消化道运动性病症的治疗

摘要

本发明涉及包含抗生素或益生菌的产品及其用于治疗例如肠易激综合征(IBS)的消化道运动性病症的用途。

权利要求

1.一种包含益生菌的组合物，用于治疗消化道运动性病症患者的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)生长过度。

2.权利要求1的组合物，其中所述消化道运动性病症是肠易激综合征。

3.权利要求1或2的组合物，其中所述益生菌选自发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)NumRes 4(LMG-P-24701)、发酵乳杆菌NumRes 2(LMG-P-24700)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CRL-431、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)BB-12、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)BB-536、干酪乳杆菌DN-114001、动物双歧杆菌DN-173010、或其混合物。

4.权利要求1-3任一项的组合物，用于治疗肠易激综合征患者的腹泻、感染、急腹痛、腹部痉挛和/或腹部疼痛，其中所述益生菌选自发酵乳杆菌NumRes 4(LMG-P-24701)、发酵乳杆菌NumRes 2(LMG-P-24700)、干酪乳杆菌CRL-431、动物双歧杆菌BB-12、长双歧杆菌BB-536、干酪乳杆菌DN-114001、动物双歧杆菌DN-173010、或其混合物。

5.权利要求1-4任一项的组合物，其中所述益生菌选自发酵乳杆菌NumRes

4(LMG-P-24701)、发酵乳杆菌NumRes 2(LMG-P-24701)、动物双歧杆菌BB-12、或其混合物。

6.权利要求1-5任一项的组合物，还包括膳食纤维。

7.权利要求6的组合物，其中所述膳食纤维选自半乳寡糖(GOS)、反式半乳寡糖(TOS)、低聚果糖(FOS)和果胶水解产物。

8.权利要求1-7任一项的组合物，还包括蛋白质、可消化性碳水化合物和脂肪，其中存在的所述脂肪为所述组合物的0.1至3重量％。

9.权利要求1-7任一项的组合物，所述组合物为一种发酵乳产品。

10.BCCM编号为LMG-P-24701的发酵乳杆菌NumRes 4。

11.BCCM编号为LMG-P-24700的发酵乳杆菌NumRes 2。

12.包含发酵乳杆菌NumRes 4(LMG-P-24701)、发酵乳杆菌NumRes 2(LMG-P-24701)、动物双歧杆菌BB-12、或其混合物的组合物用于制备一种治疗肠易激综合征的营养组合物的用途。

13.一种用于治疗消化道运动性病症的组合物，所述组合物包含一种或多种抗假单胞菌抗生素。

14.权利要求13的组合物，其中所述消化道运动性病症是肠易激综合征(IBS)。

15.权利要求13或14的组合物，其中所述一种或多种抗生素是一种抗假单胞菌β-内酰胺和一种氨基糖苷或氟喹诺酮的结合物。

16.权利要求13或14的组合物，其中所述一种或多种抗生素选自碳青霉烯、氨基糖苷、Cotrimox、环丙沙星和诺氟沙星。

说明书

消化道运动性病症的治疗

技术领域

[0001] 本发明涉及用于治疗例如肠易激综合征(IBS)的消化道运动性病症(gut motility disorder)的产品及其用途。

背景技术

[0002] 肠易激综合征(IBS)是一种病因未知的常见胃肠道病症。微生物群被认为在IBS中起作用。基于临床研究，本领域达成了共识并且制订了对IBS症状进行分类的罗马标准(Rome Criteria)。所述标准强调腹部疼痛的存在以及疼痛与排便习惯的改变之间的关系。肠易激综合征是一种常见的肠道病症，其特征是腹部疼痛和痉挛；肠道运动改变(腹泻和/或便秘)；胀气(gassiness)；胃气胀；恶心；和其他症状。对于IBS，还没有治愈的方法。该病症的许多方面都是未知的或者知之甚少；但是，饮食的改变、药物和心理治疗常能够消除或基本上减轻症状。总人口的大约10-15％患有IBS，并且相对于男性而言，女性患IBS更为常见，但其原因不明。

[0003] 治疗肠易激综合征(IBS)的一些可能的方法已有记载。

[0004] US 2005/053641描述了纤维治疗IBS的用途。

[0005] WO 2005/055934要求保护凝结芽孢杆菌(Bacilus coagulans)治疗IBS的用途。

[0006] EP 1384483公开了益生菌通过改善消化道神经肌肉功能来治疗IBS的用途。

[0007] WO 94/04136描述了具有阴离子结合特性的多糖治疗IBS的用途。

[0008] WO 2004/089115公开了益生菌和益生元的合生素(synbiotic)组合物及其治疗IBS的用途。

[0009] Faber在American Journal of Gastroenterology，vol.95，2000，p2533中分析了26名IBS患者的消化道菌群紊乱并且报道了粪便中的以下致病生物：肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)(16/26)、费氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundi)(15/26)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(3/26)和产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)(3/26)以及酵母白色念珠菌(Candida albicans)(10/26)和光滑假丝酵母菌(Candida glabrata)(4/26)。

[0010] McFarland et al.World J.Gastroenterol，vol 14，May 2008，pp2650-2661描述了对益生菌治疗IBS的公开临床试验的统合分析(meta-analysis)。

[0011] 尽管在本领域已认识到细菌菌群可能是IBS的一个重要病因因素并因此是治疗IBS的很好的选择，但是在文献中没有指出菌群的哪个组成成分造成了肠道运动性病症。

发明内容

[0012] 本发明人现在意外发现胃肠道中铜绿假单胞菌的存在与例如IBS的消化道运动性病症有关。鉴于此发现，对IBS的治疗可以比以前更有针对性，因为所述治疗可以是旨在调节——尤其是减少——存在于消化道内的铜绿假单胞菌的细菌数量。本文中调节或者减少或降低铜绿假单胞菌的细菌数量也被称作治疗铜绿假单胞菌生长过度。

[0013] 本发明人意外发现，与健康受试者相比，IBS患者的小肠和粪便中的粘膜相关细菌中的铜绿假单胞菌更为普遍并且量更多。此发现促使本发明人使用旨在降低并且优选根除小肠中的铜绿假单胞菌的特异性疗法以治疗IBS。

[0014] 一种调节(优选在小肠中的)铜绿假单胞菌的数量的可能方法是使用特异性抗生素。所述特异性抗生素优选地旨在根除铜绿假单胞菌。

[0015] 另一种调节(优选在小肠中的)铜绿假单胞菌的数量的可能方法是使用益生菌，特别是用于减少和/或防止铜绿假单胞菌生长过度，特别是在小肠中，并因此用于治疗患有的消化道运动性病症的患者，所述消化道运动性病症具体地包括肠易激综合征。

[0016] 此外，本发明人发现本发明的包含益生菌的组合物可用来治疗肠易激综合征相关的症状，包括腹泻、(胃肠道)感染、急腹痛、腹部痉挛和腹部疼痛。

[0017] 具体地，本发明人意外发现优选地将选自如下的特异性益生菌用于治疗消化道运动性病症：发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)(NumRes 4和NumRes 2)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)(CRL-431)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)(BB-12)、长双歧杆菌生物型longum(Bifidobacterium longum biotype longum)(BB-536)、干酪乳杆菌(DN-114001＝CNCM I-1518)、动物双歧杆菌(DN-173010＝CNCM I-2494)、或其混合物；因为这些选出的益生菌有特殊的有益性质，例如对肠道衬细胞的粘附性强并且有较强的抗假单胞菌活性。

具体实施方式

[0018] 抗生素组合物

[0019] 抗生素可用于调节患者消化道中——特别是小肠中——的铜绿假单胞菌的数目、量或水平。因此，合适地讲，包含一种或多种抗假单胞菌抗生素的组合物会对用于治疗消化道运动性病症特别用于治疗IBS的用途非常有益。在一个实施方案中，所述包含一种或多种抗假单胞菌抗生素的组合物用于治疗消化道运动性病症患者的铜绿假单胞菌感染，优选用于治疗IBS患者的铜绿假单胞菌感染。

[0020] 因此，在一个实施方案中，本发明涉及治疗消化道运动性病症的方法，并且优选治疗IBS的方法，所述方法包括给予有需要的患者一种包含一种或多种抗假单胞菌抗生素的组合物。也就是说，本发明涉及包含一种或多种抗假单胞菌抗生素的组合物用于制备用于治疗消化道病症、优选治疗IBS的药物的用途。本发明还可以被描述为用于治疗消化道运动性病症、优选用于治疗IBS的包含一种或多种抗假单胞菌抗生素的组合物。

[0021] 用联合疗法治疗假单胞菌生长过度是有利的。因此，在一个实施方案中，所述抗生素组合物包含一种抗假单胞菌β-内酰胺和一种氨基糖苷或氟喹诺酮(fluoroquinolone)的结合物。

[0022] 或者，一种优选的组合物包含选自以下物质的抗生素：碳青霉烯、氨基糖苷、Cotrimox、环丙沙星、诺氟沙星、或其混合物。

[0023] 益生菌组合物

[0024] 在另一种方法中，本发明人发现益生菌可使肠粘膜的假单胞菌减少。因此，在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种治疗消化道运动性病症、优选治疗IBS的方法，所述方法包括给予有需要的患者一种包含一种或多种益生菌的组合物。也就是说，本发明涉及包含益生菌的组合物用于制备一种用于治疗消化道运动性病症——优选治疗IBS——的组合物——优选营养组合物——的用途。本发明还可以被描述为一种用于治疗消化道运动性病症(优选用于治疗IBS)的包含益生菌的组合物，优选营养组合物。在一个具体的实施方案中，本发明涉及用益生菌组合物治疗消化道运动性病症患者中的铜绿假单胞菌生长过度。所述消化道运动性病症优选为IBS。在一个实施方案中，本发明涉及用益生菌组合物治疗消化道运动性病症患者中的铜绿假单胞菌感染，优选治疗IBS患者的铜绿假单胞菌感染。

[0025] 通常小肠细菌生长过度(SIBO)是指一种如下所述的病症——在该病症中，小肠中出现异常大量的细菌，每ml小肠流体有至少100,000个细菌，并且该小肠中的细菌类型更像结肠中的细菌而不是小肠中的细菌。

[0026] 铜绿假单胞菌生长过度可通过在本文实施例1中公开的方法确定。铜绿假单胞菌生长过度被定义为：小肠中的铜绿假单胞菌的细菌载量比健康受试者——特别是未被诊断为患有IBS的健康受试者——中的铜绿假单胞菌平均细菌载量高。铜绿假单胞菌生长过度优选地被定义为：在受试者小肠内，铜绿假单胞菌的细菌载量为至少2％，优选铜绿假单胞菌的细菌载量为至少5％。铜绿假单胞菌生长过度的治疗是指，与摄取所述抗生素或益生菌组合物之前的铜绿假单胞菌的细菌载量相比，在摄取所述抗生素或益生菌组合物后铜绿假单胞菌的细菌载量下降。治疗优选地是指铜绿假单胞菌的细菌载量减少至低于5％的值，优选减少至低于2％的值，更优选减少至低于健康受试者——特别是未被诊断患有IBS的健康受试者——中的平均细菌载量。实际上，这是指：若例如通过实施例1中描述的PCR方法可测出小肠中或粪便中的铜绿假单胞菌，则存在铜绿假单胞菌生长过度，而治疗则是指粪便和/或粘膜中的细菌载量减少至几乎检测不到的水平。

[0027] 在一个优选实施方案中，本发明涉及一种治疗IBS患者的腹泻、感染(优选胃肠道感染)、急腹痛、腹部痉挛和/或腹部疼痛的方法，所述方法包括给予有需要的患者一种包含一种或多种益生菌的组合物。也就是说，本发明涉及包含益生菌的组合物用于制备治疗IBS患者的腹泻、感染(优选胃肠道感染)、急腹痛、腹部痉挛和/或腹部疼痛的组合物(优选营养组合物)的用途。本发明还能被描述为一种用于治疗IBS患者的腹泻、感染(优选胃肠道感染)、急腹痛、腹部痉挛和/或腹部疼痛的包含益生菌的组合物，优选营养组合物。

[0028] 本发明人还发现各种益生菌并非同样地适合治疗患有例如IBS的肠道运动性病症的患者的假单胞菌生长过度。发现(参见表1)发酵乳杆菌NumRes 4、发酵乳杆菌NumRes 2、动物双歧杆菌BB-12和长双歧杆菌生物型longum BB-536是假单胞菌粘附小肠细胞的强抑制剂。因此，用于治疗IBS患者的铜绿假单胞菌生长过度和IBS患者的腹泻、感染(优选胃肠道感染、急腹痛、腹部痉挛和/或腹部疼痛的一种优选的组合物包含发酵乳杆菌(NumRes 4)、发酵乳杆菌(NumRes 2)、动物双歧杆菌(BB-12)、长双歧杆菌(BB-536)、或其混合物。从丹麦的Chr.Hansen可获得动物双歧杆菌(BB-12)，从日本的Morinaga可获得长双歧杆菌(BB-536)。在一个实施方案中，本发明涉及包含发酵乳杆菌NumRes4(LMG-P-24701)、发酵乳杆菌NumRes 2(LMG-P-24701)、动物双歧杆菌BB-12、或其混合物的组合物用于制备治疗肠易激综合征的组合物的用途。

[0029] 干酪乳杆菌CRL-431由于显示出对小肠细胞良好的粘附性(Morata et al.(1999)J Food Prot 62：1430-1434)以及显示出能够在鼠中防止假单胞菌感染(Alvarez et al.(2001)J Food Prot 64：1768-1774)而同样是良好的候选者。因此，在一个优选实施方案中，本发明的益生菌组合物包含干酪乳杆菌(CRL-431)。从丹麦的Chr.Hansen可获得干酪乳杆菌CRL-431。同样地，由于其有益活性，在一个优选实施方案中，本发明的益生菌组合物包含干酪乳杆菌(DN-114001＝CNCMI-1518)和/或动物双歧杆菌(DN-173010＝CNCM I-2494)。这两种细菌已显示具有非常好的益生菌特性，例如在新鲜乳制品中的稳定性和肠道定居。

[0030] 申 请 人 已 根 据 布 达 佩 斯 条 约 于2008年7 月8日 将 发 酵 乳 杆 菌NumRes 4和发 酵乳杆 菌NumRes 2保藏 于BCCM(比利 时微生 物协 作保藏 中心 (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms)，Laboratorium voor Microbiologie- (LMG)，University of Gent，K.L.Ledeganckstraat 35，B-9000 Gent，Belgium)。NumRes 4 的 BCCM 保 藏 号 为LMG-P-24701。NumRes 2的BCCM保藏号为LMG-24700。在一个实施方案中，本发明涉及BCCM保藏号为LMG-P-24701的发酵乳杆菌NumRes 4。在一个实施方案中，本发明涉及BCCM保藏号为LMG-P-24700的发酵乳杆菌NumRes 2。在一个实施方案中，本发明涉及NumRes
4(LMG-24701)用作药物。在一个实施方案中，本发明涉及NumRes 2(LMG-24700)用作药物。

[0031] 营养组合物

[0032] 在一个优选实施方案中，本发明的组合物——特别是所述益生菌组合物——是营养组合物。营养组合物优选包含至少一种、优选至少两种、更优选至少三种选自蛋白质、脂肪和可消化性碳水化合物的常量营养物。在一个有利实施方案中，本发明的营养组合物包含非可消化性碳水化合物，下文也称作膳食纤维。

[0033] 脂肪

[0034] 在一个实施方案中，本发明的营养组合物包含脂肪。γ-亚油酸(GLA)对消化系统以及肝和脾运作有刺激作用。因此，本发明组合物的一个优选实施方案含有GLA源。源自月见草种子的月见草油是天然植物油，是GLA的合适来源。

[0035] 组合物中脂肪过多可引起使IBS症状增加的消化问题。因此，本发明的组合物优选地脂肪含量低，以组合物总重量计，优选包含少于3重量％的脂肪，优选为0.1至3重量％并且甚至更优选为0.1至1重量％的脂肪。

[0036] 蛋白质和可消化性碳水化合物

[0037] 在一个实施方案中，本发明的营养组合物包含蛋白质。在一个实施方案中，本发明的营养组合物包含可消化性碳水化合物。本发明的组合物有利地包含乳蛋白。很多IBS患者不耐受乳糖，这些IBS患者将从乳糖含量低的饮食中大大地受益。因此本发明的组合物优选包含乳糖含量低或者甚至优选无乳糖的乳蛋白质源。或者，可使用来自非乳源例如大豆的蛋白源。除了乳糖，本发明的组合物优选包含选自蔗糖、葡萄糖、果糖、固态玉米糖浆、淀粉和麦芽糊精的可消化性碳水化合物。

[0038] 本发明有利地提供了一种组合物，其中脂肪提供0.5至15％的总卡路里，蛋白质提供5至50％的总卡路里，可消化性碳水化合物组分提供15至90％的总卡路里。

[0039] 膳食纤维

[0040] 在一个实施方案中，本发明的营养组合物包含膳食纤维。膳食纤维具有减轻IBS症状的有益效果。当在本说明书中使用术语“膳食纤维”时，这是意指包括非可消化性寡糖和非可消化性多糖，但不是单糖和二糖。本发明中使用的膳食纤维通常难以在人小肠中消化和吸收而优先在大肠中被完全或部分地发酵。本发明的组合物优选包含至少一种选自如下的膳食纤维：包括反式半乳寡糖在内(TOS)的半乳寡糖(GOS)、菊糖、包括长链低聚果糖(lcFOS)和短链低聚果糖(scFOS)、及其混合物在内的低聚果糖(FOS)、低聚木糖、帕拉金寡糖(palatinoseoligosaccharide)、大豆寡糖(soybean oligosaccharide)、龙胆寡糖(gentiooligosaccharide)、果胶、果胶酸盐、藻酸盐、软骨素、透明质酸、肝素(heparine)、类肝素(heparane)、唾液酸聚糖(sialoglycan)、岩藻聚糖、岩藻寡糖、角叉菜聚糖、黄原胶、纤维素、聚葡萄糖(PDX，由随机交联的葡萄糖和山梨糖醇合成的非可消化性碳水化合物)、瓜尔胶、优选为US 5,560,914的MGN-3米糠阿拉伯木聚糖化合物(MGN-3Rice Bran Arabinoxylan Compound)的阿拉伯木聚糖、木聚糖、愈创葡聚糖、木质素和/或它们的降解产物。

[0041] 在一个实施方案中，本发明的组合物包含至少两种不同的选自如下的膳食纤维：包括反式半乳寡糖在内的半乳寡糖、菊糖、低聚果糖、低聚木糖、帕拉金寡糖、抗性淀粉(resistant starch)、乳果糖、乳果寡糖(lactosucrose)、甘露寡糖、异麦芽寡糖(isomaltooligosaccharide)、麦芽寡糖(maltooligosaccharide)、葡甘露聚糖、阿拉伯半乳聚糖、大豆寡糖、龙胆寡糖、果胶、果胶酸盐、软骨素、透明质酸、唾液酸聚糖、岩藻寡糖、黄原胶、聚葡萄糖(PDX)、半乳甘露聚糖和瓜尔胶、阿拉伯木聚糖(优选MGN-3米糠阿拉伯木聚糖)、木聚糖、愈创葡聚糖和/或它们的降解产物，其中至少一种选自半乳寡糖(包括反式半乳寡糖)、菊糖、低聚果糖、低聚木糖、帕拉金寡糖、抗性淀粉、乳果糖、乳果寡糖、甘露寡糖、异麦芽寡糖、麦芽寡糖、葡甘露聚糖、阿拉伯半乳聚糖、龙胆寡糖、黄原胶、阿拉伯木聚糖、聚葡萄糖(PDX)、半乳甘露聚糖、瓜尔胶和/或它们的降解产物。

[0042] 在另一个实施方案中，本发明的组合物包括至少三种选自如下的膳食纤维：包括反式半乳寡糖在内的半乳寡糖、菊糖、低聚果糖、低聚木糖、帕拉金寡糖、抗性淀粉、乳果糖、乳果寡糖、甘露寡糖、异麦芽寡糖、麦芽寡糖、葡甘露聚糖、阿拉伯半乳聚糖、大豆寡糖、龙胆寡糖、果胶、果胶酸盐、软骨素、透明质酸、唾液酸聚糖、岩藻寡糖、黄原胶、聚葡萄糖(PDX)、半乳甘露聚糖和瓜尔胶、阿拉伯木聚糖(优选MGN-3米糠阿拉伯木聚糖)、木聚糖、愈创葡聚糖和/或它们的降解产物，其中至少两种选自：包括反式半乳寡糖在内的半乳寡糖、菊糖、低聚果糖、低聚木糖、帕拉金寡糖、抗性淀粉、乳果糖、乳果寡糖、甘露寡糖、异麦芽寡糖、麦芽寡糖、葡甘露聚糖、阿拉伯半乳聚糖、龙胆寡糖、黄原胶、阿拉伯木聚糖、聚葡萄糖(PDX)、半乳甘露聚糖、瓜尔胶和/或它们的降解产物，并且第三种是选自如下的酸性寡糖膳食纤维：果胶、果胶酸盐、软骨素、透明质酸、唾液酸聚糖和岩藻寡糖和/或它们的降解产物。

[0043] 意外的是，纤维的某些组合显示出更好的抗粘附活性。包括反式半乳寡糖(TOS)在内的半乳寡糖(GOS)、包括长链低聚果糖(lcFOS)和短链低聚果糖(scFOS)在内的低聚果糖(FOS)的组合形式以及几种与酸性寡糖(例如果胶水解产物)组合的形式都比单个的纤维效果更好，所述lcFOS被定义为由10个或更多单糖组成，并且所述scFOS被定义为由2至10个单糖组成。

[0044] 因此，本发明组合物的施用可用于达到一种或多种以下生理效应：双歧杆菌和/或乳酸细菌显著增加；乳酸显著增加和/或总的SCFA显著增加；乙酸盐相对量显著增加；丁酸盐相对量显著下降；异丁酸盐、戊酸盐和异戊酸盐的总量显著下降；气体形成减少；发酵(包括在结肠的最远端部分的发酵)时间更长更平稳，并且在结肠的最近端发酵高。

[0045] 此外可加入碳酸钙以防止气体形成。因此，优选的组合物包括与碳酸钙联用的膳食纤维。

[0046] 本发明的膳食纤维可有利地在治疗和/或预防铜绿假单胞菌生长过度、腹泻、(胃肠道)感染、急腹痛、腹部痉挛、腹部疼痛和肠易激综合征的方法中与选自如下的益生菌联合使用：发酵乳杆菌(NumRes 4)、发酵乳杆菌(NumRes 2)、动物双歧杆菌(BB-12)、干酪乳杆菌(CRL-431)、长双歧杆菌(BB-536)、干酪乳杆菌(DN-114 001)和动物双歧杆菌(DN-173010)。

[0047] 发酵乳产品

[0048] 在一个优选实施方案中，本发明的营养组合物是发酵乳产品的形式。在一个优选实施方案中，所述发酵乳产品是通过将葡萄糖(源自乳中的乳糖水解)发酵为乳酸而得的凝结乳产品，由此得到一种发酵乳产品，例如酸奶，所述葡萄糖到乳酸的发酵优选地通过保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)和嗜热链球菌——优选还与长双歧杆菌(BB-536)和/或动物双歧杆菌(BB-12)结合——来实现。此外，上述益生菌和益生元的任何一种都可加入到这样的发酵乳产品中以治疗铜绿假单胞菌生长过度和/或IBS患者的感染。

[0049] 在本文及其权利要求书中，动词“包含”及其变形以其非限制性的含义使用，意指其后的条目是被包含在内的，但是并不排除未特地提出的条目。此外，提及要素时使用的不定冠词“一个(种)”并不排除存在多于一个(种)要素的可能性，除非上下文明确地要求有且只有一个(种)所述要素。因此不定冠词“一个(种)”通常是指“至少一个(种)”。

[0050] 实施例

[0051] 实施例1

[0052] IBS患者的肠内和粪便样本中铜绿假单胞菌增加

[0053] 方法

[0054] 取样、制备和保存

[0055] 使装在无菌导管中的无菌细胞刷(Uno-Brush，Prince Médical，Ercuis，France)穿过内窥镜活组织检查通道并直视向前推进至内窥镜末端外。将十二指肠粘膜刷3次以得到粘膜相关细菌。从每位受试者的十二指肠的降部和水平部得到其细胞刷样本。刷完后，将所述细胞刷拉回至导管鞘中，将所述导管取出并且立即将细胞刷与导管分开并将细胞刷放在无菌管内置于液氮中，保存在-80℃直至分析。

[0056] 在内窥镜检查前取粪便样本。粪便样本保存在受试者的家用冰箱中，在临进行内窥镜检查前收集并且保存在-80℃直至分析。在微生物学分析前，粪便和细胞刷样本都保存在干冰中。

[0057] DNA提取和PCR扩增

[0058] 将所述冷冻的粪便解冻并且使用Fast DNA Spin kit试剂盒(Qbiogene，Irvine，USA)从0.5g粪便材料中提取DNA。将所述冷冻的细胞刷样本解冻，用180μl ATL缓冲液悬浮并且将其剧烈地涡旋震荡来提取粘附的细菌。随后，使用组织DNA酶试剂盒(Qiagen，Venlo，荷兰)依照制造商的说明书从粘膜相关细菌中分离DNA。将从粪便和细胞刷中分离到的DNA的溶液都保存在-20℃。

[0059] 将提取到的DNA用作模板，用Muyzer G et al.，Appl Environ Microbiol 1993；59(3)：695-700和Muyzer and Smalla，Antonie Van Leeuwenhoek 1998；73(1)：127-141中描述的引物U968-GC-f和U1401-r来扩增16S rRNA的V6至V8区。用来自Invitrogen的Taq DNA聚合酶试剂盒(Invitrogen，Paisley，UK)进行PCR。反应混合物由5μl 10×PCR缓冲液、50mM MgCl2、50μM三磷酸脱氧核苷酸、1.25U Taq聚合酶、各10pmol的每种引物和1μl适当稀释的模板DNA组成，终体积为50μl。在PTC-200PCR系统(MJ-Research，Waltham，USA)中对样本进行扩增，热循环程序如下：94℃5分钟；10个循环的94℃变性1分钟、65-56℃的温度退火1分钟(每个循环降1℃)、68℃延伸3分钟；33个循环的94℃1分钟、56℃1分钟和68℃3分钟。在含有溴化乙锭的1.5％(重量/体积)的琼脂糖凝胶上通过电泳对5μl等分试样的PCR产物进行分析。

[0060] PCR扩增子的DGGE分析

[0061] 通过基于Muyzer and Smalla(同上)的方法的DGGE用DGGE解码系统(DGGE Decode system)(Bio-Rad Laboratories，Hercules，California，USA)分离PCR扩增子，但有以下修改。聚丙烯酰胺凝胶由8％(体积/体积)的聚丙烯酰胺(丙烯酰胺和二丙烯酰胺的比率；37.5∶1)和0.5×Tris-乙酸-EDTA(pH 8.0)(TAE)缓冲液组成。100％变性丙烯酰胺被限定为7M脲和40％甲酰胺。所述聚丙酰胺凝胶是以32.5至72.5％的变性梯度制备的。使用梯度标记和泵(Econo梯度泵；Bio-Rad Laboratories，Hercules，California，USA)以3ml/min的速度从顶部倾倒所述凝胶。在变性凝胶(梯度体积，28ml)聚合之前加入7.5ml的不含变性化学物质的积层凝胶，然后插入合适的梳子。在60℃的恒温下于0.5×TAE缓冲液中，电泳首先在200V下进行5分钟，然后在80V下进行17个小时。用AgNO3将所述凝胶染色并在50℃下干燥过夜。

[0062] DGGE图谱的分析和合并图谱(pooled profile)的产生

[0063] 使用标准参照对凝胶图谱进行标准化。由于DGGE凝胶是在相似的变性和电泳条件下进行的，所以此标准化步骤使得能够比较不同凝胶的DGGE图谱。使用GelCompar软件(Applied Maths，Kortrijk，比利时)基于凝胶上的条带强度和位置分别在平均IBS指纹和平均健康受试者指纹中合并来自IBS患者和健康受试者的DGGE图谱。检测这些平均图谱中的条带差异，将在平均IBS和健康图谱中不相同的条带在个体DGGE图谱中定位。将个体图谱中最强的条带从原始凝胶中切下。将这些条带的DNA用于第二次DGGE分析，其中使用46-51.6％梯度。对目的条带进行如下所述的测序。

[0064] 来自DGGE条带的DNA的克隆和测序

[0065] 为鉴定与条带相关的细菌，用无菌解剖刀将选定条带的中间部分从DGGE凝胶上切下来，然后在4℃下在50μl无菌Milli-Q中孵育24小时以使其扩散。将含有DNA片段的洗脱液用于PCR再扩增，使用与先前同样的引物。为检查在首次DGGE凝胶上的目的DNA和再扩增的DNA是否迁移至同一位置，进行了第二次DGGE，以比较两个样本。当所述两条带共迁移时，用GenElute PCR DNA纯化试剂盒(Sigma，Zwijndrecht，荷兰)将DNA片段纯化，然后将其连接到pCR 2.1-TOPO 载体上并转化到大肠杆菌One Shot TOP10感受态细胞(Invitrogen，Paisley，UK)中。用Qiagen中型的质粒纯化试剂盒(Plasmid Midi Purification Kit)(Qiagen，Venlo，荷兰)提取来自卡那霉素抗性转化子集落的质粒。用M13正向和反向引物以及968f和1401r引物进行PCR以筛选插入物大小正确的提取质粒。对选出的转化子的插入PCR扩增子进行纯化并进行DNA序列分析(Baseclear，Leiden，荷兰)。用NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)中的基本局部比对搜索工具(BLAST)检查克隆的序列相似性。

[0066] 实时定量PCR分析

[0067] 进行实时定量PCR(q-PCR)以测定细胞刷和粪便样本中的铜绿假单胞菌的百分比。将如Pirnay et al.，Crit Care 2000；4(4)：255-261所描述的方法略作改动检测铜绿假单胞菌。将荧光标记从LC Red 640变为6FAM并且从荧光素变为TAMRA，而所述q-PCR的其他组分和条件保持不变。在ABI 7900HT Fast(Applied Biosystems，Nieuwerkerk aan de IJssel，荷兰)上检测退火阶段的荧光信号。如Nadkarni et al.Microbiology 2002；148(Pt 1)：257-266所描述检测总细菌载量。然后根据Liu et al.Biochem Biophys Res Commun 2002；294(2)：347-353和Anal Biochem 2002；302(1)：52-59计算铜绿假单胞菌的相对百分比。分别计算每个扩增曲线的效能并将其用于确定DNA的初始量。最后，将得到的DNA初始量之间的比率相对同一物质的单一培养物(设为100％)标准化。

[0068] 统计学分析

[0069] 用GelCompar II软件(Applied Maths，比利时)分析DGGE数据。用皮尔逊积矩相关分析(Pearson product-moment correlation)和非加权组平均法(unweighted-pair group method using arithmetic averages)(UPGMA)进行不同条带模式之间的聚类分析和相似性指数的计算。

[0070] 用独立样本t检验分析IBS患者和健康受试者的铜绿假单胞菌水平。用单因素方差分析分析IBS亚群的铜绿假单胞菌水平，其中使用邦弗朗尼校正(Bonferroni correction)。数据表示为平均值±SEM。用Windows下的SPSS 12.0.1进行分析。

[0071] 结果

[0072] DGGE凝胶在两组的小肠样本中78.2％相同而在粪便样本中86.25％相同。仅限于IBS的小肠和粪便条带的克隆主要被鉴别为假单胞菌种，其中铜绿假单胞菌是主要的种。

[0073] IBS患者的小肠中的铜绿假单胞菌占总细菌载量的百分比显著高于(8.3±0.950％)健康受试者中的(0.1±0.069％)(P＜0.001)。IBS患者的粪便中的铜绿假单胞菌占总细菌载量的百分比也显著高于(2.34±0.31％)健康受试者中的(0.003±0.0027％)(P＜0.001)。

[0074] 结论

[0075] 结果显示铜绿假单胞菌在IBS患者的粘膜相关小肠和粪便样本中增加，清楚地表明铜绿假单胞菌在IBS病理生理学中有作用。

[0076] 实施例2

[0077] 选择最佳抑制铜绿假单胞菌对人小肠细胞(Caco-2)的粘附的益生菌菌株[0078] 方法

[0079] 在37℃下在CO2培养箱中在24孔板中使Caco-2细胞在有20％FCS(小牛血清)的MEM+培养基中生长2周，直至形成单层细胞。MEM+培养基包含MEM(Gibco 10938)，并补充有10mM丙酮酸钠、1×非必须氨基酸(Gibco 11130-36)和100U青霉素-100μg链霉素(penstrep；Gibco 15140-130)。在实验前1天将所述培养基更换为含有10％FCS的MEM+培养基(无青链霉素)，并且在实验前1小时将所述培养基更换为含有1％FCS的MEM+培养基(无青链霉素)。将在TSB肉汤中的铜绿假单胞菌P112和在rMRS肉汤中的乳酸细菌的过夜培养物在PBS中洗涤一次，显微镜计数并在Caco-2细胞培养物中分别地稀释为2×10E8CFU/ml和1×10E9 CFU/ml的储液。将所述P112储用培养物也以适当的稀释度接种在NA-琼脂上。将250μl Caco-2储用培养物与250μl乳酸细菌储液混合。之后加入
250μl P112培养物并且将所得混合物在37℃下在CO2培养箱中孵育1h。将Caco-2与不加乳酸细菌的P112孵育作为阴性对照。孵育后将所述细胞在PBS中洗涤3次以除去未粘附的细菌。加入蒸馏水以使细菌分离并裂解Caco-2细胞。然后将样本以适当的稀释度接种于NA-琼脂上以测定P112活菌计数并计算粘附的细菌的百分比。

[0080] 结果

[0081] 通过使用Caco-2细胞进行体外实验来测定益生菌菌株对铜绿假单胞菌在小肠细胞上的粘附的影响。在这些实验中使用了临床分离菌株(AZU R872)铜绿假单胞菌菌株P112。Caco-2细胞是能够表达成熟肠细胞的分化特征的人结肠腺癌细胞，因此它是用于与肠细胞功能相关的研究的有价值的体外工具。Caco-2细胞与P112和长双歧杆菌BB-536的共孵育显示出抑制61％的铜绿假单胞菌对细胞的粘附。其他乳酸细菌菌株也抑制假单胞菌的粘附但是抑制程度较低。所得结果也总结在表1中。这些结果显示，长双歧杆菌BB-536能够抑制铜绿假单胞菌在肠上段定居。

[0082] 表1：对铜绿假单胞菌在与各种乳酸细菌菌株共孵育的Caco-2细胞单层上的粘附的抑制(％)

[0083]

[0084] 用于表征发酵乳杆菌的不同菌株(NumRes 2和NumRes 4)的发酵模式表明所述分离株是不同的：

[0085] NumRes 2 NumRes 4

[0086] 核糖 + +

[0087] 半乳糖 - +

[0088] 葡萄糖 + +

[0089] 果糖 + -

[0090] 甘露糖 + +

[0091] 麦芽糖 + -

[0092] 乳糖 + +

[0093] 蜜二糖 - -

[0094] 蔗糖 + +

[0095] 海藻糖 - -

[0096] L-阿拉伯糖 - -

[0097] 甘露糖醇 - -

[0098] 此外，已知口服长双歧杆菌能防止小鼠的由铜绿假单胞菌引起的肠源性脓毒症，