多数研究 工作是在淡水鱼类上开展的。迄今已先后获得了虹鳟、银大马哈鱼、大鳞大马哈鱼、大西洋 鲑等鱼类三倍体；除虹鳟外，日本还开展了诱导三倍体香鱼的研究与开发，发现三倍体香鱼 的生长速率和抗寒能力都明显优于二倍体香鱼，很受消费者和养殖家的欢迎，具有很大的 商业价值和开发潜力。但是迄今为止，有关海水鱼类三倍体鱼苗的批量化诱导，在国内外尚 未见报道。发明内容：

[0005] 本发明的目的是建立通过静水压诱导大量生产半滑舌鳎三倍体鱼苗的技术方法， 达到产业化生产三倍体鱼苗的目的；通过三倍体鱼苗的生产克服半滑舌鳎雌雄大小差异悬 殊、雄性生长缓慢、雌性性腺发育过大、影响商品鱼质量和外观等问题，从而提高半滑舌鳎 养殖产量和养殖的经济效益。

[0006] 本发明其技术内容如下：

[0007] 包括二个方面：一、半滑舌鳎三倍体鱼苗的诱导；二、半滑舌鳎三倍体鱼苗的鉴 定。[0008] 一、半滑舌鳎三倍体鱼苗的诱导：

[0009] 它的技术内容包括：1、半滑舌鳎未受精卵的采集及授精；2、三倍体诱导起始时间 的确定；3、诱导半滑舌鳎三倍体静水压休克压力和处理时间的确定。

[0010] 1、半滑舌鳎未受精卵的采集及授精：

[0011] 选择性成熟的半滑舌鳎雌鱼，采用人工挤压腹部法采卵，将采集的鱼卵置于室温 20-24°C的干燥烧杯中；将采集的新鲜半滑舌鳎精液加入未受精卵中，精液和卵的授精最 小体积比为500 μ L :50-100ml，干法授精，轻轻摇动混勻，后加入2倍于卵量体积温度为20-24°C的海水完成授精过程。

[0012] 2、三倍体诱导起始时间的确定：

[0013] 在授精后不同时间（l，2，3，4，5，6，7，8min)，将授精卵分别放入静水压机的压力 缸中进行静水压休克处理，静水压为34-36Mpa，处理时间4-5min，后将授精卵分别移入21-23°C海水中培养。根据受精率和三倍体诱导率的高低，确定半滑舌鳎三倍体诱导的最佳 起始时间为授精后4. 5-5. 5min。

[0014] 3、诱导半滑舌鳎三倍体静水压休克压力和处理持续时间的确定：

[0015] 在授精后4. 5-5. 5min，将授精卵分别置于观，32，36，40或44MPa静水压下处理 3-4分钟后，分别移入21-23°C海水中培养，根据受精率和三倍体诱导率的高低，确定半滑 舌鳎三倍体诱导的最佳静水压休克压力为36-40MPa。

[0016] 在授精后4. 5-5. 5min，将授精卵置于36_40MPa静水压下分别处理2，4，6或8分 钟，根据受精率和三倍体诱导率的高低，确定半滑舌鳎三倍体诱导的最佳静水压休克处理 时间为4分钟。

[0017] 二、半滑舌鳎三倍体鱼苗的鉴定：

[0018] 它的技术内容包括：1.通过DNA含量鉴定半滑舌鳎三倍体鱼苗；2.通过染色体分 析鉴定半滑舌鳎三倍体鱼苗。

[0019] 1.通过DNA含量鉴定半滑舌鳎三倍体鱼苗：

[0020] 采用商业上可获得的PARTEC倍性测定仪（PA)及一步法染色试剂进行三倍体胚胎 或鱼苗的倍性鉴定。采用正常二倍体胚胎或鱼苗作对照，通过分析胚胎或鱼苗细胞DNA的 含量确定倍性，二倍体胚胎或鱼苗细胞DNA含量绝大多数集中在沈-观处，而三倍体鱼苗绝 大多数细胞中的DNA含量在39-42处，是二倍体鱼苗的1. 5倍，从而确定细胞DNA含量在 39-42的胚胎或鱼苗为三倍体。

[0021] 2.通过染色体分析鉴定半滑舌鳎三倍体鱼苗：

[0022] 半滑舌鳎二倍体鱼苗的染色体数目为2n = 42条；而三倍体鱼苗的染色体数目应 该为3n = 63，在授精后4. 5-5. 5min,将授精卵置于36_40MPa静水压下处理4分钟，产生的 鱼苗中95%以上的个体含有63条染色体者，即这些鱼苗为三倍体鱼苗。

[0023] 本发明与已有技术对比其特点是：

[0024] 本发明建立了采用静水压方法直接诱导半滑舌鳎三倍体鱼苗的方法，确定了三倍 体诱导的适宜起始时间、适宜的静水压休克压力和处理时间。同时建立了三倍体鱼苗鉴定 的方法。

[0025] 本发明建立的三倍体鱼苗诱导方法可高效、可靠诱导产生三倍体鱼苗，且三倍体 鱼苗的诱导效率较高，本方法诱导的鱼苗的三倍体比例高达95%以上。4体鱼苗倍性整齐、不含二倍体和四倍体。

[0027] 本发明首次建立了静水压批量化诱导半滑舌鳎三倍体鱼苗的技术方法，其特点是 操作简单、实用性强、易行、安全可靠，为半滑舌鳎性别控制和多倍体育种开辟了新的技术 途径，可推广应用于几乎所有鱼类，对鱼类性别控制具有重要意义。附图说明：

[0028] 图1 ：三倍体鱼苗和二倍体鱼苗细胞DNA含量比较：

[0029] A ：正常二倍体鱼苗细胞DNA含量；B ：三倍体鱼苗DNA含量。

[0030] 图2 ：三倍体鱼苗和二倍体鱼苗染色体比较：

[0031] A ：正常二倍体鱼苗染色体；B ：三倍体鱼苗染色体。具体实施方式：

[0032] 采用同源精子与半滑舌鳎卵子授精，在受精后一定时间，对受精卵进行静水压休 克处理，抑制受精卵第二极体的释放，可以成功诱导半滑舌鳎三倍体鱼苗的产生，建立半滑 舌鳎三倍体鱼苗高效诱导技术，对于半滑舌鳎的性别控制，进行不育苗种养殖，提高半滑舌 鳎的养殖产量、产品质量和经济效益，具有重要的现实意义和巨大的推广应用潜力。

[0033] 下面以半滑舌鳎为例，结合附图对本发明的技术内容进行详细说明：

[0034] 本发明其技术内容包括二个方面：一、半滑舌鳎三倍体鱼苗的诱导；二、半滑舌鳎 三倍体鱼苗的鉴定。

[0035] 一、半滑舌鳎三倍体鱼苗的诱导：

[0036] 它的技术内容包括：1、半滑舌鳎未受精卵的采集及授精；2、三倍体诱导起始时间 的确定；3、静水压诱导半滑舌鳎三倍体休克压力和处理时间的确定；4.静水压诱导半滑舌 鳎三倍体鱼苗结果汇总。

[0037] 1、半滑舌鳎未受精卵的采集及授精：

[0038] 选择性成熟的半滑舌鳎雌鱼，采用人工催产方法诱导亲鱼排卵，采用人工挤压腹 部法采卵，采集的鱼卵置于室温20-24°C的干燥烧杯中；将采集的新鲜半滑舌鳎精液加入 未受精卵中，精液和卵的授精最小体积比为500 μ L :50-100ml，干法授精，轻轻摇动混勻， 加入2倍于卵量体积的温度为23-M°C的海水完成授精过程。授精过程在IOOOml烧杯中进 行。

[0039] 2、三倍体诱导起始时间的确定：

[0040] 本发明采用静水压处理抑制受精卵第二极体排出，从而使染色体加倍的方法进行 三倍体诱导。即在授精后不同时间（l，2，3，4，5，6，7，8min)，将授精卵放入静水压机的压力 缸中进行静水压休克处理，静水压处理的压力为34-36Mpa，静水压处理时间为4-5min，处 理完毕后将授精卵移入21-23°C海水中培养。统计受精率，三倍体比率。结果发现授精卵在 授精后3-7min进行静水压休克处理，都能够诱导产生三倍体鱼苗，且以授精后4. 5-5. 5min 的诱导率最高，可达到90%。从而确定半滑舌鳎三倍体诱导的最佳起始时间为授精后 4. 5-5. 5min。

[0041] 3、静水压诱导半滑舌鳎三倍体休克压力和处理时间的确定：

[0042] 确定静水压休克起始时间后，设定静水压压力梯度为观，32，36，40和44MPa，持续处理4分钟，实验结果表明，受精卵在32，36和40MPa压力下都能获得一定比例的三倍体鱼 苗，而只有在静水压压力36和40MPa时诱导三倍体鱼苗的效果最好，因此确定半滑舌鳎三 倍体诱导最佳的静水压压力为36-40MPa。（见表1)。

[0043] 最后筛选静水压处理持续时间，将梯度范围设为2，4，6和8分钟，进行静水压休克 处理。计数后代中三倍体产生情况，实验结果表明，半滑舌鳎受精卵在36MI^压力下休克处 理2-8分钟，均有鱼苗孵化出膜。但是随着压力持续时间的加大，孵化率急剧下降，只有在 休克处理4分钟时，诱导三倍体鱼苗的效果最好。（见表2)

[0044] 表1 ：静水压诱导半滑舌鳎三倍体休克压力的确定（海水温度23°C左右，授精后 5min，压力持续时间为^iin)

[0045]

[0046] 表2 ：静水压诱导半滑舌鳎三倍体处理持续时间的确定（海水温度23°C左右，受精 后5min，静水压力为36MPa)

[0047]

[0048] 4.静水压诱导半滑舌鳎三倍体鱼苗结果汇总：

[0049] 采用上面建立的方法，我们进行了半滑舌鳎三倍体鱼苗的诱导，在多次诱导实验 中获得大量三倍体鱼苗，现将半滑舌鳎三倍体诱导结果汇总如下表3 ：

[0050] 表3 ：半滑舌鳎三倍体鱼苗诱导结果汇总

[0052] 二、半滑舌鳎三倍体鱼苗的鉴定：

[0053] 它的技术内容包括：1.通过DNA含量鉴定半滑舌鳎三倍体鱼苗；2.通过染色体分析鉴定三倍体鱼苗。

[0054] 1.通过DNA含量鉴定半滑舌鳎三倍体鱼苗：

[0055] 通过三倍体诱导实验，抽检孵化出膜后2-5天的实验鱼苗20-30尾。将每尾鱼苗 放入1个1. 5ml的离心管中，用蒸馏水清洗鱼苗1次，随后向每个离心管加入0. 2ml PBS，用 碾磨棒将鱼苗碾碎成单细胞，制成单细胞悬液，碾磨下一个前先将碾磨棒在蒸馏水中洗干 净。全部磨好后，向每个管中加入l_2ml从PARTEC公司购买的一步法染色试剂，用滤膜过 滤后，将滤液转入仪器配套的5ml试管中，轻弹试管，使细胞悬液混合均勻，然后将试管置 于PARTEC倍性测定仪（PA)进行测定。测试样品，用正常二倍体胚胎作对照，再分析三倍体 诱导组。

[0056] 通过细胞DNA含量分析，得知二倍体鱼苗细胞中的DNA含量绝大多数集中在沈-28 处，而三倍体鱼苗绝大多数细胞中的DNA含量在39-42 (表4)，是二倍体鱼苗的1. 5倍（见 图1 :A、B)，因此证明我们诱导出的鱼苗为三倍体鱼苗。采用倍性测定仪主要是证明本发明 方法诱导半滑舌鳎三倍体的可行性和有效性，而在今后采用本发明方法进行半滑舌鳎三倍 体诱导时，则不必要每次都进行三倍体鱼苗的检测。

[0057] 表4 ：流式细胞仪测定三倍体鱼苗DNA相对含量汇总（三倍体率100% )

[0058]

[0059] 2.通过染色体分析鉴定三倍体鱼苗：

[0060] 半滑舌鳎二倍体鱼苗的染色体数目为2n = 42条；而三倍体鱼苗的染色体数目为 3η = 63，因此通过染色体分析即可鉴定诱导出的鱼苗是否为三倍体鱼苗。如果诱导出的鱼 苗的染色体数目为63条，则证明这些鱼苗是三倍体。本发明采用鱼苗染色体制片方法，对 人工诱导的半滑舌鳎三倍体鱼苗进行染色体分析。主要步骤包括：将1-15日龄的鱼苗置于 海水配置的0. 02%的秋水仙素中，在室温下处理2个小时。然后把鱼苗放入0. 075mol/L的 KCL中，低渗25-35分钟。用新配制的预冷卡诺氏液（甲醇：冰醋酸=3 ： 1)连续固定3 次，每次20分钟。再取单个鱼苗放入50%的冰醋酸中，使细胞游离。热滴片法滴片。10% 吉姆萨染液染色20-30分钟，镜检。每次三倍体诱导实验抽检10-20尾鱼苗进行染色体分 析，发现在优化的静水压休克条件下产生的鱼苗都含有63条染色体，正常二倍体鱼苗的染 色体数为48条，因此，含有63条染色体的鱼苗就是三倍体鱼苗（见图2 ·Λ、B)。由此证明 本方法诱导的鱼苗的三倍体比例高达95%以上。采用染色体分析主要是证明本发明方法诱 导半滑舌鳎三倍体的可行性和有效性，而在今后采用本发明方法进行半滑舌鳎三倍体诱导 时，则不必要每次都进行三倍体鱼苗的染色体分析。