一种提高植物产量的方法

摘要

本发明涉及用于提高植物产量的方法，该植物种植在会在所述植物中导致周期性氧化应激的条件下，所述方法包括使幼苗、组织培养物或小植株长成为植物的步骤，还包括如下步骤，即调控所述植物或所述植物的生长环境，使得能够在所述植物的个体发育早期有意识地抑制因所述周期性氧化应激而造成的所述植物中的呼吸和/或蛋白质周转速率的增长。

权利要求

1.一种提高植物产量的方法，其中所述植物种植在会在所述植物中导致周期性氧化应激的条件下，所述方法包括使幼苗或组织培养物长成为成熟植物的步骤，还包括如下步骤，即调控所述植物或所述植物的环境，使得能够在所述植物的个体发育早期有意识地抑制所述周期性氧化应激，从而将所述植物的总暗呼吸中的交替氧化酶AOX成分维持在与从未暴露于氧化应激下的植物中相等的水平，其中，所述个体发育早期是指当响应于环境刺激的植物特征已平稳且固定下来时，该个体发育早期结束。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，导致周期性氧化应激的所述条件选自周期性干旱应激、周期性温度应激、周期性辐射应激、周期性盐应激和周期性臭氧暴露。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述植物的总暗呼吸中的所述AOX成分接近于零。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过控制生长环境中的活性氧类物质的含量来有意识地抑制所述氧化应激。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，通过将植物暴露于会降低呼吸速率的CO2水平来抑制所述植物的个体发育早期内的周期性氧化应激。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述生长环境中的活性氧类物质是生长环境大气中的O3。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，通过使用O3净化器和/或O3前体净化器来控制所述O3的暴露。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，通过将所述植物或其生长环境大气暴露于内源性或外源性产生的异戊二烯下来控制所述O3的暴露。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述异戊二烯通过能够释放出异戊二烯的微生物来外源性地得到。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述微生物为转基因的或重组的微生物。

11.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述植物的个体发育早期是营养生长期。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述个体发育早期是发芽后1-6个月的时期。

13.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述植物是多年生植物。

14.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述植物是作物植物。

15.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述植物为小麦、玉米、大豆、土豆、水稻、甜菜、月见草、绣线菊、啤酒花、加州希蒙得木、花生、红花、大麦、燕麦、黑麦、高粱、烟草、木棉、菜豆、小扁豆、豌豆、油菜、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻、可可豆、棉花、亚麻、大麻、黄麻、肉桂、樟脑、咖啡、甘蔗、茶树或橡胶树。

16.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在所述植物的个体发育期已终止时停止对所述植物或所述植物的环境的调控的步骤。

17.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在使所述幼苗或组织培养物长成为成熟植物之前或同时确定：－同一类植物中的总暗呼吸和/或通过AOX途径的呼吸；

－同一类植物的个体发育期的长度；和/或

－导致氧化应激的周期的长度和时间间隔；

并且使用上述信息来有意识地防止所述植物在所述植物的个体发育早期阶段但不是个体发育后期阶段暴露在所述周期性氧化应激下。

18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，采用所述信息来选择所述植物的播种或移栽时机，以便防止所述植物在所述植物的个体发育早期阶段暴露在所述周期性氧化应激下。

19.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述植物的个体发育早期是营养生长期，而个体发育后期是生殖期。

20.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述植物种植在会在所述植物中导致周期性氧化应激的条件下，所述方法包括在所述植物的个体发育早期阶段施用含有能释放出异戊二烯的微生物的农业生物组合物。

21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述组合物包括用于所述微生物的生长养分，以及能诱导在该微生物中产生异戊二烯的物质。

22.根据权利要求20或21所述的方法，其特征在于，所述微生物是包含异戊二烯合酶的表达载体的转基因微生物，其中异戊二烯合酶可操作地连接在能在所述微生物中起作用的启动子上。

23.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述植物种植在会在所述植物中导致周期性氧化应激的条件下，所述方法包括在所述植物的个体发育早期阶段施用含有能产生过氧化氢酶的微生物的农业生物组合物。

24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述组合物包括用于所述微生物的生长养分，以及能诱导在该微生物中产生过氧化氢酶的物质。

25.根据权利要求23或24所述的方法，其特征在于，所述微生物是包含过氧化氢酶的表达载体的转基因微生物，其中所述过氧化氢酶可操作地连接在能在所述微生物中起作用的启动子上，并且所述微生物与植物共生。

26.用于提高作物种植区的作物平均年产量的方法，包括按照权利要求1到25中任一项所述的方法来种植植物，并且使用所述植物作为所述种植区中的作物植物。

27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，作物平均年产量的所述提高通过提高所述作物植物的净固碳效率、生物质产量、干物质含量和/或抗病虫害能力来实现。

28.一种用于在选定栽培区中提高植物产量的方法，包括步骤：

a)确定所述植物的个体发育早期阶段，在所述个体发育早期阶段中，基础呼吸速率或通过交替氧化酶AOX途径的呼吸速率固定在一个永久性的最低水平；

b)监测所述栽培区上方空气中的活性氧类物质的浓度；和

c)对所述植物进行播种或育苗移栽，使幼苗发育成为成熟植物，其中在所述植物的个体发育早期，通过用从步骤b)中取得的数据来选择播种和移栽的时机，从而使所述植物在所述栽培区上方空气中的暴露来提供最低的氧化应激诱导；

其中，所述个体发育早期是指当响应于环境刺激的植物特征已平稳且固定下来时，该个体发育早期结束。

说明书

一种提高植物产量的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及作物生产领域。更具体地，本发明涉及种植植物的方法和提高作物种植区的作物平均年产量的方法。本发明还涉及用本发明方法生产的具有增大的产量的植物，以及包括有用于控制大气中活性氧类物质含量的装置的温室。

背景技术

[0002] 预计在未来20年内，全球小麦、水稻、玉米和其他主要谷物的需求量将稳步上升。除了作为食物来源外，这种需求量会由于采用生物方法来生产植物燃料和化学品的增长而也将上升。通过增加土地使用来提高生产以满足该需求的可能性不大；尽管较好的作物管理会带来些许作用，但是大部分农业专家认为，该预期缺口必须通过提高作物产量来弥补。

[0003] 现代的作物生产管理系统制成定能优化会影响作物产量的每一项要素。水分和养分的可利用性管理以及病虫害防治是所有大田作物农业生产计划中的标准项目。对于温室作物来说，还可优化CO2、光照和温度的可利用性。因此，大多数作物目前都是在表面上看来为最佳的条件下生产的。虽然有些偏差被认为是“自然的”，但实际生产效率仍然只能达到理论最大值的一小部分。事实上，大多数作物在大田中所能达到的年均效率水平往往低于特殊年份所能达到的最高水平的一半。造成这种差别的原因并没有被正确的理解。因此，有必要进一步认识和优化生物生产效率。

[0004] 植物的生物质产量取决于植物的净固碳效率。这种效率受控于光合作用导致的与CO2固定相关的碳增长率，以及呼吸作用导致的与CO2排放相关的碳损失率。虽然总光合作用随温度上升而增强，并且呼吸作用也是如此，但是光合作用速率在约25℃时最佳的光合酶1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶的作用下趋于平稳，在高于这个温度时呼吸作用继续迅速上升，大约每10℃增加一倍（Q10通常为2倍）。在温度高于约35℃左右（至少对于C-3类物质而言）时，产生的全部糖都用于支持呼吸。在温度高于35℃时，植物呼吸消耗的糖比它们产生的糖多，这会导致植物衰败并最终死亡。因此如果想要优化生产，就必须考虑净光合作用（能源化合物的产量减去包括光呼吸作用在内的其呼吸所消耗的）。如前所述，改善碳平衡的传统方法以提高总光合速率为目的。虽然呼吸速率与温度之间的关系是众所周知的，并且已知呼吸会随蛋白质周转和维持需求而变化，然而通常认为基础呼吸速率是相对固定的。

[0005] 在其生命周期中，植物会经历大量的受控于基因表达改变的生理、生化和形态上的变化。然而，植物的形态发生能力是遗传因素和环境因素的函数，其中温度和光照条件的影响似乎最大。已经知道，描述植物从种子发芽到发育成熟的总形态发生过程会影响植物生产的诸因素，例如植物在遭受叶落或草食性动物侵害后的补偿程度。而且，众所周知，在个体发育早期影响作物生长的诸因素往往会产生一些变化，其影响会延续到整个季节，并可能导致经济产量明显改变。研究认为，这是表观遗传因素的结果，其中DNA-甲基化是最广为人知的一个。植物个体发育包括植物株型、库容以及针对不同功能（如存储、防御、繁殖）的资源分配的生长发育变化。对于木本类植物而言，植物年龄的增长与资源分配模式的变化相关，这是因为碳/养分平衡、库容以及水和养分的摄取通常会增加，而根茎比、生长速度、光合作用、气孔导度、激素生产以及代谢活性通常会下降。此外，幼年和成年乔木之间的形态差异包括叶形、叶序、茎向、季节性留叶、不定根的存在以及比叶重的变化。

[0006] 但是，还不知道作物产量是否一般都会受个体发育过程的影响，或者影响作物个体发育早期的因素是否会产生能延续到植物的整个生命过程的变化。

[0007] 很多种类的植物会释放出异戊二烯（2-甲基-1,3-丁二烯）。异戊二烯的释放通常会消耗很大比例的在光合作用过程中所固定的碳。植物中的异戊二烯释放的作用尚不完全清楚。有人提出这是起到防护热应激的作用。的确，某些植物中的异戊二烯释放呈现出依赖于植物生长温度的温度响应模式。也发现其他烯烃会提高叶片的耐热性。还有人提出，异戊二烯能提供针对应激条件的更全面保护，特别是针对（光）氧化应激，它最近被证实可以保护叶片防止臭氧损伤。烯烃如异戊二烯与单态氧、臭氧和OH自由基的反应能力是众所周知的，异戊二烯的释放已被认为是一种臭氧净化器。因此，虽然植物中的叶片温度和异戊二烯释放之间的相互关系是众所周知的，然而对植物来说非常珍贵的异戊二烯释放的生理学作用仍存争议。

[0008] 还有，维生素C即抗坏血酸盐是公认的保护植物免受氧化应激、如臭氧应激的因子。此外，已经提出酒石酸和番茄红素（一种含8个异戊二烯单元的四萜烯）可作为植物源性抗氧化剂。

[0009] 然而，用于防护应激条件的方法如何能够有利地用于提高所述植物的收率还是不明白。因此，不管是否存在对植物生存来说是必须的减产处理，都需要有表现出提高的收率的方法和植物。

发明内容

[0010] 一方面，本发明提供一种提高植物产量的方法，其中所述植物种植在会在所述植物中导致周期性氧化应激的条件下，所述方法包括使幼苗或组织培养物长成为成熟植物的步骤，还包括如下步骤，即调控所述植物或所述植物的环境，使得能够在所述植物的个体发育早期有意识地抑制所述周期性氧化应激，从而将所述植物的总暗呼吸中的AOX成分维持在与从未暴露于氧化应激下的植物中相等的水平；其中所述个体发育早期是指当响应于环境刺激的植物特征已平稳且固定下来时，该个体发育早期结束。

[0011] 根据本发明的另一方面，本发明提供一种用于在选定栽培区中优化特定类型植物以提高其产量的生产的方法，包括步骤：a)确定所述特定类型植物的个体发育早期阶段，在所述个体发育早期阶段中基础呼吸速率或通过交替氧化酶(AOX)途径的呼吸速率固定在一个永久性的最低水平；b)监测所述栽培区上方空气中的活性氧类物质的浓度；和c)对所述特定类型植物进行播种或育苗移栽，使幼苗发育成为成熟植物，其中在所述植物的个体发育早期，通过用从步骤b)中取得的数据来选择播种和移栽的时机，从而使所述植物在所述栽培区上方空气中的暴露来提供最低的氧化应激诱导；其中，所述个体发育早期是指当响应于环境刺激的植物特征已平稳且固定下来时，该个体发育早期结束。

[0012] 本发明人现已发现，基础呼吸速率、特别是总暗呼吸中的AOX成分在植物个体发育的早期便固定下来。事实上，本发明人发现，在植物个体发育早期的氧化应激会导致植物在其剩余生长寿命中具有较高的基础呼吸速率。虽然在成熟植物中呼吸速率会响应于环境条件的改变而暂时性增大，但是它将恢复到发育早期时最终固定下来的速率值。

[0013] 这一发现在巴西得以证实，在那里每年的甘蔗燃烧会导致大气中的臭氧的暂时性高浓度。结果发现，在臭氧浓度最低的时期种植的植物一致表现出高产量，而在个体发育早期存在这些不利条件的时期种植的植物则一致表现出低产率。

[0014] 因此，基于这些发现发明人认为，在个体发育早期能够抵抗环境臭氧的不良影响、或者以任何方式防止了这些不良影响的植物表现出很高的产量（以干物质含量计）。

[0015] 在个体发育早期植物会根据其生命中的那个时期占优势的条件来确定默认呼吸速率。例如由于组织损伤增加所致的蛋白质周转的增加会导致更高的呼吸速率。已经发现，这一过程在个体发育早期实质上是单向的：基础呼吸速率只上升，但不下降。结果，暴露于不利条件、诸如会导致叶片损伤和在个体发育早期呼吸速率增加的高臭氧浓度下的植物将在其整个生命过程中基本上保持较高的基础呼吸速率，或者至少持续一段很长时间。因此，这种植物将呈现出较低的净产量，但是要呼吸同样多的碳。

[0016] 本发明人现已发现，尤其是在其生命过程中的某一早期阶段中在有防臭氧化合物存在的条件下生长、并可因此被保护不受臭氧影响（即氧化应激）的植物显示出在生物质产率方面有明显提高，此外还具有更高的抗病性。防臭氧化合物的存在可通过在温室中提供特定的气候条件、或是通过在植物的附近例如由微生物或植物自身产生这些化合物来实现。本发明人发现，植物附近或者转基因植物内的防臭氧化合物的浓度或释放速率必须能够使得基础呼吸速率、特别是其AOX成分不会因为暴露于臭氧下而升高。对于异戊二烯来说，这至少可在植物的个体发育早期实现，其中在30℃下植物的异戊二烯释放至少为-2 -120nmol·m ·s 。还存在其他一些可避免基础呼吸速率、特别是其AOX成分增大的适当的
2 -2 -1
最低释放速率，例如5μg/g(干重)/h，以及0.03μg/cm/h或1.25nmol·m ·s 。

[0017] 线粒体电子传递链包括两个途径：细胞色素途径和交替氧化酶(AOX)途径。在植物中，热应激以及这里考虑的干旱应激、温度应激、辐射应激和盐应激诱导细胞色素c(cyt-c)从呼吸链中释放出来，这继而又导致了活性氧类物质(ROS)的浓度升高和AOX的诱发。AOX是一种存在于植物、一些真菌和锥体虫的线粒体内膜中的抗氰的、对羟肟酸敏感的末端氧化酶。这一活性会介导电子从UQ池到分子O2的非质子移位传递，以便形成水。经AOX流动的电子避开了Cyt-介导电子传递链上的质子移位复合物III和IV，导致氧化势能以热能形式损失。处于正常营养生长和发育期的植物中的AOX的作用仍不清楚。本发明人现已发现，作为总暗呼吸的一部分的AOX途径的最低水平可在植物生命的早期、即个体发育阶段中确定，以及就生成ATP而言的呼吸效率以及植物的收率低于植物在其生命早期暴露于会提高AOX途径的条件下所达到的水平。现在还发现，在个体发育早期通过调控植物或其环境可以有意识地抑制AOX途径中的这种增长。这种调控方式只有在理解了本发明时才可能达到有效的水平。

[0018] 在第一方面，本发明提供了一种植物，优选是种植在会导致周期性氧化应激的条件下的植物，其中所述植物或所述植物的环境被调控成使得能够在所述植物的个体发育早期有意识地抑制因所述周期性氧化应激而造成的所述植物中的呼吸和/或蛋白质周转速率的增长。例如，如果该周期性氧化应激是由臭氧引起，那么植物可在其个体发育的早期在存在有足量的防臭氧化合物的条件下生长。所述防臭氧化合物优选在植物的附近由微生物或植物自身产生。

[0019] 本发明植物的特征在于，虽然在其个体发育早期暴露于氧化应激的诱导条件下，但是该植物表现出作为总暗呼吸的成分的AOX实质上与从来没有暴露于氧化应激下的同一品种植物中的相同，还表现出作为总暗呼吸的成分的AOX比在其个体发育早期暴露于同样的所述氧化应激条件下但是该植物及其环境并没有被调控以防止AOX增长的同一品种植物中的明显更低（例如至少低5-25%）。而且，与同样地暴露但本身或其环境并没有进行如本文所述的调控的植物相比，该植物的干物质含量得到了增加。

[0020] 在本发明的转基因植物的另一优选实施例中，所述植物源自于不会自然地释放出异戊二烯的那类植物。这种植物在下文中简称为非异戊二烯释放类植物。同样地，低异戊二烯释放体在这里是指如果在个体发育早期因周期性氧化应激而导致的AOX增加可通过臭氧转化来抑制以使其异戊二烯释放率增大的植物。

[0021] 在一个替代性的优选实施例中，所述植物不是转基因高丽参（人参）、葛根、烟叶、灰白杨（银灰杨）、银白杨或拟南芥植物。

[0022] 在本发明植物的另一优选实施例中，所述个体发育早期是指发芽期和生殖期之间的阶段，因此优选是营养生长期，即植物打朵和开花之前。这个阶段大约处于发芽后几天到0.5-6个月内，对乔木来说通常长一些。

[0023] 在本发明植物的一个替代性的优选实施例中，所述植物表现出的基础呼吸速率（包括或优选是与交替氧化酶途径相关的情况）最多相当于如本文所述的至少在该植物早期发育阶段没有采取臭氧保护措施的植物的80%，优选最多是其70%、60%、50%、40%、30%，甚至20%。在一个十分优选的实施例中，该个体发育早期指所述植物的第一片叶子抽出后(DAE)的15-60天这段时间。备选地，在另一非常优选的实施例中，该个体发育早期与所述植物的预花期一致。

[0024] 在本发明植物的又一优选实施例中，所述植物源自于不能自然产生上述抗氧化化合物的那类植物。

[0025] 在本发明植物的又一优选实施例中，所述植物是成株，该成株在臭氧环境中所表现出的第一呼吸速率实质上等于个体发育早期时所述植物表现出的维持呼吸速率，并且所述植物当临时性地暴露于超过50或100ppbv臭氧的环境时表现出第二呼吸速率，该第二呼吸速率明显大于所述第一呼吸速率，并且继所述临时性暴露之后，该第二呼吸速率会恢复到暴露前的水平。

[0026] 在该植物的又一优选实施例中，所述维持呼吸速率是指在植物尚未暴露于臭氧下测得植物的一个刚发育完全的叶片的呼吸速率，该呼吸速率优选指就生成ATP而言由氧化应激（其结果是呼吸损失了效能）所致的总（暗）呼吸中AOX成分。因此，已经历了个体发育阶段并已暴露于臭氧的增强AOX条件下的本发明植物中的AOX接近于零，或至少接近于从未暴露于臭氧或其他氧化应激条件下的植物中的AOX值。因此，放置在无氧化应激环境中的本发明植物具备使其AOX基本上恢复到0%（或暴露前的水平）的能力。不采用本发明所述方法种植的并在其个体发育时期暴露于氧化应激环境下的植物，即使之后被置于无氧化应激的环境中，其AOX成分仍然较高。

[0027] 在另一方面，本发明提供了一种提高植物收率的方法，该植物种植在会在所述植物中导致周期性氧化应激的条件下，包括使育苗、组织培养物或小植株长成为植物的步骤，还包括对所述植物或所述植物的环境进行调控的步骤，该调控使得能够在该植物的个体发育早期有意识地防止因所述周期性氧化应激引起的所述植物中的呼吸和/或蛋白质周转速率的增大。

[0028] 一种提高植物收率的方法包括涉及本文所述的提高抗逆性的方法，以及提高所述植物的抗病性的方法。

[0029] 在这种方法的实施例中，氧化应激是存在于植物中的应激，其可能是由辐射、热、盐、干旱、SO2、低CO2或活性氧类物质造成的，该活性氧类物质包括H2O2或O3，优选是H2O2或O3，更优选是O3或O3前体，例如NOx。

[0030] 在本发明方法的另一优选实施例中，通过控制生长环境中的活性氧类物质(ROS)的含量来抑制氧化应激。所述生长环境中的活性氧类物质可以是H2O2或O3，优选是H2O2或O3，最优选是生长环境大气中的O3。ROS含量可通过多种方法之一来控制。例如在一封闭系统中，可以通过使用ROS净化器来进行控制。一种适当的ROS净化器例如是活性炭过滤器。或者，生长环境大气中的ROS以及尤其是O3的含量可通过使植物或其生长环境大气暴露于异戊二烯下来控制。众所周知，异戊二烯可以中和臭氧。在又一优选实施例中，异戊二烯可以由植物附近的微生物（包括转基因的或重组的微生物，其通过基因编码酶异戊二烯合酶来转化）产生。或者，可采用提高的CO2浓度水平来抵消个体发育期的氧化应激影响。

[0031] 在本发明方法的又一优选实施例中，该植物是多年生植物和/或作物植物，优选是保护性栽培的作物植物。

[0032] 在另一方面，本发明提供了一种提高作物种植区的作物平均年产量的方法，包括采用如上所述的本发明方法来种植植物，并将该植物作为作物植物种植在所述作物种植区内。

[0033] 在该方法的一个优选实施例中，作物平均年产量的提高通过提高所述作物植物的净固碳效率、生物质产量、干物质含量和/或抗病虫害能力来实现。

[0034] 在另一方面，本发明提供了一种从如上所述的本发明植物中得到的植物机体。

[0035] 在另一方面，本发明提供了一种用于种植植物的温室，其包括可在其中控制活性氧类物质的含量的大气环境。优选地，该活性氧类物质是O3，因而本发明的温室优选配有O3净化器，其可选地与O3前体转化器（例如可将NO2转化成NO+O3的光源）联用。

[0036] 在另一方面，本发明所提供了一种在选定栽培区内优化特定类型植物的生产的方法，包括以下步骤：

[0037] a)测定所述特定类型植物的个体发育早期，其中基础呼吸速率固定在一个永久性的最低水平；

[0038] b)监测上述栽培区上方的空气中的活性氧类物质的浓度，这例如通过用能够测量空气中的活性氧类物质浓度的大气传感器来进行；和

[0039] c)对所述特定类型植物进行播种或育苗或移栽小植株，使其幼苗或小植株成长为植物，其中通过用在步骤b)中得到的数据来选择播种或移栽的时机，以便在该植物的所述个体发育早期基本上防止其接触到所述栽培区上方的空气中的不利浓度水平的活性氧类物质。

[0040] 在另一方面，本发明提供了一种农业生物组合物，其包括可释放异戊二烯的微生物和具有良好农艺性的载体，该组合物还可选地包括用于所述微生物的生长养分和会在该微生物中诱导产生异戊二烯的物质，所述微生物优选是包含异戊二烯合酶表达载体的转基因微生物，其可操作地连接到可在该微生物中起作用的启动子上。

[0041] 在另一个方面，本发明提供了一种农业生物组合物，其包括可产生过氧化氢酶的微生物和具有良好农艺性的载体，该组合物还可选地包含用于该微生物的生长养分以及会在该微生物中诱导产生过氧化氢酶的物质，其中该微生物优选是包含异戊二烯合酶表达载体的转基因微生物，其可操作地连接到可在该微生物中起作用的启动子上，并且该微生物与该植物共生。

[0042] 在另一方面，本发明提供了一种提高植物收率的方法，该植物种植在会在所述植物中导致周期性氧化应激的条件下，包括在该植物的个体发育早期施用本发明的农业生物组合物。

附图说明

[0043] 图1显示了如示例2所述地针对种植且在人工气候室1中永久处于0ppbv臭氧浓度条件下的棉花植物的相移荧光测量法的测量结果（左方灰色线条：用SHAM抑制的样品；右方黑条线条：无抑制的对照样品）。

[0044] 图2显示了用相移荧光法测量的作为棉花全叶样品中的臭氧的函数的总暗呼吸的示意图。图2A为相对于臭氧的单位鲜重的相对呼吸(TDR)，其中3ppbv的臭氧浓度相应于100%的相对呼吸，也见表2；图2B为相对于臭氧的单位干重的相对呼吸(TDR)，见表2。

[0045] 图3显示了用相移荧光法测量的作为水稻全叶样品中的臭氧的函数的总暗呼吸的示意图。图3A为相对于臭氧的单位鲜重的相对呼吸(TDR)，其中3ppbv的臭氧浓度相应于100%的相对呼吸，也见表3；图3B为相对于臭氧的单位干重的相对呼吸(TDR)，见表3；图3C为相对于臭氧的干物质含量。

[0046] 图4显示了用相移荧光法测量的作为玉米全叶样品中的臭氧的函数的总暗呼吸的示意图。图4A为相对于臭氧的单位鲜重的相对呼吸(TDR)，其中3ppbv的臭氧浓度相应于100%的相对呼吸，也见表4；图4B为相对于臭氧的单位干重的相对呼吸(TDR)，见表4。

具体实施方式

[0047] 定义

[0048] 本发明所称用语“植物”指任何种类的植物。发明人在下文中提供了一些适用于本发明的一些植物的示例性说明。但是此列举仅用作示例性说明而不起限制作用，因为其他类型的为本领域技术人员所熟知的植物也适用于本发明。

[0049] 常见的农业开发植物是蔬菜类作物，包括朝鲜蓟、大头菜、芝麻菜、韭菜、芦笋、莴苣（如结球莴苣、散叶莴苣、长叶莴苣）、小白菜、暗绿叶黄体芋、花椰菜、瓜类（如香瓜、西瓜、可丽香瓜、甜瓜、哈密瓜）、芽甘蓝、卷心菜、刺菜蓟、胡萝卜、纳帕白菜、花菜、秋葵、洋葱、芹菜、香芹、鹰嘴豆、防风草、菊苣、大白菜、胡椒、羽衣甘蓝、马铃薯、黄瓜类植物（葫芦瓜、黄瓜）、南瓜、葫芦、小萝卜、干球茎洋葱、芜菁甘蓝、茄子、婆罗门参、芽菜、青葱、苦苣、大蒜、菠菜、绿洋葱、印度南瓜、青菜、甜菜（糖用甜菜和饲料甜菜）、甘薯、甜叶菜、辣根、番茄、甘蓝菜、芜箐、香料等。

[0050] 通常具有商业用途的其它类型植物包括水果和蔓生作物，如苹果、杏、樱桃、油桃、桃、梨、李子、西梅、木瓜杏仁、栗子、榛子、山核桃、开心果、胡桃、柑桔、蓝莓、杂交草莓、越橘、醋栗、罗甘莓、覆盆子、草莓、黑莓、葡萄、鳄梨、香蕉、猕猴桃、柿子、石榴、菠萝、热带水果、女阴果、甜瓜、芒果、番木瓜和荔枝。

[0051] 很多最广泛种植的植物是大田作物植物，如月见草、绣线菊、玉米（饲料玉米、甜玉米、爆米花玉米）、啤酒花、加州希蒙得木、花生、水稻、红花、小杂粮（大麦、燕麦、黑麦、小麦等）、高粱、烟草、木棉、豆科植物（菜豆、扁豆、豌豆、大豆）、油料植物（油菜、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、落花生）、纤维植物（棉花、亚麻、棕榈、黄麻）、樟科（肉桂、樟脑），或诸如咖啡、甘蔗、茶叶和天然橡胶类植物的植物。

[0052] 另一组重要的经济植物是观赏植物。经常种植的观赏植物的例子包括小百合（如巴西小百合）、紫菀、杜鹃（如杜鹃属）、秋海棠（例如海棠属）、风铃草、叶子花、仙人掌（例如仙人掌科蟹爪兰）、山茶花、康乃馨（例如香石竹）、菊花（例如菊花属）、铁线莲（例如铁线莲属）、鸡冠花、耧斗菜、仙客来（如仙客来属）、水仙（如水仙属）、扁柏、小苍兰（例如香雪兰）、天竺葵、非洲菊、剑兰（如唐菖蒲属）、冬青、芙蓉（例如木槿月季）、绣球花（如艽绣球）、杜松、百合花（如百合属）、木兰、小月季、兰花（例如兰科植物）、矮牵牛花（如矮牵牛）、一品红（例如大戟茜木）、报春花、杜鹃、玫瑰（例如蔷薇属）、金鱼草（如金鱼属）、灌木、乔木如林木（阔叶乔木和常青树、如针叶树）和郁金香（例如郁金香属）。

[0053] 本发明所称用语“植物机体”包括但并不限于源自小孢子、花粉、胚珠、叶、胚芽、根、根须、花药、花、果实、种子、茎、幼苗、接穗、根茎、砧木、原生质体、愈伤组织、分生组织等的单细胞和单一组织。

[0054] 用语“植物组织”包括分化和未分化的组织或植物，包括但不限于根、茎、幼苗、叶、花粉、种子、肿瘤组织，以及各种形式的细胞和培养物如单细胞、原生质体、胚芽和愈伤组织。植物组织可存在于植物内，或植物的器官、组织或细胞培养物内。

[0055] 本发明所称用语“多年生”指寿命超过两年的植物。多年生植物的寿命可以很短（仅为几年），也可以是长寿植物，例如一些木本植物如乔木。

[0056] 本发明所称用语“作物植物”指可以收获的或者能提供可收获产品的植物。在本发明中特别优选的植物是保护性栽培（温室）的作物植物。

[0057] 本发明所称用语“幼苗”和“小植株”是可互换的，指从抽叶、胚芽或种子萌芽起开始生长的植物幼苗，一般包括任何出现发育良好的绿色子叶和根须、并在移栽到最终种植区完成生长成熟之前进行繁殖的幼期年植物。

[0058] 本发明所称用语“组织培养物”指这样一种植物细胞培养物，其中细胞在受控条件下可在营养培养基内进行繁殖。

[0059] 用语“显著增加”指增加的量大于测量技术中的固有误差幅度，增长幅度优选为约10%-50%，甚至是2倍或更大。

[0060] 用语“显著减少”指减少的量大于测量技术中的固有误差幅度，减少幅度优选是2倍左右或更大。

[0061] 本发明所称用语“个体发育早期”指个体生长和发育到成熟的过程（个体发育阶段）中的初期阶段。这一阶段的长度在不同种类的植物之间会有差异。对于玫瑰而言，这一阶段估计约为6至8个月。本质上说，当响应于环境刺激的植物特征如呼吸速率已平稳且固定下来时，该个体发育早期结束。通过定期测量植物中的臭氧致呼吸速率，并且确定在植物的多大年龄时因暴露于臭氧下而导致的呼吸速率增加不会恢复到暴露前的值而是固定下来，本领域的技术人员就可确定任何种类植物的个体发育早期。很多植物的个体发育期将是从苗期到营养生长阶段的整个发育过程，并且一般在植物进入生殖期（花期）时结束。

[0062] 用语“调控所述植物”指对该植物进行技术干预，其中特别是通过基因调控，例如通过提供如本发明所述的转基因植物，使得不管是否存在氧化应激诱导因素如应激致臭氧浓度水平，所述植物的基础呼吸速率都不会增加。

[0063] 用语“调控所述植物的环境”指对该植物的周围或外界环境进行技术干预，其中特别是通过降低对该植物的应激，例如通过提供这样一种环境，其中氧化应激诱发因素如应激致臭氧通过技术干预而降低到亚应激水平，或者至少到相对于未采用所述干预的情况而言该植物的基础呼吸速率不会增加的水平，其中在存在氧化应激诱导因素如应激致臭氧浓度水平时该植物的基础呼吸速率将增加。

[0064] 在表述“有意识地抑制所述植物中的呼吸和/或蛋白质周转速率的增加”的上下文中的用语“有意识地”指如上所述地执行或不执行某一行为如技术干预，以实现将如这里所述的该植物总暗呼吸中的AOX成分维持在基本上等于从未暴露于氧化应激条件下的该植物的水平而达到使该植物增产的目的。

[0065] 本发明所称用语“表观遗传”指核苷酸序列不发生变化但是DNA却发生了可遗传的功能改变的情况。表观遗传变化可通过DNA修饰、特别是由组蛋白和DNA甲基化造成的染色质重塑来产生。这些变化影响基因转录，并最终影响表型。因此，表观遗传变化包括会影响细胞的行为但对DNA或其他遗传组分无直接影响的因素。分化的表观遗传指细胞经历了取决于会影响细胞、组织、器官和最终有机体命运的基因的正确的时间上和空间上的阻遏、去阻遏或活化的分化事件。因此，有机体的表观遗传变化是正常的，并会导致基因表达的改变。例如，在没有任何基因突变的情况下也会发生从正常细胞到肿瘤细胞的表观遗传转变。

[0066] 本发明所称用语“呼吸”指这样的过程，通过该过程将O2输送给细胞并供细胞使用，并且产生CO2并从细胞中排出，有机质在这一过程中被氧化。

[0067] 本发明所称用语“蛋白质周转”指氨基酸从现有蛋白质到新合成蛋白质中的流动。蛋白质周转通常被视为植物中满足能量需求方面的最重要的维持过程之一。生物合成和分解过程都影响蛋白质周转的速率。蛋白质合成和蛋白质降解都需要呼吸能量。蛋白质周转在调节植物的新陈代谢方面有几项重要作用。和蛋白质合成一起，降解是保持恰当的酶浓度水平以及基于内部和外部信号对酶的浓度水平进行调节所必须的。此外，蛋白质降解对于允许植物应对变化的环境条件是很重要的。当营养物质有限时，可以通过增大降解相对于合成的速率来加速蛋白质周转的速率，这会产生来自较次要蛋白质的游离氨基酸池，其可用于组装更重要的蛋白质。

[0068] 本发明所称用语“辐射”包括粒子辐射（即电子、质子）、高能电磁辐射（即X射线、γ射线）和辐射能谱中的其他致电离辐射，以及非电离电磁辐射，还有紫外光、可见光和红外光谱辐射。

[0069] 表述“周期性应激”上下文中的用语“周期性”，既指所述植物在间断的时期内所经历的不连续的应激形式，也指所述植物在不间断（如持续性）的时期内所经历的处于变化的水平下的应激形式。

[0070] 本发明所称用语“氧化应激”指这样一种状态，其中细胞暴露在分子氧或活性氧类物质(ROS)的过高浓度水平下，该浓度水平达到了最终会引发损伤且启动细胞修复系统的程度。然而在损害发生前，预计有受损危险的植物细胞将增强某些过程（例如通过蛋白质周转）和/或抑制其他一些过程（例如细胞质流动），以防止损伤的发生。这也可以描述为氧化应激。因此，氧化应激可通过增大的蛋白质周转速率来测量。在本文中，氧化应激尤其可以是由干旱应激、温度应激、辐射应激、热应激、盐应激或活性氧类物质所导致的。因此，此处所述的氧化应激是增大AOX途径的过程。因而，在个体发育早期防止植物增大其AOX途径可令这类植物对干旱应激、温度应激、辐射应激、热应激、盐应激更不敏感。所以，本发明的方法可固有地使植物具备对氧化应激以外的其它应激更强的抵抗能力，包括抗病虫害能力。

[0071] 本发明所称用语“活性氧类物质”(ROS)指氧离子、自由基和过氧化物，包括无机的和有机的两种。它们一般都是非常小的分子，并且由于未成对价壳层电子的存在而活性很高。ROS形成为正常氧代谢的自然副产物，并在细胞信号传输中起重要作用。然而，在环境应激发生时ROS的浓度水平会急剧增大，这会导致细胞结构的重大损伤。这样积累起来就形成称为氧化应激的状态。

[0072] 本发明所称用语“环境臭氧”表示从约10-15ppbv到约35ppbv的臭氧浓度水平。该浓度水平在白天和晚上之间会有所不同，晚上可为0ppbv左右，白天可为45至120ppbv左右。

[0073] 本发明所称用语“生长环境”指植物种植于其中的土壤、培养基、溶液或空气。

[0074] 本发明所称用语“净化器”指活性氧类物质或O3（臭氧）的净化器，涉及能够将活性氧类物质如O3结合成或化学式转化成可达到该活性氧类物质能通过接触该净化器而从其环境中消除的效果的系统、装置或化学品。

[0075] 本发明所称用语“异戊二烯”指化合物2-甲基-1,3-丁二烯。

[0076] 本发明所称用语“番茄红素”指化合物(6E,8E,10E,12E,14E,16E,18E,20E,22E,24E,26E)-2,6,10,14,19,23,27,31-八甲基三十二烷-2,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,30-十三烯，其为一种四萜类化合物，由8个异戊二烯单位构成。

[0077] 表述“内生性产生的”中的用语“内生性”指在植物（细胞）内产生。

[0078] 本发明所称用语“异戊二烯合酶”指登记号为EC2.5.1.-的酶，其在从二甲基二磷酸中消除焦磷酸盐从而生成异戊二烯的过程中起催化作用。银白杨中的酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。这一用语被认为是覆盖了具有80%以上、优选90%以上的氨基酸序列为SEQ ID NO:1的同源性物质，特别是指能从二甲基二磷酸中产生异戊二烯的同源性物质。

[0079] 本发明所称用语“预花期”指在植物中出现生殖结构之前的个体发育阶段。

[0080] 本发明所称用语“萌芽后阶段”指在种子出现胚根之后该植物的发育期。

[0081] 本发明所称用语“作物平均年产量”指作物每年或每季（相应地为作物平均季产量）的产量，以每单位种植区面积所收获的植物或植物机体的重量或数量或者作物的生物质增量（鲜重或干重）计，其中将多年内的各年产量相加，再除以年数。

[0082] 本发明所称用语“种植区”指在植物种植并产生出供收获的植物或植物机体形式的产品的场地。种植区面积的大小一般以平方米或英亩的土地来表示。种植区可以是开放的大田或温室。

[0083] 本发明所称用语“净固碳效率”可与用语“净光合效率”互换使用，指将二氧化碳转化成有机化合物的净效率，同时考虑到呼吸造成的损失。

[0084] 本发明所称用语“生物质产量”指从植物中获得的有机材料产量。

[0085] 本发明所称用语“干物质含量”指通过干燥法将水分(%)脱除后剩余物质的含量(%)。

[0086] 本发明所称用语“抗病虫害能力”指抵抗病毒、细菌、真菌和有害昆虫以及有害的软体动物和线虫的能力。

[0087] 本发明所称用语“温室”指包括墙壁、屋顶和地板的任何结构，其主要被设计和用于将植物种植在受控制和受保护的环境中。墙壁和屋顶通常由透明或半透明材料建造，以便透过阳光供植物生长。

[0088] 种植植物的方法

[0089] 根据本发明的植物种植方法基于三项基本认识：

[0090] i)在植物的个体发育早期达到的呼吸速率是基础呼吸速率过程中的最大值，该基础呼吸速率是所述植物成熟时的最小呼吸速率；

[0091] ii)该基础呼吸速率通过一个或多个阶梯式递增来实现，并最终通过表观遗传改变而固定在基础水平；

[0092] iii)呼吸速率的阶梯式递增是植物对蛋白质周转速率增加的反应，而蛋白质周转速率增加是该植物遭受氧化应激的结果；和

[0093] iv)总暗呼吸中AOX成分的阶梯式递增是该植物遭受氧化应激的结果。

[0094] 因此，如果试图保持成熟植物的呼吸速率尽可能低，重要的是在基础呼吸速率已通过表观遗传因素固定下来的阶段、即个体发育早期阶段尽可能地降低对所述植物的氧化应激。

[0095] 因此，按照本发明的植物种植方法包括使幼苗、组织培养物或小植株发育成植物，并经历其中表观遗传因素将基础呼吸速率固定在一永久性的最低水平的其个体发育早期阶段的这一重要步骤。其中表观遗传因素将基础呼吸速率固定在一个永久水平的个体发育早期阶段会因不同的植物而有所差异，因此无法对每个植物种属做提前界定。而且，表观遗传因素确定该永久最小呼吸速率的阶段在同一种属内的不同品种植物之间也会有所差异。然而，对于每个植物种属和植物品种，这一阶段可以如下地通过试验来确定：

[0096] 使幼苗、组织培养物或小植株发育成成熟的植物。记录总发育时间，并将其分成大量但实际可行的规则间隔区（在2和例如10、20、50、100或1000之间的间隔区）。在每一个间隔区内，利用标准技术测量处于发育阶段植物的呼吸速率。在每次测量后，植物都例如通过暴露于臭氧下而暂时性地承受氧化应激。在不同的间隔区内，可以选择性地施加处于递增式水平下的氧化应激。表观遗传因素将基础呼吸速率固定在一个永久水平下的个体发育早期阶段目前是通过以如下方式获得的数据来确定的：

[0097] a)在所述氧化应激期后在呼吸速率恢复到基础水平的那个间隔区之前的间隔区总数，或

[0098] b)呼吸速率相对于前一间隔区呈阶梯式增长但在其后或随后的间隔区中无减少的时间段内的间隔区总数。

[0099] 粗略地说，在本发明的方法中，表观遗传因素将基础呼吸速率固定在一个永久水平的个体发育早期是预花期，优选是发芽后的0.1-6个月的那段时期，更优选是发芽后0.5-6个月的那段时期。

[0100] 按照本发明的植物种植方法还包括在所述植物的个体发育早期抑制由于氧化应激所导致的发生呼吸和/或蛋白质周转速率的不利增加的重要步骤。可以理解，根据表观遗传因素固定基础呼吸速率的上述模式，呼吸速率的不利增加与蛋白质周转速率的不利上升相当。

[0101] 氧化应激经常但不完全是辐射或活性氧类物质导致的植物受损害的结果。因此，抑制因氧化应激所导致的呼吸和/或蛋白质周转速率的不利增长可通过防止暴露在会导致这种增加的辐射或活性氧类物质中来实现。最应注意的是，细胞内H2O2水平和大气中O3浓度都维持在亚应激水平。这种浓度水平可能在植物种属和植物品种之间会有所差异，但可容易地通过实验来确定。例如，可以在预定的时间段（即几分钟到几周不等）内将植物暴露于一定实验剂量的辐射或活性氧类物质中，并在该暴露的前后测定呼吸和/或蛋白质周转的速率。辐射或活性氧类物质的亚应激水平是指该暴露不会导致暴露后速率大于暴露前速率的水平。

[0102] 因此，在本发明方法的一个优选实施例中，通过将生长环境中的活性氧类物质含量控制成使其保持在亚应激水平下来防止氧化应激。

[0103] 生长环境可以是植物种植于其中的土壤、基质、培养基或大气。优选地控制生长环境大气中的活性氧类物质、最好是O3的含量。

[0104] 为了防止氧化应激，在个体发育早期植物生长环境大气中的O3含量较好的是保持为低于100ppbv，更好是低于75ppbv，更好是低于60ppbv，还更理想地是低于50ppbv，更理想地是低于40ppbv，但是更为理想地是低于35、30、25、20、15，10、5或1ppbv，其中ppbv是指按体积计的十亿分之一。偶然的增加可能不会对植物有重大影响，但在个体发育早期阶段，至始至终应该从根本上避免超过100ppbv的值。

[0105] 实质上，这可以通过不同的方式来实现。例如，可以控制植物在其中生长的总空间（大气）内的该含量。对总空间的控制一般涉及采用封闭式栽培系统，如温室。通过净化器或空气过滤系统可实现对活性氧类物质浓度水平的有效控制。这种过滤系统在空气调节领域是众所周知的。适宜的净化器或过滤材料包括那些可吸收或吸附活性氧类物质的材料。一种合适材料的例子是活性炭，但其他能够从流经过滤器上的过滤材料的空气中滤除活性氧类物质的材料也适用。优选使用空气循环系统，其中空气穿过或通过净化器。能与大气中的活性氧类物质反应并使活性氧类物质转化成非活性的材料也适用于此。这种材料的一个合适例子是异戊二烯。因此，温室可以定期充加异戊二烯气体，以便从空气中去除活性氧类物质。相当于十亿分之1-1000、优选为十亿分之50-150体积量(ppbv)的异戊二烯量通常就足够了。

[0106] 或者，仅控制直接接触植物表面的空气中的该浓度。这可通过向植物供给外源性异戊二烯来最有效地实现。为此，异戊二烯可以蒸汽的形式提供到植物的生长环境大气中，或者至少提供给植物的叶片。或者，异戊二烯也可以由在植物表面（叶、茎或根）处与植物共生的附生菌、例如包括细菌、真菌和酵母菌的微生物来产生。

[0107] 或者，例如可以通过在植物内共生的内生菌、例如包括细菌、真菌和酵母菌的微生物来仅控制内源性自由空间中的空气（也会散发出来而进入大气）中的该浓度。

[0108] 或者，例如可以通过在植物内共生并能够释放出能转化过氧化氢酶的H2O2的过氧化氢酶活性内生菌、例如包括细菌、真菌和酵母菌的微生物来仅控制内源性液体游离层中的ROS含量，特别是H2O2含量。

[0109] 根据本发明的植物种植方法的一项优点是在其整个生命历程中该植物的净生物合成效率得到了提高。因此，本发明对于具有多年生命周期的植物特别重要，这是因为在这些植物中，在个体发育早期达到的高基础呼吸速率会对植物在整个生命周期上的总产量有最大的影响。因此，本发明的植物优选是多年生植物。

[0110] 值得注意的是，本发明的方法特别适用于生产因素非常重要的植物，例如作物植物，以及计划用来帮助消除大气中二氧化碳的积累以实现气候稳定目标（碳信用）的植物。

[0111] 按照本发明的植物种植方法优选作为农作物生产的一部分同时实施在大量的种植植物上。因此，在另一方面，本发明提供了一种提高作物种植区内作物平均年产量的方法，包括种植本发明的植物或者按照上述本发明的方法来种植植物，并将所述植物当作所述种植区内的作物植物。

[0112] 本发明所述的植物和方法的一项优点是，平均年产量在含有活性氧类物质的大气负载下不再受季节变化的不利影响。

[0113] 作物种植区可以是几平方米的一小块地，但最优选是占地几亩甚至很多平方英里的大面积种植区。本发明的优点在涉及到大量植物时尤其突出。本发明的方法可以在大面积栽培区中实施，并且例如还包括监测会影响氧化应激的环境因素，以及选择种植或播种时机以使得在如这里所限定的其个体发育早期阶段植物暴露在最低水平的氧化应激下。因此，本发明方法可构成为作物栽培系统的一部分，该系统包括监测例如大气中的活性氧类物质，并将这些监测信息用于为作物选择最佳的种植或播种时机，使得作物不会暴露于不希望有的或会致应激的浓度水平的大气臭氧类物质如O3下。

[0114] 基于本发明所述，本领域的技术人员将会理解，鉴于例如在甘蔗燃烧时期的大气中活性氧类物质浓度过高，在巴西和世界上其他会在一年中的某些时节遭受较高浓度水平臭氧侵害的地区应当最佳地避免一些耕种时机。本发明的一个方面就是通过利用大气污染传感器或“嗅探器”来测定空气中的活性氧类物质浓度，由此监测栽培区上方空气中的活性氧类物质的浓度，从而有效地实现这种避免。

[0115] 因此，在本发明的另一个方面提供了一种优化选定栽培区内的特定类型植物的种植的方法，包括步骤：

[0116] a)例如通过采用上述方法来确定所述特定类型植物的个体发育早期阶段，在该阶段表观遗传因素将基础呼吸速率固定在一个永久性水平；

[0117] b)针对所选定栽培区内监测该栽培区上方空气中的活性氧类物质的浓度，这例如通过使用能够测定空气中的活性氧类物质浓度或从空气中采样并测定该样品中的该浓度的大气传感器来进行；和

[0118] c)对所述特定类型植物进行播种或育苗或小植株移栽，使幼苗或小植株发育成为植物，在该植物的个体发育早期，通过用从步骤b)中取得的数据来选择播种和移栽的时机，以便实质性防止由于生长环境大气中活性氧类物质而引起的氧化应激所导致的呼吸和/或蛋白质周转速率的增加。

[0119] 应当理解，步骤b)中的监测不必是恒定的但必须足够频繁，以允许确定播种或移栽的最佳时机。播种或移栽的最佳时机是这样的时机，其可确保随后的其中基础呼吸速率被固定在其最低水平的个体早期发育阶段与最低氧化应激诱导相一致，而这种诱导是所存在的全部氧化应激诱导因素的最小总和，这些因素包括生长环境大气中的活性氧类物质的浓度。

[0120] 在这里当提到诸如优化产量或提高作物平均年产量的用语时，其指这些属性包括提高所述植物的净固碳效率、生物质产量、干物质含量和/或抗病虫害能力，或者是由上述特征带来。

[0121] 本发明的另一个方面是用于种植植物的温室，特别是采用本发明的方法。本发明的温室包括用于控制温室大气中的活性氧类物质含量的装置。优选地，温室装有用于从生长环境中去除活性氧类物质的净化器。另外，温室还可装有用于监测温室大气（亦即温室内空气）中的活性氧类物质浓度的系统或设备，其形式例如为能够测定空气中活性氧类物质浓度的大气传感器。

[0122] 示例

[0123] 示例1

[0124] 作为一个示例，本发明可以如下所述地实施。在温室内在正常的温度、水分、养分和阳光的条件下种植玫瑰。另外，例如通过使用臭氧净化器来控制温室大气中的臭氧量，以减少温室大气中的臭氧量。此外，温室被很好地密封以避免外界大气中的臭氧入侵。

[0125] 至少在上文中定义的个体发育早期阶段的整个时间段内将温室中的臭氧浓度水平保持在尽可能低的水平，优选低于20-30ppbv。此后，在个体发育早期之后，植物可以种植在较宽松的条件下，或者可以移至温室外继续生长。

[0126] 相对于暴露在高臭氧的环境条件下的植物而言，将植物暴露于有利的生长环境会使植物在成熟时具有较低的呼吸速率，并且这种植物将表现出如上所述的较高产量。

[0127] 示例2

[0128] 下文所述的示例说明了如本文所述的植物个体发育阶段提供了有关通过AOX途径的呼吸的记忆效应。尤其是，它将会显示出该个体发育阶段是一个学习期，在此期间例如由臭氧激发的氧化应激会不可逆地提高高臭氧浓度的环境条件下的总暗呼吸中的非ATP致AOX途径或AOX成分。利用这一AOX途径的呼吸是“交替氧化酶途径呼吸”，也被称为“交替路径呼吸(APR)”、“氰化物不敏感性呼吸”或“SHAM敏感性呼吸”。

[0129] 在具有不同臭氧浓度条件的三种环境下进行的测量表明，棉花植物在其营养生长阶段结束后进入生殖期（即在个体发育期）时具有明确的和固定的最大呼吸效能，其表达为[TDR-AOX]/[TDR]，其中TDR指总暗呼吸，而AOX指交替氧化酶途径(AOX)呼吸。

[0130] 该呼吸效能由植物在其个体发育期所接触到的臭氧量或浓度水平、即个体发育期臭氧浓度水平(OPLO)来设定。在个体发育期之后，植物暴露在高于OPLO的臭氧浓度下会致使AOX增大（AOX随之上升）。当臭氧浓度随后恢复到OPLO时，AOX也恢复到初始个体发育阶段的水平。植物暴露在低于OPLO的臭氧浓度下不会导致AOX降低（即AOX不会受其影响，而是保持它在个体发育阶段中建立的初始浓度水平）。

[0131] 结果发现，呼吸效能较高的植物也具有较高的每单位面积叶重（以鲜重和干重计）。

[0132] 材料和方法

[0133] 植物材料

[0134] 用于试验的植物如下：棉（棉花属；双子叶）、菜豆（菜豆属，双子叶）、玉米（玉米属；单子叶）、甘蔗（甘蔗属；单子叶）、水稻（水稻属，单子叶）、大豆（大豆属，双子叶）和小麦（小麦属；单子叶）。棉花、菜豆、玉米、水稻、大豆和小麦都以种子的形式提供。甘蔗则以小植株的形式移栽，该小植株是在琼脂中通过无性系组织培养而得。

[0135] 种植

[0136] 将种子种入15号标准PE塑料花盆中（盆高15cm，上部内径为15.5cm，底部内径为12cm，底部有八个10mm的排水孔）。在每个花盆的底部放置一块直径12cm的圆形水族馆用滤布，以防止砂石从花盆中漏出。在滤布上面放置480ml洗净的砾石。将第二层滤布放在砾石上面，以将其与下面那一层分开并防止两层滤布粘在一起。第二层由1.30L的珍珠岩和蛭石的混合物(50/50%,v/v)，其用570ml营养液（见下文）预饱和。

[0137] 对于除甘蔗外的所有作物，在各花盆中分别按以下深度栽种8个选定种子：棉，2cm；菜豆，2cm；玉米，4cm；水稻，1.5cm；大豆，3cm深；小麦，2.5cm。在所有花盆上均盖有一个由倒置的1L透明(PP)花盆构成的顶盖。顶盖花盆的边缘极好地与种植花盆的内壁相配合。将花盆置于30°C的黑暗条件下，使种子发芽。棉花、菜豆和玉米先发芽，在播种三天后被放入人工气候室，次日将其顶盖揭开。水稻、大豆和小麦后发芽，在播种五天后被放入人工气候室，次日将其顶盖揭开。

[0138] 对甘蔗来说每个花盆种入4个小植株，这些小植株从琼脂培养基移植，之后用营养液（见下文）清洗其根系，以去除残留的琼脂。每个甘蔗花盆都设有一个由5L的PP水瓶形成的顶盖，其中瓶底被去除而形成了一个高30cm的顶盖。用绉布带在瓶底边缘和种植花盆之间提供气密连接。在顶部安装了40mm的螺帽，其用作通风阀，最初保持接近100%的RV以防止植株干燥。在移栽后直接将甘蔗小植株放入人工气候室（每个人工气候室放4个花盆）内，尤其是形成于人工气候室中的丙烯酸树脂箱（见下文）内。移栽10天后将顶盖揭开。

[0139] 营养液

[0140] 在整个试验阶段对所有作物提供单一成分的营养液，该营养液含15meq/l阳离子和15meq/l阴离子，使其EC值为1.7mS/cm且pH值=5.8。宏量营养素：K=4.50mmol/l，Ca=3.75mmol/l，Mg=1.50mmol/l，N-NO3=9.75mmol/l，N-NH4=0mmol/l，SO4=1.95mmol/l，PO4=1.35mmol/l。微量营养素：B=28μmol/l，Zn-EDTA=13μmol/l，Cu-EDTA=1.6μmol/l，Mo=0.1μmol/l，Fe-EDDHMA=52μmol/l，Mn-EDTA=12μmol/l。在所有需要用水的情况下仅使用蒸馏水。营养液是植物的唯一水源。

[0141] 生长条件

[0142] 人工气候室。为了在生长环境中创造和维持一个能物理性地支持被暴露和试验的植物的必要气候条件，建造了三个相同的人工气候室。每个人工气候室都设计成能内部地控制光强度、空气温度、空气湿度、空气中CO2浓度、空气中O3浓度和空气循环。采用设计用于冷库结构的带有50mm和100mm厚聚碳酸酯绝缘层的镀钢的、静电喷涂的白色组合件，制3
成3个相同的4.0m×3.0m×2.5m（长×宽×高）=30m 的密封室。每间密封室配备了一
个密封门作为通道。

[0143] 丙烯酸酯种植箱。在每个人工气候室内设有两个完全透明的种植箱（90cm深×120cm宽×140cm高，由5-6mm厚的透明丙烯酸酯板制成）。每个种植箱又被透明丙烯酸酯板分成4个植物室，每个植物室内放置4个栽有试验植物的花盆。每个植物室都通过灯墙与相邻的植物室垂直间隔开，各灯墙包括垂直叠放的4个灯管（飞利浦TLD30W/75，2000流明，25μmol/s）。最外侧植物室的外部也装有灯墙，以便为植物室提供充足的光照。每个人工气候室共安装40只飞利浦TLD30W/75灯具。每个植物室内又装有四个可以关闭的孔(22×45cm)。种植箱安放在金属台上，使之离地有60cm的间隙。各箱的顶部均装有镜子，以向内反射上行光线。

[0144] 光控制。采用可编程光控制器（PLC，型号为西门子Logo12/24RC）来控制光周期和灯序列。丙烯酸酯箱装有4级灯组，每级组10只灯（共40只灯），编号从上到下分别为1-4。1级灯组早晨5点打开。一小时后下一级灯组打开，按此顺序，在上午8点的时候提供完全照明。到下午8点时所有各级灯组关闭，提供完全黑暗的环境。

[0145] 反室。一个密封的中央通道通往人工气候室，并具有反室的功能。中央通道保持负压，以尽量减少在人工气候室开门时人工气候室之间的空气混合。采用设在通道尽头处的鼓风机来将空气从低浓度臭氧区输送到高浓度臭氧区（例如从O3设置值=0ppbv的人工气候室1输送到O3设置值=30ppbv的人工气候室2，再输送到O3设置值=60ppbv的人工气候室3），从而进一步减少臭氧从高浓度臭氧区流向低浓度臭氧区。

[0146] CO2控制。采用中央CO2接口和控制系统（C-Control II，德国Conrad Electronic GmbH）用于CO2控制。

[0147] 每隔10分钟用CO2分析仪（Priva250E，NDIR气体分析仪，Priva，荷兰）测量三个人工气候室中每一个的CO2浓度，以及其外部环境空气中的CO2浓度。

[0148] 每个人工气候室中针对CO2的设定值在有光照条件下为420ppmvat、940mBar和26℃，在无光照条件下为450ppmvat、940mBar和26℃。

[0149] 在解读之前，通过中央CO2接口及控制系统对CO2测量进行压力和温度补偿，并通过中央CO2的接口及控制系统对人工气候室内外的气压变化和温度变化，以及对与人工气候室相连的导管、电螺线管和干燥过滤器中的摩擦损失进行校正。该系统允许有20ppmv的CO2滞后。为了在内部CO2浓度过高（主要是在黑暗条件下）支持空气更新，也要评估外界空气并使其低于系统的内部过高浓度至少20ppmv，以便可以启动排气系统。在CO2浓度低于设定值时（主要是由于光照阶段的光合作用活动所致），注入纯CO2。通过中央CO2接口及控制系统来计算所需的CO2量，并控制其加入量。每一个人工气候室的内部都装有安全用固态CO2监控器（型号CDM4161A，Figaro，日本），其在CO2浓度超过1000ppmv时发出报警。

[0150] 内部空气循环。采用两个内部循环通风设备（型号Master Fan Top,Treviso，巴3
西）来确保在种植箱内每分钟有15.5m 的空气流通。

[0151] 排气系统。采用排气系统来以外部空气置换人工气候室内部的空气，从而降低人工气候室内的CO2浓度。采用轴流式风机（型号Taurus-H，Ventisilva，巴西）来驱动换气，其中结合使用外部颗粒预过滤器（型号SA-3085，Inpeca，巴西）和六个活性炭防毒面罩化学端部过滤器（型号RC203，Carbografite，巴西），以保证进入空气的质量。

[0152] 温度控制。采用York高挂壁分离式冷却系统，其型号为YJDA-12FS-ADA，制冷量为3.52kW。穿过种植箱后的空气平均温度设定为26℃(±1.5℃)。

[0153] 湿度控制。在每个人工气候室内使用通风干湿计（巴西农作物发展工程部）来监测由微风机增压驱使的气流中的其湿球和干球温度。在温差等于或大于3.0℃时，干湿计促动两个压电元件水喷雾器（型号Polaris Ion35W，来自Mallory，其内部高压“离子”发生器已被拆除），直到温差恢复到2.0℃或更低。这样将转变为在接近蒸发器单元出口处的22℃到丙烯酸酯种植箱出口处的27℃的温度区间内4到8mBar之间的蒸气压差值以及75%到85%之间的相对湿度值。收集从每个人工气候室内的蒸发器单元中排出的冷凝水用于再循环。冷凝水流过UV-C杀菌单元（Atman UV-5W，装有飞利浦TUV PL-S5W UV-C灯），之后收集到一个40升的收集池中。收集池配有潜水泵(Atman HF-750，18W)，为喷雾器的互连蓄水池供水以保证最低水位。在最低水位，电子液位控制系统启动泵。在满的时候，蓄水池会将水排到外面的水罐中。

[0154] 臭氧控制。采用臭氧监控器-发生器接口（巴西农作物发展工程部）来将臭氧发生器（型号OP-35-3P，Grupo Interozone，巴西）与臭氧监控器（型号202，美国2B Technologies公司；臭氧动态范围为1.5ppbv至100ppmv；精度1.5ppbv或读数的2%）连接。在光照强度最大（40盏灯全部打开）且除去人工气候室的内部物理结构外并无其他活性表面的干涉的条件下，人工气候室内的基础臭氧浓度水平不超过3ppbv臭氧。这个浓度值被用作1号人工气候室的上限。2号人工气候室设定为30ppbv的平均臭氧浓度。3号人工气候室设定为60ppbv的平均臭氧浓度。每隔10秒测一次2号和3号人工气候室的臭氧浓度，连续测量并计算每分钟内的平均值。每个臭氧监测器将平均值以模拟输出方式提供给臭氧监测器-臭氧发生器接口。迟滞值设定为±5ppbv。监控在接近两个内部循环通风机的入口处的臭氧浓度。调节臭氧发生器以接受来自接口的外部数字信号。

[0155] 闭路摄像系统。每个人工气候室均配有摄像机(Panasonic SDR-S7)，其通过TecVoz TEC30/04LIG2数字视频记录系统将图像输送给服务器CPU，记录所有的图像。在试验期间，摄像机被人工地放置在可以记录试验植物的位置。

[0156] 呼吸//气体交换测量

[0157] 植物材料的呼吸以下述方式进行测量：采用相移荧光测量法来测量因暗呼吸带来TM的氧消耗所造成的氧分压下降。为此，采用NeoFox 相位测量系统（台式荧光分光光度计，使用QBIF600-VIS-NIR实验室级分叉型光纤并具有FOXY-R-8cm覆膜荧光型针式氧传感器，美国Ocean Optics公司）。

[0158] 荧光相移用Tau表示，单位是微秒(μs)，并与氧分压形成逆线性关系。在26.0℃和936mBar条件下，该传感器的每1μs Tau的大气体积氧分量增量为23.79%。图1中显示了棉花的示例性图。

[0159] 采用水杨基羟肟酸（SHAM；99%，巴西圣保罗的Sigma-Aldrich Brasil Ltda.公司）作为AOX抑制剂。通过用0.1M氢氧化钠滴定SHAM直到pH值为中性来制得可溶性水杨基羟肟酸钠盐。从初始溶解的SHAM（该缩写也用于水杨基羟肟酸盐）中制备出含有300ml/L乙醇的原液(0.136M)。从该原液中，通过取12.3ml原液，向其中加入磷酸盐缓冲溶液(pH7)至100ml定容，从而配制出20mmol/L水杨基羟肟酸的最终试验溶液。这样制得的最终SHAM试验溶液含有3.7%的残余乙醇。为了进行适当的对照，配制每100ml磷酸盐缓冲溶液(pH7)含3.7ml乙醇的对比试验用溶液。向两种溶液中加入润湿剂（Silwet L-77AG，美国GE Silicones公司），每25ml试验溶液滴两滴。

[0160] 植物材料的采样总是自顶端向下或向外数起的第一片生长完全的叶片（例如对于单子叶植物）。对于棉花而言是自顶端向下的第三个叶片。每次测量中从四个不同植物中采集四个叶片。棉花叶沿其中间叶脉剖成两半。用剪子将每个叶片切分成面积相等的162
个叶片部分，每个部分400.9mm，一次剪切从下半部而一次从上半部，将这样每片叶子分成
4个部分，每次试验16个部分。叶片部分分成两个相等的子样品组，一组用水杨基羟肟酸处理，另一组不用。使用手术刀片将所有部分（从头至尾）在其几乎整个长度上平行地剪7次，每次剪切相隔约2.5mm，以保证试验溶液的侧面渗透和气体交换。

[0161] 在10分钟内将植物采样分切，初始子样本用高精度实验天平称重记录，在黑暗条件下分别将子样本放进含有和不含水杨基羟肟酸的溶液中处理60min，以保证暗适应。

[0162] 每个样本有4片叶子，每片叶子分成4个部分，一共16个部分，每个子样本组8个部分。在一个子样本组的8个部分中AOX被抑制，另一子样本组作为对照。此后，每组子样本材料用滤纸进行组织干燥和叠放，使用同一剪子将子样本切分成若干叶片部分。每组子样本包括9片滤纸和8个叶片部分。每叠子样本放置在一个50ml无菌标准尖头注射器（Embramac，Campinas，巴西）内，其内部容量设置为总共10毫升。

[0163] 呼吸//气体交换测量

[0164] 采用相移荧光测量法来测量因暗呼吸带来的氧消耗所造成的氧蒸气分压下降。

[0165] 将两个注射器（SHAM和对照样）置于16L的装有温控装置（C-Control II，德国Conrad Electronic GmbH）的强制水循环式绝热恒温水浴槽中，利用高精度温度传感器接口将温度设定为26.00℃，通过计算并用25W的玻璃包覆电阻元件（巴西农作物发展工程部）供给所需的热量来将水温保持在±0.03℃。

[0166] 将NeoFoxTM相移测量系统的氧探针插入50ml注射器的头部并密封，将整个组件浸入水浴槽中。在读取有效读数前使注射器保持恒温60分钟。SHAM样品先读数，每秒记取一次读数。一般情况下15至20分钟内读数趋于线性稳定。切换注射器前记取多达20分钟的稳定曲线，对于非SHAM子样来说，重复上述稳定和读数的过程。

[0167] 在测量SHAM和非SHAM子样之间，探针要进行稳定。读数采集到计算机存储器中。由此确定了包括AOX（非SHAM）的总暗呼吸(TDR)以及不含AOX(SHAM)的总暗呼吸(TDR)。
棉花的测定结果列于表1。

[0168] 表1.用相移荧光测量法测定棉花的总暗呼吸和水杨基羟肟酸(SHAM)敏感性的AOX

[0169]

[0170] 1种植在0ppvb O3环境中的植物；2种植在0ppvb O3环境中并移栽到30ppvb O3环3 4
境中的植物；种植在0ppvb O3环境中并移栽到60ppvb O3环境中的植物；种植在0ppvb
5
O3环境中、移栽到60ppvb O3环境中且再被移栽回0ppvb O3环境中的植物；种植在30ppvb
6 7
O3环境中的植物；种植在60ppvb O3环境中的植物；种植在60ppvb O3环境中并移栽到
8
0ppvb O3环境中的植物。 测量曲线的斜率值如图1所示。

[0171] 此外，对棉花、玉米和水稻进行全叶总暗呼吸(TDR)的测量，不使用任何预处理溶液（无SHAM和预处理对照）。数据（表2、3和4）明显显示出a)每单位鲜重的总呼吸和臭氧浓度之间的与b)每单位干重的总呼吸和臭氧浓度之间的正相关。

[0172] 表2.全叶棉花总暗呼吸(TDR)测量

[0173]生长过程中的臭氧浓度(ppbv) 0 30 60
归一化暗呼吸活性(fwt)1 82.4 72.6 67.9
归一化暗呼吸活性(dwt)2 14.1 13.4 12.7

[0174] 1以h/Tau/g(鲜重)/40ml计；2以h/Tau/g(干重)/40ml计

[0175] 表3.全叶水稻总暗呼吸(TDR)测量

[0176]生长过程中的臭氧浓度(ppbv) 0 30 60
归一化暗呼吸活性(fwt)1 32.6 29.2 29.4
归一化暗呼吸活性(dwt)2 9.6 8.2 7.6

[0177] 1以h/Tau/g(鲜重)/40ml计；2以h/Tau/g(干重)/40ml计

[0178] 表4.全叶玉米总暗呼吸(TDR)测量

[0179]生长过程中的臭氧浓度(ppbv) 0 30 60
归一化暗呼吸活性(fwt)1 83.9 78.3 72.1
归一化暗呼吸活性(dwt)2 17.2 14.7 14.5

[0180] 1以h/Tau/g(鲜重)/40ml计；2以h/Tau/g(干重)/40ml计

[0181] 结论

[0182] 在0ppbv臭氧环境中经历其个体发育阶段的植物，总暗呼吸速率为100%时其AOX呼吸速率为26.0%。当放置在30ppbv臭氧环境中时，AOX呼吸速率增加至30.3%，与初始AOX呼吸速率相比增加了16.5%，将植物放置在60ppbv臭氧环境中后，AOX呼吸速率增加至39.6%，与初始AOX呼吸速率相比增加了52.5%。

[0183] 当将该植物移回到植物生长的个体发育阶段的0ppbv臭氧环境中时，已经历过60ppbv臭氧环境的植物的AOX呼吸速率完全恢复到其初始水平。

[0184] 在60ppbv臭氧环境中生长成熟的植物在0ppbv臭氧环境中停留时并不会降低其AOX呼吸速率，而是仍然保持其较高AOX呼吸速率。

[0185] AOX的呼吸速率表示为总暗呼吸的百分比，其被定义为个体发育阶段的基础呼吸水平。

[0186] 当遭遇由较高浓度臭氧水平引起的氧化应激时，具有在个体发育阶段已确定的AOX水平的植物会增大其AOX呼吸，但是当氧化应激降低时，棉花展示了其AOX呼吸速率可在3天内完全恢复到基础水平。当暴露在臭氧浓度低于植物基础呼吸水平的环境时，AOX呼吸并不会降低到低于在个体发育阶段中已确定的基础呼吸水平。

[0187] 这些研究结果对防止植物的无效呼吸以及提高植物产量的方法有重大的意义。