植物提取物及其治疗用途

摘要

本发明关于一种包含至少一种母菊属植物和/或至少一种蓍属植物的水性和/或有机提取物的组合物，该组合物用于治疗异常增生和/或病毒病症，条件为对于所述异常增生病症的治疗欧蓍草的单一/单独提取物被排除在外并且进一步条件为对于所述病毒病症的治疗德甘菊的单一/单独提取物被排除在外。

权利要求

1.一种组合物，所述组合物包含至少一种母菊属植物和/或至少一种蓍属植物的水性和/或有机提取物，所述组合物用于治疗异常增生和/或病毒病症，条件为对于所述异常增生病症的治疗欧蓍草的单一/单独提取物被排除在外，并且进一步条件为对于所述病毒病症的治疗德甘菊的单一/单独提取物被排除在外。

2.权利要求1的组合物，其特征在于所述组合物由至少一种母菊属植物和/或至少一种蓍属植物的水性和/或有机提取物及必要时的至少一种药学和/或皮肤病学可接受的助剂组成。

3.权利要求1至2中任一项的组合物，其特征在于对于异常增生病症的治疗包括异常增生的哺乳动物细胞，特别是癌细胞的同步化和S期停滞。

4.权利要求3的组合物，其特征在于所述同步化包含鸟氨酸脱羧酶的诱导和/或拓扑异构酶，特别是拓扑异构酶II的抑制。

5.权利要求1至4中任一项的组合物，其特征在于所述有机提取物可用醇，特别是具有2至6个碳原子的醇提取得到，其中乙醇为特别优选，或者可用酮，特别是具有3至5个碳原子的酮提取得到，其中丙酮为特别优选。

6.权利要求1至5中任一项的组合物，其特征在于所述提取物为可从母菊属植物的花头部，特别是不含芹菜素和芹菜素-糖苷的管状花获得，和/或可从草本植物和/或从蓍属植物的花头部，特别是管状花获得。

7.权利要求1至6中任一项的组合物，其特征在于所述母菊属植物选自：-母菊种，特别是

-母菊(Matricariarecutita L.)

-同花母菊(Matricaria discoidea DC.)-春黄菊种，特别是

-白花春黄菊(Anthemis nobilis L.)-刺干菊(Anthemis arvensis L.)

-臭干菊(Anthemis cotula L.)

-春黄菊(Anthemis tinctoria L.)-摩洛哥洋甘菊(Ormenis multicaulis Br.-Bl&Maire)-岬角甘菊(Eriocephalus punctulatus DC.)，其中母菊为特别优选。

8.权利要求1至7中任一项的组合物，其特征在于对于待提取的植物部分预先进行蒸汽蒸馏以去除精油。

9.权利要求1至8中任一项的组合物，其特征在于对初级液体水性和/或有机提取物进行分子量过滤以收集分子量小于10000道尔顿的组分并去除分子量大于10000道尔顿的组分，由此所得的液体提取物部分有时被加工成干粉。

10.权利要求1至8中任一项的组合物，其特征在于对初级液体水性和/或有机提取物进行分子量过滤以收集分子量大于10000道尔顿的组分并去除分子量小于10000道尔顿的组分，由此所得的液体提取物部分有时被加工成干粉。

11.权利要求1至10中任一项的组合物，其特征在于所述组合物包含至少一种药学和/或皮肤病学可接受的助剂。

12.权利要求1至11中任一项的组合物，其特征在于所述治疗包含所述组合物和至少一种抗肿瘤剂的同时或顺序给药。

13.权利要求12的组合物，其特征在于所述治疗包含：

-所述组合物至少给药2天，优选至少给药5天，以同步所述异常增生的哺乳动物细胞，特别是所述癌细胞，并使它们停滞在S期，然后-在至少一种抗肿瘤剂开始给药之前将所述给药停止至少6小时，优选至少24小时，由此-在所述抗肿瘤剂的给药期间不给予所述组合物，且由此

-在接下来的所述抗肿瘤剂洗出阶段，也不给予所述组合物。

14.权利要求13的组合物，其特征在于所述治疗周期重复至少两次，优选至少3次。

15.权利要求12至14中任一项的组合物，其特征在于所述组合物由至少一种母菊属植物和/或至少一种蓍属植物的水性和/或有机提取物和至少一种抗肿瘤剂和必要时的至少一种药学和/或皮肤病学可接受助剂组成。

16.权利要求12至15中任一项的组合物，其特征在于所述抗肿瘤剂为天然的、半合成的或合成的来源。

17.权利要求12至16中任一项的组合物，其特征在于所述抗肿瘤剂选自：-抗代谢物、

-DNA烷化剂、

-有丝分裂抑制剂和

-DNA嵌入剂。

18.权利要求1至17中任一项的组合物，其特征在于所述初级提取物包含至少一种具有脂质基团的水溶性污染物，所述污染物通过以下步骤去除：(i)将所述组合物与亲脂组分接触，亲脂组分与所述污染物形成复合物；

(ii)第一去除步骤，该步骤去除具有大于步骤(i)形成的复合物的颗粒尺寸的物质；

和

(iii)第二去除步骤，该步骤去除步骤(i)形成的复合物。

19.权利要求18的组合物，其特征在于所述污染物为内毒素，优选选自革兰氏阴性菌细胞壁的碎片或构成革兰氏阴性菌细胞壁的分子片段，例如选自脂多糖类和具有蛋白基团的糖类，特别是具有至少一个脂链的糖蛋白。

20.权利要求18至19中任一项的组合物，其特征在于所述内毒素具有超过10000道尔顿的分子量，优选超过5000道尔顿，还更优选超过1000道尔顿且最优选超过500道尔顿。

21.权利要求18至20中任一项的组合物，其特征在于所述亲脂组分为油，优选为脂肪油。

22.权利要求18至21中任一项的组合物，其特征在于步骤(iii)包含超滤，优选使用具有0.001至0.02μm的孔尺寸的滤器，更优选0.001至0.01μm孔尺寸。

23.权利要求1至22中任一项的组合物，其特征在于所述提取物不含或基本不含内毒素，由此所述提取物以不超过100EU/ml-根据欧洲药典的内毒素单位/ml-的量包含内毒素，优选不超过50EU/ml，例如不超过25EU/ml。

24.权利要求1至23中任一项的组合物，其特征在于所述治疗通过注射所述组合物或通过口服、直肠给药或体表给药来实现。

25.包含至少一种母菊属植物和/或至少一种蓍属植物的水性和/或有机提取物的组合物用于治疗异常增生和/或病毒病症的用途，条件为对于所述异常增生病症的治疗欧蓍草的单一/单独提取物被排除在外，并且进一步条件为对于所述病毒病症的治疗德甘菊的单一/单独提取物被排除在外。

26.权利要求25的用途，其特征在于所述组合物为权利要求2至24中任一项限定的组合物。

27.包含至少一种母菊属植物和/或至少一种蓍属植物的水性和/或有机提取物的组合物用于制备治疗异常增生和/或病毒病症的药剂的用途，条件为对于所述异常增生病症的治疗欧蓍草单一/单独提取物被排除在外，并且进一步条件为对于所述病毒病症的治疗德甘菊的单一/单独提取物被排除在外。

28.权利要求27的用途，其特征在于所述组合物为权利要求2至24中任一项限定的组合物。

29.一种用于治疗患有异常增生和/或病毒病症的人或动物体的方法，其特征在于对于所述患者施用或给予包含至少一种母菊属植物和/或至少一种蓍属植物的水性和/或有机提取物的组合物，条件是对于所述异常增生病症的治疗欧蓍草的单一/单独提取物被排除在外，并且进一步条件为对于所述病毒病症的治疗德甘菊的单一/单独提取物被排除在外。

30.权利要求29的方法，其特征在于所述组合物为权利要求2至24中任一项限定的组合物。

说明书

植物提取物及其治疗用途

发明领域

[0001] 本发明涉及植物提取物及其治疗用途。

[0002] 发明背景

[0003] WO 03/101479A1描述了包含通常通过肌内注射一起给药的多种组分的组合物的有价值的治疗性能。用于所述实例中的组合物包含春黄菊(camomile)提取物-尽管没有直接的治疗活性归因于它；更确切地讲，它被描述成抗刺激剂，它的存在可减轻注射本身令人不愉快的效果。

[0004] WO 2007/057651A1公开了一种用于从春黄菊的水性组合物中去除具有脂质基团的水溶性污染物的方法，特别是去除内毒素。

[0005] WO 01/13929A1中描述了一种从欧蓍草(Achillea millefolium)中分离的基本纯的生物活性提取物。这种提取物(优选甲醇提取物)具有抗肿瘤活性，并用作抗癌剂。

[0006] WO 2008/146009A1中描述了春黄菊精油或黑枯茗种子油或两种油的混合物对于人粒细胞细胞系HL60中5-脂加氧酶活性及对于人成胶质细胞瘤细胞系U87MG中DNA合成的作用。该文献中还描述了所述油对于人巨噬细胞系THP1中IL-6释放和对于人前列腺癌细胞DU145中DNA合成的作用。

[0007] US 6300370B1中描述了一种用于生产春黄菊精油的方法。该方法中对春黄菊提取残余物进行蒸汽蒸馏或者进行水蒸馏(aqueousdistillation)。所述春黄菊提取残留物通过用水性或有机溶剂或其混合物处理春黄菊花和茎获得，其中对原材料使用或不使用上述蒸汽蒸馏。

[0008] P.Vilaginès，P.Delaveau和R.Vilaginès“Inhibition de la replicationdu poliovirus par un extrait de Matricaria chamomilla(L.)”，ComptesRendus de l’Académie des Sciences，Série III，Tome 301，No.6，1985，289-294页，描述了德甘菊(Matricaria chamomillaL.)的含水酒精提取物对于脊髓灰质炎病毒类型1生长的作用。当在脊髓灰质炎病毒生长的早期阶段加入这种春黄菊提取物，则所述提取物抑制了细胞和病毒RNA合成。这种抑制是部分可逆的。

[0009] 发明目的

[0010] 本发明的一个目的是提供一种用于治疗异常增生和/或病毒病症的组合物。

[0011] 本发明的另一个目的是提供一种用于人或动物体内异常增生的哺乳动物细胞，特别是癌细胞的同步化和S期停滞(arrest)的组合物。

[0012] 这种同步化应包含鸟氨酸脱羧酶的诱导和/或拓扑异构酶II的抑制。

[0013] 本发明的还一个目的是提供一种用于治疗异常增生病症的组合物，其中该治疗包含此组合物和至少一种抗肿瘤剂的同时或顺序给药。

[0014] 这些目的在本发明中被实现。

[0015] 发明概述

[0016] 本发明通过独立权利要求中限定的特征来表征。

[0017] 优选的实施方案在从属权利要求中被限定。

[0018] 该组合物还可由至少一种母菊属(Chamomilla)植物的和/或至少一种蓍属(Achillea)植物的水性和/或有机提取物和至少一种抗肿瘤剂及必要时的至少一种药学和/或皮肤病学可接受的助剂组成。

[0019] 令人惊奇的是，现已发现从春黄菊花头部获得的提取物(例如描述于WO2007/057651A1中)具有有价值的治疗性能。特别是，已发现它能减少DNA和RNA合成而对蛋白质合成没有本质的影响，由此可推断出在治疗癌症中的效用。

[0020] 甚至更令人惊奇的是，已发现母菊(Matricaria recutita L.)的管状花(Flores tubiformis)的有机提取物适合用于异常增生的哺乳动物细胞，特别是癌细胞的同步化和S期停滞。

[0021] 这种同步化的发生是由于鸟氨酸脱羧酶的诱导(从G0期转变至G1期)和拓扑异构酶II的抑制(在S期早期累积并停滞)。

[0022] 还发现有机提取物对于拓扑异构酶II的抑制比水性提取物对于拓扑异构酶II的抑制强100倍以上(关于酶完全抑制的浓度)。

[0023] 由于拓扑异构酶II的抑制对于细胞同步化的效果很关键这一事实，本发明的母菊管状花(Flores tubiformis)的有机提取物比相应的水性提取物明显更有效。

[0024] 发明描述

[0025] 本发明为基于使用春黄菊的水性提取物获得的数据并基于使用母菊的管状花(Flores tubiformis)的有机提取物，特别是醇类提取物，例如乙醇提取物获得的数据。

[0026] 可用的证据表明如下文描述所得到的水性春黄菊提取物维持蛋白生物合成，然而减少了DNA和RNA生物合成。这是对该提取物的所需要性能的好的评估。

[0027] 所述水性和/或有机提取物可通过任何本领域普通技术人员已知的合适的程序获得。所述提取物可通过使用水性和/或有机介质，尤其是醇类介质(例如乙醇介质)获得，并与其他组分分离。

[0028] 用于制备水性提取物的优选程序描述于WO 2007/057651A1中。

[0029] 优选地，本发明的组合物还包含至少一种选自药用助剂，优选选自药用剂和药用赋形剂的组分。

[0030] 可对所述水性提取物进行纯化处理。此类提取物包含水溶性组分的多组分混合物。可通过向合适的植物部分添加水以得到悬液，然后通常将该悬液加热至低于水沸点的温度(例如90-94℃)，然后冷却至室温，以此获得该提取物。

[0031] 然后对所述水性提取物进行两次过滤步骤。仅出于说明的目的，它们将在下文分别被描述为微量过滤和超滤。其他技术(例如使用亲脂隔离)可为合适的。如有需要每个过滤步骤可以以一级、两级或多于两级来实施。

[0032] 使用微量过滤以去除原本将损害超滤步骤效果的物质。

[0033] 以下部分描述了本发明的可能实施方案。

[0034] 以下实例描述了本发明。

[0035] 对实施例中得到样品的细菌内毒素用Cambrex PyroGene分析(使用1∶10.000的稀释因子)进行分析。

[0036] 实施例1和2

[0037] 将45g黄色管状春黄菊花(Chamomilla recutita)与900g水(Aquapurificata，Ph.Helv.)混合。将该混合物在20至30分钟内加热至90℃和94℃之间的温度。然后将该混合物储存于室温(15℃至25℃)直至达到30℃和35℃之间的温度。

[0038] 通过深层过滤去除药物残余物。将所得到的粗滤液通过用0.22μm膜过滤来澄清。

[0039] 向澄清的滤液，加入0.3％(实施例1)或0.1％(实施例2)(相对于提取物质量)的蓖麻油(Ph.Eur.)。将得到的混合物均化5分钟。将如此制备的提取物用0.22μm膜过滤(以切向流模式)，并且回收截留物。

[0040] 将得到的渗透液用0.1μm膜过滤(以切向流模式)，且回收截留物。最后，将得到的渗透液用1000kDa膜过滤(以切向流模式)，且回收截留物。

[0041] 在各自的最后滤液中细菌内毒素的残余：＜100EU/ml。

[0042] 实施例3至5

[0043] 重复实施例1，除了用0.3％(实施例3)、1.0％(实施例4；VIP-E_Matr’06_1003)和3.0％(实施例5)(相对于提取物质量)的mygliol(Ph.Eur.)代替蓖麻油加入澄清的滤液中。

[0044] 各自的终滤液中细菌内毒素的残余：＜100EU/ml。

[0045] 实施例6

[0046] 该实施例使用了修订的方案，其中加热和冷却不在高压灭菌锅中进行，而是在10L双层容器中在搅拌条件下进行(加热设备的最大温度140℃)。

[0047] 加入mygliol代替蓖麻油。该mygliol为来自 的“肠胃外使用的Mygliol812”。将该混合物在室温搅拌10分钟，代替均化。

[0048] 以上描述的方法中的微量过滤全部用Millipore Pellicon 2系统进行。为了更好的实用性并且避免费时的清洁程序，该实施例中的微量过滤用以下设备进行：

[0049]

[0050] 此外，为了所述提取物的稳定加入酚。加入的酚的量为6.0-8.0mg/ml。在1000kDa过滤之后将其加入。加入后将悬液搅拌约10分钟，直到所有的酚溶解。

[0051] 每种情况下内毒素的水平都低。

[0052] 实施例7(制备液体提取物ViP-E_Matr’08_1102)

[0053] 将100g来自母菊花序的管状花在搅拌下在40℃和60℃之间的温度下，用500g80％(m/m)乙醇(相当于药物对溶剂的比例为1/5)提取2小时。然后将该制剂用纤维素滤器(AF 6 )进行深层过滤。得到385g澄清茶褐色液体提取物，固体含量4.43％(m/m)。

[0054] 实施例8(制备液体提取物ViP-E_Matr’08_1106)

[0055] 将100g来自母菊花序的管状花在搅拌下在40℃和60℃之间的温度下，用500g90％(m/m)乙醇(相当于药物对溶剂的比例为1/5)提取2小时。然后将该制剂用纤维素滤器(AF 6 )进行深层过滤。得到398g澄清茶褐色液体提取物，固体含量1.89％(m/m)。

[0056] 实施例9(制备液体提取物ViP-E_Matr’08_1105)

[0057] 将100g来自母菊花序的管状花在搅拌下在40℃和60℃之间的温度下，用500g99.9％(m/m)乙醇(相当于药物对溶剂的比例为1/5)提取2小时。然后将该制剂用纤维素滤器(AF 6 )进行深层过滤。得到412g澄清茶褐色液体提取物，固体含量1.54％(m/m)。

[0058] 以下实施例描述了实施例4、7、8和9的提取物的药学活性特征。

[0059] 实施例10(鸟氨酸脱羧酶表达的诱导)

[0060] 用实施例4制备的VIP-E_Matr’06_1003液体提取物进行鸟氨酸脱羧酶表达实验。

[0061] 为了测量鸟氨酸脱羧酶表达的诱导，将该提取物以150、100或30μg/ml的浓度添加至HepG2细胞。经如此处理的细胞在10％FBS培养基中培养6小时、24小时或48小时。

[0062] 然后通过Westernblot分析检测鸟氨酸脱羧酶量的变化。

[0063] 从图9显示的数据可明显看出，本发明的提取物以浓度依赖的方式诱导鸟氨酸脱羧酶表达。

[0064] 实施例11(对比实施例；拓扑异构酶I活性抑制)

[0065] 用实施例7制备的液体提取物ViP-E_Matr’08_1102以0.3、1、3、10或30μg/ml的提取物浓度进行拓扑异构酶I活性实验。同时用喜树碱作为阳性对照。

[0066] 为了测量拓扑异构酶I活性的抑制，将该提取物加入至纯化的人DNA拓扑异构酶I和来自TopoGEN的“Topoisomerase I DrugScreening Kit(拓扑异构酶I药物筛选试剂盒)”。由此按照生产厂商的方案进行实验。将DNA通过琼脂糖凝胶电泳分离并在用溴化乙锭染色后在UV灯下观看。用这种方法可检测到通过拓扑异构酶I产生的松弛DNA(拓扑异构体)并且其与超螺旋DNA底物明显地分离。

[0067] 从图10所示数据可明显看到，本发明的提取物仅非常弱但是以浓度依赖的方式抑制拓扑异构酶I活性。

[0068] 实施例12(拓扑异构酶II活性抑制)

[0069] 用实施例7制备的液体提取物ViP-E_Matr’08_1102、实施例8制备的液体提取物ViP-E_Matr’08_1106或者实施例9制备的液体提取物ViP-E_Matr’08_1105以0.3、1或3μg/ml的提取物浓度进行拓扑异构酶II活性实验。同时用依托泊苷作为阳性对照。

[0070] 用纯化的人DNA拓扑异构酶IIα和来自TopoGEN的“Topoisomerase II Drug Screening Kit(拓扑异构酶II药物筛选试剂盒)”测量拓扑异构酶II的抑制。由此按照生产厂商的方案进行实验。将DNA通过琼脂糖凝胶电泳分离并在溴化乙锭染色后在UV灯下观看。用这种方法可检测到通过拓扑异构酶II产生的松弛DNA(拓扑异构体)并且其与超螺旋DNA底物明显地分离。

[0071] 从图11所示数据可明显看到，本发明的所有提取物以浓度依赖的方式强烈抑制拓扑异构酶II活性。抑制的程度随着作为提取溶剂的乙醇％m/m的浓度增加(99％＞90％＞80％)而明显增加。用99％m/m乙醇制备的提取物表现出对于酶活性几乎完全的抑制-即使在低至300ng/ml的浓度。

[0072] 这种抑制比用实施例4的水性提取物得到的抑制强100倍以上。近150μg/ml对于完全抑制是必需的(数据未显示)。

[0073] 实施例13(细胞周期在S期停滞的诱导)

[0074] 用实施例4制备的液体提取物VIP-E_Matr’06_1003进行细胞周期分析实验。同时使用喜树碱作为细胞周期在S期停滞的阳性对照。

[0075] 为了测量细胞周期停滞的诱导，将该提取物以10、50、100或150μg/ml的浓度添加至HepG2细胞。将如此处理的细胞在10％FBS培养基中培养48小时。

[0076] 然后通过细胞计量术分析检测细胞在细胞周期的G1、S或G2期的细胞量的变化。

[0077] 从图12所示的数据可明显看出，本发明的提取物以低至10μg/ml的浓度在已经培养48小时后显著诱导了细胞周期在S期的停滞。

[0078] 实施例14(树脂提取物的制备)

[0079] 用类似于实施例9的方法获得的液体提取物，在减压(300至10mbar)且略微升高的温度(35℃至45℃)下使溶剂蒸发。得到6.4g茶褐色树脂提取物，且干燥物质含量＞99％(m/m)。

[0080] 发现得到的树脂提取物不含或几乎不含精油(＜0.01％m/m)。发现乙醇的含量为＜0.05％(m/m)，且发现水含量为＜0.01％(m/m)。

[0081] 实施例15(无水液体提取物的制备)

[0082] 用类似于实施例9的方法得到6.4g液体提取物，向其中加入6.4g油酸(Ph.Eur.)和19.2g Macrogol 400(Ph.Eur.)。

[0083] 在减压(300至10mbar)且略微升高的温度(35℃至45℃)下使乙醇蒸发。得到31.8g茶褐色自由流动的液体提取物，且不挥发组分的含量为＞99％(m/m)。

[0084] 据发现得到的无水液体提取物不含或几乎不含精油(＜0.01％m/m)。发现乙醇的含量为＜0.05％(m/m)，且发现水的含量为＜0.01％(m/m)。

[0085] 实施例16(无水液体提取物的制备)

[0086] 用类似于实施例14的方法得到10g树脂提取物，向其中加入10g油酸(Ph.Eur.)和20g Macrogol 400(Ph.Eur.)。

[0087] 将该混合物均化。

[0088] 如此得到的无水液体提取物具有不挥发组分的含量为＞99％(m/m)。

[0089] 实施例17

[0090] 将20g黄色管状春黄菊花(白花春黄菊(Anthemis nobilis L.))与380g水(Aqua purificata，Ph.Helv.)混合。将该混合物在20至30分钟内加热至90℃和94℃之间的温度。然后将该混合物储存于室温(22℃)直至达到30℃和35℃之间的温度。

[0091] 通过深层过滤去除药物残余物。将所得到的粗滤液通过用0.22μm膜的过滤来澄清。

[0092] 向澄清的滤液加入0.3％mygliol(Ph.Eur.)(相对于提取物质量)。将得到的混合物均化5分钟。将如此制备的提取物用0.22μm膜过滤(以切向流模式)，且回收截留物。

[0093] 将得到的渗透液用0.1μm膜过滤(以切向流模式)，且回收截留物。最后，将得到的渗透液用1000kDa膜过滤(以切向流模式)，且回收截留物。

[0094] 具有得到的309g澄清水性提取物，具有1.1％m/m的干物质含量。

[0095] 实施例18

[0096] 除了使用20g白花春黄菊的全花头部之外，使用与实施例17相同的程序。

[0097] 具有得到的295g澄清水性提取物，具有1.6％m/m的干物质含量。

[0098] 实施例19

[0099] 将40g黄色管状花(欧蓍草(Achillea millefolium L.))与760g水(Aqua purificata，Ph.Helv.)混合。将该混合物在20至30分钟内加热至90℃和94℃之间的温度。然后将该混合物储存于室温(22℃)直至达到30℃和35℃之间的温度。

[0100] 通过深层过滤去除药物残余物。将所得的粗滤液通过0.22μm膜的过滤来澄清。

[0101] 向澄清的滤液加入0.3％mygliol(Ph.Eur.)(相对于提取物质量)。将得到的混合物均化5分钟。将如此制备的提取物用0.22μm膜过滤(以切向流模式)，且回收截留物。

[0102] 将得到的渗透液用0.1μm膜过滤(以切向流模式)，且回收截留物。最后，将得到的渗透液用1000kDa膜过滤(以切向流模式)，且回收截留物。

[0103] 具有得到的667g澄清水性提取物，具有1.3％m/m的干物质含量。

[0104] 实施例20

[0105] 除了使用40g欧蓍草的全花头部之外，使用与实施例19相同的程序。

[0106] 得到634g澄清水性提取物，具有1.4％m/m的干物质含量。

[0107] 实施例21

[0108] 将20g来自白花春黄菊花序的管状花在搅拌下在40℃和60℃之间的温度，用100g99.9％(m/m)乙醇(相当于药物对溶剂的比例为1/5)提取2小时。然后将该制剂用纤维素滤器(AF 6 )进行深层过滤。得到71g澄清茶褐色液体提取物，具有1.62％(m/m)的固体含量。

[0109] 实施例22

[0110] 将40g欧蓍草花序的管状花在搅拌下在40℃和60℃之间的温度，用200g 99.9％(m/m)乙醇(相当于药物对溶剂的比例为1/5)提取2小时。然后将该制剂用纤维素滤器(AF 6 )进行深层过滤。得到153g澄清茶褐色液体提取物，具有1.62％(m/m)固体含量。

[0111] 实施例23(DNA合成(BrdU结合分析)

[0112] 体外检测实施例21的液体提取物在人肝细胞癌细胞(HepG2)中抑制DNA合成的能力。

[0113] 为了 测 试 细胞 增 生，用5-Bromo-2′ -deoxy-uridine(BrdU)Labelingand Detection Kit III(5-溴-2′-脱氧-尿苷(BrdU)标记及检测试剂盒III)(Roche Applied Science；Mannheim，Germany)量化新合成的DNA。BrdU为胸腺嘧啶核苷类似物，它会结合至新的细胞DNA中。[参见：Gratzner，H.G.(1982)Science 218，474-475]。

[0114] 简而言之，人肝细胞癌细胞(HepG2)通过胰酶消化收集并以10,000个细胞/孔在96孔微量培养板中接种。在37℃及5％CO2中预培养24小时后，将这些细胞用实施例21的液体提取物以如下浓度处理30小时：0、1、3、10和100μg/ml。

[0115] 然后将10μl BrdU(100μM)加至这些细胞并再培养18小时。培养后，将细胞用培养基洗3次以便在用乙醇固定之前去除过量的BrdU。用过氧化物酶(POD)标记的抗BrdU抗体培养之前，用核酸酶将DNA部分消化以使该抗体能接近所结合的BrdU。洗去过量的抗体之后，加入POD底物ABTS。POD催化ABTS裂解，产生有色反应产物。用Safire多功能微板读数仪(multifunctional microplate reader)(Tecan， Switzerland)在405nm处(参考波长为490nm)测量反应产物的吸光度。将测量的每孔吸光度直接与结合至细胞DNA的BrdU水平相关联。

[0116] 样品点的测量重复三次；误差以标准差表示(数据未显示)。

[0117] 样品的数据以溶剂对照值的百分比表示，并且使用GraphPadSoftware Inc(Prism，version 5，San Diego，CA.USA)计算IC50值。

[0118] 结果

[0119] 结果表明实施例21的液体提取物具有大约7μg/ml(6.228至7.881μg/ml)的IC50值。因此，所述液体提取物以剂量依赖的方式抑制人肝细胞癌细胞(HepG2)的生长。

[0120] 本发明的组合物可通过本领域技术人员已知的方法配制。应使用药学可接受的组分。

[0121] 优选通过静脉内或更优选通过肌内注射给药。

[0122] 包含活性成分的药学组合物还可以为适合经口使用的形式。

[0123] 治疗用途包括治疗(并且也可能预防)癌症，例如肺癌、肝癌和胰腺癌。其他的用途包括体表病症(例如牛皮癣、硬皮病和天疱疮)，传染性支气管炎，包括肉瘤(例如卡波西肉瘤)、白血病、皮肤癌和癌(carcinomas)(其治疗在下文详细描述)的癌症(cancer)以及艾滋病。一般地说，该组合物可用于治疗增生和病毒病症，特别是与DNA或RNA病毒相关的病症。对RNA病毒的作用可为直接的，而对于DNA病毒和癌症的作用至少可为进行性的。该药剂还可用于治疗其他遗传病例如运动神经元病和多发性硬化。

[0124] 该药剂还可用于治疗其他病毒病症。例如，该病毒可为冠状病毒，如在SARS(严重急性呼吸道综合征(severe acute respiratory syndrome))的情况。此外，该药剂可在兽医学(例如在禽类疾病例如新城疫病和禽痘中)方面具有效用。

[0125] 以下的研究解释了用实施例4的提取物得到的本发明的其他方面。

[0126] 以下部分给出附图简述：

[0127] 图1涉及系统4并显示实施例4的提取物对于HepG2细胞中DNA合成(A)、RNA合成(B)和蛋白生物合成(C)的作用。使用的提取物浓度为150、500和1660μg/ml。

[0128] 图2类似于图1，但使用的提取物浓度为10、50、100和150μg/ml。

[0129] 图3涉及系统4并显示实施例4的提取物对于RNA合成(A)和蛋白生物合成(B)的作用，考虑到图2(A)显示的结果进行计算。

[0130] 图4涉及系统4并显示实施例4的提取物对于HT1376细胞中DNA合成(A)、RNA合成(B)和蛋白生物合成(C)的作用。使用的提取物浓度为150、500和1660μg/ml。

[0131] 图5涉及系统4并显示实施例4的提取物对于C33-A细胞中DNA合成(A)、RNA合成(B)和蛋白生物合成(C)的作用。使用的提取物浓度为150、500和1660μg/ml。

[0132] 图6涉及系统5并显示实施例4的提取物24小时后对于HepG2细胞中凋亡诱导的作用。使用的提取物浓度为10、50、100、150和300μg/ml。

[0133] 图7涉及系统5并显示实施例4的提取物24小时后对于HepG2细胞中细胞毒性(膜完整性)的作用。使用的提取物浓度为10、50、100、150和300μg/ml。

[0134] 图8涉及系统5并显示实施例4的提取物48小时后对于HepG2细胞中凋亡诱导的作用。使用的提取物浓度为10、50、100、150和300μg/ml。

[0135] 图9涉及实施例10并显示实施例4的提取物6、24和48小时后对于HepG2细胞中鸟氨酸脱羧酶表达诱导的作用。使用的提取物浓度为30、100和150μg/ml。

[0136] 图10涉及实施例11并显示实施例7的提取物对于无细胞分析中拓扑异构酶I抑制的作用。使用的提取物浓度为0.3、1、3、10和30μg/ml。使用喜树碱作为阳性对照。

[0137] 图11涉及实施例12并显示实施例7、8和9的提取物对于无细胞分析中拓扑异构酶II抑制的作用。使用的提取物浓度为0.3、1和3μg/ml。使用依托泊苷作为阳性对照。

[0138] 图12涉及实施例13并显示实施例4的提取物对于HepG2细胞中S期的细胞周期停滞的诱导作用。使用的提取物浓度为10、50、100和150μg/ml。使用喜树碱作为阳性对照。

[0139] 图13涉及实施例12并显示实施例7的提取物对于无细胞分析中拓扑异构酶II抑制的作用。使用的提取物浓度为0.3、1、3、10和30μg/ml。使用依托泊苷作为阳性对照。出于比较的原因使用0.3、3和30μg/ml的α-没药醇或0.3、3和30ug/ml的母菊精油。

[0140] 1)研究目标

[0141] 系统4：RNA、DNA和蛋白生物合成

[0142] 体外检测了使用三种不同的细胞系(HepG2：肝癌细胞；C33-A：子宫颈癌细胞和HT1376：膀胱癌细胞)的实施例4的提取物对于RNA、DNA和蛋白生物合成的影响。

[0143] 系统5：凋亡和膜完整性

[0144] 此外实施例4的提取物对于凋亡诱导的影响用HepG2细胞测试。同时实施例4的提取物的细胞毒性(膜完整性)用HepG2细胞检测。

[0145] 2)材料和方法

[0146] 2.1)样品和样品制备

[0147]

[0148] VIP-E_Matr’06_1003按照实施例4制备。

[0149] 2.2)分析条件

[0150]

[0151]

[0152] 2.3)分析

[0153] 2.3.3)RNA/DNA合成

[0154] 对于RNA和DNA合成，试验细胞(HepG2：肝细胞癌，人；C33-A：子宫颈癌，人和HT1376：膀胱癌，人)通过胰酶消化收集并以10,000个细胞/孔在96孔板中接种。在用该样品以要求的浓度处理细胞之后将该板在37℃和5％CO2中培养2小时。在另外培养243
小时的时间内将细胞用5-H-尿苷(1μCi/ml)(Perkin Elmer)进行脉冲(pulse)用于RNA
3
合成，并用6-H-胸腺嘧啶核苷(1μCi/ml)(Perkin Elmer)进行脉冲用于DNA合成。将细胞用PBS洗涤并用甲醇两次固定5分钟。用0.3N TCA沉淀蛋白质。在洗涤步骤之后加入
150μl 0，3N NaOH15分钟以裂解细胞。用不含细胞的样品作为阴性对照t(0)。

[0155] 为了测定结合的用于RNA合成的5-3H-尿苷和用于DNA合成的6-3H-胸腺嘧啶核苷，将该样品转移至含有闪烁混合物(cocktail)的闪烁管中。用Tri-Carb 1900TR液体闪烁计数器(Packard，USA)进行量化。

[0156] 通过在该分析条件下测量放射标记的量(dpm)对几种浓度样品的效果进行测量。剂量相关的值以阳性对照值的百分比表示。样品点的测量重复两次，以与平均值的差来表示误差。

[0157] 考虑DNA合成分析的结果，对特定细胞的5-3H-尿苷结合率(％)进行计算。用对应的合成值(％)除以DNA合成系数。

[0158] 2.3.4)蛋白生物合成

[0159] 对于蛋白生物合成，试验细胞(HepG2：肝细胞癌，人；C33-A：子宫颈癌，人和HT1376：膀胱癌，人)通过胰酶消化收集并以10,000个细胞/孔在96孔板中接种。在用该样品以要求的浓度处理细胞之后将该培养板在37℃和5％CO2中培养2小时。在另外243
小时的培养时间内将细胞用L-[3，4，5-H(N)]-亮氨酸(1μCi/ml)(Perkin Elmer)进行脉冲。将细胞用PBS洗两次，用RIPA-缓冲液裂解，并在冰上培养15分钟。将该裂解液转移至管中，加入250μl冰冷的TCA(20％)并且将样品在冰上再培养15分钟。以10,000×g在4℃离心20分钟后将上清液去除，并将沉淀用250μl TCA(5％)重悬并再次离心。将每种样品得到的裂解液重悬于250μl NaOH(0，2N)中并于50℃加热2分钟。用不含细胞的样品作为阴性对照t(0)。

[0160] 为了测定结合的L-[3，4，5-3H(N)]-亮氨酸，将该样品转移至含有闪烁混合物的闪烁管中。用Tri-Carb 1900TR液体闪烁计数器(Packard，USA)进行量化。

[0161] 通过在该分析条件下测量放射标记的量(dpm)对几种浓度样品的效果进行测量。剂量相关的值以阳性对照值的百分比表示。样品点的测量重复四次，误差以标准差表示。

[0162] 考虑DNA合成分析的结果，对特定细胞的L-[3，4，5-3H(N)]-亮氨酸结合率(％)进行计算。用对应的合成值(％)除以增生系数。

[0163] 2.3.5)凋亡分析

[0164] HepG2细胞(肝细胞癌，人)通过胰酶消化收集并以100μl中10,000个细胞/孔在96孔板中接种。24h后加入20μl样品和80μl新鲜培养基(总体积200μl)。将该板再培养24小时并且在附加实验中培养48小时。以200×g将该板离心10分钟之后，弃上清液并且将沉淀于室温在200μl裂解缓冲液中裂解30分钟。最后将裂解液以200×g离心10分钟。用溶剂代替样品作为溶剂对照(＝阴性对照)。接种和培养在培养箱中在37℃和5％CO2中进行。

[0165] 使用Cell Death Detection ELISAplus Kit(细胞死亡检测ELISAplus试剂盒)(Roche，Cat-No：11774425001)按照供应商的介绍体外测量裂解液上清液中的细胞质组蛋白相关的DNA片段(单核小体和寡核小体)。

[0166] 用微量培养板读数设备(TECAN Infinite M200)在波长λ＝405nm和参考波长λ＝490nm时测量吸光度。释放至细胞质中的单核小体和寡核小体的特定富集系数按照如下方式计算：

[0167] 富集系数＝样品吸光度/对应的阴性对照吸光度

[0168] 样品点的测量重复两次，以与平均值的差表示误差。

[0169] 2.3.6)LDH-细胞毒性分析(坏死诱导)

[0170] LDH-细胞毒性分析(膜完整性/坏死诱导)：用HepG2细胞(肝细胞癌，人)测试细胞毒性。将细胞以10,000个细胞每孔接种至96孔板过夜。加入20μl指定浓度的相应样品和溶剂对照和80μl新鲜培养基(总体积200μl)。接种和培养在培养箱中在37℃和5％CO2中进行。24小时的培养时间之后，用LDH-cytotoxicity Assay Kit(LDH-细胞毒性分析试剂盒)(BioVision，#K311-400，CA USA)测量膜完整性。

[0171] 细胞的膜完整性通过测量在样品的影响下释放至培养基中的胞质乳酸脱氢酶(LDH)的活性来测定。此种酶的活性通过测定四唑鎓盐INT作为底物产生的甲(formazan)来测量。甲 的量通过用培养板读数仪(TECAN Infinite M200)在波长λ＝490nm测定光密度(OD)来直接测量。

[0172] 对于每次测试浓度，将背景(含有样品但不含细胞的分析混合物)的OD值从含有细胞的OD测量值中减去。以100％的细胞毒性读数对应于用溶剂裂解(triton X-100)细胞的测量值，且0％的细胞毒性读数对应于仅用溶剂培养细胞的测量值，以此将OD490值转换成百分比值。光学测试重复进行两次。以与平均值的差表示误差。

[0173] 4)总结

[0174] 关于DNA、RNA和蛋白生物合成，实施例4的提取物显示出如下效果：DNA合成被剂量依赖抑制，而高至相当高的剂量时RNA合成仍未受影响并且蛋白生物合成仅受少量影响或者(如果适合于增生细胞的量)甚至会增加(图3)。这种效果在非细胞毒性剂量范围内对于所有三种细胞系是明显的且可被解释成细胞停滞和可能的分化的标志。所有测试的癌细胞，HepG2肝癌、HT1376膀胱癌和C33A子宫颈癌都表现出这种现象。

[0175] 在随后开始的将HepG2细胞用于区别凋亡和坏死(由LDH渗漏和细胞膜完整性损失指示)的实验中，在24小时后我们未检测到凋亡的诱导-即使用最高测试剂量。实施例4的提取物对凋亡和细胞毒性均未显示出任何效果。

[0176] 因此决定进行细胞培养48小时的附加实验。有趣的是，48小时后仍未发现凋亡诱导。

[0177] 从图13明显看出，实施例7的提取物显示出从3μg/ml浓度开始完全抑制拓扑异构酶II活性。在3μg/ml浓度以下未检测到抑制。

[0178] α-没药醇(母菊属植物精油的一种主要组分)在所有测试浓度未影响拓扑异构酶II活性。

[0179] 母菊的精油几乎没有抑制拓扑异构酶H活性。仅观察到在30μg/ml的相对高浓度有不完全抑制。

[0180] 出于本发明的目的，术语“包括”或“包含”应指也可能存在其他化合物或组分，而术语“组成”应指除了那些明确提到的之外不存在其他化合物或组分。

[0181] 5)参考文献

[0182] 1Toshie H.，Noriko N.M.，Yoshiyuki A.，Mittsuhiro N.，Toshiro Y.，Naohito O.Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor(GM-CSF)Regulates Cytokine Induction by 1，3-β-D-Glucan SCG inDBA/2Mice in vitro(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)在体外调节DBA/2小鼠1，3-β-D-葡聚糖SCG的细胞因子诱导).J.ofIFNand Cytokine Research 24：478-489(2004)。

[0183] 2Golenbock D.T.，Hampton R.Y.，Qureshi N.，Takayama K.，RaetzC.R.H.(1991)Lipid A-like molecules that antagonize the effect ofendotoxins on human monocytes(拮抗内毒素对人单核细胞的作用的脂质A样分子).J.Biol.Chem.266(29)：19490-498。

[0184] 3Garrelds I.M.，van Hal P.Th.W.，Haakmat R.C.，Hoogsteden H.C.，Saxena P.R.，Zijlstra F.J.：Time dependent production of cytokinesand eicosanoides by human monocytic leukaemia U937 cells；effects ofglucocorticosteroids(人单核细胞白血病U937细胞时间依赖性地产生细胞因子和eicosanoide；糖皮质激素的作用).Mediators of Inflammation：8，229-235(1999)。

[0185] 4Lindl T.(2000)Zell-und Gewebekultur：Einführung in dieGrundlagen sowie Methoden und Anwendungen.4.überarb.und erw.Auflage-Heidelberg；Berlin：Spectrum，Akad.Verlag(ISBN3-8274-0803-2)[0186] 5Decker T.&Lohmann-Matthes M.L.(1988)A quick and simplemethodfor the quantification of lactate dehydrogenase release inmeasurements of cellular cytotoxicity and tumor necrosis factoractivity(在细胞毒性和肿瘤坏死因子活性的测定中量化乳酸脱氢酶释放的快速且简单的方法).J.Immunol Methods 15(1)：61-69。