八月红梨果实可滴定酸含量的分子标记

摘要

本发明提供了‘八月红’梨果实可滴定酸含量的分子标记，属于遗传育种领域。利用SRAP、SSR、AFLP构建‘八月红’的遗传连锁图谱，结合对果实可滴定酸含量的表型鉴定，采用区间作图法对此群体进行分析，在‘八月红’的第3连锁群上检测到主效QTL的存在，可解释49.3%的可滴定酸含量特征。距离主效QTL位点Pta-1距离最近的标记为EAACMCAG-850m*，其距离为2cM。所获得的可滴定酸主效QTL分子标记对于加快梨品种的遗传改良进程，提高育种选择效率具有重要的理论和实践指导意义。

权利要求

1.一种‘八月红’梨果实可滴定酸含量的分子标记，是通过下列步骤获得：

a）利用梨品种‘八月红’和‘砀山酥梨’杂交获得F1后代单株；

b） 采 用 AFLP 引 物 E-AAC：5'- GACTGCGTACCAATTCAAC-3' 和 M-CAG：5'- GATGAGTCCTGAGTAACAG-3' ，以梨基因组DNA为模板进行PCR扩增，使用EcoⅠ和Mes Ⅰ两-1 -1种内切酶，连接液为：1µl浓度为50 µmol·µL 的MseⅠadopter，1µl浓度为5µmol·µL的EcoRⅠadopter，1µl T4 Buffer（10×），0.9U T4 DNA ligase，ddH2O1.7µl；

扩增产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，对‘八月红’和‘砀山酥梨’及其杂交后代基因组DNA进行分析，统计分析在亲本间具有多态性的位点在后代群体中的遗传类型，将得到的多态性标记位点导入Joinmap3.0作图软件，构建‘八月红’梨的遗传连锁图谱；

c）对‘八月红’和‘砀山酥梨’杂交后代的F1群体单株的果实可滴定酸含量进行测定，利用MapQTL5.0作图软件的区间作图法，将F1群体每个单株的果实可滴定酸含量与‘八月红’梨遗传连锁图谱中的分子标记进行连锁和QTL分析，以LOD值≥2.5为标准，大于2.5说明存在一个QTL位点，检测到在母本‘八月红’的第3连锁群上检测到可滴定酸含量的QTL位点Pta1，其LOD值为3.91，是主效QTL，距离最近的一个分子标记为EAACMCAG-850m*，大小为850 bp，距Pta1的距离为2cM，该标记可以作为梨果实可滴定酸含量的标记。

2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于：所述QTL位点Pta1位于‘八月红’梨第 3连锁群上，其解释49.3%的可滴定酸含量特征。

3. 权利要求1或2所述分子标记在梨品种‘八月红’和‘砀山酥梨’杂交育种中的应用。

4．根据权利要求3所述的应用，其特征在于：用梨基因组DNA，采用AFLP引物E-AAC：

5'- GACTGCGTACCAATTCAAC-3'和M-CAG：5'- GATGAGTCCTGAGTAACAG-3'进行PCR扩增，扩增产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，如果获得一个分子标记大小为850 bp，则表明梨果实可滴定酸含量的主效QTL位点存在，该QTL位点Pta1位于‘八月红’梨第 3连锁群上，其解释49.3%的可滴定酸含量特征。

说明书

八月红梨果实可滴定酸含量的分子标记

一、技术领域

[0001] 本发明提供了‘八月红’梨果实可滴定酸含量的分子标记，属于分子遗传育种领域，可用于梨果实可滴定酸含量性状的早期分子辅助选择，以提高育种效率。二、背景技术

[0002] 梨(Pyrus L.)原产我国，是我国第三大果树树种。梨因其果实营养价值高，香甜多汁，而深受消费者喜爱。可滴定酸是影响梨果品质的重要因素之一，其作为梨果实中所特有的组成成分，不仅影响到鲜食品质，而且影响到加工品质。因此，降低梨果实可滴定酸的含量，对改善梨果品质至关重要。培育果实可滴定酸含量少的品种已经成为梨育种的重要目标之一。

[0003] 由于梨为多年生木本果树作物，与果实品质相关的性状大都是由多基因控制、易受环境影响的数量性状，在分离后代表现为广泛的表型变异，其基因型与表现型间的对应关系难以确定。而以往的传统育种是基于经典数量遗传学理论，把控制某一性状的多个基因作为整体进行研究和选择，在现有基础上改良目标性状难度越来较大。近年来，随着分子标记技术的迅速发展、高密度的分子遗传图谱的出现，以及数量性状作图方法的不断完善，使得数量性状基因座(Quantitative trait loci，QTL)定位变成了现实，也为提高目标数量性状优良基因型选择的可能性、准确性及预见性奠定了基础。利用分子标记定位数量性状QTL，其实质就是分析分子标记与目标性状QTL之间的连锁关系，即利用已知座位的分子标记来定位未知座位的QTL，通过计算分子标记与QTL之间的交换率，来确定QTL的具体位置。基于获得的标记基因型分离与数量性状的量之间的关系，可直接把握数量性状基因，并开发可应用于分子标记辅助选择(Molecular-assisted selection，MAS)育种的技术，这已在许多重要农作物上取得了成功应用。

[0004] 目前有关梨数量性状的QTL定位研究仍属起步阶段，已有的研究主要是针对一些病害或生长性状，对重要品质性状之一的可滴定酸的QTL定位及分子标记的研究尚没有开展。因此，开展梨果实可滴定酸主效基因的QTL定位，筛选紧密连锁的分子标记，建立杂交后代早期辅助选择技术，对于提高梨果可滴定酸品质改良效率，缩短育种进程，节约生产成本显得尤为重要。三、发明内容

[0005] 技术问题

[0006] 本发明的目的是定位梨果实可滴定酸主效QTL，并提供与QTL位点紧密连锁的分子标记，通过检测这些分子标记可以预测梨果实可滴定酸含量，为实现对该性状的早期鉴定和筛选提供分子辅助选择技术支持。

[0007] 技术方案

[0008] 一种梨果实可滴定酸含量主效QTL连锁的分子标记，是通过下列步骤获得：

[0009] a)利用梨品种‘八月红’和‘砀山酥梨’杂交获得F1后代单株；

[0010] b) 采 用 AFLP 引 物 E-AAC：5 ′ -GACTGCGTACCAATTCAAC-3 ′ 和 M-CAG：5′-GATGAGTCCTGAGTAACAG-3′以梨基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物在6％变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，对‘八月红’和‘砀山酥梨’及其杂交后代基因组DNA进行分析，统计分析在亲本间具有多态性的位点在后代群体中的遗传类型，将得到的多态性标记位点导入Joinmap3.0作图软件，构建‘八月红’梨的遗传连锁图谱；

[0011] c)对‘八月红’和‘砀山酥梨’杂交后代的F1群体单株的果实可滴定酸含量进行测定，利用MapQTL5.0作图软件的区间作图法，将F1群体每个单株的果实可滴定酸含量与‘八月红’梨遗传连锁图谱中的分子标记进行连锁和QTL分析，以LOD值≥2.5为标准，大于2.5说明存在一个QTL位点，检测到在母本‘八月红’的第3连锁群上检测到可滴定酸含量的QTL*位点Pta1，其LOD值为3.91，是主效QTL，距离最近的一个分子标记为EAACMCAG-850m，大小为850bp，距Pta1的距离为2cM，该标记可以作为梨果实可滴定酸含量的标记。所述QTL位点Pta1位于‘八月红’梨第3连锁群上，其解释49.3％的可滴定酸含量特征。

[0012] 所述分子标记在梨分子育种中的应用，其特征在于：用梨基因组DNA，采用AFLP引物E-AAC：5′-GACTGCGTACCAATTCAAC-3′和M-CAG：5′-GATGAGTCCTGAGTAACAG-3′进行PCR扩增，扩增产物在6％非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，如果获得一个分子标记大小为850bp，则表明梨果实可滴定酸含量的主效QTL位点存在，该QTL位点Pta1位于‘八月红’梨第3连锁群上，其解释49.3％的可滴定酸含量特征。

[0013] 有益效果

[0014] (1)本发明首次对决定‘八月红’梨果实可滴定酸含量的数量性状位点进行了QTL定位，这为实现基于分子育种的多基因控制性状改良奠定了重要的基础和必要的前提。

[0015] (2)本发明中确定了‘八月红’果实可滴定酸含量的QTL位点，对该数量性状决定的贡献率较高，位点的贡献率为49.3％。因此，基于此位点筛选连锁分子标记对目标性状判断的准确性大大提高。

[0016] (3)目前普遍认为可应用于分子辅助选择的连锁标记与目标性状的距离需≤5cM，本发明中与主效QTL连锁的标记距离为2cM，与目标位点表现为紧密连锁，这对于提高分子标记辅助选择的准确性和效率具有重要意义。因此，以上标记具有良好的应用价值，可加快对梨果实可滴定酸性状改良的进度四、附图说明

[0017] 图1为‘八月红’可滴定酸含量QTL位点Pta1在BYH3上的位置。

[0018] BYH代表的是‘八月红’连锁群，BYH后的数字代表连锁群数。

[0019] 连锁群上左侧的数字是标记之间的遗传距离，单位为cM，右侧则表示的是分子标记的名称。共有3种分子标记，“E-M-”为AFLP标记，E和M分别指限制性内切酶Eco I和Mse I酶切，其后的数字是该标记多态性条带的编号；其它为SRAP、SSR标记。

[0020] 连锁群右侧的实心长方形指示QTL作图区间Pta1。右边的曲线图为QTL的LOD分布图，虚线为2.5阈值。

[0021] 图2为AFLP引物组合E-AAC/M-CAG在6％变性聚丙烯酰胺凝胶上的电泳检测图。*
箭头所指的条带即EAACMCAG-850m。
五、具体实施方式

[0022] 实施例1：

[0023] a)利用我国的两个梨品种‘八月红’和‘砀山酥梨’杂交组合，获得其97株F1群体。

[0024] b) 用 SSR(Simple sequence repeat)、SRAP(Sequence related amplified polymorphism)和AFLP(Amplified fragment length polymorphism)三种分子标记方法分析两个亲本及其F1群体，统计分析在亲本间具有多态性的位点在后代群体中的遗传类型。最终获得了23个SSRs、S基因位点、226个SRAPs和482个AFLPs等共732个多态性标记位点，然后利用Jionmap3.0作图软件对其进行连锁分析，构建了一张共包含240个多态性标记的‘八月红’梨的遗传连锁图谱。

[0025] 利用SSR、SRAP、AFLP分子标记方法，对‘八月红’和‘砀山酥梨’及后代进行分析，并统计分析在亲本间具有多态性的位点在后代群体中的遗传类型。

[0026] SSR标记的实验操作程序参考Yomamoto T.等(Euphytica，2002，124：129-137)的方法；SRAP标记的实验操作程序参考Li等(Theor Appl Genet，2001，103：455-461)的方法；AFLP标记分别使用Eco I和Mes I两种内切酶，具体实验操作程序参考Vos等(Nucleic Acids Res，1995，23：4407-4414)的方法。SSR和SRAP标记用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶强碱银染法检测，AFLP标记用6％变性聚丙烯酰胺凝胶银染检测。

[0027] 将SSR、SRAP、AFLP电泳图谱上清晰出现的多态性条带记为“1”，无带记为“0”，不清楚的带或缺失记为“-”，根据已知分子量的Marker(100bp DNALadder)计算各多态性条2
带的分子量。将分离条带按亲本来源归类，确定其来源及遗传类型。利用χ 测验分析各标记分离是否符合3∶1或1∶1的孟德尔分离比例，偏分离的在标记末尾用“*”标注。

[0028] c)用Joinmap3.0分析软件构建‘八月红’梨的分子遗传连锁图谱。

[0029] 将第b)步骤中得到的多态性标记位点按Joinmap3.0分析软件中适于cp群体构图的格式导入Joinmap3.0，排除缺失数据过多的位点和显著偏分离的位点，以LOD＝4.0～7.0，重组率＝0.4，选择Kosambi作图函数构建遗传连锁图(VanOoijen，2001)。

[0030] d)对该F1群体单株的果实可滴定酸含量进行了测定，测定方法采用碱式滴定法测定(龙淑珍和伍永群，2002)。将可滴定酸含量的表型值和‘八月红’连锁图谱的相关文件导入MapQTL5.0作图软件，选择区间作图法，以LOD值≥2.5为标准，对梨的可滴定酸含量在‘八月红’的连锁图谱上进行QTL分析和定位。

[0031] 结果表明，在‘八月红’的第3连锁群上检测到可滴定酸含量的QTL位点Pta1(图1)，LOD值为3.91，与最近的AFLP分子标记EAACMCAG-850m*的连锁距离为2cM，对该性状的贡献率为49.3％。该QTL位点为主效QTL，其最近标记的距离也远小于可应用于分子辅助选择的连锁标记与目标性状的所要求的最大距离。

[0032] 其中AFLP分子标记方法为，以梨DNA为模板

[0033] 双酶切体系20μ：DNA 400ng，1×NEB Buffer，BSA0.2μl，EcoR I 3U，Mse I 3U。充分混匀后37℃酶切5h，然后在65℃放置20min以使内切酶失活。

[0034] 将5μl的下述连接液加到上步 失活后的酶切产物中：1μl Mse I -1 -1adopter(50μmol·μL )，1μl EcoR I adopter(5μmol·μL )，1μl T4Buffer(10×)，
0.9U T4DNA ligase，ddH2O1.7μl。充分混匀后16℃连接过夜，65℃放置10min终止反应。

[0035] 预扩增反应体系20μl∶1μl连接产物10×稀释液，2μl dNTP(2.5mmol·L-1)，-1 -11.2μl MgCl2(25mmol·L )，1μl Mse I预扩引物(50ng·μl )，1μl EcoR I预扩引物-1
(50ng·μl )，1U rTaq酶，1×Buffer。

[0036] 预扩的PCR反应程序：

[0037]

[0038] 选 择 性 扩 增 反 应 体 系20μl∶ 1μl预 扩 增 产 物 的 20×稀 释 液，-1 -11.6μldNTP(2.5mmol·L )，1.2μl MgCl2(25mmol·L )，1μl Mse I 预 扩 引 物-1 -1
(50ng·μl )，1μl EcoR I预扩引物(50ng·μl )，1U rTaq酶，1×Buffer。

[0039] 选择性引物：

[0040] E-AAC：5′-GACTGCGTACCAATTCAAC-3′

[0041] M-CAG：5′-GATGAGTCCTGAGTAACAG-3′

[0042] 选择性扩增的PCR反应程序：

[0043]

[0044] 扩增产物在6％非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，能扩增出26条多态性条*带，其中850bp大小的一条就是目标条带EAACMCAG-850m，则标明QTL位点Ptal(图1)存*
在，与AFLP分子标记EAACMCAG-850m 的连锁距离为2cM，对该性状的贡献率为49.3％。

[0045] 实施例2

[0046] 利用筛选到的与‘八月红’果实可滴定酸含量主效QTL相连锁的分子标记对‘八月红’与‘砀山酥梨’的97株F1杂交后代进行初步检测，以检测该方法在梨果实可滴定酸含量分子标记辅助选择中的实用价值。用该97株后代的基因组DNA及AFLP选择性扩增引物*组合E-AAC/M-CAG进行PCR反应，电泳后根据EAACMCAG-850m 条带的有无来确定是否存在相应的标记，如果存在标记，说明该植株的果实可滴定酸含量高，不存在则说明低，同时用实际测得的果实可滴定酸含量结果与分子标记检测结果进行验证。

[0047] 结果显示，在‘八月红’和‘砀山酥梨’的97株F1杂交后代中，共有63株的DNA扩*增结果出现EAACMCAG-850m 条带，这64株当中有35株的果实可滴定酸含量大于0.2mg/g，所有这64株的果实可滴定酸含量平均值为0.243mg/g；共有14株后代的DNA扩增结果不*
出现EAACMCAG-850m 条带，其中7株的可滴定酸含量小于0.2mg/g，所有这14株的果实可*
滴定酸含量的平均值为0.176mg/g；12个单株条带缺失。用EAACMCAG-850m 预测可滴定酸含量有较好的预测效果。