一种含雄黄的药物组合物

摘要

本发明提供一种含雄黄的药物组合物，具体地讲该药物组合物含有雄黄微生物浸出液以及人参提取物、黄芪提取物和苦参素，动物实验表明该药物组合物对原癌基因Ras通路的过度激活具有明显的下调作用，且毒性低，该药物组合物适于在制备抗肿瘤药物中应用。

权利要求

1.一种含雄黄的药物组合物，其特征在于该药物组合物含有雄黄溶解液，人参提取物，黄芪提取物，苦参素。

2.根据权利要求1所述的一种含雄黄的药物组合物，其特征在于该组合物含以下成分：以体积比计算，雄黄溶解液2.5％-40％，人参提取物0.8％-20.0％，黄芪提取物

0.8％-20.0％，苦参素0.8％-20.0％。

3.根据权利要求1所述的一种含雄黄的药物组合物，其特征在于雄黄溶解液砷不低于32μg/ml，人参提取物按生药量计不低于6.75mg/ml，其中人参皂苷Rg1含量不少于

0.08％，人参皂苷Re的含量不少于0.67％，人参皂苷Rb1的含量不少于0.90％；黄芪提取物，按生药量计不低于25mg/ml，其中黄芪甲苷含量不少于0.1％；苦参素不低于250μg/ml。

4.根据权利要求1至3任意一项所述的一种含雄黄的药物组合物，其特征在于该组合物在制备抗肿瘤药物中应用。

说明书

一种含雄黄的药物组合物

技术领域

[0001] 本发明提供一种含雄黄的药物组合物，具体地讲该药物组合物含有雄黄溶解液，人参提取物，黄芪提取物和苦参素，属抗肿瘤药物领域。

背景技术

[0002] 2000年9月美国FDA批准了将As2O3注射液用于治疗难治、复发急性早幼粒细胞白血病。国内外研究表明，砷剂不但对血液系统肿瘤有显著的效果，而且还可应用于治疗其它恶性实体瘤。因而，砷制剂治疗癌症引起人们更多的关注，含砷制剂的开发和应用成为了一个抗肿瘤药物研究的热点，但无论是As2O3注射液还是其它含砷制剂都存在毒性大的通病。

[0003] 作为含砷的矿物药雄黄，其主要成分为As2S2(或As4S4)，在临床上已成功地用于治疗慢性和急性早幼粒细胞白血病(International Journal of Hematology 2002：76：316-318)，因而，雄黄的抗肿瘤作用备受国内外相关学者的关注。但是，雄黄作为一种含砷矿物药，同样存在毒性高的问题，同时由于雄黄又是一种极其难溶的矿物药，还存在生物利用度低等问题，制约了它在临床上的应用。

[0004] 中国发明专利2006102000675记载了利用细菌对雄黄进行溶解的方法，雄黄溶解后可释放出可溶性的砷，并含有Zn、Cu、Mg、Mn、Fe、Se等与人体健康密切相关的微量元素，相对于传统雄黄，雄黄溶解液对肿瘤治疗具有生物利用度高、用量少，毒性降低，疗效显著的特性。

[0005] 但雄黄溶解液的药效仍有进一步提升的可能，毒性也仍有进一步降低的空间。

[0006] 因此，我们设计了含有雄黄溶解液的药物组合物，以期达到对雄黄溶解液进行减毒或增效作用。

发明内容

[0007] 本发明提供了一种雄黄药物组合物，该药物组合物含有雄黄溶解液，人参提取物，黄芪提取物，苦参素。

[0008] 该组合物含以下成分：以体积比计算，雄黄溶解液2.5％-40.0％，人参提取物0.8％-20.0％，黄芪提取物0.8％-20.0％，苦参素0.8％-20.0％。此外，可以在组方中加入药学上可以接受的盐或缓冲，这是同领域人员可以理解的。

[0009] 雄黄溶解液砷不低于32μg/ml，人参提取物按生药量计不低于6.75mg/ml，其中人参皂苷Rg1含量不少于0.08％，人参皂苷Re的含量不少于0.67％，人参皂苷Rb1的含量不少于0.90％；黄芪提取物按生药量计不低于25mg/ml，其中黄芪甲苷含量不少于0.1％；苦参素不低于250μg/ml。

[0010] 雄黄溶解液是按照中国发明专利申请2006102000675公开的细菌处理方法制备，以电感耦合等离子体原子发射光谱测砷含量。

[0011] 人参提取物制备工艺流程：

[0012]

[0013] 苦参素：分子式为C15H24N2O2，又称氧化苦参碱，含量(按干燥品计算)：98.17％，购于陕西旭煌植物科技发展有限公司。

[0014] 动物实验表明该药物组合物对原癌基因Ras通路的过度激活具有明显的下调作用，且毒性低，该组合物适于在制备抗肿瘤药物中应用。

[0015] 本发明的有益效果在于提供了一种含雄黄的组合物，其毒性较雄黄浸出液低，或者具有协同作用，提高了雄黄浸出液的抗肿瘤效果。

具体实施方式

[0016] 实施例一药物各组分的制备及质量控制

[0017] 雄黄溶解液的制备：按照中国发明专利申请号为2006102000675公开的细菌处理方法制备。利用浸矿微生物氧化亚铁硫杆菌对雄黄矿粉进行生物法炮制，雄黄在室温30℃2+
左右，粒度为180-200目，矿浆浓度为1％，初始Fe 浓度为1.0g/L，矿浆pH值为2.2，细菌接种量为20％，130rpm摇瓶作用30天，过滤，滤液即为雄黄溶解液。溶解液以电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)法测定总砷含量为1590μg/ml。临用前稀释至32μg/ml，待用。

[0018] 苦参素溶液制备：取苦参素50mg，用蒸馏水5ml溶解，使之成为10mg/ml，用0.22μm的滤膜进行过滤。临用前稀释至250μg/ml，待用。

[0019] 人参提取物制备：取13.5g的人参，加8倍量90％乙醇浸泡14h后，回流提取两次，每次3h，合并滤液，回收乙醇，用蒸馏水定容至50ml。即原液含生药量为0.27g/ml，过0.22μm的滤膜。采用岛津20A高效液相色谱仪(二极管阵列检测器)测定的。色谱条件：用ZorbaxC18柱，以水和乙腈为流动相，梯度洗脱，流速1ml/min，柱温30℃，检测波长为
203nm，测其含量Rg1含量为0.08％，人参皂苷Re的含量为0.67％，人参皂苷Rb1的含量为
0.90％。临用前稀释至6.75mg/ml待用。

[0020] 黄芪提取物制备：取黄芪50g，加8倍量的水浸泡1h，煎煮2h，过滤，滤渣加8倍量的水煎煮2h，合并滤液，滤液浓缩至50ml。即原液为1g/ml，过0.22μm的滤膜。采用岛津20A高效液相色谱仪(蒸发光散射检测器)测定的。色谱条件：用Cosmosil-C18柱，以水和甲醇为流动相，梯度洗脱，流速0.8ml/min，柱温40℃，检测波长为254nm，测其含量黄芪提取物中黄芪甲苷含量为0.1％。临用前稀释至25mg/ml待用。

[0021] 阳性对照As4SX溶液制备：称取过200目筛的雄黄粉溶于0.1N的氢氧化钠溶液中，使之成为0.5mM的储备液，放于4℃冰箱保存(PNAS 2008：105：4826-4831)。临用前用0.22μm的滤膜进行过滤。临用前稀释32μg/ml待用。

[0022] 实施例二雄黄溶解液对线虫Let-60的抑制作用

[0023] 材料：秀丽隐杆线虫：Let-60(n1046)IV

[0024] M液：每升缓冲液中含15g Na2HPO4·12H2O，3g KH2PO4，5g NaCl，0.25g MgSO4·7H2O。

[0025] 原理：研究发现，大约30％的人类肿瘤存在Ras基因的突变激活及Ras蛋白表达水平增高的现象，(Signal-Transduction[M].2005：20-100)，Hara-and Han采用与人类Ras同源的let-60秀丽隐杆线虫突变体，研究了两种Ras法尼基转移酶抑制剂对Ras通路的作用，结果表明，这两种Ras法尼基转移酶抑制剂可以下调Ras通路的过度激活，多阴门表型的let-60突变体线虫在药物的作用下变成野生型(PNAS 1995：92：3333-3337.)。因此，目前秀丽隐杆线虫多阴门表型突变体已被普遍采用为抗癌基因Ras活性药物筛选的模式生物(CANCER-CELL 2005：7：325-336)。

[0026] 此外，Dengg和van Meel的研究结果表明应用秀丽隐杆线虫测定的药物LC50对药物毒性进行排序的结果同以小鼠测定的药物毒性排序的结果相一致(J Pharma Toxicol Methods2004：50：209-214)，因此，目前秀丽隐杆线虫也已被普遍用于测定药物毒性的大小。

[0027] 本发明采用秀丽隐杆线虫的let-60突变体作为模式生物对含雄黄药物组合物进行了药效及毒性的测定。

[0028] 实验步骤：将在培养皿中培养至成虫的秀丽隐杆线虫用M液冲洗下来，用6.4％次氯酸钠溶液和1M NaOH溶液(1∶1比例混合)进行同步化，待卵孵出后，将L1期幼体线虫放入已铺有OP50的不同药物浓度的NGM板上，每板50～100条，每个药物处理设3个重复。培养至成虫后，用M溶液将线虫从板上冲洗下来，在倒置显微镜下观察成虫总数及野生型数目，计算野生型比例。与空白对照相比，野生型比率越高意味着药物作用更强。秀丽隐杆线虫的培养及同步化具体方法参见Brenner(Genetics 1974：77：71-94)。

[0029] LC50实验步骤：雄黄浸出液(640μg/ml)稀释成160μg/ml和As4S4溶液(150μg/ml)作为母液，分别把母液用M液按1∶0.8稀释成8个浓度。每个浓度加L1期线虫30-50条，每个浓度做3个平行。作用16h后，观察并计算其死亡率，实验结果如表1所示：

[0030] 表1雄黄溶解液和阳性对照As4S4溶液对Let-60的作用

[0031]组别 总砷含量(μg/mL) 野生型比例(％) LC50(μg/ml)
空白对照组 M液 25.0±4.3
阳性对照组(As4S4溶液) 12.8 45.2±5.2* 25.1
阳性对照组(As4S4溶液) 3.2 23.6±0.2 25.1
阳性对照组(As4S4溶液) 0.8 22.4±3.9 25.1
雄黄溶解液 12.8 84.1±0.9* 34.0
雄黄溶解液 3.2 69.7±1.6* 34.0
雄黄溶解液 0.8 34.6±3.8* 34.0

[0032] 注：与空白组比较 *P＜0.05

[0033] 实施例三雄黄溶解液组合物对Let-60的作用

[0034] 实验步骤：同实施例二

[0035] LC50实验步骤：同实施例二

[0036] 雄黄溶解液组合物：雄黄溶解液40％，苦参素0.8％，人参提取物0.8％，黄芪提取物0.8％，M液补足至100％，实验结果如表2所示：

[0037] 表2雄黄溶解液组合物对Let-60的作用

[0038]组别 总砷含量(μg/ml) 野生型比例(％) LC50(μg/ml)
空白组 M液 36.0±5.0
雄黄溶解液组合物 12.8 91.9±2.7* 49.8

[0039] 注：与空白组比较 *P＜0.05

[0040] 实施例四雄黄溶解液组合物对Let-60的作用

[0041] 实验步骤：同实施例二

[0042] LC50实验步骤：同实施例二

[0043] 雄黄溶解液组合物：雄黄溶解液10％，苦参素20％，人参提取物4％，黄芪提取物0.8％，M液补足至100％，实验结果如表3所示：

[0044] 表3雄黄溶解液组合物对Let-60的作用

[0045]组别 总砷含量(μg/ml) 野生型比例(％) LC50(μg/ml)
空白组 M液 36.0±5.0
雄黄溶解液组合物 3.2 57.3±4.7* 55.0

[0046] 注：与空白组比较 *P＜0.05

[0047] 实施例五雄黄溶解液组合物对Let-60的作用

[0048] 实验步骤：同实施例二

[0049] LC50实验步骤：同实施例二

[0050] 雄黄溶解液组合物：雄黄溶解液10％，苦参素4％，人参提取物0.8％，黄芪提取物20％，M液补足至100％，实验结果如表4所示：

[0051] 表4雄黄溶解液组合物对Let-60的作用

[0052]组别 总砷含量(μg/ml) 野生型比例(％) LC50(μg/ml)
空白组 M液 36.0±5.0
雄黄溶解液组合物 3.2 63.6±7.1* 43.3

[0053] 注：与空白组比较 *P＜0.05

[0054] 实施例六雄黄溶解液组合物对Let-60的作用

[0055] 实验步骤：同实施例二

[0056] LC50实验步骤：同实施例二

[0057] 雄黄溶解液组合物：雄黄溶解液10％，苦参素0.8％，人参提取物20％，黄芪提取物4％，M液补足至100％，实验结果如表5所示：

[0058] 表5雄黄溶解液组合物对Let-60的作用

[0059]组别 总砷含量(μg/ml) 野生型比例(％) LC50(μg/ml)
空白组 M液 36.0±5.0
雄黄溶解液组合物 3.2 77.1±7.4* 51.9

[0060] 注：与空白组比较 *P＜0.05

[0061] 实施例七雄黄溶解液组合物对Let-60的作用

[0062] 实验步骤：同实施例二

[0063] LC50实验步骤：同实施例二

[0064] 雄黄溶解液组合物：雄黄溶解液2.5％，苦参素20％，人参提取物0.8％，黄芪提取物4％，M液补足至100％，实验结果如表6所示：

[0065] 表6雄黄溶解液组合物对Let-60的作用

[0066]组别 总砷含量(μg/ml) 野生型比例(％) LC50(μg/ml)
空白组 M液 36.0±5.0
雄黄溶解液组合物 0.8 47.3±2.5* 55.3

[0067] 注：与空白组比较 *P＜0.05

[0068] 实施例八雄黄溶解液组合物对Let-60的作用

[0069] 实验步骤：同实施例二

[0070] LC50实验步骤：同实施例二

[0071] 雄黄溶解液组合物：雄黄溶解液2.5％，苦参素4％，人参提取物20％，黄芪提取物0.8％，M液补足至100％，实验结果如表7所示：

[0072] 表7雄黄溶解液组合物对Let-60的作用