用于引发免疫应答的组合物，方法及试剂盒转让专利
申请号 : CN200980128872.3
文献号 : CN102123732A
文献日 : 2011-07-13
发明人 : J·H·桑普森 , D·A·米切尔
申请人 : 杜克大学
摘要 :
本发明涉及用于引发针对由癌细胞表达的至少一种CMV抗原的免疫应答，尤其是用于治疗及预防癌的组合物，方法，及试剂盒。也提供CMV确定方法，组合物，及试剂盒。
权利要求 :
1.在受试者中引发针对表达巨细胞病毒(CMV)抗原的细胞的免疫应答的方法，所述方法包括：给所述受试者施用药学可接受的组合物，所述药学可接受的组合物包括：●至少一种CMV抗原，或
●编码所述至少一种CMV抗原的核酸，
其中所述药学可接受的组合物在施用于受试者时引发针对所述细胞的免疫应答。
2.权利要求1的方法，其中所述细胞特征在于是癌前细胞，癌细胞，或易感于发展与CMV相关的癌的细胞-类型。
3.权利要求1的方法，其中所述药学可接受的组合物以足以预防或治疗所述受试者中与CMV相关的癌的预防或治疗有效量提供。
4.权利要求1的方法，其中所述至少一种CMV抗原对应于选自下列的多肽，或其免疫原性片段：壳体多肽，体被多肽，及包膜多肽。
5.权利要求1的方法，其中所述至少一种CMV抗原对应于选自下列的多肽，或其免疫原性片段：磷蛋白独特长83(ppUL83；a/k/app65)，糖蛋白UL55(gpUL55；a/k/a gB)，UL123立即早期1(IE1)蛋白，UL122 IE2蛋白，UL111A(a/k/a mtrII)，US28，ppUL32，ppUL65，ppUL80a，ppUL82，ppUL98a，ppUL99，gpUL4(a/k/a gp48)，gpUL16，gpUL18(a/k/a MHC)，gpUL75(a/k/a gH)，gpUL100，gpUL110(a/k/a gM)，gpUL115(a/k/a gL)，pUL46，pUL48，pUL56，pUL86(a/k/a MCP)，糖蛋白独特短10(gpUS10)，gpUS11，糖蛋白复合物II(gcII)，gp65，及gp93。
6.权利要求1的方法，其中所述编码所述至少一种CMV抗原的核酸是RNA。
7.权利要求1的方法，其中所述编码所述至少一种CMV抗原的核酸是cDNA。
8.权利要求1的方法，其中所述至少一种CMV抗原是全CMV抗原，全灭活的CMV病毒，或其级分。
9.权利要求1的方法，其中所述药学可接受的组合物还包括至少一种佐剂，或编码所述佐剂的核酸。
10.权利要求9的方法，其中所述佐剂是选自下列的细胞因子：GM-CSF，G-CSF，IL-2，IL-4，IL-7，IL-12，IL-15，IL-21，TNF-a，及M-CSF。
11.权利要求9的方法，其中所述佐剂包括弗氏不完全佐剂(Montanide ISA 51)或粒状棒状杆菌P40。
12.药学可接受的组合物，其包括至少一种CMV抗原，或编码所述至少一种CMV抗原的核酸，其中所述药学可接受的组合物在施用于受试者时引发针对表达CMV抗原的细胞的免疫应答。
13.权利要求12的药学可接受的组合物，其还包括：生理学可接受的载质，稀释剂，或赋形剂。
14.权利要求12的药学可接受的组合物，其还包括佐剂。
15.权利要求14的药学可接受的组合物，其中所述佐剂是细胞因子。
16.权利要求14的药学可接受的组合物，其中所述佐剂是选自下列的细胞因子：GM-CSF，G-CSF，IL-2，IL-4，IL-7，IL-12，IL-15，IL-21，TNF-a，及M-CSF。
17.权利要求14的药学可接受的组合物，其中所述佐剂包括弗氏不完全佐剂(Montanide ISA 51)或粒状棒状杆菌P40。
18.预防或治疗有效量的权利要求12～17中任一项的药学可接受的组合物。
19.在受试者中引发针对表达CMV抗原的细胞的免疫应答的方法，所述方法包括：给受试者施用组合物，所述组合物包括：有效量的抗原呈递细胞，T-淋巴细胞，或两者，其中所述抗原呈递细胞及T淋巴细胞已用致敏-有效量的至少一种CMV抗原体外致敏，其中所述有效量的抗原呈递细胞，T淋巴细胞，或两者足以引发针对所述表达CMV抗原的细胞的免疫应答。
20.权利要求19的方法，其中所述细胞特征在于是癌前细胞，癌细胞，或易感于发展与CMV相关的癌的细胞-类型。
21.权利要求19的方法，其中所述抗原呈递细胞或T淋巴细胞是自体的。
22.制备抗原呈递细胞的方法，所述方法包括：
在对于至少一种CMV抗原被所述抗原呈递细胞呈递而言足够的条件下，使抗原呈递细胞与至少一种CMV抗原或编码所述至少一种CMV抗原的核酸体外接触，其中所述抗原呈递细胞呈递至少一种CMV抗原。
23.组合物，其包括在对于至少一种CMV抗原被抗原呈递细胞呈递而言足够的条件下，与至少一种CMV抗原或编码所述至少一种CMV抗原的核酸体外接触的抗原呈递细胞。
24.制备淋巴细胞的方法，所述方法包括：
(a)在对于至少一种CMV抗原被抗原呈递细胞呈递而言足够的条件下，使抗原呈递细胞与至少一种CMV抗原或编码所述至少一种CMV抗原的核酸体外接触；及(b)在足以产生淋巴细胞的条件下使所述淋巴细胞与步骤(a)的抗原呈递细胞接触，其中所述淋巴细胞能引发针对表达CMV抗原的细胞的免疫应答。
25.权利要求24的方法，其中所述细胞特征在于是癌前细胞，癌细胞，或易感于发展与CMV相关的癌的细胞-类型。
26.权利要求24的方法，其中所述淋巴细胞是T淋巴细胞。
27.组合物，其包括T淋巴细胞，所述T淋巴细胞在足以产生能引发针对表达CMV抗原的细胞的免疫应答的T淋巴细胞的条件下与抗原呈递细胞接触，其中所述抗原呈递细胞已在对于至少一种CMV抗原被所述抗原呈递细胞呈递而言足够的条件下与至少一种CMV抗原或编码所述至少一种CMV抗原的核酸体外接触。
28.权利要求27的组合物，其中所述细胞特征在于是癌前细胞，癌细胞，或易感于发展与CMV相关的癌的细胞-类型。
29.用于治疗或降低受试者中癌的严重性的方法，所述方法包括：给受试者施用治疗或预防有效量的权利要求23或28的组合物。
30.在受试者中引发针对表达CMV抗原的细胞的免疫应答的方法，所述方法包括：给所述受试者施用药学可接受的组合物，所述药学可接受的组合物包括用至少一种CMV抗原或编码所述至少一种CMV抗原的核酸离体装载的树突细胞，其中所述药学可接受的组合物在施用于受试者时引发针对所述表达CMV抗原的细胞的免疫应答。
31.权利要求30的方法，其中所述细胞特征在于是癌前细胞，癌细胞，或易感于发展与CMV相关的癌的细胞-类型。
32.处理表达CMV抗原的细胞的方法，所述方法包括：给受试者施用治疗或预防有效量的药学可接受的组合物，以降低或抑制所述受试者中所述细胞的生长或扩展，其中所述组合物包括：(a)至少一种CMV抗原或编码所述至少一种CMV抗原的多核苷酸；
(b)抗-CMV抗体；
(c)呈递至少一种CMV抗原的抗原呈递细胞，针对所述CMV抗原激发的淋巴细胞，或两者；或(d)它们的组合。
33.权利要求32的方法，其中所述细胞特征在于是癌前细胞，癌细胞，或易感于发展与CMV相关的癌的细胞-类型。
34.在受试者中引发针对表达CMV抗原的细胞的免疫应答的方法，所述方法包括：给受试者施用组合物，所述组合物包括：有效量的抗原呈递细胞，淋巴细胞，或两者，其中所述抗原呈递细胞及淋巴细胞已用致敏-有效量的至少一种CMV抗原体外致敏，其中所述有效量的抗原呈递细胞，淋巴细胞，或两者足以引发针对所述表达CMV抗原的细胞的免疫应答。
35.权利要求34的方法，其中所述细胞特征在于是癌前细胞，癌细胞，或易感于发展与CMV相关的癌的细胞-类型。
36.权利要求34的方法，其中所述抗原呈递细胞，淋巴细胞或两者是自体的。
37.处理表达CMV抗原的细胞的方法，所述方法包括：给受试者施用组合物，所述组合物包括：有效量的抗原呈递细胞，淋巴细胞，或两者，其中所述抗原呈递细胞已在对于至少一种CMV抗原被抗原呈递细胞呈递而言足够的条件下与至少一种CMV抗原或编码所述至少一种CMV抗原的核酸体外接触，其中所述淋巴细胞已与呈递至少一种CMV抗原的抗原呈递细胞接触。
38.权利要求37的方法，其中所述细胞特征在于是癌前细胞，癌细胞，或易感于发展与CMV相关的癌的细胞-类型。
39.权利要求37的方法，其中所述淋巴细胞是T淋巴细胞。
40.在受试者中引发针对表达CMV抗原的细胞的免疫应答的方法，所述方法包括：给所述受试者施用药学可接受的组合物，所述药学可接受的组合物包括抗-CMV抗体。
41.权利要求40的方法，其中所述细胞特征在于是癌前细胞，癌细胞，或易感于发展与CMV相关的癌的细胞-类型。
42.权利要求40的方法，其中所述抗体缀合到毒性部分，其中所述抗体将细胞毒性剂量的所述毒性部分有效递送到所述细胞。
43.权利要求40的方法，其中所述毒性部分是放射性同位素，其中所述抗体将所述细胞毒性剂量作为粒子辐射有效递送到所述细胞。
44.试剂盒，其包括药学可接受的组合物，所述药学可接受的组合物包括：至少一种CMV抗原或编码所述至少一种CMV抗原的核酸，其中所述药学可接受的组合物在施用于受试者时引发针对表达CMV抗原的细胞的免疫应答。
45.权利要求44的试剂盒，其还包括佐剂。
46.权利要求44的试剂盒，其还包括化学治疗剂。
47.权利要求1，19，30，32，34，37，40中任一项的方法，还包括扩增来自受试者的生物样品的核酸分子，以获得扩增子，其中所述扩增包括使核酸分子与至少一对包括第一引物及第二引物的引物接触，其中所述扩增子长度约为1000个碱基对(bp)或以下。
48.权利要求47的方法，其中所述扩增子长度为200个碱基对(bp)或以下。
49.权利要求47的方法，其中所述扩增步骤还包括提供包括可检测的标记物的核酸探针。
50.所述权利要求49的方法，
其中所述第一引物包括如SEQ ID NO：67中所示的第一引物序列，其中所述第二引物包括如SEQ ID NO：68中所示的第二引物序列，其中所述探针具有如SEQ ID NO：69中所示的探针序列。
说明书 :
用于引发免疫应答的组合物，方法及试剂盒
[0001] 【相关申请的交叉引用】
[0002] 本申请根据35USC§119要求提交于2008年6月20日的美国临时申请No.61/074,582的优先权，将其通过引用整体并入本文。
[0003] 【政府权益】
[0004] 美国政府通过来自国家健康学会，国家癌学会，及国家神经性障碍及中风学会的资金具有本申请中的某些权利(脑癌中的NINDS孢子P50-CA1-0876；恶性神经胶质瘤的NCI树突细胞免疫治疗R01 CA97222)。【技术领域】
[0005] 本发明涉及用于引发针对表达巨细胞病毒(CMV)抗原的细胞的免疫应答的组合物，方法，及试剂盒。本发明也涉及用于确定CMV的方法，组合物，及试剂盒。【背景技术】
[0006] 用于治疗癌的方法包括使用化学治疗剂，放射治疗，及手术。许多肿瘤抗原的鉴定导致旨在开发基于细胞的治疗。一些方法依赖于首先鉴定肿瘤抗原，即，相对于非-肿瘤细胞，优先在肿瘤细胞中表达的多肽。例如，几种人肿瘤抗原已从黑色素瘤患者分离，及鉴定的及表征。
[0007] CMV是β-疱疹病毒。人巨细胞病毒(HCMV)在人群中是地方性的，及已报道，除了在免疫妥协的宿主中之外，该病毒通常不导致临床疾病。一些人疱疹病毒已牵涉许多人恶性肿瘤，包括淋巴瘤，鼻咽癌，子宫颈癌，及卡波西肉瘤。最近，已报道在一些肿瘤中出现完整病毒的HCMV抗原表达及检测。
[0008] 尽管攻击性多科性治疗包括手术，辐射，及化学治疗，患癌的患者的预后仍相对差。而且，常规治疗对癌的非特异性性质常导致周围的正常及全身组织无能力损坏。因此，有开发靶向癌细胞的有效诊断以及治疗及预防策略的需求。
[0009] 【发明概述】
[0010] 一方面，本发明提供在受试者中引发针对表达巨细胞病毒(CMV)抗原的细胞的免疫应答的方法。所述方法包括：给所述受试者施用药学可接受的组合物，所述药学可接受的组合物包括至少一种CMV抗原，或编码所述至少一种CMV抗原的核酸，其中所述药学可接受的组合物在施用于受试者时引发针对所述细胞的免疫应答。
[0011] 另一方面，本发明提供药学可接受的组合物，所述药学可接受的组合物包括：至少一种CMV抗原，或编码所述至少一种CMV抗原的核酸，其中所述药学可接受的组合物在施用于受试者时引发针对表达CMV抗原的细胞的免疫应答。
[0012] 一些方面，本发明提供预防或治疗有效量的药学可接受的组合物，其中所述药学可接受的组合物包括：至少一种CMV抗原，或编码所述至少一种CMV抗原的核酸，其中所述药学可接受的组合物在施用于受试者时引发针对表达CMV抗原的细胞的免疫应答。
[0013] 其他方面，本发明提供在受试者中引发针对表达CMV抗原的细胞的免疫应答的方法，所述方法包括：
[0014] 给受试者施用组合物，所述组合物包括：有效量的抗原呈递细胞，T-淋巴细胞，或两者，其中所述抗原呈递细胞及T淋巴细胞已用致敏-有效量的至少一种CMV抗原体外致敏，其中所述有效量的抗原呈递细胞，T淋巴细胞，或两者足以引发针对所述表达CMV抗原的细胞的免疫应答。
[0015] 一方面，本发明提供制备抗原呈递细胞的方法，所述方法包括：在对于至少一种CMV抗原被抗原呈递细胞呈递而言足够的条件下，使抗原呈递细胞与至少一种CMV抗原或编码所述至少一种CMV抗原的核酸体外接触，其中所述抗原呈递细胞呈递至少一种CMV抗原。
[0016] 再一方面，本发明提供组合物，所述组合物包括在对于至少一种CMV抗原被抗原呈递细胞呈递而言足够的条件下，与至少一种CMV抗原或编码所述至少一种CMV抗原的核酸体外接触的抗原呈递细胞。
[0017] 一些方面，本发明提供制备淋巴细胞的方法，所述方法包括：
[0018] (a)在对于至少一种CMV抗原被抗原呈递细胞呈递而言足够的条件下，使抗原呈递细胞与至少一种CMV抗原或编码所述至少一种CMV抗原的核酸体外接触；及
[0019] (b)在足以产生淋巴细胞的条件下使所述淋巴细胞与步骤(a)的抗原呈递细胞接触，其中所述淋巴细胞能引发针对表达CMV抗原的细胞的免疫应答。
[0020] 其他方面，本发明提供组合物，所述组合物包括：在足以产生能引发针对表达CMV抗原的细胞的免疫应答的T淋巴细胞的条件下与抗原呈递细胞接触的T淋巴细胞，其中所述抗原呈递细胞已在对于至少一种CMV抗原被所述抗原呈递细胞呈递而言足够的条件下与至少一种CMV抗原或编码所述至少一种CMV抗原的核酸体外接触。
[0021] 一方面，本发明提供用于治疗或降低受试者中癌的严重性的方法。所述方法包括：给受试者施用治疗或预防有效量的组合物，所述组合物包括在足以产生能引发针对表达CMV抗原的细胞的免疫应答的T淋巴细胞的条件下与抗原呈递细胞接触的T淋巴细胞，其中所述抗原呈递细胞已在对于至少一种CMV抗原被所述抗原呈递细胞呈递而言足够的条件下与至少一种CMV抗原或编码所述至少一种CMV抗原的核酸体外接触。
[0022] 另一方面，本发明提供在受试者中引发针对表达CMV抗原的细胞的免疫应答的方法。所述方法包括：
[0023] 给所述受试者施用药学可接受的组合物，所述药学可接受的组合物包括用至少一种CMV抗原或编码所述至少一种CMV抗原的核酸离体装载的树突细胞，其中所述药学可接受的组合物在施用于受试者时引发针对所述表达CMV抗原的细胞的免疫应答。
[0024] 一些方面，本发明提供处理表达CMV抗原的细胞的方法，所述方法包括：给受试者施用治疗或预防有效量的药学可接受的组合物，以降低或抑制所述受试者中所述细胞的生长或扩展，其中所述组合物包括：
[0025] (a)至少一种CMV抗原或编码所述至少一种CMV抗原的多核苷酸；
[0026] (b)抗-CMV抗体；
[0027] (c)呈递至少一种CMV抗原的抗原呈递细胞，针对所述CMV抗原激发的淋巴细胞，或两者；或
[0028] (d)它们的组合。
[0029] 其他方面，本发明提供在受试者中引发针对表达CMV抗原的细胞的免疫应答的方法，所述方法包括：
[0030] 给受试者施用组合物，所述组合物包括：有效量的抗原呈递细胞，淋巴细胞，或两者，其中所述抗原呈递细胞及淋巴细胞已用致敏-有效量的至少一种CMV抗原体外致敏，其中所述有效量的抗原呈递细胞，淋巴细胞，或两者足以引发针对所述表达CMV抗原的细胞的免疫应答。
[0031] 一方面，本发明提供处理表达CMV抗原的细胞的方法，所述方法包括：给受试者施用组合物，所述组合物包括：有效量的抗原呈递细胞，淋巴细胞，或两者，其中所述抗原呈递细胞已在对于至少一种CMV抗原被抗原呈递细胞呈递而言足够的条件下与至少一种CMV抗原或编码所述至少一种CMV抗原的核酸体外接触，其中所述淋巴细胞已与呈递至少一种CMV抗原的抗原呈递细胞接触。
[0032] 另一方面，本发明提供在受试者中引发针对表达CMV抗原的细胞的免疫应答的方法，所述方法包括：
[0033] 给所述受试者施用药学可接受的组合物，所述药学可接受的组合物包括抗-CMV抗体。
[0034] 在各其他方面，本发明提供在受试者中确定CMV核酸(优选血或其他生物流体中的CMV DNA)(例如从自受试者获得的血样品中确定亚临床的病毒血症)的组合物及方法。因此，所述组合物及方法提供弥补各种诊断性和/或治疗性过程的诊断，监控，及预后测试/测定，及包括本文所述的方法的治疗，例如，预防性和/或治疗性处理与癌前细胞，癌细胞，或易感于发展与CMV相关的癌的细胞-类型相关的疾病或病情。
[0035] 其他方面，本发明提供试剂盒，所述试剂盒包括药学可接受的组合物，所述药学可接受的组合物包括至少一种CMV抗原，或编码所述至少一种CMV抗原的核酸，其中所述药学可接受的组合物在施用于受试者时引发针对表达CMV抗原的细胞的免疫应答。【附图说明】
[0036] 图1显示：(A)人巨细胞病毒(HCMV)蛋白的免疫组织化学检测：(a)阴性对照(无第一抗体；物镜×10)；(b)抗平滑肌肌动蛋白(小鼠IgG2a mAb；×10)；(c)用抗-HCMV IE1染色的成胶质细胞瘤多形性(GBM)样本1(小鼠IgG2a mAb，×10)；(d)更高放大倍率的抗-IE1染色显示阳性肿瘤细胞及内皮细胞，但阴性淋巴细胞及血管内膜(×20)；(e)用抗-HCMV IE1染色的GBM样本2显示血管周肿瘤细胞染色，但坏死区内缺失检测(×10)；(f)用抗-IE1mAb染色的血管周肿瘤细胞(×20)；(g及h)用抗-HCMV pp65mAb染色的GBM样本3显示贯穿GBM样本的肿瘤细胞散布的细胞核及核周染色(×10及×20，分别)；(i及j)用抗平滑肌肌动蛋白mAb染色的感染CMV的肺(×10)；(k)用抗-HCMV IE1染色的感染CMV的肺(×20)；(l)用抗-HCMV pp65mAb染色的感染CMV的肺(×20)；及(B)匹配的GBM及正常脑中的HCMV检测。染色自含正常脑及肿瘤区的2个GBM样本的代表性的组织化学切片用于使用同种型对照抗体(患者1，左栏)，或抗-HCMV pp65(患者1肿瘤，中栏；患者
2，右栏)检测。贯穿肿瘤涉及区观察到针对HCMVpp65抗体的反应性病灶区，但正常脑缺乏针对HCMV-特异性抗体的免疫反应性(IE1染色呈现与肿瘤中IE1的更普遍检测相同的发现，未显示)。以×40物镜放大倍率获取全部照片。
2，右栏)检测。贯穿肿瘤涉及区观察到针对HCMVpp65抗体的反应性病灶区，但正常脑缺乏针对HCMV-特异性抗体的免疫反应性(IE1染色呈现与肿瘤中IE1的更普遍检测相同的发现，未显示)。以×40物镜放大倍率获取全部照片。
[0037] 图2显示恶性神经胶质瘤样本中HCMV的聚合酶链式反应(PCR)检测。泳道1：100bp阶梯，泳道2-E：MG样本；泳道4：MG样品4+100bp阶梯；泳道F：阴性对照(无DNA模板)。
[0038] 图3显示对于CMV血清阳性及血清阴性的受试者中从有或无自体淋巴细胞转移(ALT)的治疗性TMZ-诱导的淋巴细胞减少恢复期间，对于患新-诊断的GBMs的受试者使用CMV pp65-LAMP RNA-装载的DCs疫苗接种流程的示意图。
[0039] 图4是显示对于用CMV pp65RNA装载的DCs处理的患新-诊断的GBM的患者的时间进展的坐标图。用靶向CMV pp65的DC疫苗处理13名患GBM的患者。时间进展相比组织对照有利(P＝0.0008)。
[0040] 图5是显示用CMV pp65RNA装载的DC疫苗处理的患GBM的患者的总体生存的坐标图。
[0041] 图6是显示对于患GBM的33岁的雌性受试者pp65RNA装载的DC疫苗接种期间接近完全的放射摄影反应的磁共振图像(MRI)。
[0042] 图7显示多功能T细胞与CMV pp65反应的分析。在HIV疫苗试验网络的免疫学监控核心实验室(Immunologic Monitoring Core laboratory of the HIV Vaccine Trials Network)将自CMV血清阳性供体的外周血单核细胞(PBMCs)用CMV pp65肽混合剂体外刺激，及使用确认的11-色彩多色流式细胞仪分析来分析。功能和布尔选通软件用于测定多功能T细胞比例(分泌多个细胞因子及展示粒酶活化标记物CD107a)。已显示多功能免疫应答以区别有HIV感染的发展者对比非-发展者，及相比分泌特定细胞因子的细胞的绝对数或百分率，良好相关于病毒感染中的免疫保护。
[0043] 图8是显示通过用pp65 mRNA脉冲的自体树突细胞接受疫苗接种的患新-诊断的GBM的患者中pp65抗体反应的增加的坐标图。左图显示pp65-特异性单克隆抗体结合用重组pp65蛋白包被的珠的标准曲线。右图显示存在于患者血清稀释液的抗体与用重组pp65包被的珠的特异性结合。前-疫苗血清含低滴度的pp65-特异性抗体，及在#5疫苗增加滴度(如用抗-人IgG荧光抗体检测后平均倍数增加(MFI)所示)及通过#9疫苗进一步增加。此外，在替莫唑胺循环期间诱导这些反应，展示并行的化学治疗施用期间诱导有力的体液反应的能力。
[0044] 图9是显示通过用pp65 mRNA脉冲的自体树突细胞接受疫苗接种的患新-诊断的GBM的患者中延迟型超敏(DTH)反应增加的条形图。将针对pp65及对照抗原(破伤风及念2
珠菌)疫苗接种之前及之后的展示阳性DTH反应(＝10mm)的患者比例显示在左边；及疫苗接种之前及之后的皮肤红斑面积显示在右侧。此外，替莫唑胺循环期间诱导这些反应，展示并行的化学治疗施用期间诱导细胞DTH反应的能力。
珠菌)疫苗接种之前及之后的展示阳性DTH反应(＝10mm)的患者比例显示在左边；及疫苗接种之前及之后的皮肤红斑面积显示在右侧。此外，替莫唑胺循环期间诱导这些反应，展示并行的化学治疗施用期间诱导细胞DTH反应的能力。
[0045] 图10是荧光-活化的细胞分选(FACS)特征。自PBMCs的非粘连细胞使用抗-CD3-包被的平板体外刺激72小时，及收获，洗涤，及用编码绿色荧光蛋白(GFP)或CXC
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趋化因子受体2(CXCR2)的RNA(2μg的RNA/10 细胞)电穿孔，如以下实施例10&11中所述。
细胞在培养基(AIM-V培养基，2％AB血清，hIL-2[100U/ml])培养48小时，洗涤，及通过施用缀合别蓝藻素(APC)的CXCR2-特异性单克隆抗体及流式细胞术分析GFP表达及CXCR2。
上部：未转染的T细胞表达GFP(左上部)及CXCR2(右上部)。底部：用GFPRNA电穿孔后GFP表达(左下部)，及用CXCR2RNA电穿孔后CXCR2表达(右下部)。此实验重复两次，有类似结果。
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趋化因子受体2(CXCR2)的RNA(2μg的RNA/10 细胞)电穿孔，如以下实施例10&11中所述。
细胞在培养基(AIM-V培养基，2％AB血清，hIL-2[100U/ml])培养48小时，洗涤，及通过施用缀合别蓝藻素(APC)的CXCR2-特异性单克隆抗体及流式细胞术分析GFP表达及CXCR2。
上部：未转染的T细胞表达GFP(左上部)及CXCR2(右上部)。底部：用GFPRNA电穿孔后GFP表达(左下部)，及用CXCR2RNA电穿孔后CXCR2表达(右下部)。此实验重复两次，有类似结果。
[0046] 图11是FACS特征。将自HLA-A2-阳性供体的PBMCs通过用HLA-A2-限制的pp65肽(N9V)脉冲的自体DCs刺激7天，收获，及用GFP RNA电穿孔。48小时之后，在N9V-四聚体-阳性对比N9V四聚体-阴性CD8+T细胞中检查GFP表达。左：对母细胞样淋巴细胞(R1；顶部)及CD8+T细胞(R2；底部)选通。中：用对照RNA(CXCR2)转染的细胞内无GFP表达。右：24.57％的CD8+T细胞中GFP表达(右上部)，如四聚体染色所示的，其几乎完全由pp65-特异性T细胞构成(对淋巴细胞(R1)及CD8+细胞(R2)选通的)(右下部)。
[0047] 图12是显示表达GFP的细胞的百分率及FACS谱的坐标图。(A)用DCs刺激的RNA-转染的T细胞中的GFP表达的动力学。如以下实施例10&11中所述，将PBMCs利用用6
pp65mRNA脉冲的自体DCs体外刺激11天。细胞收获及用GFP RNA(2μg/10 细胞)转染。
电穿孔后24小时开始评价四聚体-阳性(HLA-A2B)及四聚体-阴性细胞中的GFP表达，及监控直到第7天的后电穿孔。(B)分选的GFP RNA-转染的T细胞的扩展。如材料及方法中所述，将PBMCs利用用pp65mRNA脉冲的自体DCs体外刺激11天。收获细胞，及用GFP
6
RNA(2μg/10 细胞)转染。48小时之后，通过基于GFP表达的流式细胞术分选细胞(GFP+及GFP-)，及放回入含高-剂量IL-2的培养基。通过锥虫蓝染色及每3～4天计数等份的细胞来评价细胞扩展。此实验用自另一供体的PBMCs重复，得到类似结果。(C)HLA-A2-及HLA-B7-限制的pp65-特异性T细胞的四聚体分析。一组四聚体用于鉴定有针对可通过四聚体检测的pp65的多于一种类型的单体型-限制的T细胞反应性的患者。左：GFP-级分中HLA-A2-及HLA-B7pp65-特异性T细胞的频度。右：GFP级分中四聚体-阳性细胞的频度。
(D)通过RNA电穿孔分离CMV抗原-特异性CD4T细胞。如前所述产生利用pp65RNA脉冲的DCs刺激的PBMCs，及在DC刺激后第11天用GFP RNA电穿孔。细胞分选为GFP+及GFP-级分，及48小时之后通过细胞内细胞因子流式细胞术分析暴露于无抗原，SEB(1Bg/ml)，或CMV pp65肽混合剂(Beckman Coulter)后IFN-B产生。左：GFP-CD4+T细胞中的IFN-B表达。右：GFP+CD4+T细胞中的IFN-B。
pp65mRNA脉冲的自体DCs体外刺激11天。细胞收获及用GFP RNA(2μg/10 细胞)转染。
电穿孔后24小时开始评价四聚体-阳性(HLA-A2B)及四聚体-阴性细胞中的GFP表达，及监控直到第7天的后电穿孔。(B)分选的GFP RNA-转染的T细胞的扩展。如材料及方法中所述，将PBMCs利用用pp65mRNA脉冲的自体DCs体外刺激11天。收获细胞，及用GFP
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RNA(2μg/10 细胞)转染。48小时之后，通过基于GFP表达的流式细胞术分选细胞(GFP+及GFP-)，及放回入含高-剂量IL-2的培养基。通过锥虫蓝染色及每3～4天计数等份的细胞来评价细胞扩展。此实验用自另一供体的PBMCs重复，得到类似结果。(C)HLA-A2-及HLA-B7-限制的pp65-特异性T细胞的四聚体分析。一组四聚体用于鉴定有针对可通过四聚体检测的pp65的多于一种类型的单体型-限制的T细胞反应性的患者。左：GFP-级分中HLA-A2-及HLA-B7pp65-特异性T细胞的频度。右：GFP级分中四聚体-阳性细胞的频度。
(D)通过RNA电穿孔分离CMV抗原-特异性CD4T细胞。如前所述产生利用pp65RNA脉冲的DCs刺激的PBMCs，及在DC刺激后第11天用GFP RNA电穿孔。细胞分选为GFP+及GFP-级分，及48小时之后通过细胞内细胞因子流式细胞术分析暴露于无抗原，SEB(1Bg/ml)，或CMV pp65肽混合剂(Beckman Coulter)后IFN-B产生。左：GFP-CD4+T细胞中的IFN-B表达。右：GFP+CD4+T细胞中的IFN-B。
[0048] 图13是FACS特征。RNA电穿孔后pp65-特异性T细胞中CXCR2的选择性表达。如实施例10&11中所述，将PBMCs利用用pp65 mRNA脉冲的自体DCs体外刺激11天。收获
6
细胞，及用CXCR2 RNA(2μg/10 细胞)转染。48小时之后，收获细胞，及分析四聚体-阳性(HLA-A2-限制的供体)及四聚体-阴性CD8+细胞中CXCR2表达。CXCR2的活化的CD8+T细胞中的基线表达大致为10％(数据未显示)。结果显示，RNA电穿孔导致仅CMV-特异性T细胞中增加的CXCR2表达，在49.1％的四聚体-阳性细胞中表达，然而，在DC刺激后四聚体-阴性细胞中观察到相比基线的表达无增加。
6
细胞，及用CXCR2 RNA(2μg/10 细胞)转染。48小时之后，收获细胞，及分析四聚体-阳性(HLA-A2-限制的供体)及四聚体-阴性CD8+细胞中CXCR2表达。CXCR2的活化的CD8+T细胞中的基线表达大致为10％(数据未显示)。结果显示，RNA电穿孔导致仅CMV-特异性T细胞中增加的CXCR2表达，在49.1％的四聚体-阳性细胞中表达，然而，在DC刺激后四聚体-阴性细胞中观察到相比基线的表达无增加。
[0049] 图14是坐标图。(A)CXCR2及GFP RNA-转染的T细胞向IL-8的体外趋化性。如实施例10&11中所述，将PBMCs用固定的抗-CD3抗体-介导的刺激体外活化4天。收获细6
胞，及用CXCR2或GFP RNA(2μg/10 细胞)转染。48小时之后，收获细胞，计数，及如实施例10&11中所述以一式三份放入过滤室培养板。在下室中指定的浓度的IL-8的存在下培养45分钟后，评定未转染的，GFP RNA转染的，及CXCR2RNA-转染的T细胞响应增加浓度的IL-8的迁移。结果显示CXCR2RNA转染的T细胞相比未转染的及GFP RNA-转染的细胞的＊
增强的趋化反应( p＜0.05；t检验)。此实验已重复几次，得到相同结果。(B)CXCR2及GFP RNA-转染的T细胞向GRO-a的体外趋化性。如上所述针对过滤室板下室内增加浓度的GRO-a测定细胞。CXCR2-转染的T细胞呈现显著增加的响应GRO-a的趋化活性，然而GFP ＊
RNA-转染的及未转染的T细胞呈现响应GRO-a的迁移中无显著的变化( p＜0.05；t检验)。(C)CXCR2及GFP RNA转染的T细胞向UL146的体外趋化性。如上所述针对过滤室板下室内增加浓度的CMV-分泌的趋化因子UL146测定细胞。CXCR2-转染的T细胞呈现显著增加的响应UL146的趋化活性，然而GFP RNA-转染的及未转染的T细胞呈现在响应UL146＊＊
的迁移中无变化( p＜0.01；t检验)。
胞，及用CXCR2或GFP RNA(2μg/10 细胞)转染。48小时之后，收获细胞，计数，及如实施例10&11中所述以一式三份放入过滤室培养板。在下室中指定的浓度的IL-8的存在下培养45分钟后，评定未转染的，GFP RNA转染的，及CXCR2RNA-转染的T细胞响应增加浓度的IL-8的迁移。结果显示CXCR2RNA转染的T细胞相比未转染的及GFP RNA-转染的细胞的＊
增强的趋化反应( p＜0.05；t检验)。此实验已重复几次，得到相同结果。(B)CXCR2及GFP RNA-转染的T细胞向GRO-a的体外趋化性。如上所述针对过滤室板下室内增加浓度的GRO-a测定细胞。CXCR2-转染的T细胞呈现显著增加的响应GRO-a的趋化活性，然而GFP ＊
RNA-转染的及未转染的T细胞呈现响应GRO-a的迁移中无显著的变化( p＜0.05；t检验)。(C)CXCR2及GFP RNA转染的T细胞向UL146的体外趋化性。如上所述针对过滤室板下室内增加浓度的CMV-分泌的趋化因子UL146测定细胞。CXCR2-转染的T细胞呈现显著增加的响应UL146的趋化活性，然而GFP RNA-转染的及未转染的T细胞呈现在响应UL146＊＊
的迁移中无变化( p＜0.01；t检验)。
[0050] 图15是坐标图及FACS特征。(A)CXCR2RNA-转染的T细胞迁移进入腹膜腔。如以下实施例10&11中所述，将PBMCs利用用pp65mRNA脉冲的自体DCs体外刺激11天。收6
获细胞，及用CXCR2RNA(2Bg/10 细胞)转染。48小时之后，收获未转染的及CXCR2RNA-转染的细胞，及在PBS中用CFSE(对于未转染的细胞是1μM，及对于CXCR2RNA-转染的细胞
7
是10BM)区别标记5分钟，洗涤，混合，及静脉内注射到SCID小鼠(2×10 细胞/小鼠，n＝3/组)。T细胞注射后每8小时给小鼠腹膜内注射仅PBS，或PBS中的1μg/ml趋化因子(GRO-a，IL-8，或UL146)24小时。处死后通过经腹膜灌洗及离心收获淋巴细胞，及通过流式细胞仪分析评价未转染的及CXCR2 RNA-转染的细胞的相对蓄积。PBS-处理的动物中高 低
CFSE 细胞(CXC2RNA转染的T细胞)及CFSE 细胞(未转染的T细胞)的蓄积用作与细
胞因子-处理的动物中细胞的蓄积比较的基线。数据显示为相比PBS-处理的动物的倍数变化。(B)CXCR2RNA-转染的T细胞迁移进入CNS。如实施例10&11中所述，将PBMCs利用
6
用pp65mRNA脉冲的自体DCs体外刺激11天。收获细胞，及用CXCR2RNA(2μg/10 细胞)转染。48小时之后，收获未转染的及CXCR2RNA-转染的细胞，及在PBS中用CFSE(5μM)标记
7
5分钟，洗涤，及注射静脉内到SCID小鼠(1×10 细胞/小鼠，n＝3/组)。麻醉的小鼠随后经右顶叶注射CMV趋化因子UL146(5μl的PBS中1μg)，及经左顶叶注射仅PBS。解剖脑半球及从顶叶制备单个-细胞消化物后，6小时之后通过流式细胞术评定右及左顶叶中CFSE-标记的细胞的蓄积。用CXCR2RNA-转染的T细胞注射的小鼠的代表性的流式细胞点图显示注射了CXCR2配体UL146的右顶叶中淋巴细胞的更大蓄积。(C)CXCR2-转染的T细胞的体内迁移。通过流式细胞术及人T细胞每100,000事件点图评定右(UL146-注射的)及左(PBS-注射的)顶叶中T细胞蓄积。结果显示CNS内响应UL146的CXCR2RNA-转染的＊
T细胞的显著的蓄积，然而未转染的T细胞未呈现任何优先蓄积( p＜0.05；t检验)。
获细胞，及用CXCR2RNA(2Bg/10 细胞)转染。48小时之后，收获未转染的及CXCR2RNA-转染的细胞，及在PBS中用CFSE(对于未转染的细胞是1μM，及对于CXCR2RNA-转染的细胞
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是10BM)区别标记5分钟，洗涤，混合，及静脉内注射到SCID小鼠(2×10 细胞/小鼠，n＝3/组)。T细胞注射后每8小时给小鼠腹膜内注射仅PBS，或PBS中的1μg/ml趋化因子(GRO-a，IL-8，或UL146)24小时。处死后通过经腹膜灌洗及离心收获淋巴细胞，及通过流式细胞仪分析评价未转染的及CXCR2 RNA-转染的细胞的相对蓄积。PBS-处理的动物中高 低
CFSE 细胞(CXC2RNA转染的T细胞)及CFSE 细胞(未转染的T细胞)的蓄积用作与细
胞因子-处理的动物中细胞的蓄积比较的基线。数据显示为相比PBS-处理的动物的倍数变化。(B)CXCR2RNA-转染的T细胞迁移进入CNS。如实施例10&11中所述，将PBMCs利用
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用pp65mRNA脉冲的自体DCs体外刺激11天。收获细胞，及用CXCR2RNA(2μg/10 细胞)转染。48小时之后，收获未转染的及CXCR2RNA-转染的细胞，及在PBS中用CFSE(5μM)标记
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5分钟，洗涤，及注射静脉内到SCID小鼠(1×10 细胞/小鼠，n＝3/组)。麻醉的小鼠随后经右顶叶注射CMV趋化因子UL146(5μl的PBS中1μg)，及经左顶叶注射仅PBS。解剖脑半球及从顶叶制备单个-细胞消化物后，6小时之后通过流式细胞术评定右及左顶叶中CFSE-标记的细胞的蓄积。用CXCR2RNA-转染的T细胞注射的小鼠的代表性的流式细胞点图显示注射了CXCR2配体UL146的右顶叶中淋巴细胞的更大蓄积。(C)CXCR2-转染的T细胞的体内迁移。通过流式细胞术及人T细胞每100,000事件点图评定右(UL146-注射的)及左(PBS-注射的)顶叶中T细胞蓄积。结果显示CNS内响应UL146的CXCR2RNA-转染的＊
T细胞的显著的蓄积，然而未转染的T细胞未呈现任何优先蓄积( p＜0.05；t检验)。
[0051] 图16是显示来自患GBM的患者的外周血及肿瘤的CMV gB(UL55)DNA的扩增的电泳凝胶。A：泳道1：100bpDNA阶梯；泳道2～12：在初次切除肿瘤的时间获取的来自11名患新-诊断的GBM的患者的外周血样品在11名患者中6名显示强病毒DNA检测，及11名患者中3名显示适当尺寸的弱条带。B：泳道1：100bp DNA阶梯；泳道2-F：来自14名患高度星形细胞瘤的患者的GBM肿瘤样品(11GBM，3AA)显示，14名患者中11名的适当尺寸的清晰条带。泳道4具有与用于扩增的条带比对的样品混合的100bp DNA阶梯。
[0052] 图17是从GBM患者血清HCMV gp64实时PCR的熔解曲线坐标图。
[0053] 图18是从GBM患者血清的HCMV gp64实时PCR的PCR扩增循环坐标图。
[0054] 图19显示序列同源性。通过在Duke DNA测序核心设备中进行的DNA测序评价来自22个新鲜切除的GBM样本的扩增的gB(UL55)DNA。使用Vector NTI Advance10(Invitrogen，Carlsbad，CA)进行序列比对。通过NCBI DNA数据库的BLAST评价与鉴定的CMV株的同源性。样品之间的序列变异区以蓝色显示，核苷酸差异以白色亮显。黄色显示全部22样本之间的保守的同一性。白色及蓝色显示序列变化区。
[0055] 【发明详述】
[0056] 申请人发现，可使用包括涉及例如，疫苗的免疫治疗的CMV-特异性免疫学技术靶向表达CMV抗原的细胞。本发明可应用，但不限于开发用于诊断及治疗表达CMV抗原的细胞的组合物，方法，及试剂盒。
[0057] I.定义
[0058] 本文中的术语″免疫应答″指免疫系统针对抗原或抗原决定簇的任何反应。例示免疫应答包括体液免疫应答(例如抗原-特异性抗体的产生(中和或别样地))及细胞-介导的免疫应答(例如淋巴细胞增殖)。
[0059] II.方法及组合物
[0060] 一方面，本发明提供在受试者中引发针对表达CMV抗原的细胞的免疫应答的方法。所述方法包括：给所述受试者施用药学可接受的组合物，所述药学可接受的组合物包括至少一种CMV抗原，或编码所述至少一种CMV抗原的核酸，其中所述药学可接受的组合物在施用于受试者时引发针对所述细胞的免疫应答。
[0061] 表达CMV抗原的细胞可为任意类型的细胞。细胞可特征在于是癌细胞，癌前细胞，或易感于发展与CMV相关的癌的细胞-类型。癌包括但不限于：脑癌(例如，神经胶质瘤)，肺癌，肝癌，子宫颈癌，软组织肉瘤，内分泌肿瘤，造血癌，黑色素瘤，膀胱癌，乳腺癌，胰腺癌，前列腺癌，结肠癌，及卵巢癌。癌也可特征在于是良性或恶性的。在一实施方式中，癌是高度神经胶质瘤。在另一实施方式中，高度神经胶质瘤是成胶质细胞瘤多形性，间变性星形细胞瘤，或少突神经胶质瘤。
[0062] 一般而言，免疫应答可包括体液免疫应答，细胞-介导的免疫应答，或两者。例如，通过涉及MHC II蛋白或直接B-细胞刺激的免疫学通路的抗原呈递可产生体液反应；而通过涉及MHC I蛋白的通路呈递的抗原可引发免疫系统的细胞臂。
[0063] 体液反应可通过标准免疫测定就来自接受药学可接受的组合物的受试者的血清样品中的抗体水平来测定。细胞免疫应答是涉及T细胞的反应，及可体外或体内测定。例如，全身细胞免疫应答可作为施用药学可接受的组合物后适宜时间从受试者采样的细胞(例如，外周血白细胞(PBLs))内的T细胞增殖活性来测定。例如，PBMCs与刺激物温育适3
当的时期后，可测定[H]胸苷合并。增殖的T细胞子集可使用流式细胞术测定。也可测定T细胞细胞毒性(CTh)。
当的时期后，可测定[H]胸苷合并。增殖的T细胞子集可使用流式细胞术测定。也可测定T细胞细胞毒性(CTh)。
[0064] 在一实施方式中，引发的免疫应答足以预防性或治疗性处理肿瘤形成疾病，或与其相关的症状，特别是与CMV相关的癌。因此，药学可接受的组合物的有利效果将通常至少部分是免疫-介导的，尽管免疫应答不需阳性展示，以使本文所述的组合物及方法落入本发明的范围内。
[0065] 施用给人及非-人脊椎动物二者认为在本发明的范围内。也考虑兽医学应用。一般而言，受试者是可引发免疫应答的任何活体。受试者之例包括但不限于：人，家畜，狗，猫，小鼠，大鼠，及其转基因物种。
[0066] 受试者可患肿瘤形成疾病(例如，肿瘤)，或有风险发展肿瘤形成疾病。受试者可通过临床标准表征，例如，有晚期肿瘤形成疾病或呈现临床上可测量的肿瘤的高肿瘤负荷的那些。临床上可测量的肿瘤是可基于肿瘤质量(例如，通过触诊，MRI，CAT扫描，X射线)检测的肿瘤。因此，例如，根据本发明的药学可接受的组合物可施用于有加重的疾病的受试者，旨在缓和它们的病情。优选地，降低肿瘤质量作为施用本发明的药学可接受的组合物的结果发生，但任何临床改善构成益处。临床改善包括降低的风险或进展速度或肿瘤病理后果的降低，例如。
[0067] 作为另一实施例，受试者可为曾患癌及已付诸另一模式治疗者。其他治疗可包括例如，手术切除，放射治疗，化学治疗，及其他模式的免疫治疗，其中，作为其他治疗的结果，受试者不呈现临床上可测量的肿瘤。但是，受试者可测定为有癌复发或进展风险者，接近原肿瘤位点，或通过转移。所述受试者可进一步分类为高-风险及低-风险受试者。细分化可基于初始治疗之前或后观察的特征进行。这些特征临床领域已知，及对各不同癌被适宜定义。特征为典型的高风险亚组的是肿瘤侵袭相邻组织，或显示涉及淋巴结的那些。因此，例如，本发明的药学可接受的组合物可施用于受试者，以引发主要作为对抗复发的预防测量的抗-癌反应。优选地，施用组合物延缓癌复发，或更优选地，降低复发风险(即，提高治愈率)。所述参数可相比其他患者群及其他治疗模式测定。
[0068] 药学可接受的组合物可在任何适当的时间施用。例如，施用可在具有肿瘤负荷的受试者的传统治疗之前或期间进行，且在肿瘤变得临床上不可检测后持续。施用也可在显示复发迹象的受试者中持续。
[0069] 药学可接受的组合物可以治疗或预防有效量单独或与一或多种其他抗原组合施用，其中所述药学可接受的组合物包括至少一种CMV抗原，或编码所述至少一种CMV抗原的核酸。将本发明的药学可接受的组合物施用给受试者可使用已知的过程及以足以实现期望效果的剂量及时间进行。例如，治疗或预防有效量的药学可接受的组合物可根据因素例如受试者年龄，性别，及重量而变化。本领域技术人员可调整剂量方案，以引发期望的免疫应答，包括提供治疗或预防效应的免疫应答。
[0070] 药学可接受的组合物可施用于受试者的任何适宜位点，例如远离或接近原发性肿瘤的位点。施用途径可为肠胃外，肌内，皮下，真皮内，腹膜内，鼻内，静脉内(包括经内在导管)，经传入淋巴管，或通过从肿瘤形成疾病治疗及受试者的病情的观点适宜的任何其他途径。优选地，将以在造成所需反应中有效的一定量及一定时间施用的剂量是引发免疫应答或预防性或治疗性处理肿瘤形成疾病和/或与其相关的症状的剂量。
[0071] 药学可接受的组合物可随后，先于或同时于其他治疗给予，所述其他治疗包括也在所述受试者中引发免疫应答的治疗。例如，受试者可之前或同时通过化学治疗(例如，通过烷化剂例如替莫唑胺)，放射治疗，及其他形式的免疫治疗来治疗，所述其他治疗优选以旨在不干扰本发明的组合物的免疫原性的方式提供。
[0072] 施用可由照护者(例如，医师，兽医)选择恰当的时机，及可取决于受试者的临床状况，施用目的，和/或也考虑或施用其他治疗。在一些实施方式中，可施用初始剂量，及监控受试者的免疫学或临床反应，优选两者。免疫学监控的适宜手段包括使用患者的外周血淋巴细胞(PBL)作为反应者，及肿瘤形成细胞作为刺激物。免疫学反应也可通过在施用位点延迟的炎症反应来测定。如适当，初始剂量随后可给予一或多个剂量，一般每月，每半月，或优选每周，直到实现期望效果。然后，可根据需要给予额外的辅助或维持剂量，特别当免疫学或临床益处似乎减退时。
[0073] A.CMV抗原
[0074] 在一实施方式中，至少一种CMV抗原是多肽，或由CMV基因编码的其免疫原性片段。如上所述，本文中的术语″CMV″包括任何感染动物(例如哺乳动物，例如人及猴)的病毒株。感染人的CMV株一般称为人CMV(HCMV)。来自HCMV的ORFs和/或它们的相应多肽可指使用例如，Chee et al.，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，154：125(1990)及Spaete et al.，J.General Virology，74：3287(1994)所述的命名法，各均通过引用就它们的所述多肽及它们的命名法的教导并入本文。参考所述来自CMV的阅读框及多肽也可指见于不同株的相应序列及位置同源物，包括任何天然存在的CMV株中的序列，及对所述株的突变以及间接变体。
[0075] 不同CMV株的基因序列以及ORFs及编码的多肽为本领域所知，包括，无限制地，HCMV AD169(美国典型培养物保藏中心(ATCC)#VR 538)，HCMV Towne(ATCC#VR977)，HCMV Davis(ATCC#VR 807)，HCMV Toledo(Quinnan et al，Ann.Intern.Med.，
101：478-83(1984))，猴CMV Rh68.1(ATCC#VR 677)，猴CMV CSG(ATCC#VR 706)，大鼠CMV Priscott(ATCC#VR 991)，及小鼠CMV Smith(ATCC#VR 1399)。作为另一实施例，HCMV AD169株的基因及多肽序列信息也被GENBANK登录号No.BK000394.2及X17403.1描述，各均通过引用整体并入本文。而且，对应于一种CMV株(例如，HCMV AD169株)的已知的序列信息可用于测定另一CMV株的基因及多肽的序列信息。例如，可测定的同源物包括共有共同的进化起源，结构/功能，及编码具有至少约20％，例如，约20到约100％，约30到约90％，约
40到约80％，约50到约70％序列同一性的氨基酸序列同一性的多肽的产物的基因。同源物可通过本领域中已知的方法，例如使用计算机程序(例如BLAST)比较彼此的核酸或氨基酸序列，或通过设计为检测预定量的序列之间的错配的在严格条件下杂交来鉴定。而且，可采用基于同源性的序列信息分离及表征特定分离物的序列，例如使用引物及聚合酶链式反应(PCR)。
101：478-83(1984))，猴CMV Rh68.1(ATCC#VR 677)，猴CMV CSG(ATCC#VR 706)，大鼠CMV Priscott(ATCC#VR 991)，及小鼠CMV Smith(ATCC#VR 1399)。作为另一实施例，HCMV AD169株的基因及多肽序列信息也被GENBANK登录号No.BK000394.2及X17403.1描述，各均通过引用整体并入本文。而且，对应于一种CMV株(例如，HCMV AD169株)的已知的序列信息可用于测定另一CMV株的基因及多肽的序列信息。例如，可测定的同源物包括共有共同的进化起源，结构/功能，及编码具有至少约20％，例如，约20到约100％，约30到约90％，约
40到约80％，约50到约70％序列同一性的氨基酸序列同一性的多肽的产物的基因。同源物可通过本领域中已知的方法，例如使用计算机程序(例如BLAST)比较彼此的核酸或氨基酸序列，或通过设计为检测预定量的序列之间的错配的在严格条件下杂交来鉴定。而且，可采用基于同源性的序列信息分离及表征特定分离物的序列，例如使用引物及聚合酶链式反应(PCR)。
[0076] 在一些实施方式中，至少一种CMV抗原是由HCMV基因或其同源物的开放阅读框(ORF)编码的多肽或其免疫原性片段。在一实施方式中，多肽或其免疫原性片段由对应于GENBANK登录号No.BK000394.2或X17403.1所示的CMV株的基因编码。
[0077] 在其他实施方式中，至少一种CMV抗原对应于选自下列的多肽或其免疫原性片段：磷蛋白独特长83(ppUL83；a/k/a pp65)，糖蛋白UL55(gpUL55；a/k/a gB)，UL123立即早期1(IE1)蛋白，UL122IE2蛋白，UL111A(a/k/a mtrII)，US28，ppUL32，ppUL65，ppUL80a，ppUL82，ppUL98a，ppUL99，gpUL4(a/k/a gp48)，gpUL16，gpUL18(a/k/a MHC)，gpUL75(a/k/a gH)，gpUL100，gpUL110(a/k/a gM)，gpUL115(a/k/a gL)，pUL46，pUL48，pUL56，pUL86(a/k/a MCP)，糖蛋白独特短10(gpUS10)，gpUS11，糖蛋白复合物II(gcII)，gp65，及gp93。
[0078] 在一实施方式中，至少一种CMV抗原包括对应于来自CMV的相同抗原或不同抗原的一或多个表位的氨基酸序列。在一些实施方式中，一或多个表位可特征在于局限于或不局限于单个I类MHC单体型。在其他实施方式中，所述一或多个表位特异于足够数量的I类MHC分子，以提供覆盖至少约5％的一般群，例如，至少约5，10，20，30，40，50，60，70，80，90，及100％的一般群，无关于种族起源或种族。本领域技术人员将容易在一个位置测定需要于使用HLA特异性实验提供任何给定群的覆盖的个体HCMV细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位的数。任选地，一或多个表位还显示HLA超型特异性和/或包括足以辅助受试者中的T辅助细胞功能的一或多个CD4+决定簇。
[0079] CMV表位之例包括但不限于包括如Trivedi et al.，Blood，105：2793(2005)及美国专利申请公开No.2005/0019344所述的氨基酸序列的肽，各均通过引用就它们的CMV表位教导并入本文。在一实施方式中，所述至少一种CMV抗原是多肽，或其抗原性片段，包括SEQ ID NO：1，2，或3的氨基酸序列。
[0080] 在另一实施方式中，至少一种抗原包括通过显性HLA等位基因限制的一或多个CMV CTL表位。例如，疫苗接种策略可涉及有模拟已知被CMV-诱导的CTL反应识别的免疫显性的表位的合成的肽制剂的CD8+T-细胞库产生，例如通过混合多个肽，或者通过使用可融合以构建重组或合成的多表位多肽的最小CTL表位。而且，基于来自潜在的抗原的CTL表位的疫苗设计可针对CMV-转化的潜在感染的细胞，以及也用于CMV-血清阴性移植物受体，因为它们的增加的针对CMV病毒-诱导的条件的感受性。
[0081] 在其他实施方式中，至少一种抗原对应于一组肽。在一实施方式中，所述一组肽包括至少约8-聚体氨基酸序列，例如，约8-聚体到约30-聚体，约9-聚体到约25-聚体，约10-聚体到约20-聚体，约11-聚体到约18-聚体，约12-聚体到约16-聚体，及约13-聚体到约15-聚体，其中所述肽序列具有至少约6个氨基酸重叠，例如，约6到约20，约7到约
19，约8到约18，约9到约17，约10到约16，及约11到约14个氨基酸重叠，其中所述一组肽涵盖至少约10％的HCMV蛋白，例如，约10到约100％，约20到约90％，约30到约80％，约40到约70％，及约50到约60％的HCMV蛋白。
19，约8到约18，约9到约17，约10到约16，及约11到约14个氨基酸重叠，其中所述一组肽涵盖至少约10％的HCMV蛋白，例如，约10到约100％，约20到约90％，约30到约80％，约40到约70％，及约50到约60％的HCMV蛋白。
[0082] 在一实施方式中，HCMV蛋白是IE-1蛋白(例如，HCMV株AD169的IE-1蛋白；见，例如，Swiss-Prot登录号No.P13202，将其通过引用整体并入本文)。在另一实施方式中，HCMV蛋白是pp65蛋白(例如，HCMV株AD169的pp65蛋白；见，例如，Swiss-Prot登录号No.P06725，将其通过引用整体并入本文)。
[0083] 在其他实施方式中，所述一组肽包括11个氨基酸重叠的15-聚体氨基酸序列，覆盖一或多种HCMV蛋白的完全或基本上完全序列。一些实施方式中，一或多种HCMV蛋白TM是IE-1蛋白或pp65蛋白。例如，在一些实施方式中，所述一组肽包括PepTivator CMV TM
pp65(Miltenyi Biotec，Gladbach，德国)或PepTivator CMV IE-1(Miltenyi Biotec，Gladbach，德国)。
pp65(Miltenyi Biotec，Gladbach，德国)或PepTivator CMV IE-1(Miltenyi Biotec，Gladbach，德国)。
[0084] 在一些实施方式中，使用肽表位可使其更容易制备现代优良生产实践(cGMP)级的产品。因此，在一些实施方式中，本发明提供包括所述一组肽的免疫原性组合物。
[0085] 因此，一些方面，本发明提供一或多种免疫学活跃的肽，及其功能变体，能引发针对表达CMV抗原的细胞的细胞免疫应答。例如，细胞可特征在于是癌细胞，癌前细胞，或易感于发展与CMV相关的癌的细胞-类型。在一些实施方式中，肽能引导CTL识别及裂解所述细胞。所述免疫学活跃的肽，结合I类MHC分子，可被具有潜在的或活跃的HCMV感染的个体的CTL识别。
[0086] 所述肽(例如，所述一组肽)可以肽或脂肽疫苗的形式施用，任选含佐剂。在一些实施方式中，肽可以细胞疫苗的形式通过已体外处理以在它们的表面呈递所述组的肽的自体或同种异体抗原呈递细胞或树突细胞的施用来施用。在另一实施方式中，T细胞可从个体除去，及用所述肽体外处理，其中所述得到的CTL再自体或同种异体输注到受试者。在各种其他实施方式中，本发明的肽也可以多核苷酸疫苗的形式施用于受试者，或体外施用于T细胞，其中将一或多种适宜基因转移载体，例如含在适当的表达调控序列的控制下的编码所述肽片段的DNA的质粒或经加工的病毒载体，施用于受试者或体外施用于T细胞。
[0087] 一组肽被例如，Kiecker et al.，Hum Immunol.65：523-36(2204)公开，将其通过引用就其一组肽及使用一组肽用于刺激T细胞的教导并入本文。
[0088] 至少一种CMV抗原也可通过本领域中已知的常规实验使用技术测定。例如，可使用库及表达载体克隆及表征被免疫系统识别的特定CMV株的抗原决定簇。例如，可从HCMV DNA的粘粒库产生DNA随机片段。可选择各长度(例如，约50～600bp长度)的片段，及克隆进开放阅读框(ORF)表达载体，以创建代表整个病毒基因组或指定的亚区的ORF-库。分离克隆，及免疫学筛选由偶联于报告子(例如，大肠杆菌β-半乳糖苷酶分子)的CMV序列编码的抗原性肽构成的融合蛋白的合成。动物中产生的抗-CMV血清以及人超免疫球蛋白可用于集落筛选。不同组的抗原性融合蛋白可被不同抗血清识别。给出与免疫血清强反应的克隆可定位在CMV基因组，及确定CMV插入子序列。可在小鼠或兔中产生针对融合蛋白的抗体，以鉴定相应的CMV蛋白。
[0089] 在其他实施方式中，至少一种CMV抗原还包括一或多种信号序列，例如，但不限于，gp96内质网靶向肽信号序列，LAMP-1溶酶体的靶向肽信号序列等。信号序列可增强I类和II类MCH抗原加工及呈递，以及提供其他靶向性质。在其他实施方式中，至少一种CMV抗原可缀合到载质蛋白(例如，匙孔青贝血蓝蛋白(KLH)，或通过核酸编码序列的重组合成为融合蛋白。
[0090] 如下进一步阐释，药学可接受的组合物可包括至少一种CMV抗原或编码所述至少一种CMV抗原的核酸。
[0091] A.核酸
[0092] 一般而言，受试者可用包括核酸的药学可接受的组合物通过任何肠胃外途径接种。例如，受试者可通过静脉内，腹膜内，真皮内，皮下，吸入，或肌内途径接种，或通过使用基因枪粒子轰击。优选地，肌肉组织可为用于递送及表达多核苷酸的位点。一剂量的多核苷酸可通过多个和/或重复的注射施用进肌肉，例如，以长时间延长施用。因此，肌肉细胞可用编码至少一种CMV抗原的多核苷酸注射，及表达的抗原可在主要组织相容性复合物的抗原的环境中被肌肉细胞呈递，以引发针对至少一种CMV抗原的免疫应答。
[0093] 表皮可为用于递送及表达多核苷酸的另一有用的位点，例如通过直接注射或粒子轰击。一剂量的多核苷酸可施用于表皮，例如通过多个注射或轰击，以长时间延长施用。例如，皮肤细胞可用编码至少一种CMV抗原的多核苷酸注射，及表达的抗原可在主要组织相容性复合物的抗原的环境中被皮肤细胞呈递，以引发针对至少一种CMV抗原的免疫应答。
[0094] 受试者也可通过粘膜途径接种。多核苷酸可通过各种方法，包括含多核苷酸的鼻-滴液，吸入剂，栓剂，微球-包裹的多核苷酸，或通过用多核苷酸-包被的金粒子轰击来施用于粘膜表面。例如，可将编码至少一种CMV抗原的核酸施用于呼吸系统粘膜表面。
[0095] 任何适当的生理相容的培养基，例如注射用盐水，或用于粒子轰击的金粒子适宜于将多核苷酸导入受试者。
[0096] 1.RNA
[0097] 在一些实施方式中，药学可接受的组合物包括编码所述至少一种CMV抗原的核酸，其中所述核酸是RNA。RNAs包括可翻译的RNA模板，以引导提供至少一种CMV抗原的氨基酸链的细胞内合成。编码至少一种CMV抗原的RNAs也可体外转录，例如，反转录，以产生cDNAs，其可然后通过PCR扩增，如果需要，及随后体外转录，有或无克隆cDNA。本领域技术人员可用许多方法制备编码至少一种CMV抗原的RNAs。因此，例如，常规体外转录技术及细菌聚合酶可用于产生体外转录的RNAs，或体外转录的RNAs可从编码至少一种CMV抗原的克隆的DNA序列合成。
[0098] 2.DNA
[0099] 在另一实施方式中，编码所述至少一种CMV抗原的核酸包括具有编码至少一种CMV抗原的开放阅读框的DNAs。例如，包括具有编码至少一种CMV抗原的DNA开放阅读框的表达载体的药学可接受的组合物可施用于受试者。
[0100] 包括编码至少一种CMV抗原的开放阅读框的基因组DNA片段和/或cDNAs可用于本发明的方法。cDNAs可从上述编码至少一种CMV抗原的RNAs，使用本领域技术人员已知的技术制备。如果需要，DNA可片段化，例如通过物理片段化，或优选地，通过酶促切割，即使用限制性内切酶。片段化方法为本领域技术人员熟知，及可变化(例如，通过使用不同限制性内切酶或组合及消化时间)以获得在尺寸及组成方面不同的片段。具有编码至少一种CMV抗原的开放阅读框的DNAs或其片段可通过本领域中已知的方法及试剂克隆进表达载体。
[0101] 可采用标准克隆载体，其具有可选择的标记物(例如，氨苄西林)及，优选复制原点(例如，ori)及适宜启动子。然后可用载体转化细菌(例如，大肠杆菌)或其他适宜宿主，及通过标准方法培养转化体，及通过所述如层析或有机分离的方法分离质粒DNA。例如，质粒可用于克隆进一个位点，其可将由开放阅读框表达的至少一种CMV抗原引导至MHC I或II。用于引发免疫应答的表达载体及使用所述表达载体的方法描述于美国专利申请公开No.20040241140，将其就其用于引发免疫应答的表达载体及使用所述表达载体的方法的教导并入本文。
[0102] 当被细胞(例如，肌肉细胞，抗原呈递细胞(APC)例如树突细胞，巨噬细胞等)摄取时，DNA分子可存在于细胞内，作为染色体外分子和/或可整合进染色体。DNA可以可保持作为分离的遗传物质的质粒的形式导入细胞。或者，可将可整合进染色体的线性DNAs导入细胞。任选地，当将DNA导入细胞，可加入促进DNA整合进染色体的试剂。
[0103] 因此，优选DNAs包括必要于表达开放阅读框的调控元件。所述元件可包括，例如，启动子，起始密码子，终止密码子，及多聚腺苷酸化信号。此外，可包括增强子。如本领域技术人员所知，这些元件优选运作性连接到编码至少一种CMV抗原的序列。优选选择在待被施用的受试者物种中运作的调控元件。优选包括与编码序列在同一框内的起始密码子及终止密码子。
[0104] 启动子之例包括但不限于来自下列的启动子：猿猴病毒40(SV40)，小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)启动子，人免疫缺陷病毒(HIV)，例如HIV长末端重复(LTR)启动子，莫洛尼病毒，巨细胞病毒(CMV)，例如CMV立即早期启动子，爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)，劳斯肉瘤病毒(RSV)，以及来自人基因(例如人肌动蛋白，人肌球蛋白，人血红蛋白，人肌肉肌酸，及人金属硫蛋白)的启动子。适宜多聚腺苷酸化信号之例包括但不限于SV40多聚腺苷酸化信号及LTR多聚腺苷酸化信号。
[0105] 除了DNA表达需要的调控元件之外，其他元件还可包括在DNA分子内。所述额外的元件包括增强子。增强子包括上文所述的启动子。优选的增强子/启动子包括，例如，人肌动蛋白，人肌球蛋白，人血红蛋白，人肌肉肌酸及病毒增强子，例如来自CMV，RSV及EBV的那些。
[0106] 任选地，DNAs可运作性合入载质或递送载体。有用的递送载体包括但不限于：可生物降解的微胶囊，免疫刺激复合物(ISCOMs)或脂质体，及遗传加工的衰减的活载质，例如病毒或细菌。
[0107] 在一些实施方式中，载体是病毒载体，例如：慢病毒，反转录病毒，疱疹病毒，腺病毒，腺伴随病毒，痘苗病毒，杆状病毒，鸡痘病毒，AV-痘病毒，修饰的安卡拉痘病毒(MVA)及其他重组病毒。例如，痘苗病毒载体可用于感染树突细胞。
[0108] 因此，编码至少一种CMV抗原或其免疫原性片段的载体可使用病毒载体或通过直接导DNA体内，离体，或体外导入。靶向的组织中的表达可通过靶向转基因载体到特异性细胞来实现，例如用病毒载体或受体配体，或通过使用组织-特异性启动子，或两者。
[0109] 病毒载体通常用于体内或离体靶向，及疫苗接种过程是基于DNA的载体及反转录病毒载体。构建及使用病毒载体的方法为本领域所知(见，例如，Miller and Rosman，BioTechniques，7：980-990，1992)。优选地，病毒载体是复制缺陷型，即，它们不能在靶细胞内自主复制。优选地，复制缺陷型病毒是最小病毒，即，其仅保持其必要于壳体化基因组来产生病毒粒子的基因组的序列。
[0110] DNA病毒载体包括衰减的或缺陷型DNA病毒，例如但不限于：单纯疱疹病毒(HSV)，乳头瘤病毒，爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)，腺病毒，腺伴随病毒(AAV)，痘苗病毒等。特定载体之例包括但不限于：缺陷型疱疹病毒1(HSV1)载体(Kaplitt，et al.，Molec.Cell.Neurosci.2：320-330，1991；国际专利公开No.WO 94/21807，1994年9月29日公开；国际专利公开No.WO 92/05263，1994年4月2日公开)；衰减的腺病毒载体，例如由Stratford-Perricaudet等 人(J.Clin.Invest.90：626-630，1992；也 见 La Salle，et al.，Science 259：988-990，1993)描述的载体；及缺陷型腺伴随病毒载体(Samulski，et al.，J.Virol.61：3096-3101，1987；Samulski，et al.，J.Virol.63：3822-3828，1989；
Lebkowski，et al.，Mol.Cell.Biol.8：3988-3996，1988)。病毒载体也可商购。
Lebkowski，et al.，Mol.Cell.Biol.8：3988-3996，1988)。病毒载体也可商购。
[0111] 任选地，DNAs也可用提高细胞摄取遗传物质的试剂提供。例如，DNA可用摄取辅助剂配制，或连同摄取辅助剂施用，所述摄取辅助剂选自：苯甲酸酯类，酰苯胺类，脒类，及氨基甲酸乙酯类。
[0112] B.树突细胞
[0113] 本领域技术人员将认可，体外产生树突细胞(DCs)的能力也可根据本发明用于用至少一种CMV抗原或编码所述至少一种CMV抗原的核酸离体装载DCs，及施用DC疫苗作为引发针对表达CMV抗原的细胞的免疫应答的策略。临床前研究显示DCs是B及T淋巴细胞中新及回忆应答的有效活化子。
[0114] 在一些实施方式中，本发明提供在受试者中引发针对表达CMV的细胞的免疫应答的方法，所述方法包括给所述受试者施用药学可接受的组合物，所述药学可接受的组合物包括用至少一种CMV抗原或编码所述至少一种CMV抗原的核酸离体装载的树突细胞，其中所述药学可接受的组合物在施用于受试者时引发针对所述细胞的免疫应答。
[0115] 因此，本发明的CMV抗原-激发的抗原呈递细胞及用这些抗原呈递细胞产生的CMV抗原-特异性T淋巴细胞可用作用于预防性或治疗性应用的免疫调节组合物中的活性化合物。如下述，在一些实施方式中，本发明的抗原-激发的抗原呈递细胞可用于产生用于过继转移给受试者的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)(例如，CD8+或CD4+CTL)。
[0116] C.组合物
[0117] 其他方面，本发明提供药学可接受的组合物，所述药学可接受的组合物包括至少一种CMV抗原或编码所述至少一种CMV抗原的核酸。所述药学可接受的组合物在施用于受试者时引发针对表达CMV抗原的细胞的免疫应答。本发明的药学可接受的组合物可作为用于预防性或治疗性处理所述受试者中肿瘤形成疾病或其症状，特别用于预防或治疗CMV-相关的癌(例如，肿瘤)的疫苗组合物有用。
[0118] 在一些实施方式中，药学可接受的组合物还包括生理学可接受的载质，稀释剂，或赋形剂。配制及施用技术也可见于Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版。
[0119] 本领域中已知的药学可接受载质包括但不限于，无菌水，盐水，葡萄糖，右旋糖，或缓冲溶液。试剂，例如稀释剂，稳定剂(例如，糖类及氨基酸)，防腐剂，润湿剂，乳化剂，pH缓冲剂，增强粘度的添加剂等。优选地，培养基或载质将产生最小或无不利效果。
[0120] 在其他实施方式中，药学可接受的组合物还包括生理学可接受的佐剂。优选地，采用的佐剂提供增加的免疫原性。佐剂可为提供抗原的缓慢释放的试剂(例如，佐剂可为脂质体)，或其可为在其所在处有免疫原性，由此与抗原协同发挥作用的佐剂。例如，佐剂可为已知的佐剂或促进核酸摄取，募集免疫系统细胞到施用位点，或辅助应答淋巴样细胞的免疫活化的其他物质。佐剂包括但不限于，免疫调节分子(例如，细胞因子)，油及水乳液，氢氧化铝，葡聚糖，葡聚糖硫酸酯，氧化铁，藻酸钠，细菌-佐剂，合成的聚合物，例如聚氨基酸及氨基酸共聚物，皂苷，石蜡油，及胞壁酰二肽。
[0121] 在一实施方式中，佐剂是免疫调节分子。例如，免疫调节分子可为重组蛋白细胞因子，趋化因子，或免疫刺激剂或编码细胞因子的核酸，趋化因子，或设计为的增强免疫应答的免疫刺激剂。
[0122] 免疫调节细胞因子之例包括：干扰素类(例如，IFNa，IFNβ及IFN？)，白细胞介素类(例如，IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-12及IL-20)，肿瘤坏死因子类(例如，TNFa及TNFβ)，红细胞生成素(EPO)，FLT-3配体，gIp10，TCA-3，MCP-1，MIF，MIP-1a，MIP-1β，Rantes，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，以及前述之任何的功能片段。任何结合趋化因子受体的免疫调节趋化因子，即，CXC，CC，C，或CX3C趋化因子受体，也可使用在本发明中。趋化因子之例包括但不限于，Mip1a，Mip-1β，Mip-3a(Larc)，Mip-3β，Rantes，Hcc-1，Mpif-1，Mpif-2，Mcp-1，Mcp-2，Mcp-3，Mcp-4，Mcp-5，嗜酸性粒细胞趋化因子，Tarc，Elc，I309，IL-8，Gcp-2Gro-a，Gro-β，Gro-？，Nap-2，Ena-78，Gcp-2，Ip-10，Mig，I-Tac，Sdf-1，及Bca-1(Blc)，以及前述之任何的功能片段。
[0123] 在另一实施方式中，佐剂是选自下列的细胞因子：GM-CSF，G-CSF，IL-2，IL-4，IL-7，IL-12，IL-15，IL-21，TNF-a，及M-CSF。在一些实施方式中，佐剂包括弗氏不完全佐剂(Montanide ISA 51)或粒状棒状杆菌P40。
[0124] 本领域技术人员将认同，这些之一些佐剂不可从载体表达，所述情况中，佐剂，当使用时，可同时或依次，以任何顺序施用。
[0125] 本领域技术人员知道，本发明的方法及组合物可用作部分联合治疗，例如方法和/或组合物包括一或多种其他试剂，例如，但不限于，化学治疗剂，免疫治疗剂，免疫调节剂，抗-血管生成剂，抗-病毒试剂，及激素试剂。
[0126] 抗-病毒试剂之例包括但不限于，更昔洛韦(例如， )，缬更昔洛韦(例如， )，膦甲酸(例如， )，西多福韦(例如，
HPMPC)，阿德福韦(例如，PMEA， )，阿昔洛
韦(例如， )，伐昔洛韦(例如，VALTREXTM，ZELITREXTM)，多聚阴离子，及蛋白
激酶C抑制剂(例如，双-吲哚基马来酰亚胺)。在一实施方式中，与本发明的组合物及方法联合采用的抗-病毒试剂是更昔洛韦，缬更昔洛韦，西多福韦，或膦甲酸。
HPMPC)，阿德福韦(例如，PMEA， )，阿昔洛
韦(例如， )，伐昔洛韦(例如，VALTREXTM，ZELITREXTM)，多聚阴离子，及蛋白
激酶C抑制剂(例如，双-吲哚基马来酰亚胺)。在一实施方式中，与本发明的组合物及方法联合采用的抗-病毒试剂是更昔洛韦，缬更昔洛韦，西多福韦，或膦甲酸。
[0127] 在其他实施方式中，一或多种其他试剂实现CMV抗原表达，优选通过增强CMV抗原表达，优选通过增强潜在感染的细胞中(优选在神经胶质瘤细胞中)的CMV抗原表达。在一实施方式中，一或多种试剂选自：视黄酸(RA)，阿仑珠单抗(Campath 1H)，及免疫抑制剂(例如，环磷酰胺，环孢菌素)。在另一实施方式中，照射和/或免疫耗竭与本发明的组合物及方法组合提供。
[0128] 在各种实施方式中，一或多种其他试剂可为化学治疗剂，天然存在的或合成的，例如，如″Cancer Chemotherapeutic Agents″，American Chemical Society，1995，W.O.Foye Ed.中所述。
[0129] 在一实施方式中，化学治疗剂选自小分子受体拮抗剂，例如：瓦他拉尼，SU 11248或AZD-6474，EGFR或HER2拮抗剂，例如吉非替尼，厄洛替尼，CI-1033或赫赛汀，抗体例如贝伐珠单抗，西妥昔单抗，利妥昔单抗，DNA烷化药物，例如顺铂，奥沙利铂或卡铂，蒽环类抗生素例如多柔比星或表柔比星，抗代谢剂，例如5-FU，培美曲塞，吉西他滨或卡培他滨，喜树碱，例如伊立替康或托泊替康，抗-癌药物，例如紫杉醇或多西他赛，表鬼臼毒素，例如依托泊苷或替尼泊苷，蛋白酶体抑制剂，例如硼替佐米或抗-炎症药物，例如塞来考昔或罗非考昔，任选以药学可接受的盐的形式，以水合物和/或溶剂化物的形式及任选以个体旋光异构体，个体对映异构体或其外消旋体的混合物的形式。
[0130] 在另一实施方式中，化学治疗剂选自小分子VEGF受体拮抗剂，例如瓦他拉尼(PTK-787/ZK222584)，SU-5416，SU-6668，SU-11248，SU-14813，AZD-6474，AZD-2171，CP-547632，CEP-7055，AG-013736，IM-842或GW-786034，双EGFR/HER2拮抗剂，例如吉非替尼，厄洛替尼，CI-1033或GW-2016，EGFR拮抗剂，例如易瑞沙(ZD-1839)，塔西法(OSI-774)，PKI-166，EKB-569，HKI-272或赫赛汀，促细胞分裂原-活化的蛋白激酶的拮抗剂，例如BAY-43-9006或BAY-57-9006，喹唑啉衍生物，例如4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-6-{[4-(N，N-二甲基氨基)-1-氧代-2-丁-烯-1-基]氨基}-7-(-四氢呋喃-3-基氧基)喹唑啉或4-[(3-氯-4-氟-苯基)氨基]-6-{[4-(均吗啉-4-基)-1-氧代-2-丁-烯-1-基]
氨基}-7-[-(四氢呋喃-3-基)氧基]-喹唑啉，或其药学可接受的盐，蛋白激酶受体拮抗剂，其分类于合成的小分子，例如阿曲生坦，利妥昔单抗，西妥昔单抗，AvastinTM(贝伐珠单抗)，IMC-1C11，爱必妥(C-225)，DC-101，EMD-72000，vitaxin，伊马替尼，蛋白酪胺酸激酶抑制剂，其为融合蛋白，例如VEGFtrap，烷化剂或铂化合物，例如美法仑，环磷酰胺，氧氮磷环类，顺铂，卡铂，奥沙利铂，沙铂，四铂，异丙铂，丝裂霉素，链佐星，卡莫司汀(BCNU)，洛莫司汀(CCNU)，白消安，异环磷酰胺，链佐星，塞替派，苯丁酸氮芥，氮芥，例如氮芥，乙烯亚胺化合物，烷基磺酸盐，柔红霉素，多柔比星(阿霉素)，多柔比星脂质体(doxil)，表柔比星，伊达比星，米托蒽醌，安吖啶，更生霉素，偏端霉素或其衍生物，纺锤菌素，pibenzimol，丝裂霉素，CC-1065，多卡米星，普卡霉素，色霉素，橄榄霉素，酞酰苯胺，例如普罗帕脒或茋脒，安曲霉素，吖丙啶，亚硝基脲或其衍生物，嘧啶或嘌呤类似物或拮抗剂，或核苷二磷酸还原酶的抑制剂，例如阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶(5-FU)，培美曲塞，替加氟/尿嘧啶，乌拉莫司汀，氟达拉滨，吉西他滨，卡培他滨，巯嘌呤，克拉屈滨，硫鸟嘌呤，甲氨喋呤，喷司他丁，羟基脲，或叶酸，腐草霉素，博来霉素或其衍生物或盐，CHPP，BZPP，MTPP，BAPP，似博霉素(liblomycin)，吖啶或其衍生物，利福霉素，放线菌素，甲烯土霉素，喜树碱，例如伊立替康(camptosar)或托泊替康，安吖啶或其类似物，三环甲酰胺，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，例如SAHA，MD-275，曲古抑菌素A，CBHA，LAQ824，或丙戊酸，来自植物的抗-癌药物，例如紫杉醇(泰素)，多西他赛或泰素帝，长春花生物碱，例如诺维本，长春碱，长春新碱，长春地辛或长春瑞滨，环庚三烯酚酮生物碱，例如秋水仙碱或其衍生物，大环内酯，例如美坦辛，安丝菌素或根霉素，抗有丝分裂肽，例如拟茎点霉毒素或多拉司他汀，表鬼臼毒素或鬼臼毒素的衍生物，例如依托泊苷或替尼泊苷，斯的甘辛，抗有丝分裂氨基甲酸酯衍生物，例如考布他汀或amphetinile，丙卡巴肼，蛋白酶体抑制剂，例如硼替佐米，酶，例如天冬酰胺酶，聚乙二醇化的天冬酰胺酶(培天冬酶)或胸苷-磷酸化酶抑制剂，孕激素或雌激素，例如雌莫司汀(T-66)或甲地孕酮，抗-雄激素，例如氟他胺，康士得，尼鲁米特或环丙孕酮乙酸盐，芳香酶抑制剂，例如氨鲁米特，阿那曲唑，福美坦或来曲唑，GNrH类似物，例如亮丙瑞林，布舍瑞林，戈舍瑞林或曲普瑞林，抗-雌激素，例如他莫昔芬或其柠檬酸盐，屈洛昔芬，曲沃昔芬，雷洛昔芬或秦哚昔芬，17β-雌二醇的衍生物，例如ICI 164，384或ICI 182，780，氨鲁米特，福美坦，法倔唑，非那雄胺，酮康唑，LH-RH拮抗剂，例如亮丙立德，甾类，例如泼尼松，泼尼松龙，甲泼尼龙，地塞米松，布替耐德，氟可龙或曲安西龙，干扰素例如干扰素β，白细胞介素例如IL-10或IL-12，抗-TNFa抗体例如依那西普，免疫调节药物，例如沙利度胺，其R-及S-对映异构体及其衍生物，或revimid(CC-5013)，白三烯拮抗药，丝裂霉素C，aziridoquinone，例如BMY-42355，AZQ或EO-9，2-硝基咪唑，例如米索硝唑，NLP-1或NLA-1，硝基吖啶，硝基喹啉，硝基吡唑啉吖啶，″双官能″硝基芳族，例如RSU-1069或RB-6145，CB-1954，氮芥的N-氧化物，例如氧氮芥，氮芥的金属络合物，抗-CD3或抗-CD25抗体，耐受性诱导试剂，双磷酸或其衍生物，例如米诺膦酸或其衍生物(YM-529，Ono-5920，YH-529)，唑来膦酸一水合物，伊班膦酸钠水合物或氯膦酸二钠，硝基咪唑，例如甲硝唑，米索硝唑，苄硝唑或尼莫唑，硝基芳基化合物，例如RSU-1069，硝酰基或N-氧化物，例如SR-4233，卤化嘧啶类似物，例如溴脱氧尿苷，碘脱氧尿苷，硫代磷酸酯，例如WR-2721，光-化学活化的药物，例如卟菲尔钠，光敏素，苯并卟啉衍生物，脱镁叶绿甲酯酸衍生物，部花青540(MC-540)或锡etioporpurin，反模板或反义RNA或DNA，例如奥利美生，非甾族炎症药物，例如乙酰水杨酸，美沙拉秦，布洛芬，萘普生，氟比洛芬，非诺洛芬，芬布芬，酮洛芬，吲哚洛芬，吡洛芬，卡洛芬，奥沙普秦，普拉洛芬，咪洛芬，硫噁洛芬，舒洛芬，阿明洛芬，噻洛芬酸，氟洛芬，吲哚美辛，舒林酸，托美丁，佐美酸，萘丁美酮，双氯芬酸，芬氯酸，阿氯芬酸，溴芬酸，异丁芬酸，醋氯芬酸，阿西美辛，芬替酸，环氯茚酸，依托度酸，奥昔平酸，甲芬那酸，甲氯芬那酸，氟芬那酸，尼氟酸，托芬那酸，二氟尼柳，氟苯柳，吡罗昔康，替诺昔康，氯诺昔康，尼美舒利，美洛昔康，塞来考昔，罗非考昔，或非甾族炎症药物的药学可接受的盐，细胞毒性抗生素，靶向癌细胞表面分子的抗体，例如apolizumab或1D09C3，金属硫蛋白酶抑制剂，例如TIMP-1或TIMP-2，锌，癌基因抑制剂，例如P53及Rb，稀土元素络合物，例如镧系元素的杂环络合物，光-化学治疗剂，例如PUVA，转录因子复合物抑制剂ESX/DRIP130/Sur-2，HER-2表达抑制剂，例如热激蛋白HSP90调节剂格尔德霉素及其衍生物17-烯丙基氨基格尔德霉素或17-AAG，或治疗剂，选自：IM-842，四硫钼酸盐，角鲨胺，combrestatin A4，TNP-470，马立马司他，新伐司他，比卡鲁胺，阿巴瑞克，oregovomab，米妥莫单抗，TLK-286，阿仑珠单抗，替伊莫单抗，替莫唑胺，地尼白介素2，阿地白介素，达卡巴嗪，氟尿苷，普卡霉素，米托坦，哌泊溴烷，普卡霉素，他莫昔芬及睾内酯。优选的化合物包括小分子VEGF受体拮抗剂，例如瓦他拉尼(PTK-787/ZK222584)，SU-5416，SU-6668，SU-11248，SU-14813，AZD-6474，EGFR/HER2拮抗剂，例如CI-1033或GW-2016，EGFR拮抗剂，例如易瑞沙(吉非替尼，ZD-1839)，塔西法(厄洛替尼，OSI-774)，PKI-166，EKB-569，HKI-272或赫赛汀，促细胞分裂原-活化的蛋白激酶拮抗剂，例如BAY-43-9006或BAY-57-9006，阿曲生坦，利妥昔单抗，西妥昔单抗，阿瓦斯丁.TM.(贝伐珠单抗)，IMC-1C11，爱必妥(C-225)，DC-101，EMD-72000，vitaxin，伊马替尼，烷化剂或铂化合物，例如美法仑，环磷酰胺，顺铂，卡铂，奥沙利铂，沙铂，柔红霉素，多柔比星(阿霉素)，多柔比星脂质体(doxil)，表柔比星，伊达比星，嘧啶或嘌呤类似物或拮抗剂或核苷二磷酸还原酶抑制剂，例如阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶(5-FU)，培美曲塞，替加氟/尿嘧啶，吉西他滨，卡培他滨，巯嘌呤，甲氨喋呤，抗-癌药物，例如紫杉醇(泰素)或多西他赛，长春花生物碱，例如诺维本，长春碱，长春新碱，长春地辛或长春瑞滨，抗有丝分裂肽，例如多拉司他汀，表鬼臼毒素或鬼臼毒素衍生物，例如依托泊苷或替尼泊苷，非甾族炎症药物，例如美洛昔康，塞来考昔，罗非考昔，靶向癌细胞表面分子的抗体，例如apolizumab或ID09C3或热激蛋白HSP90调节剂格尔德霉素及其衍生物17-烯丙基氨基格尔德霉素或17-AAG。
氨基}-7-[-(四氢呋喃-3-基)氧基]-喹唑啉，或其药学可接受的盐，蛋白激酶受体拮抗剂，其分类于合成的小分子，例如阿曲生坦，利妥昔单抗，西妥昔单抗，AvastinTM(贝伐珠单抗)，IMC-1C11，爱必妥(C-225)，DC-101，EMD-72000，vitaxin，伊马替尼，蛋白酪胺酸激酶抑制剂，其为融合蛋白，例如VEGFtrap，烷化剂或铂化合物，例如美法仑，环磷酰胺，氧氮磷环类，顺铂，卡铂，奥沙利铂，沙铂，四铂，异丙铂，丝裂霉素，链佐星，卡莫司汀(BCNU)，洛莫司汀(CCNU)，白消安，异环磷酰胺，链佐星，塞替派，苯丁酸氮芥，氮芥，例如氮芥，乙烯亚胺化合物，烷基磺酸盐，柔红霉素，多柔比星(阿霉素)，多柔比星脂质体(doxil)，表柔比星，伊达比星，米托蒽醌，安吖啶，更生霉素，偏端霉素或其衍生物，纺锤菌素，pibenzimol，丝裂霉素，CC-1065，多卡米星，普卡霉素，色霉素，橄榄霉素，酞酰苯胺，例如普罗帕脒或茋脒，安曲霉素，吖丙啶，亚硝基脲或其衍生物，嘧啶或嘌呤类似物或拮抗剂，或核苷二磷酸还原酶的抑制剂，例如阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶(5-FU)，培美曲塞，替加氟/尿嘧啶，乌拉莫司汀，氟达拉滨，吉西他滨，卡培他滨，巯嘌呤，克拉屈滨，硫鸟嘌呤，甲氨喋呤，喷司他丁，羟基脲，或叶酸，腐草霉素，博来霉素或其衍生物或盐，CHPP，BZPP，MTPP，BAPP，似博霉素(liblomycin)，吖啶或其衍生物，利福霉素，放线菌素，甲烯土霉素，喜树碱，例如伊立替康(camptosar)或托泊替康，安吖啶或其类似物，三环甲酰胺，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，例如SAHA，MD-275，曲古抑菌素A，CBHA，LAQ824，或丙戊酸，来自植物的抗-癌药物，例如紫杉醇(泰素)，多西他赛或泰素帝，长春花生物碱，例如诺维本，长春碱，长春新碱，长春地辛或长春瑞滨，环庚三烯酚酮生物碱，例如秋水仙碱或其衍生物，大环内酯，例如美坦辛，安丝菌素或根霉素，抗有丝分裂肽，例如拟茎点霉毒素或多拉司他汀，表鬼臼毒素或鬼臼毒素的衍生物，例如依托泊苷或替尼泊苷，斯的甘辛，抗有丝分裂氨基甲酸酯衍生物，例如考布他汀或amphetinile，丙卡巴肼，蛋白酶体抑制剂，例如硼替佐米，酶，例如天冬酰胺酶，聚乙二醇化的天冬酰胺酶(培天冬酶)或胸苷-磷酸化酶抑制剂，孕激素或雌激素，例如雌莫司汀(T-66)或甲地孕酮，抗-雄激素，例如氟他胺，康士得，尼鲁米特或环丙孕酮乙酸盐，芳香酶抑制剂，例如氨鲁米特，阿那曲唑，福美坦或来曲唑，GNrH类似物，例如亮丙瑞林，布舍瑞林，戈舍瑞林或曲普瑞林，抗-雌激素，例如他莫昔芬或其柠檬酸盐，屈洛昔芬，曲沃昔芬，雷洛昔芬或秦哚昔芬，17β-雌二醇的衍生物，例如ICI 164，384或ICI 182，780，氨鲁米特，福美坦，法倔唑，非那雄胺，酮康唑，LH-RH拮抗剂，例如亮丙立德，甾类，例如泼尼松，泼尼松龙，甲泼尼龙，地塞米松，布替耐德，氟可龙或曲安西龙，干扰素例如干扰素β，白细胞介素例如IL-10或IL-12，抗-TNFa抗体例如依那西普，免疫调节药物，例如沙利度胺，其R-及S-对映异构体及其衍生物，或revimid(CC-5013)，白三烯拮抗药，丝裂霉素C，aziridoquinone，例如BMY-42355，AZQ或EO-9，2-硝基咪唑，例如米索硝唑，NLP-1或NLA-1，硝基吖啶，硝基喹啉，硝基吡唑啉吖啶，″双官能″硝基芳族，例如RSU-1069或RB-6145，CB-1954，氮芥的N-氧化物，例如氧氮芥，氮芥的金属络合物，抗-CD3或抗-CD25抗体，耐受性诱导试剂，双磷酸或其衍生物，例如米诺膦酸或其衍生物(YM-529，Ono-5920，YH-529)，唑来膦酸一水合物，伊班膦酸钠水合物或氯膦酸二钠，硝基咪唑，例如甲硝唑，米索硝唑，苄硝唑或尼莫唑，硝基芳基化合物，例如RSU-1069，硝酰基或N-氧化物，例如SR-4233，卤化嘧啶类似物，例如溴脱氧尿苷，碘脱氧尿苷，硫代磷酸酯，例如WR-2721，光-化学活化的药物，例如卟菲尔钠，光敏素，苯并卟啉衍生物，脱镁叶绿甲酯酸衍生物，部花青540(MC-540)或锡etioporpurin，反模板或反义RNA或DNA，例如奥利美生，非甾族炎症药物，例如乙酰水杨酸，美沙拉秦，布洛芬，萘普生，氟比洛芬，非诺洛芬，芬布芬，酮洛芬，吲哚洛芬，吡洛芬，卡洛芬，奥沙普秦，普拉洛芬，咪洛芬，硫噁洛芬，舒洛芬，阿明洛芬，噻洛芬酸，氟洛芬，吲哚美辛，舒林酸，托美丁，佐美酸，萘丁美酮，双氯芬酸，芬氯酸，阿氯芬酸，溴芬酸，异丁芬酸，醋氯芬酸，阿西美辛，芬替酸，环氯茚酸，依托度酸，奥昔平酸，甲芬那酸，甲氯芬那酸，氟芬那酸，尼氟酸，托芬那酸，二氟尼柳，氟苯柳，吡罗昔康，替诺昔康，氯诺昔康，尼美舒利，美洛昔康，塞来考昔，罗非考昔，或非甾族炎症药物的药学可接受的盐，细胞毒性抗生素，靶向癌细胞表面分子的抗体，例如apolizumab或1D09C3，金属硫蛋白酶抑制剂，例如TIMP-1或TIMP-2，锌，癌基因抑制剂，例如P53及Rb，稀土元素络合物，例如镧系元素的杂环络合物，光-化学治疗剂，例如PUVA，转录因子复合物抑制剂ESX/DRIP130/Sur-2，HER-2表达抑制剂，例如热激蛋白HSP90调节剂格尔德霉素及其衍生物17-烯丙基氨基格尔德霉素或17-AAG，或治疗剂，选自：IM-842，四硫钼酸盐，角鲨胺，combrestatin A4，TNP-470，马立马司他，新伐司他，比卡鲁胺，阿巴瑞克，oregovomab，米妥莫单抗，TLK-286，阿仑珠单抗，替伊莫单抗，替莫唑胺，地尼白介素2，阿地白介素，达卡巴嗪，氟尿苷，普卡霉素，米托坦，哌泊溴烷，普卡霉素，他莫昔芬及睾内酯。优选的化合物包括小分子VEGF受体拮抗剂，例如瓦他拉尼(PTK-787/ZK222584)，SU-5416，SU-6668，SU-11248，SU-14813，AZD-6474，EGFR/HER2拮抗剂，例如CI-1033或GW-2016，EGFR拮抗剂，例如易瑞沙(吉非替尼，ZD-1839)，塔西法(厄洛替尼，OSI-774)，PKI-166，EKB-569，HKI-272或赫赛汀，促细胞分裂原-活化的蛋白激酶拮抗剂，例如BAY-43-9006或BAY-57-9006，阿曲生坦，利妥昔单抗，西妥昔单抗，阿瓦斯丁.TM.(贝伐珠单抗)，IMC-1C11，爱必妥(C-225)，DC-101，EMD-72000，vitaxin，伊马替尼，烷化剂或铂化合物，例如美法仑，环磷酰胺，顺铂，卡铂，奥沙利铂，沙铂，柔红霉素，多柔比星(阿霉素)，多柔比星脂质体(doxil)，表柔比星，伊达比星，嘧啶或嘌呤类似物或拮抗剂或核苷二磷酸还原酶抑制剂，例如阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶(5-FU)，培美曲塞，替加氟/尿嘧啶，吉西他滨，卡培他滨，巯嘌呤，甲氨喋呤，抗-癌药物，例如紫杉醇(泰素)或多西他赛，长春花生物碱，例如诺维本，长春碱，长春新碱，长春地辛或长春瑞滨，抗有丝分裂肽，例如多拉司他汀，表鬼臼毒素或鬼臼毒素衍生物，例如依托泊苷或替尼泊苷，非甾族炎症药物，例如美洛昔康，塞来考昔，罗非考昔，靶向癌细胞表面分子的抗体，例如apolizumab或ID09C3或热激蛋白HSP90调节剂格尔德霉素及其衍生物17-烯丙基氨基格尔德霉素或17-AAG。
[0131] 在另一实施方式中，化学治疗剂选自与下列物质相互作用或结合下列物质的化合物：微管蛋白，合成的小分子VEGF受体拮抗剂，小分子生长因子受体拮抗剂，EGF受体和/或VEGF受体和/或整联蛋白受体或任何其他分类于合成的小-分子的蛋白酪胺酸激酶受体抑制剂，针对EGF受体和/或VEGF受体和/或整联蛋白受体或任何其他蛋白酪胺酸激酶受体的抑制剂(其为融合蛋白)，与核酸相互作用及分类为烷化剂或铂化合物的化合物，与核酸相互作用及分类为蒽环类抗生素的化合物，DNA嵌入剂或作为DNA交联剂，包括DNA小沟结合化合物，抗代谢药，天然存在的，半-合成的或合成的博来霉素类型抗生素，DNA转录酶抑制剂，及尤其是拓扑异构酶I或拓扑异构酶II抑制剂，染色质修饰剂，有丝分裂抑制剂，抗有丝分裂剂，细胞周期抑制剂，蛋白酶体抑制剂，酶，激素类，激素拮抗剂，激素抑制剂，甾类生物合成抑制剂，甾类，细胞因子，缺氧-选择性细胞毒素，细胞因子抑制剂，淋巴因子，针对细胞因子的抗体，口服及肠胃外耐受性诱导试剂，支持剂，化学辐射敏化剂及保护剂，光-化学活化的药物，合成的多核苷酸或寡核苷酸，任选修饰的或缀合的，非甾族抗-炎症药物，细胞毒性抗生素，靶向癌细胞表面分子的抗体，靶向生长因子类或它们的受体的抗体，金属硫蛋白酶抑制剂，金属，癌基因抑制剂，基因转录或RNA翻译或蛋白表达抑制剂，稀土元素络合物，及光-化学治疗剂。
[0132] 在其他实施方式中，化学治疗剂选自：紫杉醇(泰素)，多西他赛，长春花生物碱，例如诺维本，长春碱，长春新碱，长春地辛或长春瑞滨，烷化剂或铂化合物，例如美法仑，环磷酰胺，氧氮磷环类，顺铂，卡铂，奥沙利铂，沙铂，四铂，异丙铂，丝裂霉素，链佐星，卡莫司汀(BCNU)，洛莫司汀(CCNU)，白消安，异环磷酰胺，链佐星，塞替派，苯丁酸氮芥，氮芥，例如氮芥，免疫调节药物，例如沙利度胺，其R-及S-对映异构体及其衍生物，或revimid(CC-5013))，乙烯亚胺化合物，烷基磺酸盐，柔红霉素，多柔比星(阿霉素)，多柔比星脂质体(doxil)，表柔比星，伊达比星，米托蒽醌，安吖啶，更生霉素，偏端霉素或其衍生物，纺锤菌素，pibenzimol，丝裂霉素，CC-1065，多卡米星，普卡霉素，色霉素，橄榄霉素，酞酰苯胺，例如普罗帕脒或茋脒，安曲霉素，吖丙啶，亚硝基脲或其衍生物，嘧啶或嘌呤类似物或拮抗剂或核苷二磷酸还原酶抑制剂，例如阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶(5-FU)，乌拉莫司汀，氟达拉滨，吉西他滨，卡培他滨，巯嘌呤，克拉屈滨，硫鸟嘌呤，甲氨喋呤，喷司他丁，羟基脲，或叶酸，吖啶或其衍生物，利福霉素，放线菌素，甲烯土霉素，喜树碱，例如伊立替康(camptosar)或托泊替康，安吖啶或其类似物，三环甲酰胺，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，例如SAHA，MD-275，曲古抑菌素A，CBHA，LAQ824，或丙戊酸，蛋白酶体抑制剂，例如硼替佐米，小分子VEGF受体拮抗剂，例如瓦他拉尼(PTK-787/ZK222584)，SU-5416，SU-6668，SU-11248，SU-14813，AZD-6474，AZD-2171，CP-547632，CEP-7055，AG-013736，IM-842 或GW-786034，促细胞分裂原-活化的蛋白激酶拮抗剂，例如BAY-43-9006或BAY-57-9006，双EGFR/HER2拮抗剂，例如吉非替尼，厄洛替尼，CI-1033或GW-2016，EGFR拮抗剂，例如易瑞沙(ZD-1839)，塔西法(OSI-774)，PKI-166，EKB-569，HKI-272或赫赛汀，喹唑啉衍生物例如4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-6-{[-4-(N，N-二甲基氨基)-1-氧代-2-丁-烯-1-基]氨基}-7-(-四氢呋喃-3-基氧基)-喹唑啉或4-[(3-氯-4-氟-苯基)氨基]-6-{[4-(均
吗啉-4-基)-1-氧代-2-丁-烯-1-基]氨基}-7-[-(四氢呋喃-3-基)氧基]-喹唑
啉，或其药学可接受的盐，转录因子复合物抑制剂ESX/DRIP130/Sur-2，HER-2表达抑制剂，例如热激蛋白HSP90调节剂格尔德霉素及其衍生物17-烯丙基氨基格尔德霉素或17-AAG，分类于合成的小分子的蛋白激酶受体拮抗剂，例如阿曲生坦，利妥昔单抗，西妥昔单抗，阿瓦斯丁.TM.(贝伐珠单抗)，IMC-1C11，爱必妥(C-225)，DC-101，EMD-72000，vitaxin，伊马替尼，及靶向癌细胞表面分子的抗体，例如apolizumab或1D09C3。
吗啉-4-基)-1-氧代-2-丁-烯-1-基]氨基}-7-[-(四氢呋喃-3-基)氧基]-喹唑
啉，或其药学可接受的盐，转录因子复合物抑制剂ESX/DRIP130/Sur-2，HER-2表达抑制剂，例如热激蛋白HSP90调节剂格尔德霉素及其衍生物17-烯丙基氨基格尔德霉素或17-AAG，分类于合成的小分子的蛋白激酶受体拮抗剂，例如阿曲生坦，利妥昔单抗，西妥昔单抗，阿瓦斯丁.TM.(贝伐珠单抗)，IMC-1C11，爱必妥(C-225)，DC-101，EMD-72000，vitaxin，伊马替尼，及靶向癌细胞表面分子的抗体，例如apolizumab或1D09C3。
[0133] 在一些其他实施方式中，化学治疗剂是降低由一或多种ABC转运子介导的透明质酸糖胺多糖转运的化合物，或药物转运抑制剂，例如：P-糖蛋白(P-gp)抑制剂分子或抑制剂肽，MRP1抑制剂，针对及能封闭ABC转运子的抗体，针对一或多种ABC转运子的反义寡聚体，iRNA，siRNA或适体。根据本发明的P-糖蛋白(P-gp)抑制剂分子之例是zosuquidar(LY335973)，其盐(尤其是三氯化盐)及其同质多象变体，环孢菌素A(也被称为环孢菌素)，维拉帕米或其R-异构体，他莫昔芬，奎尼丁，d-a生育酚聚乙二醇1000琥珀酸盐，VX-710，PSC833，吩 噻 嗪，GF120918(II)，SDZ PSC 833，TMBY，MS-073，S-9788，SDZ 280-446，XR(9051)及这些的功能性衍生物，类似物及异构体。
[0134] D.过继免疫治疗
[0135] 其他方面，至少一种CMV抗原，或编码所述至少一种CMV抗原的核酸，也可提供用于组合物及的方法提供CMV抗原-激发的，抗原呈递细胞，和/或用这些抗原呈递细胞产生的CMV抗原-特异性T淋巴细胞，例如，用作针对表达CMV抗原的细胞的预防性或治疗性应用的免疫调节组合物及方法的活性化合物。
[0136] 因此，一方面，本发明提供制备CMV抗原-激发的，抗原呈递细胞的方法，通过：
[0137] 在对于至少一种CMV抗原被抗原呈递细胞呈递而言足够的条件下，使抗原呈递细胞与至少一种CMV抗原或编码所述至少一种CMV抗原的核酸体外接触。所述至少一种CMV抗原，或编码所述至少一种CMV抗原的核酸如上所述。
[0138] 至少一种CMV抗原，或编码所述至少一种CMV抗原的核酸，可与同质的，基本上同质的，或异质的包括抗原呈递细胞的组合物接触。例如，组合物可包括但不限于全血，新鲜血，或其级分，例如，但不限于，外周血单核细胞，全血的血沉棕黄层级分，红细胞压积，照射的血，树突细胞，单核细胞，巨噬细胞，嗜中性粒细胞，淋巴细胞，天然杀伤细胞，及天然杀伤T细胞。如果，任选地，使用抗原呈递细胞前体，可在足以使前体分化成抗原呈递细胞的适宜培养条件下培养所述前体。优选地，抗原呈递细胞(或，任选地，前体)选自单核细胞，巨噬细胞，骨髓细胞系，B细胞，树突细胞，或郎格尔汉斯细胞。
[0139] 待与抗原呈递细胞接触的至少一种CMV抗原，或编码所述至少一种CMV抗原的核酸的量可由本领域技术人员通过常规实验测定。一般而言，抗原呈递细胞与至少一种CMV抗原，或编码所述至少一种CMV抗原的核酸接触对于细胞而言足够的一定时间，以呈递用于T细胞调节的经加工形式的抗原。在一实施方式中，抗原呈递细胞在至少一种CMV抗原，或编码所述至少一种CMV抗原的核酸的存在下温育小于约一周，例如，约1分钟到约48小时，约2分钟到约36小时，约3分钟到约24小时，约4分钟到约12小时，约6分钟到约8小时，约8分钟到约6小时，约10分钟到约5小时，约15分钟到约4小时，约20分钟到约3小时，约30分钟到约2小时，及约40分钟到约1小时。必要于抗原呈递细胞加工及呈递抗原的抗原或编码所述抗原的核酸的时间及量可，例如使用脉冲示踪法测定，其中接触之后是清洗期，及暴露于读取系统，例如，抗原反应性T细胞。
[0140] 一般而言，必要于抗原呈递细胞在其表面呈递抗原的时间长度可取决于许多因素变化，包括采用的抗原或抗原形式(例如，肽对比编码多核苷酸)，其剂量，及采用的抗原呈递细胞，以及进行抗原装载的条件。这些参数可由本领域技术人员使用常规过程测定。抗原呈递细胞激发效率可通过体外测定T细胞细胞毒性活性，或使用抗原呈递细胞作为CTLs靶来测定。本发明也考虑其他可检测抗原呈递细胞表面有抗原的方法。
[0141] 已知许多将抗原递送到抗原呈递细胞的内源性加工通路的方法。所述方法包括但不限于涉及pH-敏感脂质体，将抗原偶联于有力的佐剂，凋亡细胞递送，将细胞脉冲到树突细胞，将包括抗原的重组嵌合病毒-样粒子(VLPs)递送到树突细胞系的I类MHC加工通路的方法。
[0142] 在一实施方式中，溶解的CMV抗原与抗原呈递细胞温育。在其他实施方式中，至少一种CMV抗原可偶联于溶细胞素，以增强抗原转移进用于递送到I类MHC通路的抗原呈递细胞的胞质溶胶。例示溶细胞素包括：皂苷化合物，例如含皂苷的免疫刺激复合物(ISCOMs)，孔隙-形成毒素(例如，a-毒素)，及革兰氏阳性细菌的天然的溶细胞素，例如利斯特菌溶血素O(LLO)，链球菌溶血素O(SLO)，及产气荚膜梭菌细胞溶素O(PFO)。
[0143] 作为另一实施例，在其他实施方式中，抗原呈递细胞，优选树突细胞及巨噬细胞，可根据本领域中已知的方法分离，及通过本领域中已知的将编码CMV抗原的核酸导入APCs的方法用多核苷酸转染。转染试剂及方法(例如， )也可商购。例如，编码CMV抗原的RNAs可提供在适宜培养基(例如， )，及与APCs接触之前与脂
TM TM
质(例如，阳离子脂质)组合。脂质的非限定例包括LIPOFECTIN ，阳离子脂质体 ，DODAC/DOPE，及CHOL/DOPE。然后可使得到的多核苷酸-脂质复合物与APCs接触。或者，可使用技术(例如电穿孔或磷酸钙转染)将多核苷酸导入APCs。多核苷酸-装载的APCs然后可用于体内或离体刺激细胞毒性T淋巴细胞(CTL)增殖。在一实施方式中，离体扩展的CTL在过继免疫治疗方法中施用于受试者。多核苷酸-装载的抗原呈递细胞刺激CTL反应的能力可通过已知的方法测定，例如通过测定效应细胞裂解靶细胞的能力。使用用例如，RNA装载的抗原呈递细胞的方法及组合物描述于美国专利No.6,306,388，Nair等人，将其通过引用就其产生及使用用RNA装载的APCs的方法的教导并入本文。
TM TM
质(例如，阳离子脂质)组合。脂质的非限定例包括LIPOFECTIN ，阳离子脂质体 ，DODAC/DOPE，及CHOL/DOPE。然后可使得到的多核苷酸-脂质复合物与APCs接触。或者，可使用技术(例如电穿孔或磷酸钙转染)将多核苷酸导入APCs。多核苷酸-装载的APCs然后可用于体内或离体刺激细胞毒性T淋巴细胞(CTL)增殖。在一实施方式中，离体扩展的CTL在过继免疫治疗方法中施用于受试者。多核苷酸-装载的抗原呈递细胞刺激CTL反应的能力可通过已知的方法测定，例如通过测定效应细胞裂解靶细胞的能力。使用用例如，RNA装载的抗原呈递细胞的方法及组合物描述于美国专利No.6,306,388，Nair等人，将其通过引用就其产生及使用用RNA装载的APCs的方法的教导并入本文。
[0144] 另一方面，本发明提供组合物，其包括已在对于至少一种CMV抗原被抗原呈递细胞呈递而言足够的条件下与至少一种CMV抗原或编码所述至少一种CMV抗原的核酸体外接触的抗原呈递细胞。
[0145] 另一方面，本发明提供制备淋巴细胞的方法，所述淋巴细胞特异于至少一种CMV抗原。所述方法包括使淋巴细胞与上述抗原呈递细胞在足以产生能引发针对表达CMV抗原的细胞的免疫应答的CMV抗原-特异性淋巴细胞的条件下接触。因此，抗原呈递细胞也可用于提供淋巴细胞，包括T淋巴细胞及B淋巴细胞，用于引发针对表达CMV抗原的细胞的免疫应答。
[0146] 在一实施方式中，使T淋巴细胞制剂与上述抗原呈递细胞接触一定时间，优选至少约24小时，用于激发T淋巴细胞于被抗原呈递细胞呈递的至少一种CMV抗原。
[0147] 例如，在另一实施方式中，抗原呈递细胞群可与异质的外周血T淋巴细胞群伴随至少一种CMV抗原或包括至少一种CMV抗原的核酸共培养。细胞可共培养一定时间，及对于待被抗原呈递细胞呈递的CMV抗原或它们的经加工形式而言足够的条件下，及抗原呈递细胞激发T淋巴细胞群，以响应表达CMV抗原的细胞。因此，可制备被激发以响应表达CMV抗原的细胞的T淋巴细胞及B淋巴细胞。
[0148] 如本文所述，诱导淋巴细胞呈现免疫应答的能力可通过任何方法测定，包括，但不限于，使用例如CMV抗原-特异性抗原呈递细胞作为CMV抗原-特异性细胞裂解T淋巴细胞(CTL)的靶，体外确定T淋巴细胞细胞裂解活性；测定CMV抗原-特异性T淋巴细胞增殖；及使用，例如，ELISA方法确定B细胞对表达CMV抗原的细胞的反应。
[0149] T淋巴细胞可从任何适宜来源得到，例如外周血，脾脏，及淋巴结。T淋巴细胞可用作粗制剂或作为部分纯化的或基本上纯化的制剂，其可通过标准技术得到，包括，但不限于，涉及使用抗体的免疫磁性或流式细胞术技术的方法。
[0150] 也在本发明的范围内考虑的是已遗传修饰而用于特异性识别表达CMV抗原的细胞的细胞。(例如，经遗传加工以在它们的表面表达细胞-特异性抗体的T-细胞)。在一些实施方式中，抗原-特异性T细胞通过本领域中已知的基因转移技术修饰，以表达一或多种异源基因，例如标记物基因或基因产物可增强或附加特定表型或功能到抗原-特异性T细胞的基因。因此，例如，可在活化的T细胞内响应抗原脉冲的树突细胞表达标记物基因，且使抗原-特异性T细胞的选择性富集及修饰。作为另一实施例，抗原-特异性T细胞可修饰为表达受体(例如，趋化因子受体)，以体外及体内向受体配体迁移。
[0151] 其他方面，本发明提供组合物，其包括上述抗原呈递细胞或淋巴细胞，及药学可接受的载质和/或稀释剂。在一些实施方式中，所述组合物还包括如上所述的佐剂。
[0152] 另一方面，本发明提供引发针对所述表达CMV抗原的细胞的免疫应答的方法，所述方法包括给受试者以足以引发免疫应答的有效量施用上述抗原呈递细胞或淋巴细胞。在一些实施方式中，本发明提供的方法治疗或预防肿瘤形成疾病或与CMV相关的症状，所述方法包括给受试者施用有效量的上述抗原呈递细胞或淋巴细胞。在一实施方式中，抗原呈递细胞或淋巴细胞施用全身，优选通过注射。或者，可局部而非全身施用，例如，经直接注到组织，优选以贮存器或持续的释放制剂。此外，可在靶向的药物递送系统中施用，例如，在用组织-特异性抗体包被的脂质体中。脂质体可靶向及被组织选择性地摄取。在另一实施方式中，本发明提供抗原呈递细胞或淋巴细胞在制备用于引发针对表达CMV抗原的细胞的免疫应答，优选用于治疗或预防癌的药物的用途。
[0153] 因此，本发明的抗原-激发的抗原呈递细胞及用这些抗原呈递细胞产生的抗原-特异性T淋巴细胞可用作用于癌的预防性或治疗性应用的免疫调节组合物中的活性化合物。在一些实施方式中，本发明的CMV抗原-激发的抗原呈递细胞可用于产生用于过继转移给受试者的CD8+CTL，CD4+CTL，和/或B淋巴细胞。因此，例如，CMV抗原-特异性CTLs可在患恶性肿瘤(例如神经胶质瘤)的受试者中以治疗性目的过继转移。
[0154] 上述抗原呈递细胞和/或淋巴细胞可通过本身或组合施用于受试者，用于引发免疫应答，特别用于引发针对表达CMV抗原的细胞的免疫应答。因此，所述基于细胞的组合物有用于治疗或预防癌。细胞可通过引发针对表达CMV抗原的细胞的期望的免疫应答的任何模式导入受试者。此外，抗原呈递细胞和/或淋巴细胞可源于受试者(即，自体细胞)或来自与所述受试者MHC匹配的或错配的不同受试者(例如，同种异体)。注射位点可选自皮下，腹膜内，肌内，真皮内，静脉内，或淋巴内。
[0155] 可用由照护者(例如，医师)选择的细胞数及处理进行抗原呈递细胞及淋巴细胞的单个或多个施用。优选地，抗原呈递细胞和/或淋巴细胞以药学可接受的载质施用。适宜载质可为细胞生长的生长培养基，或任何适宜缓冲培养基，例如磷酸缓冲盐水。细胞可单独施用或作为附加治疗连同其他治疗剂施用。
[0156] 因此，本发明涉及治疗和/或预防表达CMV抗原的细胞，优选CMV-相关的癌细胞的方法，所述方法包括给需要所述治疗或预防的受试者施用治疗/预防有效量的如本文所述的组合物。
[0157] 配制及施用技术可见于Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版。适宜途径可，例如，包括口服，直肠，经粘膜，或肠内施用；肠胃外递送，包括肌内，皮下，髓内注射，以及鞘内，直接心室内，静脉内，腹膜内，鼻内，或眼球内注射。对于注射，本发明的治疗性/预防组合物可在水溶液中配制，优选在生理相容的缓冲液，例如Hank溶液，Ringer溶液，或生理盐水缓冲液中配制。
[0158] F.抗体
[0159] 本发明的组合物也可用于产生靶向表达CMV抗原的细胞的抗体。因此，其他方面，本发明的组合物及方法提供一或多种针对表达CMV抗原的细胞的抗体，抗体本身具有许多用途，例如，被动免疫或对于效应子的靶-特异性递送，以及诊断性测试及基于免疫学结合的试剂盒的用途。因此，在一些实施方式中，本发明提供可用于治疗性和/或诊断性应用的CMV-相关的，癌细胞-特异性抗体。
[0160] 本发明的抗体可用于筛选或诊断性应用。本发明的抗体对于体外及体内诊断性目的有价值。例如，抗体可用于蛋白印迹，免疫沉淀，酶联免疫吸附测定(ELISA)，荧光活化的细胞分选(FACS)，间接免疫荧光显微镜检，免疫组织化学(IHC)等。在一实施方式中，本发明提供确定表达CMV抗原的细胞的免疫学的方法，所述方法包括使细胞与至少一种如本文所述的抗体接触。
[0161] 例如，抗体可用作测定CMV抗原表达细胞检测的诊断剂。本发明的抗体应特别适宜作为给定它们对表达CMV抗原的细胞的结合亲和力的诊断剂。基本上，将包括细胞(例如，癌细胞)的样品与抗体温育足够的时间，以使免疫学相互作用发生。本领域技术人员会认可，这些基本过程中有许多变化。这些变化包括，例如，RIA，ELISA，沉淀，凝集，补体结合及免疫荧光法。优选地，受试抗体将标记，以使检测抗体-细胞免疫复合物。而且，本发明的抗体也对于体外检测及定量表达CMV抗原的细胞有用，或杀及消除来自混合的细胞群的所述细胞作为其他细胞纯化中的一个步骤。
[0162] 用于制备经标记形式的抗体的标记物包括可直接检测的部分，例如一定反应或衍生待检测的放射性标记物及荧光色素，以及部分，例如酶。放射性标记物包括但不限于，99 203 67 68 72 111 113m 97 62 641 52 52m 51 186 188 77 90
Tc， Pb，Ga，Ga，As， In， In，Ru，Cu， Cu，Fe， Mn，Cr， Re， Re，As，Y，
67 169 121 127 142 143 198 199 161 109 165 149 151 153 157 159
Cu， Er，Sn， Te， Pr， Pr， Au， Au， Tb， Pd， Dy， Pm， Pm， Sm， Gd， Gd，
166 172 169 175 177 105 111
Ho， Tm，Yb， Yb，Lu， Rh，及 Ag。放射性标记物可通过目前可用的计数方法之任何检测。
Tc， Pb，Ga，Ga，As， In， In，Ru，Cu， Cu，Fe， Mn，Cr， Re， Re，As，Y，
67 169 121 127 142 143 198 199 161 109 165 149 151 153 157 159
Cu， Er，Sn， Te， Pr， Pr， Au， Au， Tb， Pd， Dy， Pm， Pm， Sm， Gd， Gd，
166 172 169 175 177 105 111
Ho， Tm，Yb， Yb，Lu， Rh，及 Ag。放射性标记物可通过目前可用的计数方法之任何检测。
[0163] 酶标记物可通过目前利用的测热，分光光度计测量，荧光分光光度计测量或气体定量技术之任何检测。酶与有桥分子(例如碳二亚胺，高碘酸盐，二异氰酸盐，戊二醛等)的抗体组合。可用于这些过程的许多酶已知及可利用。例为perioxidase，碱性磷酸酶，β-葡萄糖醛酸糖苷酶，β-D-葡萄糖苷酶，脲酶，葡萄糖氧化酶加过氧化物酶，半乳糖氧化酶，加过氧化物酶及酸性磷酸酶。可使用的荧光物质包括，例如，荧光黄及其衍生物，若丹明及其衍生物，金胺，丹磺酰，伞形酮，luciferia，2，3-二氢酞吖嗪二酮，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，溶菌酶，及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。抗体可通过已知的方法用所述标记物标记。例如，偶联剂，例如醛，碳二亚胺，二马来酰亚胺，安他心，湖泊酰亚胺，双-重氮化联苯胺等可用于用上述荧光，化学发光，及酶标记物标记抗体。各标记技术描述于Morrison，Methods in Enzymology，(1974)，32B，103；Syvanen et al.，J.Biol.Chem.，(1973)，284，3762；and Bolton and Hunter，Biochem J.，(1973)，133，529。
[0164] 抗体及标记的抗体可用于各种免疫成像或免疫测定过程，以检测受试者中有表达CMV抗原的细胞，或监控所述受试者中所述细胞或癌的状态。当用于监控表达CMV抗原的细胞的状态时，可使用定量免疫测定过程。例如，如果所述监控测定周期性地进行，及比较结果，可进行有关是否受试者的肿瘤负荷增加或降低的确定，其中所述肿瘤是CMV-相关的肿瘤。可使用的常见的测定技术包括直接及间接测定。
[0165] 例如，治疗性应用的情况中，抗体可用于抑制涉及疾病进展的靶或造成靶细胞的细胞毒性死亡。而且，所述治疗性抗体可抑制信号转导通路或诱导抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性，补体-依赖性细胞毒性等。
[0166] 本发明的抗体因此提供可(但不需)为瞬时或永久偶联于效应子的(由此形成杂交体分子或嵌合部分)有效靶向部分，及用于引导效应子到特定靶细胞(例如，癌细胞)。
[0167] 效应分子指特异性地转运到靶细胞的分子或分子组。效应分子一般具有待递送到211
靶细胞的特征性活性。效应分子包括但不限于细胞毒素，标记物，放射性核素(例如， At)，配体，抗体，药物，脂质体，表位标签等。优选的效应子包括细胞毒素(例如，假单胞菌属外毒素，白树毒素，蓖麻毒素，相思豆毒蛋白，白喉毒素等)，如本文所述的免疫调节剂，或细胞毒性药物或药物前体，所述情况中，杂交体分子可发挥特异性地靶向细胞毒素到表达CMV抗原的细胞的有力的杀细胞剂的作用。
靶细胞的特征性活性。效应分子包括但不限于细胞毒素，标记物，放射性核素(例如， At)，配体，抗体，药物，脂质体，表位标签等。优选的效应子包括细胞毒素(例如，假单胞菌属外毒素，白树毒素，蓖麻毒素，相思豆毒蛋白，白喉毒素等)，如本文所述的免疫调节剂，或细胞毒性药物或药物前体，所述情况中，杂交体分子可发挥特异性地靶向细胞毒素到表达CMV抗原的细胞的有力的杀细胞剂的作用。
[0168] 效应子之其他例包括但不限于，粒酶，荧光素酶，血管内皮生长因子，β-内酰胺酶，Tr-apo-1，Ang II，TAT，烷化剂，道诺霉素，阿霉素，苯丁酸氮芥，抗代谢药(例如，甲氨喋呤)，头孢他啶A链，a-八叠球菌，油桐(Aleurites Fordii)蛋白，石竹素蛋白，美国商陆蛋白(PAPI，PAPII，及PAP-S)，苦瓜(Momordica Charantia)抑制剂，麻风树毒素，巴豆毒素，肥皂草(Saponaria Officinalis)抑制剂，米托洁林，restrictocoin，酚毒素及依诺霉素。
[0169] 又一实施方式中，效应子可包括：包裹药物(例如，抗-癌药物，例如多柔比星，长春碱，泰素，或其他化学治疗剂，本文所述的)的脂质体，由免疫系统成分刺激束缚细胞的识别的抗原，及特异性结合免疫系统成分及使它们针对表达CMV抗原的细胞的抗体等。
[0170] 其他适宜效应分子包括药剂或含各药剂的包裹系统。因此，杂交体分子的靶向分子可直接附接于待直接递送到表达CMV抗原的细胞的药物。所述药物为本领域技术人员所熟知，及包括但不限于，多柔比星，长春碱，染料木素，反义分子，本文所述的各其他化学治疗剂等。
[0171] 或者，效应分子可为包裹系统，例如病毒壳体，脂质体；或含治疗性组合物，例如药物，核酸(例如，反义核酸)的微团；或优选从直接暴露于循环系统隔离的另一治疗性部分。制备附接到抗体的脂质体的方法为本领域技术人员所熟知。见，例如，美国专利No.4,957,735；Connor，J.et al.(1985)Pharmacol.Ther.，28：341-365。
[0172] G.确定CMV核酸
[0173] 其他方面，本发明提供在受试者中确定CMV核酸，优选在血或其他生物流体中确定CMV DNA，例如，在从受试者获得的血样品中确定亚临床的病毒血症的组合物及方法。因此，在各种实施方式中，所述组合物及方法提供补充包括本文所述的方法的各诊断性和/或治疗性过程及治疗，例如，预防性和/或治疗性处理与癌前细胞，癌细胞，或易感于发展与CMV相关的癌的细胞-类型相关的疾病或病情的有效诊断性，监控，及预后测试/测定。
[0174] 例如，提供在确定经历同种异体骨髓移植(aBMT)的人患者中的CMV复活中可靠的，及有时相比目前使用的临床上获得批准的诊断性CMV PCR测定提前病毒复活检测达6周的扩增方法。也如本文提供的实施例所述，来自手术切除的GBM样本的CMV DNA可使用PCR扩增分析，例如，横跨HCMV基因组中gB基因可变区(区82801-84180，NCBI GenBank登录号No.NC_001347)及随后的DNA测序。
[0175] 在一实施方式中，本发明提供在受试者中确定CMV核酸的方法，所述方法包括：(a)扩增来自生物样品的核酸分子，以获得扩增子，其中所述扩增包括使核酸分子与至少一对包括第一引物及第二引物的引物接触，其中所述扩增子长度约为1000个碱基对(bp)或以下；及(b)确定有扩增子，其中有扩增子指示所述受试者中的CMV核酸。
[0176] 在一些实施方式中，扩增子长度不大于约1000bp，例如，长度不大于约900bp，不大于约800bp，不大于约700bp，不大于约600bp，不大于约500bp，不大于约400bp，不大于约300bp，不大于200bp，不大于约150bp，不大于约100bp，不大于约90bp，不大于约80bp，不大于约70bp，不大于约60bp，不大于约50bp，及不大于约40bp。在一些实施方式中，扩增子长度为200个碱基对(bp)或以下。
[0177] 引物对及它们的相应靶基因的非限定例显示于表1及2。
[0178] 表1：用于确定CMV DNA的人CMV引物对
[0179]
[0180]1
[0181] 在实验室中用NTI Advance 10软件(Invitrogen，Carlsbad，CA)设计引物。
[0182] 表2：对自经历同种异体骨髓移植的患者的外周血样品的定量PCR结果。
[0183]
[0184]
[0185] 1如实时PCR中使用的，探针显示为用荧光团及猝灭剂染料双-标记(5′FAM/3′TAMRA)的。
[0186] 在一实施方式中，第一引物及第二引物足以提供对应于gB(例如，UL55)或MIE基因区的扩增子。但是，可提供对应于CMV核酸的任何区的扩增子的任何引物对也在本发明的范围内。在一些实施方式中，根据本发明使用的引物包括如SEQ ID NO：8～63中所示的核苷酸序列。
[0187] 在另一实施方式中，第一引物及第二引物对应于引物对，其中所述第一引物包括如SEQ ID NO：8所示的第一引物序列，其中所述第二引物包括如SEQ ID NO：9所示的第二引物序列。在其他实施方式中，第一引物及第二引物对应于引物对，其中所述第一引物包括如SEQ ID NO：10所示的第一引物序列，其中所述第二引物包括如SEQID NO：11所示的第二引物序列。
[0188] 在另一实施方式中，第一引物及第二引物对应于引物对，其中所述第一引物包括如SEQ ID NO：16所示的第一引物序列，其中所述第二引物包括如SEQ ID NO：17所示的第二引物序列。在一实施方式中，第一引物及第二引物对应于引物对，其中所述第一引物包括如SEQ ID NO：34所示的第一引物序列，其中所述第二引物包括如SEQID NO：35所示的第二引物序列。
[0189] 在其他实施方式中，本发明提供在受试者中确定CMV核酸的方法，所述方法包括：(a)扩增来自生物样品的核酸分子以获得扩增子，其中扩增包括使核酸分子与如表2中所示的至少一对引物及至少一种相应探针接触。在一实施方式中，所述一对引物具有如SEQ ID NO：67及68所示的序列；及所述相应探针具有如SEQ ID NO：69所示的序列。
[0190] 在一些实施方式中，在所述受试者中确定CMV核酸的方法还包括使生物样品经历速冻。速冻方法为本领域熟知及可使用各种试剂及技术进行，包括，例如，在液氮或醇/干冰(例如，MeOH/干冰)中速冻。
[0191] 优选地，方法还速冻步骤之后包括浓缩核酸。在一实施方式中，浓缩步骤包括在速冻步骤之后沉淀核酸。在另一实施方式中，沉淀包括使核酸与醇接触(例如，EtOH沉淀)。
[0192] 再一实施方式中，确定有扩增子的步骤通过检测扩增子的任何适宜方法进行，例如特征在于具有用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶的至少10倍的检测灵敏度的检测方法。
[0193] 其他方面，本发明提供在受试者中引发针对细胞的免疫应答的方法，所述方法包括：
[0194] (a)扩增来自受试者的生物样品的核酸分子，以获得扩增子，其中所述扩增包括使核酸分子与至少一对包括第一引物及第二引物的引物接触，其中所述扩增子长度约为1000个碱基对(bp)或以下；
[0195] (b)确定有扩增子，其中有扩增子指示所述受试者中的CMV核酸；及
[0196] (c)给所述受试者施用药学可接受的组合物，所述药学可接受的组合物包括至少一种CMV抗原，或编码所述至少一种CMV抗原的核酸，其中所述药学可接受的组合物在施用于受试者时引发针对所述细胞的免疫应答。步骤(a)，(b)，及(c)如上所述。
[0197] 另一方面，本发明提供在受试者中引发针对细胞的免疫应答的方法，所述方法包括：
[0198] (a)扩增来自受试者的生物样品的核酸分子，以获得扩增子，其中所述扩增包括使核酸分子与至少一对包括第一引物及第二引物的引物接触，其中所述扩增子长度约为1000个碱基对(bp)或以下；
[0199] (b)确定有扩增子，其中有扩增子指示所述受试者中的CMV核酸；及
[0200] (c)给受试者施用组合物，所述组合物包括：有效量的抗原呈递细胞，T-淋巴细胞，或两者，其中所述抗原呈递细胞及T淋巴细胞已用致敏-有效量的至少一种CMV抗原体外致敏，其中所述有效量的抗原呈递细胞，T淋巴细胞，或两者足以引发针对所述表达CMV抗原的细胞的免疫应答。
[0201] 一方面，本发明提供降低或抑制表达CMV抗原的细胞生长或扩展的方法，所述方法包括：
[0202] (a)扩增来自受试者的生物样品的核酸分子，以获得扩增子，其中所述扩增包括使核酸分子与至少一对包括第一引物及第二引物的引物接触，其中所述扩增子长度约为1000个碱基对(bp)或以下；
[0203] (b)确定有扩增子，其中有扩增子指示所述受试者中的CMV核酸；及
[0204] (c)给受试者施用治疗或预防有效量的药学可接受的组合物，以降低或抑制所述受试者中所述细胞的生长或扩展。步骤(a)，(b)，及(c)如上所述。
[0205] 再一实施方式中，本发明提供监控对具有表达CMV抗原的细胞的受试者治疗的治疗性功效的方法，所述方法包括：
[0206] (a)在来自受试者的第一生物样品中确定第一量的CMV核酸，其中确定包括：扩增来自生物样品的核酸分子以获得扩增子，其中所述扩增包括使核酸分子与至少一对包括第一引物及第二引物的引物接触，其中所述扩增子长度约为1000个碱基对(bp)或以下，其中有扩增子指示所述受试者中的CMV核酸；
[0207] (b)治疗受试者；
[0208] (c)适宜时期后在从经治疗的受试者获得的第二样品中确定第二量的CMV核酸；及
[0209] (d)比较第一量与第二量，其中第一量与第二量之间的差异指示治疗有效性。
[0210] 在一些实施方式中，步骤(b)中的治疗包括给受试者施用治疗或预防量的如上所述的药物组合物。
[0211] 在其他实施方式中，本发明提供针对对具有针对表达CMV抗原的细胞的活性的药学试剂的确定的测定，所述方法包括：
[0212] (a)在来自受试者的第一生物样品中确定第一量的CMV核酸，其中确定包括：扩增来自生物样品的核酸分子以获得扩增子，其中所述扩增包括使核酸分子与至少一对包括第一引物及第二引物的引物接触，其中所述扩增子长度约为1000个碱基对(bp)或以下，其中有扩增子指示所述受试者中的CMV核酸；
[0213] (b)用药学试剂治疗受试者；
[0214] (c)适宜时期后在从经治疗的受试者获得的第二样品中确定第二量的CMV核酸；及
[0215] (d)比较第一量与第二量，其中当第二量小于第一量时，所述药学试剂具有针对细胞的活性。
[0216] III.试剂盒
[0217] 本发明的组合物可以单元剂量或试剂盒形式供给。试剂盒可包括以分离的容器提供的药学可接受的组合物或其疫苗的各成分，以及包括化学治疗剂的各其他活性成分或试剂。例如，容器可独立地包括至少一种CMV抗原或编码所述至少一种CMV抗原的核酸，从而当与试剂盒的其他成分组合时一起构成以单元剂量或多个剂型的药学可接受的组合物。优选的试剂盒在分离的容器中至少包括抗原来源(例如，至少一种CMV抗原或编码它们的核酸)；及一或多种佐剂(例如，细胞因子)。试剂盒可还在分离的容器中包括生理学可接受的载质，稀释剂，或赋形剂。任选地，试剂盒可还包括递送剂，例如纳米粒子或转染试剂。本发明的包装的组合物及试剂盒也可包括有关储存，制备，及施用的使用说明。一或多种核酸引物根据本发明任选包括在试剂盒中，优选在一或多个分离的容器中提供。
[0218] 本发明将通过实施例进一步详述，但需注意，本发明不限于实施例。【实施例】
[0219] 【实施例1】恶性神经胶质瘤中的HCMV蛋白表达
[0220] 为测定HCMV蛋白是否在恶性神经胶质瘤(MGs)中表达，通过免疫组织化学(IHC)检查选自我们的脑肿瘤银行的来自45GBM样本的石蜡切片。
[0221] 以石蜡块得到人GBM，少突神经胶质瘤，脑膜瘤，室管膜瘤，及正常脑手术样本(有伦理委员会[IRB]批准)。要求基于对仅来自Duke组织银行的Preston Robert Tisch脑肿瘤中心的肿瘤样本的诊断。选择由神经病理学家确证的总45个GBM病例(36个原发性GBM及9个复发的GBM)。组由26个雄性及19个雌性构成，中位年龄51岁。将样本进行切片(6μm)及就内源性过氧化物酶封闭(3％H2O2，持续12分钟)，及在添加单克隆抗体(mAb)之前，用Fc受体阻断剂温育(于20℃ 10分钟；Innovex Biosciences，Richmond，CA，美国)。使用3-阶段辣根过氧化物酶检测系统(BioGenex，San Ramon，CA，USA；Dako，Carpinteria，CA，USA；and Innovex Biosciences)用以下mAbs进行IHC：
抗-IE1-72(1∶25；BioGenex)，抗-pp65(1∶30；Novocastra，Newcastle upon Tyne，UK)，及抗平滑肌肌动蛋白(1∶15；BioGenex)。对于各mAb使用DAB(Innovex Biosciences)作为色原建立抗体参数(例如，后固定，取回，及温育时间)。将从新鲜切除的GBM样本建立14～21天的原发性神经胶质瘤培养物固定及使用冷甲醇渗透，然后用10％中性缓冲的福尔马林后固定10分钟。使用生物素阻断及亲和素阻断(BioGenex)及FC受体阻断(Innovex)进行非特异性结合的阻断。与第一抗体使用同种型对照(小鼠IgG1，小鼠IgG2a；Invitrogen，Carlsbad，CA，美国)，CD45抗体(BDBiosciences，San Jose，CA，美国)，pp28抗体(Virusys，Sykesvile，MD，美国)，糖蛋白B(gB；Virusys)，及HIV p17(Virogen，Watertown，MA，美国)进行温育2小时或于4℃过夜(1μg/ml抗体浓度)，及使用BioGenex
3-阶段辣根检测系统进行检测。
抗-IE1-72(1∶25；BioGenex)，抗-pp65(1∶30；Novocastra，Newcastle upon Tyne，UK)，及抗平滑肌肌动蛋白(1∶15；BioGenex)。对于各mAb使用DAB(Innovex Biosciences)作为色原建立抗体参数(例如，后固定，取回，及温育时间)。将从新鲜切除的GBM样本建立14～21天的原发性神经胶质瘤培养物固定及使用冷甲醇渗透，然后用10％中性缓冲的福尔马林后固定10分钟。使用生物素阻断及亲和素阻断(BioGenex)及FC受体阻断(Innovex)进行非特异性结合的阻断。与第一抗体使用同种型对照(小鼠IgG1，小鼠IgG2a；Invitrogen，Carlsbad，CA，美国)，CD45抗体(BDBiosciences，San Jose，CA，美国)，pp28抗体(Virusys，Sykesvile，MD，美国)，糖蛋白B(gB；Virusys)，及HIV p17(Virogen，Watertown，MA，美国)进行温育2小时或于4℃过夜(1μg/ml抗体浓度)，及使用BioGenex
3-阶段辣根检测系统进行检测。
[0222] 使用特异于HCMV-编码的抗原的mAb，IE1-72进行检测。检测通过IHC检查的45个中的42个(93％)样本中的IE1-72免疫反应性。在肿瘤细胞中及偶尔还在内皮细胞中(图1)检测到强细胞核及细胞质染色。但是，浸润淋巴细胞及周围的正常脑区缺乏针对IE1-72抗体的免疫反应性。为进一步确认HCMV的特异性检测，检查45个病例中的33个的对特异于HCMV基质蛋白的mAb，pp65的反应性。33个病例中的30个(91％)对于肿瘤细胞中但非相邻正常脑区中的pp65有免疫反应性。pp65反应性一般而言相比肿瘤细胞中的IE1-72检测欠普遍，但检查的全部样本中的大部分肿瘤细胞显示针对pp65抗体的免疫反应性(图1；表3)。
[0223] 表3：GBM样本中HCMV检测的总结
[0224]HCMV GBM组织样本 原发性GBM培养物
IE1 IHC 42/45(93％)a 4/4(100％)
pp65 IHC 30/33(91％)a 12/12(100％)
HCMV DNA ISH 16/16(选定的病例) 未测试
gB PCR 21/34(61.7％)b 13/17(70.6％)
IE1 PCR 8/34(24％)b 9/17(53％)
IE1 IHC 42/45(93％)a 4/4(100％)
pp65 IHC 30/33(91％)a 12/12(100％)
HCMV DNA ISH 16/16(选定的病例) 未测试
gB PCR 21/34(61.7％)b 13/17(70.6％)
IE1 PCR 8/34(24％)b 9/17(53％)
[0225] 缩写：
[0226] HCMV，人巨细胞病毒；
[0227] GBM，成胶质细胞瘤多形性；
[0228] IHC，免疫组织化学；
[0229] ISH，原位杂交；
[0230] gB，糖蛋白B；
[0231] PCR，聚合酶链式反应。
[0232] a通过IHC测试的其他肿瘤对于HCMV为阴性：少突神经胶质瘤(n5＝5)；一种病例呈现了内皮细胞中HCMV IE1的病灶检测，但在肿瘤薄壁组织内无反应性)；脑膜瘤(n＝5)；室管膜瘤(n＝5)。
[0233] b从21gB PCR反应及6IE1 PCR分离PCR产物，及通过DNA测序确证特异于HCMV。
[0234] 为排除肿瘤细胞中非特异性检测的可能性，用同种型-及浓度-匹配的对照mAbs在肿瘤切片上进行IHC。以与HCMV-特异性mAbs同一浓度使用的同种型-匹配的，对照抗体呈现在肿瘤细胞内无免疫反应性，及针对平滑肌肌动蛋白的同种型-匹配的mAb展示肿瘤及正常脑切片内针对血管的反应性(图1A)，但在肿瘤细胞内无反应性。对脑膜瘤(n＝5)，室管膜瘤(n＝5)，及少突神经胶质瘤(n＝5)的IE1及pp65检查结果是阴性的，除了在单个病例的少突神经胶质瘤用IE1单克隆抗体观察到病灶内皮染色之外(表3)。
[0235] 【实施例2】恶性神经胶质瘤样本中HCMV的PCR检测
[0236] 如中所示图2，进行11/13高度MGs(9/11GBMS，2/2AAs)中gB的PCR扩增。使用gB特异性引物进行40个PCR循环，以扩增122bp产物。在32个阳性样品中的17中确证HCMV gB序列。
[0237] 【实施例3】存在于恶变前损伤的CMV抗原
[0238] 显示了CMV IE1及pp65蛋白存在于大于约75％的恶变前结直肠息肉及大于约80％的结肠腺癌，但不在相邻非-肿瘤形成结肠活组织检查样品中(见，例如，Harkins等人，Lancet，360：1557(2002))。此外显示，在约48％的低度神经胶质瘤中有CMV，其常进展为高度损伤(见，例如，Scheurer et al.，Detection of Human Cytomegalovirusin Different Histological Types of Gliomas，Acta Neuropathologica，Epublished March
20，2008，Springer Berlin/Heidelberg)。因此，也可提供本发明的组合物及方法用于预防或治疗前肿瘤形成，低度，和/或恶变前损伤，以及进展为肿瘤形成疾病。
20，2008，Springer Berlin/Heidelberg)。因此，也可提供本发明的组合物及方法用于预防或治疗前肿瘤形成，低度，和/或恶变前损伤，以及进展为肿瘤形成疾病。
[0239] 【实施例4】自体DC的离体产生
[0240] 白细胞去除术产物(LP)袋内容放入1L无菌corning瓶中，及加入等体积的磷酸TM缓冲盐水(PBS)以稀释LP。使用离心管，将20ml的Histopaque (Sigma#1077-1)用30ml的稀释的LP轻轻覆盖，然后以1300×g旋转25分钟。除去界面(每管1个界面)；加入PBS至50mL；及细胞以500×g于室温(RT)沉淀5分钟。将上清轻轻倒出，及将沉淀重悬浮于
50mL PBS，然后如上沉淀。将上清轻轻倒出，及将2个沉淀并入50mL PBS中，然后如上沉淀。
再次，将上清轻轻倒出，及将2个沉淀并入50mL PBS，然后如上沉淀。合并沉淀，及用PBS洗涤直到全部细胞合并入1管。
50mL PBS，然后如上沉淀。将上清轻轻倒出，及将2个沉淀并入50mL PBS中，然后如上沉淀。
再次，将上清轻轻倒出，及将2个沉淀并入50mL PBS，然后如上沉淀。合并沉淀，及用PBS洗涤直到全部细胞合并入1管。
[0241] 进行锥虫蓝排除，以通过利用血细胞计数器测定活及死细胞的数。将细胞以8
2×10/mL重悬浮于含2％人AB血清(HABS)(ValleyBiomedical #HP1022)的AIM V培养基(Life Technologies#870112dk)中。将29ml的含2％HABS的AIM V培养基及1ml的PBMC细胞悬浮液加入T-150细胞培养瓶。将全部细胞培养瓶放入单个专用的湿润的温育器，于37℃，5％CO2温育2小时，以使单核细胞前体附着。附着期后，除去非-附着的细胞，及其余单层细胞用PBS洗涤一次。附着的细胞每瓶补加30ml的补充了800U/mL重组人GM-CSF(Berlex Laboratories，Inc.)及500U/mL重组人IL-4(R&DSystems#204-IL/CF)的AIM-V，及在湿润的温育器中于37℃，5％CO2温育7天。
2×10/mL重悬浮于含2％人AB血清(HABS)(ValleyBiomedical #HP1022)的AIM V培养基(Life Technologies#870112dk)中。将29ml的含2％HABS的AIM V培养基及1ml的PBMC细胞悬浮液加入T-150细胞培养瓶。将全部细胞培养瓶放入单个专用的湿润的温育器，于37℃，5％CO2温育2小时，以使单核细胞前体附着。附着期后，除去非-附着的细胞，及其余单层细胞用PBS洗涤一次。附着的细胞每瓶补加30ml的补充了800U/mL重组人GM-CSF(Berlex Laboratories，Inc.)及500U/mL重组人IL-4(R&DSystems#204-IL/CF)的AIM-V，及在湿润的温育器中于37℃，5％CO2温育7天。
[0242] 7-天培养期后，附着的DCs用冷PBS洗涤。加入10ml的无酶的解离缓冲液(Life Technologies #13150-016)，及将DCs于4℃温育10分钟。附着的DC的残留物从瓶冲洗，及与之前收获的DC组合，然后于4℃以500×g沉淀10分钟。用冷PBS洗涤一次后，检查细胞的数量及活力。
[0243] 【实施例5】RNA装载&树突细胞成熟
[0244] 如上所述产生的树突细胞以2.5×107细胞/ml的ViaSpan重悬浮(BelzerUW-CSS，DuPont Pharmaceuticals，Wilmington，DE)。然后将200μL的悬浮液伴随10μg的pp65RNA放入比色杯(GenePulser Cuvette，Bio-Rad#165-2086)，及细胞以300伏电穿
8
孔(BTXElectro Square Porator#ECM830)500μs。将大致1×10 的电穿孔的细胞转移到含50ml的补充了800U/ml的重组人GM-CSF(Berlex实验室，Inc。)及500U/ml重组人IL-4(R&D系统#204-IL/CF)的AIM V的T225瓶中，然后于37℃，5％CO2温育1小时。温育期末，加入适量的含成熟细胞因子的培养基至成熟混合剂中细胞因子终浓度为10ng/ml TNF-a(R&D系统，#210-TA/CF)；10ng/ml IL-1β(R&D系统，#201-LB/CF)；及1000个单位/ml IL-6(R&D系统，#208-IL/CF)。细胞于37℃及5％CO2温育过夜。
8
孔(BTXElectro Square Porator#ECM830)500μs。将大致1×10 的电穿孔的细胞转移到含50ml的补充了800U/ml的重组人GM-CSF(Berlex实验室，Inc。)及500U/ml重组人IL-4(R&D系统#204-IL/CF)的AIM V的T225瓶中，然后于37℃，5％CO2温育1小时。温育期末，加入适量的含成熟细胞因子的培养基至成熟混合剂中细胞因子终浓度为10ng/ml TNF-a(R&D系统，#210-TA/CF)；10ng/ml IL-1β(R&D系统，#201-LB/CF)；及1000个单位/ml IL-6(R&D系统，#208-IL/CF)。细胞于37℃及5％CO2温育过夜。
[0245] 在成熟期末除去上清，及放入在冰上的冷冻的50ml圆锥形管中。其余单层细胞用冰冷的PBS洗涤；与上清合并；然后于4℃以500×g沉淀5分钟。将沉淀重悬浮于10ml的冰冷的PBS，及保持在冰上。加入10～20ml的无酶解离缓冲液(Life
Technologies#13150-016)，及将细胞于4℃保持，及每5分钟监控细胞脱离的过程。将瓶用
10ml的冰冷的PBS洗涤两次，与来自解离缓冲液的细胞合并，及使用500×g沉淀。将细胞与其他细胞组合，及达到50ml及计数。
Technologies#13150-016)，及将细胞于4℃保持，及每5分钟监控细胞脱离的过程。将瓶用
10ml的冰冷的PBS洗涤两次，与来自解离缓冲液的细胞合并，及使用500×g沉淀。将细胞与其他细胞组合，及达到50ml及计数。
[0246] 【实施例6】用于疫苗接种的树突细胞的制备
[0247] 在50mL圆锥形离心管中的成熟的抗原-装载的树突细胞，及缓慢添加25ml的PBS，然后将细胞于22℃以200×g沉淀5分钟。将细胞重悬浮于10ml的PBS及，使用2ml移液器除去100μl悬浮液样品，及使用血细胞计数器及锥虫蓝对细胞计数，如上所述。在4
进行之前，细胞测定为＝70％有活力。将细胞于22℃以500×g沉淀5分钟，及以5×10 细胞/mL重悬浮于0.9％氯化钠。将细胞装入带25G 5/8规格针头的1cc注射器。样品在施用之前送革兰氏染色及内毒素测试。
进行之前，细胞测定为＝70％有活力。将细胞于22℃以500×g沉淀5分钟，及以5×10 细胞/mL重悬浮于0.9％氯化钠。将细胞装入带25G 5/8规格针头的1cc注射器。样品在施用之前送革兰氏染色及内毒素测试。
[0248] 【实施例7】使用CMV pp65-LAMP RNA-装载的DCs疫苗接种患新-诊断的GBMs的受试者
[0249] 切除6周内募集25患新诊断的GBM的患者(各随机化的组内＝3CMV血清阳性患7 7
者)。评定仅1剂量水平的DCs(2×10)及1剂量水平的ALT(3×10/Kg)。随后试验中升
高剂量的决定依赖于此试验中得到的安全性及免疫应答分析。追踪患者直到死亡。如果任何组内的任何2名患者经历药物-相关的IV级或不可逆的III级毒性，则暂停研究。全部患者在切除后经历白细胞去除术，用于收获ALT的PBLs及DCs产生。图3示意疫苗接种流程。
者)。评定仅1剂量水平的DCs(2×10)及1剂量水平的ALT(3×10/Kg)。随后试验中升
高剂量的决定依赖于此试验中得到的安全性及免疫应答分析。追踪患者直到死亡。如果任何组内的任何2名患者经历药物-相关的IV级或不可逆的III级毒性，则暂停研究。全部患者在切除后经历白细胞去除术，用于收获ALT的PBLs及DCs产生。图3示意疫苗接种流程。
[0250] 患者以75mg/m2/d的标准靶向剂量接受放射治疗(RT)及并行的TMZ。辐射期间患进行性疾病及在疫苗接种的时期依赖于补充甾类在生理学水平以上的患者不能耐受TMZ，2
及取代未符合释放标准的其DCs或PBLs。然后其余患者在完成RT后以200mg/m/d的标准靶向剂量接受TMZ的初始循环5天3±1周，及随机化以接受ALT，或不同时用DC#1疫苗。
将DCs真皮内供给，及等分到两个腹股沟区。#2及#3疫苗以2周间隔出现。全部患者再次经历白细胞去除术，用于用基线抗原-特异性细胞及体液免疫应答的特异性评定及#3疫苗后4±2周的后续DC代免疫学监控。然后患者每月疫苗接种，连同随后每5±1周TMZ循环到RT后总6个循环。第1～5天给予TMZ，及第21天±7天给予DCs。TMZ循环后的DC
疫苗接种持续结束。
及取代未符合释放标准的其DCs或PBLs。然后其余患者在完成RT后以200mg/m/d的标准靶向剂量接受TMZ的初始循环5天3±1周，及随机化以接受ALT，或不同时用DC#1疫苗。
将DCs真皮内供给，及等分到两个腹股沟区。#2及#3疫苗以2周间隔出现。全部患者再次经历白细胞去除术，用于用基线抗原-特异性细胞及体液免疫应答的特异性评定及#3疫苗后4±2周的后续DC代免疫学监控。然后患者每月疫苗接种，连同随后每5±1周TMZ循环到RT后总6个循环。第1～5天给予TMZ，及第21天±7天给予DCs。TMZ循环后的DC
疫苗接种持续结束。
[0251] 患者每两个月成像，不接受任何其他描述的抗-肿瘤治疗，及用疫苗接种持续直到进展。如果需要持续疫苗接种，患者经历额外的白细胞去除术用于DCs产生。在#4疫苗，111
患者在腹股沟位点随机化到不同皮肤制剂，及接受 In-标记的DCs，以比较不同皮肤制剂对DC迁移的效应。当进展发生时，患者在腹股沟区双侧接受最终真皮内疫苗接种，及在颌
111
角用 In-标记的DCs，以比较不同疫苗接种位点对DC迁移的效应。作为对于这些患者的部分标准护理，肿瘤进展之后，参与者可经历立体定向的活组织检查或切除。因为此不是研究过程，独立地得到同意。但是，如果得到组织，其用于组织学确认肿瘤进展，及用于评定免疫学细胞浸润，及在肿瘤位点的pp65抗原逸出。
患者在腹股沟位点随机化到不同皮肤制剂，及接受 In-标记的DCs，以比较不同皮肤制剂对DC迁移的效应。当进展发生时，患者在腹股沟区双侧接受最终真皮内疫苗接种，及在颌
111
角用 In-标记的DCs，以比较不同疫苗接种位点对DC迁移的效应。作为对于这些患者的部分标准护理，肿瘤进展之后，参与者可经历立体定向的活组织检查或切除。因为此不是研究过程，独立地得到同意。但是，如果得到组织，其用于组织学确认肿瘤进展，及用于评定免疫学细胞浸润，及在肿瘤位点的pp65抗原逸出。
[0252] 研究包含标准包括：年龄＞18岁；募集之前＜6周有确定的切除的GBM(WHO IV级)，对于任何轴平面中最大直径＜1cm的CT或MRI切除后的残差放射摄影对比度增强；及＞80％的卡诺夫斯基能力状态(KPS)及I～IV的Curran组状态。
[0253] 研究排除标准包括：疫苗接种之前任何时间的柔脑膜或多中心疾病的放射摄影或细胞学证据；不同于甾类，RT，或TMZ的现有的常规抗-肿瘤治疗；研究期间怀孕的或需要哺育(所需的阴性β-HCG测试)；对在第一疫苗接种的时间连续的皮质类甾醇类在生理学水平以上的需求；要求处理的活跃的感染或未解明的发热(＞101.5°F)病；已知的免疫抑制疾病或人免疫缺陷病毒感染；患不稳定或严重的介入性医学状况(例如严重的心脏或肺疾病)的患者；由于不同于淋巴细胞减少的理由而过敏或不能耐受TMZ；或经之前腹股沟淋巴结解剖的患者。
[0254] 调差研究的例示过程包括：用于在DCs上的产生的白细胞去除术及ALT；用抗原装111
载的DCs的真皮内免疫；ALT；用 In标记的抗原装载的DCs的真皮内免疫及SPECT扫描；
及对用标准回忆抗原及抗原装载的及幼稚的DCs的DTH测试。
载的DCs的真皮内免疫；ALT；用 In标记的抗原装载的DCs的真皮内免疫及SPECT扫描；
及对用标准回忆抗原及抗原装载的及幼稚的DCs的DTH测试。
[0255] 与认为是标准护理活性的流程相关的活性包括：外部光束放射治疗；替莫唑胺(TMZ)；MRI；及复发时的活组织检查。
[0256] 患者在用25～50mg苯海拉明及650mg的泰诺前-药物治疗以阻止输注反应后，静脉内(通过位置于你的静脉的导管)接受它们自身的淋巴细胞。接受输血45～90分钟，依赖于重量及接受的细胞的数。给定小注射体积(在＞2个真皮内位置之间分配1mL)及各注射之前DCs严格测试无菌性的事实，感染风险概率相对低。通过生物安全质量保证及测试最小化由于实验室内潜在DCs污染的感染风险。在无菌条件下在专用于处理人细胞的核心组织培养设备内操作全部细胞培养物。注射到患者之前，DCs在巯基乙酸盐肉汤，胰蛋白酶大豆血琼脂，及抑制性萨布罗琼脂中经过无菌性测试。注射后，研究全程监控患者的任何迹象及感染症状。如果怀疑活跃的感染，用适当的抗生素培养及处理患者。
[0257] 用111In放射性标记患者DCs用于相关研究。暴露于患者及卫生保健人员的辐射以推荐的剂量最小，及粗略相当于生活在高海拔城市，例如丹佛13天，或乘4次从纽约到洛杉矶的飞行。因此，不采取特别的辐射预防。得到SPECT图像用于分析。
[0258] MRI期间，患者给予对比度试剂。常规给予试剂，以获得脑的增强的MRI扫描。试剂通过静脉施用，及要求布置IV导管。导管布置类似于流血，除了导管在试剂活跃地递送期间仍在静脉内之外。
[0259] 【实施例8】用CMV pp65RNA装载的DCs治疗的患新-诊断的GBM的患者的肿瘤进展时间(TTP)增加
[0260] DCs通过用GM-CSF及IL-4培养7-天从白细胞去除术产生体外。对于DCs的体外产生而言，PBMCs通过白细胞去除术得到，及转运到细胞处理设备。对于无足够的白细胞去除术静脉接入的患者而言，插入临时的静脉内导管。
[0261] 产生DCs的7天温育末，采取培养基样品用于支原体测试，及然后收获细胞，及用pp65-LAMP mRNA电穿孔(2μg RNA/百万DCs)。将DCs于37℃，5％CO2放入有含GM-CSF+IL-4+TNF-a+IL-6+IL-1β的AIM V培养基的瓶中18～20小时，以成熟。细胞用PBS6
洗涤两次，及以5×10 细胞/mL，在90％自体人AB血清(ValleyBiomedical，Winchester，VA 22602)，10％DMSO及5％葡萄糖中，在控制速度的冷冻器中，以1℃/分钟的速度冷冻。
然后于-135℃保存DCs直到需要。冷冻后，将等份的细胞解冻，及送于耗氧及厌氧细菌培养
6 6
物(1×10DCs)及真菌培养物(1×10DCs)。
洗涤两次，及以5×10 细胞/mL，在90％自体人AB血清(ValleyBiomedical，Winchester，VA 22602)，10％DMSO及5％葡萄糖中，在控制速度的冷冻器中，以1℃/分钟的速度冷冻。
然后于-135℃保存DCs直到需要。冷冻后，将等份的细胞解冻，及送于耗氧及厌氧细菌培养
6 6
物(1×10DCs)及真菌培养物(1×10DCs)。
[0262] 对于各疫苗接种，于37℃快速解冻DCs，用PBS洗涤3次，评定活力，及计数。为进7
行，得到＝70％的细胞活力。将细胞浓度调至4×10 细胞/mL，及将DCs重悬浮于无防腐剂的盐水，及放入带27规格针头的无菌结核菌素注射器中。
行，得到＝70％的细胞活力。将细胞浓度调至4×10 细胞/mL，及将DCs重悬浮于无防腐剂的盐水，及放入带27规格针头的无菌结核菌素注射器中。
[0263] 对于全部DC制剂，将细胞样品在施用之前送革兰氏染色及内毒素测试。不给DC疫苗接种，直到经过内毒素测试(＜5.0酶单位/Kg)，及革兰氏染色为阴性。等份的细胞也6 6
送于耗氧及厌氧细菌培养物(1×10DCs)及真菌培养物(1×10DCs)。
送于耗氧及厌氧细菌培养物(1×10DCs)及真菌培养物(1×10DCs)。
[0264] 起始使用自体pp65RNA装载的DCs的I/II期临床试验。此试验募集了21名经历2
总体切除(＞95％)然后标准外部光束辐射(60Gy)及并行的TMZ(75mg/m/d)6周，然后每
2
月5天TMZ(150～200mg/m/d)持续6个循环的患新诊断的GBM的患者。5名患者辐射期间进展，及不在流程上治疗。2名患者基于同情使用流程外治疗。手术切除后及TMZ起始
7
之前收获的白细胞去除术用于产生DCs，及经pp65RNA电穿孔的自体DCs(2×10DCs i.d.)在首次TMZ循环后头3个剂量每2周施用，及然后在各循环的第21天每月施用。患者通过MRI监控(每2个月)肿瘤进展及每月收集血用于免疫学监控。对照与在源于MD Anderson数据库的ATTAC试验募集的患者的同一合格标准年龄，预后因素符合。
总体切除(＞95％)然后标准外部光束辐射(60Gy)及并行的TMZ(75mg/m/d)6周，然后每
2
月5天TMZ(150～200mg/m/d)持续6个循环的患新诊断的GBM的患者。5名患者辐射期间进展，及不在流程上治疗。2名患者基于同情使用流程外治疗。手术切除后及TMZ起始
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之前收获的白细胞去除术用于产生DCs，及经pp65RNA电穿孔的自体DCs(2×10DCs i.d.)在首次TMZ循环后头3个剂量每2周施用，及然后在各循环的第21天每月施用。患者通过MRI监控(每2个月)肿瘤进展及每月收集血用于免疫学监控。对照与在源于MD Anderson数据库的ATTAC试验募集的患者的同一合格标准年龄，预后因素符合。
[0265] 结果显示于图4。在21个月的追踪中，16名患者中的13名仍活(范围从手术后7.6个月～22个月)，中位TTP为12.5个月，及中位总体生存尚未达到但大于20.1个月，其相比组织对照高度有利(见，例如，Stupp et al.，N.Engl.J.Med.352：987(2005)；III期TMZ/XRT+佐剂TMZ中位TTP为7.1个月，及中位生存为14.6个月)。
[0266] 【实施例9】用CMV pp65RNA-装载的DC疫苗治疗的GMB患者的总体生存增加[0267] RT及并行的每天TMZ(75mg/m2/d)完成后，患者随机化为仅接受DC疫苗接种的及伴随ALT接受第一DC疫苗接种的。随机化通过CMV血清学状态分隔，及分配从已由研究统计学家制备的一组连续密封的包膜使用随机数发生器进行。DC疫苗接种伴随头5天2
(第1～5天)TMZ(200mg/m)循环开始。在第21天±2天的TMZ循环，两个患者组接受用
7
2×10pp65-LAMP mRNA装载的成熟的DCs每2周总3次免疫的真皮内免疫。各免疫等分到腹股沟区。将每侧总体积200μL真皮内递送(SOP-JHS-HDC-CL-012“真皮内施用树突细胞过程”)。过程之细节以适当形式(FORM-JHS-HDC-CL-012)记录。注射使用1.5英寸25规格针头进行。患者免疫后临床监控30分钟～1小时任何不利效果的发展。免疫过程由已完成加强心脏生命支持(ACLS)课程的护士或医师监督。当在严重的过敏反应事件中进行这些免疫时，心脏救护车近旁可用。初始3次疫苗以各2±1周相隔给予。
(第1～5天)TMZ(200mg/m)循环开始。在第21天±2天的TMZ循环，两个患者组接受用
7
2×10pp65-LAMP mRNA装载的成熟的DCs每2周总3次免疫的真皮内免疫。各免疫等分到腹股沟区。将每侧总体积200μL真皮内递送(SOP-JHS-HDC-CL-012“真皮内施用树突细胞过程”)。过程之细节以适当形式(FORM-JHS-HDC-CL-012)记录。注射使用1.5英寸25规格针头进行。患者免疫后临床监控30分钟～1小时任何不利效果的发展。免疫过程由已完成加强心脏生命支持(ACLS)课程的护士或医师监督。当在严重的过敏反应事件中进行这些免疫时，心脏救护车近旁可用。初始3次疫苗以各2±1周相隔给予。
[0268] 第三次疫苗后，患者经历4-小时白细胞去除术用于免疫学监控及DC产生。随后，患者在第21天±2天免疫每循环的TMZ，其每5±1周递送。因此，除了与辐射并行给予的2 2
TMZ(75mg/m/d)之外，给予总6个TMZ添加循环(200mg/m/第1～5天)。
TMZ(75mg/m/d)之外，给予总6个TMZ添加循环(200mg/m/第1～5天)。
[0269] 如果完成TMZ循环而无进展，每5±1周持续DC疫苗接种直到临床或放射摄影进展，无任何其他描述的抗-肿瘤治疗。期间，患者在每次访问时用常规物理及神经学检查，及MMSE测试，及用约束-增强的CT或MRI每8±4周临床监控。各访问时得到外周血，还免疫学监控。
[0270] 进行II期随机化的，预期临床试验，以使用pp65-RNA转染的树突细胞(DCs)评定患新-诊断的GBM的患者中靶向免疫显性的CMV外壳蛋白，pp65的免疫原性及功效。切除2 2
及用并行的TMZ辐射(75mg/m/d)后，患者接受随后的每月循环的TMZ(200mg/m)同时用真
7
皮内疫苗接种，及随机化，以在疫苗接种之前接受ALT(3×10/Kg)。受试者接受疫苗接种，直到有肿瘤进展的迹象。
及用并行的TMZ辐射(75mg/m/d)后，患者接受随后的每月循环的TMZ(200mg/m)同时用真
7
皮内疫苗接种，及随机化，以在疫苗接种之前接受ALT(3×10/Kg)。受试者接受疫苗接种，直到有肿瘤进展的迹象。
[0271] 结果显示于图5。21名患者同意。5名在放射治疗期间进展。无疫苗-相关的，可报道的严重不利的事件(SAEs)。但是，TMZ治疗在第一TMZ循环后在70％的患者中诱导3级淋巴细胞减少(500细胞/mL)。TMZ后，免疫抑制调控T细胞(TReg)
+ ++ + +
(CD4CD25 CD45ROCD127-FOXP3)水平从5.2％(3.3～7.5)增加到11.8％(6.9～13.8)(P＝0.0004；成对的t-检验)。观察到一个几乎完全反应。中位PFS是12.5个月(CI95：10.0，
8)。用CMV pp65RNA装载的DC疫苗处理的患GBM的患者的总体生存有利。6PFS(100％；13名患者中的13名)，12个月生存(92.3％；13名患者中的12名)，及15个月生存(90％；10名患者中的9名)有利地比肩于有类似诊断(见，例如， (63.7周)(Stupp et al.，
TM
N Engl JMed.，352：987(2005))；及Gliadel (59.6周)(Westphal et al.，NeuroOncol.，
5：79-88(2003)))的患者。总体中位生存大于19.7个月。如图6中所示，患GBM的33岁雌性几乎有对与自体淋巴细胞转移组合的CMV pp65RNA-装载的DC疫苗的完全放射摄影反应。MRIs呈现在增强损伤，校正中线偏移，及神经学症状分辨率中的降低。此患者在GBM初次手术切除后21个月时仍存活及良好。
+ ++ + +
(CD4CD25 CD45ROCD127-FOXP3)水平从5.2％(3.3～7.5)增加到11.8％(6.9～13.8)(P＝0.0004；成对的t-检验)。观察到一个几乎完全反应。中位PFS是12.5个月(CI95：10.0，
8)。用CMV pp65RNA装载的DC疫苗处理的患GBM的患者的总体生存有利。6PFS(100％；13名患者中的13名)，12个月生存(92.3％；13名患者中的12名)，及15个月生存(90％；10名患者中的9名)有利地比肩于有类似诊断(见，例如， (63.7周)(Stupp et al.，
TM
N Engl JMed.，352：987(2005))；及Gliadel (59.6周)(Westphal et al.，NeuroOncol.，
5：79-88(2003)))的患者。总体中位生存大于19.7个月。如图6中所示，患GBM的33岁雌性几乎有对与自体淋巴细胞转移组合的CMV pp65RNA-装载的DC疫苗的完全放射摄影反应。MRIs呈现在增强损伤，校正中线偏移，及神经学症状分辨率中的降低。此患者在GBM初次手术切除后21个月时仍存活及良好。
[0272] CMV-特异性多功能细胞及体液免疫应答的初步结果显示患GBM的患者具有CMV-特异性免疫学缺陷(图7～9)。
[0273] 【实施例10】抗原-特异性CD8+及CD4+T细胞可从响应CMVpp65抗原-脉冲的DCs的本体培养物分离
[0274] 为鉴定及分离多克隆抗原-特异性CD4+及CD8+T细胞群，对利用用编码CMV的全长pp65抗原的mRNA转染的DCs刺激的T细胞进行绿色荧光蛋白(GFP)RNA电穿孔。
[0275] 【树突细胞产生，用肽及RNA的抗原装载，及树突细胞成熟】
[0276] 这些实验中使用的全部细胞物质在已给予知情同意后，在Duke大学伦理委员会的批准下从正常自愿者及患恶性神经胶质瘤的患者得到。通过白细胞去除术得到外周血单核细胞(PBMCs)，及于37℃在AIM-V培养基(Invitrogen Life Technologies，Grand Island，NY)中温育1小时而使附着到塑料，然后在补充了粒细胞-巨噬细胞集落-刺激因子(800个单位/ml)及IL-4(500个单位/ml)的AIM-V培养基中培养6天。在第6天7
收获未成熟的树突细胞，洗涤，及以2.5×10/ml重悬浮于Opti-MEM(Invitrogen Life Technologies)。将来自DC培养物的上清保存为条件培养基，待后期使用。细胞使用方波发生器(ECM 830 Electro Square Porator；BTX，Genetronics的分部，SanDiego，CA)在2-mm
6 6
比色杯中对200μl的DCs(5×10 细胞)300V电穿孔500μs。DCs用2.5μg的RNA/10 细胞电穿孔。细胞转移到含1∶1条件树突细胞生长培养基与新鲜培养基的组合的60-mm组织培养皿。细胞与IL-1β(5ng/ml)，肿瘤坏死因子-a(5ng/ml)，IL-6(150ng/ml)，及地诺前列酮(1μg/ml)成熟过夜。IL-4，肿瘤坏死因子-a，IL-1β，及IL-6从R&D系统(Minneapolis，MN)得到；粒细胞-巨噬细胞集落-刺激因子来自Duke大学医学中心(Durham，NC)的药房，及地诺前列酮来自Pharmacia(Erlangen，德国)。就肽刺激而言，将成熟的树突细胞洗涤及重悬浮于1∶1条件培养基，及含10μg/ml浓度的HLA-A2-限制的免疫原性人巨细胞病毒pp65肽NLVPMVATV(pp65495-503)(SEQ ID NO：109)的新鲜培养基(AnaSpec，San Jose，CA)。
收获未成熟的树突细胞，洗涤，及以2.5×10/ml重悬浮于Opti-MEM(Invitrogen Life Technologies)。将来自DC培养物的上清保存为条件培养基，待后期使用。细胞使用方波发生器(ECM 830 Electro Square Porator；BTX，Genetronics的分部，SanDiego，CA)在2-mm
6 6
比色杯中对200μl的DCs(5×10 细胞)300V电穿孔500μs。DCs用2.5μg的RNA/10 细胞电穿孔。细胞转移到含1∶1条件树突细胞生长培养基与新鲜培养基的组合的60-mm组织培养皿。细胞与IL-1β(5ng/ml)，肿瘤坏死因子-a(5ng/ml)，IL-6(150ng/ml)，及地诺前列酮(1μg/ml)成熟过夜。IL-4，肿瘤坏死因子-a，IL-1β，及IL-6从R&D系统(Minneapolis，MN)得到；粒细胞-巨噬细胞集落-刺激因子来自Duke大学医学中心(Durham，NC)的药房，及地诺前列酮来自Pharmacia(Erlangen，德国)。就肽刺激而言，将成熟的树突细胞洗涤及重悬浮于1∶1条件培养基，及含10μg/ml浓度的HLA-A2-限制的免疫原性人巨细胞病毒pp65肽NLVPMVATV(pp65495-503)(SEQ ID NO：109)的新鲜培养基(AnaSpec，San Jose，CA)。
[0277] 【用pp65肽或mRNA脉冲树突细胞及T细胞的活化】
[0278] DCs从HLA-A2+正常自愿者及患恶性神经胶质瘤的患者产生，及于37℃在AIM-V培养基-2％人AB血清中用pp65肽(10μg/ml)脉冲3小时。就用编码pp65的mRNA装载而言，将DCs洗涤及重悬浮于Opti-MEM用于电穿孔。2μg的编码全长HCMV pp65的mRNA6
每1×10DCs用BTX ECM 830电穿孔。DCs用45ml的AIM-V培养基洗涤一次，及以1∶10
6
比(DC∶T细胞)加入自体反应者淋巴细胞。体积调至2×10 细胞/ml，及细胞于37℃在含5％CO2的湿润的气氛中温育。3天后，加入等量的含2％合并的人AB血清加IL-2(10U/ml)的AIM-V培养基，及将细胞以1ml/孔的体积转移到24孔平板。然后，每2～3天评价
6
细胞的生长，及调至1×10 细胞/ml。与pp65-脉冲的DCs共培养8～11天后，收获T细胞，及用编码GFP的mRNA电穿孔。或者，T细胞通过多克隆刺激使用固定的抗-CD3单克隆抗体(Ortho Biotech，Raritan，NJ)(2μg/ml在磷酸-缓冲的盐水[PBS]中在T-150瓶中
6
过夜)刺激。细胞平铺于CD3-包被的平板中的含2％人AB血清(10 细胞/ml)的AIM-V培养基中，及在收获之前培养3～5天。
每1×10DCs用BTX ECM 830电穿孔。DCs用45ml的AIM-V培养基洗涤一次，及以1∶10
6
比(DC∶T细胞)加入自体反应者淋巴细胞。体积调至2×10 细胞/ml，及细胞于37℃在含5％CO2的湿润的气氛中温育。3天后，加入等量的含2％合并的人AB血清加IL-2(10U/ml)的AIM-V培养基，及将细胞以1ml/孔的体积转移到24孔平板。然后，每2～3天评价
6
细胞的生长，及调至1×10 细胞/ml。与pp65-脉冲的DCs共培养8～11天后，收获T细胞，及用编码GFP的mRNA电穿孔。或者，T细胞通过多克隆刺激使用固定的抗-CD3单克隆抗体(Ortho Biotech，Raritan，NJ)(2μg/ml在磷酸-缓冲的盐水[PBS]中在T-150瓶中
6
过夜)刺激。细胞平铺于CD3-包被的平板中的含2％人AB血清(10 细胞/ml)的AIM-V培养基中，及在收获之前培养3～5天。
[0279] 【T淋巴细胞来源】
[0280] 非粘连(NA)细胞在Duke大学伦理委员会批准下给予患者知情同意后从来自患恶性神经胶质瘤的患者及正常自愿者的PBMCs产生。单核细胞来自通过Ficoll-Hypaque梯度分离(LSM；MP Biomedicals，Solon，OH)的外周血分离。
[0281] 【用GFP电穿孔DC-脉冲的pp65肽-刺激的T细胞】
[0282] 编码GFP的mRNA从PGEM4Z/GFP/A64载体(由E.Gilboa友情提供，Duke大学医学中心)制备，如前所述(Zhao等人，血，102：4137(2003))。如上所述使用用pp65肽脉冲的DCs刺激自体T细胞。细胞保持在含10U/ml的IL-2的培养基中，及于37℃温育7天。6
就电穿孔而言，将0.2ml的细胞悬浮液(5×10)与10μg的体外-转录的GFP mRNA混合。
混合物在0.4-cm比色杯(EquiBio；PEQLABBiotechnologie，Erlangen，德国)中使用电穿孔装置以300V及150Mf电穿孔。电穿孔后，将细胞在补充了2％人AB血清的新鲜AIM-V培养基中培养，及过夜温育。电穿孔后24小时时，收获细胞，及就CD8及HLA-A2四聚体阳性染色，及通过流式细胞术分析。
就电穿孔而言，将0.2ml的细胞悬浮液(5×10)与10μg的体外-转录的GFP mRNA混合。
混合物在0.4-cm比色杯(EquiBio；PEQLABBiotechnologie，Erlangen，德国)中使用电穿孔装置以300V及150Mf电穿孔。电穿孔后，将细胞在补充了2％人AB血清的新鲜AIM-V培养基中培养，及过夜温育。电穿孔后24小时时，收获细胞，及就CD8及HLA-A2四聚体阳性染色，及通过流式细胞术分析。
[0283] 【分选的T细胞的扩展】
[0284] 使用如上所述的相同刺激及电穿孔方法，在转染后24小时时，在FACSVantage SE流式细胞仪(BD Biosciences，San Jose，CA)上分选GFP-阳性及阴性T细胞。将细胞放入补充了100U/ml的IL-2的AIM-V培养基中以使扩展。在第0，7，10，14，及17天，使用光学显微镜及锥虫蓝染料排除来计数活细胞。
[0285] 【抗-CD3-活化的T细胞中的GFP表达】
[0286] 电穿孔之前用固定的抗-CD3抗体刺激T细胞48～96小时导致在60～70％的T细胞中高水平的GFP表达，如通过流式细胞术分析(图10A)。
[0287] 【使用GFP的RNA电穿孔的CMV抗原-特异性CD8+T细胞的选择】
[0288] 有效RNA转染的对于T细胞活化的需求可使本体刺激的PBMC培养物中的抗原-特异性T细胞的鉴定。为测定抗原-特异性T细胞中的RNA电穿孔效率，PBMCs用使用HLA-A2-限制的pp65肽脉冲的自体DCs刺激7天。在第7天，将刺激的培养物用GFP RNA电穿孔，及使用HLA-A2pp65四聚体检查抗原-特异性及非特异性T细胞中的GFP表达。前向和侧向散射选通揭示母细胞样形态的活化的淋巴细胞细胞(图11，左上部)。GFP表达显示于大致25％的全部CD8+T细胞(图11，右上部)，及四聚体分析揭示，表达几乎完全局限于pp65-特异性T细胞内(图11，右下部)。表达GFP蛋白的T细胞中，通过四聚体染色
97％鉴定为pp65特异性。此外，多于98％的全部四聚体-阳性CD8+T细胞表达GFP蛋白，表明RNA转染不仅局限于抗原刺激的T细胞(展示精确的特异性；97.40％)，但此处理也有效鉴定全部相关反应者T细胞(展示对于鉴定抗原-特异性T细胞的高灵敏度；对于鉴定全部相关细胞的89.77％灵敏度)。这些结果以3个重复实验确认，有93.10±5.87％的抗原-特异性T细胞转染的平均特异性，及86.45±8.45％的通过GFP表达检测全部四聚体-阳性T细胞的灵敏度。培养于IL-2(10U/ml)的DC-刺激的T细胞中的GFP表达发现持续5～7天(图12A)，表明在快速扩展的T细胞中瞬时表达蛋白的能力。
97％鉴定为pp65特异性。此外，多于98％的全部四聚体-阳性CD8+T细胞表达GFP蛋白，表明RNA转染不仅局限于抗原刺激的T细胞(展示精确的特异性；97.40％)，但此处理也有效鉴定全部相关反应者T细胞(展示对于鉴定抗原-特异性T细胞的高灵敏度；对于鉴定全部相关细胞的89.77％灵敏度)。这些结果以3个重复实验确认，有93.10±5.87％的抗原-特异性T细胞转染的平均特异性，及86.45±8.45％的通过GFP表达检测全部四聚体-阳性T细胞的灵敏度。培养于IL-2(10U/ml)的DC-刺激的T细胞中的GFP表达发现持续5～7天(图12A)，表明在快速扩展的T细胞中瞬时表达蛋白的能力。
[0289] 【使用GFP的RNA电穿孔的CMV抗原-特异性CD8+及CD4+T细胞的富集及扩展】[0290] 为鉴定及分离多克隆CMV抗原-特异性CD4+及CD8+T细胞群，在用使用编码全长pp65抗原的mRNA转染的DCs刺激的T细胞上进行GFP RNA电穿孔。用pp65RNA脉冲的DCs体外刺激后11天时，来自HLA-A2-阳性患者(n＝3)的PBMCs用GFP RNA电穿孔，及通过流式细胞术评价RNA表达动力学(图12A)。基因表达发现在48小时处有峰，及通过转染后第7天降至基线。因此，在重复的实验中，T细胞在第11天在DC刺激后电穿孔，及48小时之后通过流式细胞细胞分选分离GFP-阳性(GFP+)及GFP-阴性(GFP-)T细胞。分选的细胞通过四聚体分析来分析，及细胞因子流式细胞术用于富集CMV抗原-特异性T细胞。等数量的GFP+及GFP-细胞放回入含IL-2(100U/ml)的培养物，及在分选后第7，10，
14，及17天评价扩展。有趣的是，当用IL-2培养时，仅GFP+T细胞能进一步扩展，表明RNA电穿孔可有效分离能从无活性或灭活的T细胞用RNA-脉冲的DCs刺激后进一步体外扩展的T细胞(图3B)。为测定是否GFP表达是简单分离增殖T细胞与无活性细胞，将GFP+及GFP-分选的细胞也用由同种异体饲养细胞(来自不匹配的正常供体的PBMCs)，抗-CD3，及高-剂量IL-2(100U/ml)构成的多克隆扩展平台，在适宜于在14天内产生临床规模T细胞扩展(×1000倍扩展)的快速扩展流程(REP)中刺激。使用REP流程，GFP-及GFP+T细胞均有效扩展，展示RNA转染不分开功能性与非功能性T细胞的能力，而是鉴定在与抗原脉冲的树突细胞共培养以进入有丝分裂细胞周期期间已接受足够的活化的T细胞。
14，及17天评价扩展。有趣的是，当用IL-2培养时，仅GFP+T细胞能进一步扩展，表明RNA电穿孔可有效分离能从无活性或灭活的T细胞用RNA-脉冲的DCs刺激后进一步体外扩展的T细胞(图3B)。为测定是否GFP表达是简单分离增殖T细胞与无活性细胞，将GFP+及GFP-分选的细胞也用由同种异体饲养细胞(来自不匹配的正常供体的PBMCs)，抗-CD3，及高-剂量IL-2(100U/ml)构成的多克隆扩展平台，在适宜于在14天内产生临床规模T细胞扩展(×1000倍扩展)的快速扩展流程(REP)中刺激。使用REP流程，GFP-及GFP+T细胞均有效扩展，展示RNA转染不分开功能性与非功能性T细胞的能力，而是鉴定在与抗原脉冲的树突细胞共培养以进入有丝分裂细胞周期期间已接受足够的活化的T细胞。
[0291] 检查的3个患者样品之一展示HLA-A2-及HLA-B7-限制的pp65-特异性CD8+T细胞的用RNA-脉冲的DCs刺激后扩展。RNA电穿孔及分选后，含95％的HLA-A2-限制的T细胞及98％的HLA-B7-限制的T细胞的GFP+级分，在GFP+级分内呈递20～50倍富集的抗原-特异性T细胞，及展示几乎全部抗原-特异性CD8+T细胞的有效鉴定及分离(图12C)。用2名其他仅展示HLA-A2-限制的pp65T细胞反应性的患者得到类似结果。为测定CMV抗原-特异性CD4+T细胞的富集能力，用未刺激的，葡萄球菌属肠毒素B(SEB)-刺激的，或CMV pp65肽混合剂-刺激的T细胞级分进行细胞因子流式细胞术。阳性对照(SEB-刺激的T细胞)显示GFP-阴性级分中13.69％的CD4+T细胞分泌的IFN-？及22.49％的GFP+CD4+T细胞分泌的IFN-？，证实，两种级分含能响应超抗原的功能性效应子CD4+T细胞。但是，响应CMV肽混合剂而由CD4+T细胞的IFN-？分泌局限于GFP+级分，相比GFP-级分中0.31％的CD4+T细胞，有14.15％的分泌细胞因子的CD4+T细胞(图12D)。
[0292] 结果呈现在分离用pp65-脉冲的DCs刺激的T细胞后，在GFP+级分中抗原-特异性CD4+T细胞的45倍富集；及展示是在用于富集的本体PBMC培养物中鉴定抗原-特异性CD8+及CD4+T细胞的有效方法。此外，鉴定及富集多克隆抗原-特异性CD8+及CD4+T细胞群的能力提供用广抗原识别产生T细胞群的方法及用于过继免疫治疗的效应子功能。
[0293] 【实施例11】抗原-特异性T细胞可修饰为向受体-特异性趋化因子体外及体内迁移
[0294] 树突细胞产生，用肽及RNA的抗原装载，树突细胞成熟，用pp65肽或mRNA脉冲树突细胞，T淋巴细胞来源，及T细胞活化如以上实施例7中所述进行，除了CXCR2mRNA用于电穿孔DC-脉冲的pp65肽-刺激的T细胞之外。CXCR2mRNA从pcDNA3.1+载体(MissouriS&T cDNA Resource Center，Missouri University of Science and Technology，Rolla，MO)制备，及在Psp73-sph/A64载体(也由E.Gilboa友情提供)中表达(Nair et al.，Blood，102：964(2003))。
[0295] 就细胞迁移测定而言，将活化的淋巴细胞(5×105细胞)一式三份放入6孔过滤室板(Beckman Coulter，Fullerton，CA)的上室。将不含细胞因子或含各浓度的IL-8，GRO-a，或UL146的培养基放入下室，及细胞于37℃温育45分钟～1小时。收集下室中的培养基，及细胞离心，及重悬浮于50ml的培养基，及通过锥虫蓝染料排除计数。就测定体内迁移入腹膜腔而言，将未修饰的或CXCR2RNA-转染的T淋巴细胞在PBS中用羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE；Invitrogen，Carlsbad，CA)以1μM(未转染的)及10μM(CXCR2RNA转染的)7
区别标记5分钟，洗涤，及以10 细胞/小鼠静脉内注射到受者NOD/SCID小鼠(Taconic，Hudson，NY)。将1ml的PBS中的1μg的趋化因子(IL-8，UL146，或GRO-a)在T细胞注射后每8小时腹膜内注射持续24小时。处死小鼠，通过用3ml的PBS经腹膜灌洗来收获淋巴细胞，及细胞通过离心浓缩。细胞用缀合藻红蛋白(PE)的抗-人CD45(BD Biosciences)染色，低 高
及通过流式细胞术评价未转染的(CFSE )及CXCR2RNA转染的(CFSE )细胞的蓄积。T细胞群的相对蓄积通过使用用于比较对趋化因子注射的反应的PBS-处理的动物中的蓄积作为基线来确定。就体内迁移测定到CNS而言，将5μl的PBS中的1μg的UL146使用立体定向的框架注入全身麻醉下的小鼠右顶叶，及5μl的PBS注入左顶叶。将CFSE(5μM)-标记
7
的未转染的或CXCR2RNA-转染的T细胞以10 细胞/小鼠注入受者小鼠。6小时之后，处死小鼠及收获脑，及解剖为右及左顶叶。通过于37℃胶原酶消化(在RPMI中1mg/ml)30分钟来制备切碎的组织的单个-细胞消化物(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。通过CFSE-标记的细胞的流式细胞仪分析评定左及右顶叶的单个-细胞悬浮液中的输注的淋巴细胞蓄积；
收集100,000个事件，及通过CFSE-阳性细胞的流式细胞计数来测定浸润T细胞的总数。
区别标记5分钟，洗涤，及以10 细胞/小鼠静脉内注射到受者NOD/SCID小鼠(Taconic，Hudson，NY)。将1ml的PBS中的1μg的趋化因子(IL-8，UL146，或GRO-a)在T细胞注射后每8小时腹膜内注射持续24小时。处死小鼠，通过用3ml的PBS经腹膜灌洗来收获淋巴细胞，及细胞通过离心浓缩。细胞用缀合藻红蛋白(PE)的抗-人CD45(BD Biosciences)染色，低 高
及通过流式细胞术评价未转染的(CFSE )及CXCR2RNA转染的(CFSE )细胞的蓄积。T细胞群的相对蓄积通过使用用于比较对趋化因子注射的反应的PBS-处理的动物中的蓄积作为基线来确定。就体内迁移测定到CNS而言，将5μl的PBS中的1μg的UL146使用立体定向的框架注入全身麻醉下的小鼠右顶叶，及5μl的PBS注入左顶叶。将CFSE(5μM)-标记
7
的未转染的或CXCR2RNA-转染的T细胞以10 细胞/小鼠注入受者小鼠。6小时之后，处死小鼠及收获脑，及解剖为右及左顶叶。通过于37℃胶原酶消化(在RPMI中1mg/ml)30分钟来制备切碎的组织的单个-细胞消化物(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。通过CFSE-标记的细胞的流式细胞仪分析评定左及右顶叶的单个-细胞悬浮液中的输注的淋巴细胞蓄积；
收集100,000个事件，及通过CFSE-阳性细胞的流式细胞计数来测定浸润T细胞的总数。
[0296] 【抗原-特异性T细胞内CXCR2mRNA的表达】
[0297] 检查了CXCR2RNA电穿孔到用pp65-脉冲的DCs刺激的T细胞后，通过表达趋化因子受体CXCR2来调节T细胞迁移功能的能力。使用CXCR2-特异性抗体及流式细胞术监控四聚体-阳性对比四聚体-阴性CD8+T细胞内的CXCR2表达。10～15％的刺激的CD8+T细胞在它们的表面以基线表达CXCR2(图10B)，及CXCR2RNA转染后，大致50％的CMV抗原-特异性T细胞在它们的表面表达CXCR2(图13)。相反，四聚体-阴性T细胞未呈现背景以上的CXCR2表达(10.9％)，表明RNA电穿孔后抗原-特异性T细胞内趋化因子受体的选择性表达。
[0298] 【CXCR2RNA-修饰的T细胞的增强的体外趋化功能】
[0299] 也检查了在Transwell迁移测定中响应CXCR2-特异性配体IL-8，GRO-a，及UL146的未修饰的，GFP RNA-转染的，及CXCR2RNA-转染的T细胞的趋化功能(图14A～C)。CXCR2RNA-转染的T细胞相比未修饰的或GFP RNA-转染的T细胞呈现了针对全部3种配体的剂量-应答性增强的趋化反应。向在许多肿瘤内高水平分泌的IL-8及由人巨细胞病毒产生的趋化因子UL146，及专用于CXCR2的仅有的配体的趋化反应在CXCR2-修饰的T细胞中增加多于300～500％。
[0300] 【CXCR2RNA-修饰的T细胞的增强的体内迁移】
[0301] 为测定CXCR2RNA是否转染进活化的T细胞可体内辅助T细胞迁移，评价了RNA-修饰的T细胞迁移进入已用CXCR2-特异性趋化因子注射的SCID小鼠腹膜腔及CNS。小鼠输注区别地CFSE-标记的未转染的或CXCR2RNA-转染的T细胞后每8小时用趋化因子(1μg/ml)腹膜内注射24小时。处死小鼠及通过经腹膜灌洗来收获细胞，及CXCR2-转染的及未转低染的T细胞蓄积通过对人CD45+细胞选通，通过流式细胞术分析，及评估CFSE 细胞(未转高
染的)对比CFSE 细胞(CXCR2RNA转染的)的相对蓄积。趋化因子-注射的小鼠中T细胞的相对蓄积与PBS-注射的小鼠比较及显示于图15A。结果呈现CXCR2RNA转染的细胞响应UL146及IL-8蓄积。最大趋化反应是对UL146的，其与体外研究的发现平行。在此体内测定中观察到无显著的响应GRO-a的蓄积。
染的)对比CFSE 细胞(CXCR2RNA转染的)的相对蓄积。趋化因子-注射的小鼠中T细胞的相对蓄积与PBS-注射的小鼠比较及显示于图15A。结果呈现CXCR2RNA转染的细胞响应UL146及IL-8蓄积。最大趋化反应是对UL146的，其与体外研究的发现平行。在此体内测定中观察到无显著的响应GRO-a的蓄积。
[0302] 也检查了是否CXCR2RNA修饰可导致T细胞响应UL146在CNS内蓄积。免疫缺陷型小鼠在立体定向的框架引导下在左额顶叶施用单个注射的PBS，或在右额顶叶施用UL146(1μg)。静脉内注射CFSE-标记的未转染的或CXCR2RNA-转染的T细胞，及注射后6小时，收获左及右脑半球，制备单个细胞消化物，及通过流式细胞术评价CFSE-标记的T细胞的检测。如图15B中所示，CXCR2RNA-修饰的T细胞呈现UL146-注射的半球相比PBS-注射的半球增强的浸润，然而未转染的T细胞呈现两侧半球浸润均无显著的差异。CXCR2RNA-修饰的T细胞的优先蓄积在后期时间点观察不到，可能对于通过颅内注射建立的趋化因子的瞬时梯度次要。
[0303] 这些结果显示，CXCR2RNA-修饰的T细胞呈现增强的体外及体内趋化功能，及T细胞的基于RNA的修饰可用于选择性地鉴定及修饰抗原-特异性T细胞。
[0304] 因此，利用了采用信使RNA编码基因的电穿孔的可用于从未转染的T细胞群鉴定及分离转染的T细胞群，以及修饰它们的迁移功能的基因转移技术。使用GFP作为标记物基因的实例，CMV抗原-特异性T细胞容易从用pp65-脉冲的DCs刺激的培养物鉴定及分离，及RNA转染可用于同时分离抗原-特异性CD4+及CD8+T细胞。抗原-特异性T细胞的核酸-介导的转染具有在能通过单个策略(例如趋化因子受体或其他目的表面受体的电穿孔及基于转染的受体表达的细胞分离)同时富集纯度及修饰抗原-特异性T细胞功能的特定优点。编码可调节T细胞功能的蛋白(例如CXCR2)的基因的表达可使用例如，抗原特异性刺激平台、然后RNA电穿孔优先靶向有目的特异性的T细胞。增强T细胞迁移到发炎，病毒感染，或肿瘤进展位点的基因，例如趋化因子受体，代表表达可显著增强过继转移的淋巴细胞功效的一类蛋白。CXCR2仅在小级分的T淋巴细胞中正常表达，及介导向IL-8，GRO-a，及UL146的趋化性，后者是CMV抗原-特异性趋化因子。IL-8已显示在发炎位点增加，以及在神经胶质瘤及其他肿瘤内显著升高。GRO-a在许多恶性肿瘤(包括黑色素瘤，消化道癌，及恶性神经胶质瘤)中表达增加。其神经胶质瘤中的表达与肿瘤级相关，赋予T细胞向GRO-a(跟踪下降侵袭性的高度损伤中有用的效应子)的趋化功能。UL146是由有对CXCR2的特异性的CMV合成的趋化因子。通过UL146-介导的化学吸引将表达CXCR2的CMV抗原-特异性T细胞定位到病毒感染位点可增强免疫治疗功效。
[0305] 附加地，这些研究至少展示，T细胞可使用编码趋化因子受体或其他趋化受体的RNAs定位到，例如目的治疗性位点。这是靶向脑肿瘤，作为CNS展示循环免疫细胞的有限的正常运输的特定用途。其中，此方法也可引导抗原-特异性效应子T细胞到肿瘤生长，病毒感染位点，或用于优先扩展的疫苗位点。
[0306] 【实施例12】定性CMV检测
[0307] 为开发定性CMV检测方法，评价跨10种不同CMV基因的29种不同PCR引物(表1)，用于在来自患新-诊断的GBM的患者的血样品(来自45名患新-诊断的GBM的患者的
223系列血样品)的扩展的同群中检测CMV DNA。
223系列血样品)的扩展的同群中检测CMV DNA。
[0308] 根据Duke大学伦理委员会收集来自正常自愿者(对于健康自愿者(n＝11)中位年龄42；及对于手术对照患者(n＝6)，年龄46)，患新-诊断的GBM的患者(中位年龄52.5(n＝45))，及经历同种异体骨髓移植的患者(中位年龄(n＝5))的外周血。全血等分入冷冻管，及在液氮中速冻，及保存于-130℃直到DNA提取。通过以2000g离心分别肝素化的或非-肝素化的血20分钟收集血浆及血清，及在冷冻管中在液氮中速冻及保存于-130℃直到DNA提取。由患新-诊断的GBM的患者知情同意后手术期间收集肿瘤，切碎及在液氮TM
中速冻。样本保存于-130℃直到DNA提取。DNA从10mg的切碎的组织使用TissueDirect Multiplex PCR系统(GenScript Corporation， Piscataway，NJ)提取。
中速冻。样本保存于-130℃直到DNA提取。DNA从10mg的切碎的组织使用TissueDirect Multiplex PCR系统(GenScript Corporation， Piscataway，NJ)提取。
[0309] DNA从GBM肿瘤样本及人血或血浆或血清用TissueDirectTMMultiplex PCR系统(GenScript Corporation，Piscataway，NJ)提取。对于阳性对照样品，向来自血清阴性自愿者的全血，血清，或血浆添加已知浓度的CMV定量的病毒DNA AD169株(AdvancedBiotechnologies(Cat#08-925-000)，Columbia，MD)。通过将溶液TD-A与溶液TD-B以1∶9比TM混合来制备来自TissueDirect Multiplex试剂盒的裂解溶液。对于DNA提取，评价裂解溶液与样品的各体积比，及将50μl的裂解溶液TD-A/B每样品加入10μl的血(血清或血浆或肿瘤组织)，通过移液器吸吐或敲打/旋转管来良好混合，及短暂旋转。将样品于95℃温育15～30分钟，确保保持盖紧，以阻止由于蒸发损失，直到样品被裂解溶液均匀裂解。
将50μl的溶液TD-C加入各样品，良好混合及以高速在离心机上旋转1分钟及收集上清。
将11μl的5M NaAC或3M NH4AC(裂解的样品体积的1∶10体积)及220μl的100％醇
(EtOH，2体积的样品体积)加入上清，用于沉淀DNA。然后将DNA沉淀在离心机中以全速(～14,000rpm)离心至少10分钟，用70％EtOH洗涤两次，及用10μl的无核酸酶的水或TE缓冲液复原。全部DNA提取在从进行PCR反应的分子生物学实验室的分离的实验室进行。将2～5μl的各样品(相当于从2～5μl的全血，血浆，或血清提取的DNA)加入PCR反应，用于CMV检测。
将50μl的溶液TD-C加入各样品，良好混合及以高速在离心机上旋转1分钟及收集上清。
将11μl的5M NaAC或3M NH4AC(裂解的样品体积的1∶10体积)及220μl的100％醇
(EtOH，2体积的样品体积)加入上清，用于沉淀DNA。然后将DNA沉淀在离心机中以全速(～14,000rpm)离心至少10分钟，用70％EtOH洗涤两次，及用10μl的无核酸酶的水或TE缓冲液复原。全部DNA提取在从进行PCR反应的分子生物学实验室的分离的实验室进行。将2～5μl的各样品(相当于从2～5μl的全血，血浆，或血清提取的DNA)加入PCR反应，用于CMV检测。
[0310] 使用TissueDirectTM Multiplex PCR系统(GenScript Corporation，Piscataway，NJ)根据生产商的使用说明运行定性PCR检测，及通过凝胶电泳可视化。跨10种CMV基因的29种不同引物选自公开文献或用Vector NTI Advance 9软件(Invitrogen，Carlsbad，CA)设计，及通过整合的DNA Technologies(IDT，Coralville，IA)合成。从2～5μl的样品(全血，血清，或血浆)提取DNA，或将肿瘤组织小心加入各50μl的PCR反应。平行使用来自CMV血清阴性供体的样品及无DNA酶的水作为PCR阴性对照。于94℃在iCycler(Bio-Rad，Hercules，CA)上运行PCR 15分钟，94℃40秒钟，退火温度1分钟及72℃1分钟的40个循环，及通过于72℃延伸10分钟来结束。PCR产物通过在1×TBE(Bio-Rad，Hercules，CA)中的标准预凝固的10％的聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad(Cat#345-0053)，Hercules，CA)上电泳来可视化，及用SYBR金核酸凝胶染色(Invitrogen(Cat#S11494)，Carlsbad，CA)染色。有关确认CMVDNA检测，用QIAEXII(Qiagen，Valencia，CA)，根据生产商的流程从凝胶分离一些扩增的DNA条带，及在Duke大学综合癌中心DNA测序设备上测序。序列同一性分析使用NCBI数据库上的BLAST，及使用Vector NTI Advance 10(Invitrogen，Carlsbad，CA)进行样本比对分析。
[0311] 如表1中所示，患GBM的患者的外周血样品中CMV病毒血症的检测率变动于12％～73.5％，取决于PCR测定中利用的引物。gB基因(例如，B-i1i2)中的引物发现对于患GBM的患者外周血中CMV的检测最敏感。在对照泳道(仅水)中无病毒DNA检测，及正常自愿者外周血在几个重复测定之后对于病毒DNA检测为阴性(包括11CMV血清阳性自-10
愿者的17个样品中的0个；p＝8.4×10 ；费歇尔精确检验)。223个血样品的扩展的同群中(223样品中164个阳性)CMV检测率未显著不同于20个阳性血样品中16个的初始发现(p＝0.603；费歇尔精确检验)(数据未显示)。
愿者的17个样品中的0个；p＝8.4×10 ；费歇尔精确检验)。223个血样品的扩展的同群中(223样品中164个阳性)CMV检测率未显著不同于20个阳性血样品中16个的初始发现(p＝0.603；费歇尔精确检验)(数据未显示)。
[0312] 为评估扩增子尺寸对CMV检测率的效应，基于单独的扩增子尺寸，通过Spearman及Pearson相关系数分析比较就全部引物的患GBM的患者血中CMV的总体检测率。设计为给出200bp或以下的扩增子的引物也发现具有CMV检测及更可靠的扩增的更低阈值(表1)。例如，引物gB E1E2(扩增子尺寸268)，gBi1i2(扩增子尺寸144)，及gBi3i4(扩增子尺寸122)全部跨gB基因内的相同DNA区及区别仅在于引物组之间的距离。还用在其他CMV基因内的引物得到了更小的扩增子给出更高检测速度的观察。对于所评估的基因的独立研究的29个引物显示扩增子尺寸及检测率之间的反相关。Pearson相关系数(r＝-0.37622)及Spearman相关系数(r＝-0.41523均显著(分别p＝0.0443及0.0251)。这些结果显示引物选择及扩增子尺寸对患GBM的患者外周血中CMV DNA的检测率的深刻的效应。
[0313] 为研究不经DNA纯化直接从样品PCR扩增的影响，将BloodReadyTM试剂盒TM
(GenScript Corporation，Piscataway，NJ) 与 TissueDirect 试 剂 盒 (GenScript Corporation，Piscataway，NJ)就从全血及肿瘤组织直接扩增DNA进行了比较。PCR扩增可在DNA提取后直接从细胞裂解物进行，或从其他存在于细胞裂解物中的有机分子纯化DNA后进行。
(GenScript Corporation，Piscataway，NJ) 与 TissueDirect 试 剂 盒 (GenScript Corporation，Piscataway，NJ)就从全血及肿瘤组织直接扩增DNA进行了比较。PCR扩增可在DNA提取后直接从细胞裂解物进行，或从其他存在于细胞裂解物中的有机分子纯化DNA后进行。
[0314] 人组织手术后立即保持在冰上，及在小于半小时内切碎成10mg尺寸，然后在液氮中速冻，及保存于-137℃直到使用。患者或正常血以每管10μl等分，及在液氮中速冻，及保存于-137℃直到使用。
[0315] 基因组DNA 制备：使用的TissueDirectTM DNA制 备及扩 增PCR试剂 盒(Cat#L00195；GenScript，Piscataway，NJ)：1.于室温解冻缓冲液TD-A，TD-B及TD-C及解冻后放置在冰上；2.对于各样品，将5μl的TD-A及45μl的TD-B(1∶9比)混合，及旋转以产生50μl的裂解溶液(TD-A/B)每样品；3.将50μl的裂解溶液TD-A/B加入各样品
10mg的组织或10μl的血(血清或血浆)，及通过移液器吸吐或敲打/旋转管良好混合；
4.于65℃温育样品至少10分钟直到发生样品的完全裂解；5.从温育移出管，将50μl的TD-C加入各管，及良好混合；6.以～14,000rpm旋转样品至少1分钟；7.于4℃储存上清(基因组DNA提取物)或用PCR扩增处理；8.在每样品20μl的PCR中使用1.5μl的基因组DNA提取物。
10mg的组织或10μl的血(血清或血浆)，及通过移液器吸吐或敲打/旋转管良好混合；
4.于65℃温育样品至少10分钟直到发生样品的完全裂解；5.从温育移出管，将50μl的TD-C加入各管，及良好混合；6.以～14,000rpm旋转样品至少1分钟；7.于4℃储存上清(基因组DNA提取物)或用PCR扩增处理；8.在每样品20μl的PCR中使用1.5μl的基因组DNA提取物。
[0316] 【PCR扩增】
[0317] A.定性测量：用TissueDirectTM DNA制备及扩增PCR试剂盒(Cat#L00195；TM
GenScript，Piscataway，NJ)或HotMaster Taq PCR系统(Brinkmann，Westbury，NY)进行PCR扩增：
GenScript，Piscataway，NJ)或HotMaster Taq PCR系统(Brinkmann，Westbury，NY)进行PCR扩增：
[0318] 预混剂溶液显示于表4。
[0319] 表4：预混剂
[0320]GenScript Multiplex PCR系统 1×
PCR H2O 8.2μl
正义引物(lug/μl) 0.15μl
反义引物(1ug/μl) 0.15μl
GenScript 2×PCR预混剂 10μl
预混剂体积 18.5μl
待加入的基因组DNA 1.5μl
总体积 20μl
退火温度 60℃
PCR H2O 8.2μl
正义引物(lug/μl) 0.15μl
反义引物(1ug/μl) 0.15μl
GenScript 2×PCR预混剂 10μl
预混剂体积 18.5μl
待加入的基因组DNA 1.5μl
总体积 20μl
退火温度 60℃
[0321] 将1.5μl的基因组DNA溶液加入18.5μl的显示于表4的预混剂，以每管给出20μl的PCR溶液。将PCR管放入Bio-Rad iCycler(Bio-Rad，Milpitas，CA)及如下循环：
94℃5分钟的1个循环(变性)；及40个循环的：94℃40秒钟(变性)/60℃40秒钟(退
火)/72℃40秒钟(延伸)/1个循环的72℃10分钟(延伸)。
94℃5分钟的1个循环(变性)；及40个循环的：94℃40秒钟(变性)/60℃40秒钟(退
火)/72℃40秒钟(延伸)/1个循环的72℃10分钟(延伸)。
[0322] B.定量测量：实时PCR扩增用iQ SYBR绿色超混剂(对于实时为2×混合剂，Bio-Rad Cat。#170-8880)或iQ超混剂(用于实时的2×超混剂，Bio-Rad
Cat.#170-8860)：
Cat.#170-8860)：
[0323] 预混剂溶液显示于表5。
[0324] 表5：预混剂
[0325]GenScript PCR 1×
PCRH2O 16.7μl
iQ SYBR绿色超混剂或有基因特异性探针的iQ超混剂 20μl
正义引物(lug/μl) 0.15μl
反义引物(lug/μl) 0.15μl
预混剂体积 37μl
待加入的基因组DNA 5μl
总体积 40μl
退火温度 60℃
PCR产物bp
PCRH2O 16.7μl
iQ SYBR绿色超混剂或有基因特异性探针的iQ超混剂 20μl
正义引物(lug/μl) 0.15μl
反义引物(lug/μl) 0.15μl
预混剂体积 37μl
待加入的基因组DNA 5μl
总体积 40μl
退火温度 60℃
PCR产物bp
[0326] 将3μl的基因组DNA加入37μl的显示于表5的预混剂，以产生40μl的PCR溶液。将PCR溶液放入Byroad iCycler及如下循环：1个循环的95℃3分钟(变性)；及40个循环：94℃30秒钟(变性)/60℃30秒钟(退火)/72℃30秒钟(延伸)/1个循环的
72℃10分钟(延伸)。
72℃10分钟(延伸)。
[0327] 扩增后，用标准曲线分析实时PCR产物，及数据用持家基因标准化。
[0328] PCR产物检测：基本上如下使用TBE(Cat.#345-0053；BioRad，Hercules，CA)中的TMCriterion 预凝固的10％凝胶(26孔，15μl/孔)：将1×TBE缓冲液加入电泳室达填充线。每样品将2.5μl的DNA装载缓冲液与10μl的PCR产物混合以产生12.5μl等份。将
1.5μl的EZ DNA分子量标准品(100bp MW，BioRad Cat#170-8352，0.05μg/μl，500μl)加入凝胶第一孔。将12.5μl等份的PCR产物加入孔2～26。凝胶于室温(RT)以120伏运行2小时。终结电泳及将各凝胶转移到1×TBE中的25ml的染色缓冲液(SYBR金核酸凝胶染色，Invitrogen/分子探针Cat#511494)。凝胶于室温染色15分钟。使用不同曝光时间拍摄凝胶照片以记录及分析PCR产物。然后从凝胶切出各正确尺寸的PCR产物，及使用QIAEX II(Qiagen，Valencia，CA)提取DNA。提取的DNA然后测序。
1.5μl的EZ DNA分子量标准品(100bp MW，BioRad Cat#170-8352，0.05μg/μl，500μl)加入凝胶第一孔。将12.5μl等份的PCR产物加入孔2～26。凝胶于室温(RT)以120伏运行2小时。终结电泳及将各凝胶转移到1×TBE中的25ml的染色缓冲液(SYBR金核酸凝胶染色，Invitrogen/分子探针Cat#511494)。凝胶于室温染色15分钟。使用不同曝光时间拍摄凝胶照片以记录及分析PCR产物。然后从凝胶切出各正确尺寸的PCR产物，及使用QIAEX II(Qiagen，Valencia，CA)提取DNA。提取的DNA然后测序。
[0329] 如图16中所示，TissueDirectTM试剂盒对于提供来自全血及肿瘤样品的干净的TM及不同扩增的条带是可靠的。也将在小样品体积(10～20μL)上使用TissueDirect试剂盒的PCR结果与2种商业DNA纯化试剂盒： (Qiagen，Valencia，CA)及
(Qiagen，Valencia，CA)(它们对于DNA提取要求更大样品体积
TM
(0.2ml～1.0ml的全血，血清，或血浆))比较。当使用TissueDirect 试剂盒时，相比从更大样品体积纯化DNA，发现病毒DNA检测下限中无差异(未显示)，表明更简单的及更快的直接DNA提取方法等同有效及可优选，特别是当样品体积有限时。从GBM患者血清的HCMV gp64实时PCR的熔解曲线坐标图显示于图17，及从GBM患者血清的HCMV gp64实时PCR的PCR扩增循环坐标图显示于图18。
(Qiagen，Valencia，CA)(它们对于DNA提取要求更大样品体积
TM
(0.2ml～1.0ml的全血，血清，或血浆))比较。当使用TissueDirect 试剂盒时，相比从更大样品体积纯化DNA，发现病毒DNA检测下限中无差异(未显示)，表明更简单的及更快的直接DNA提取方法等同有效及可优选，特别是当样品体积有限时。从GBM患者血清的HCMV gp64实时PCR的熔解曲线坐标图显示于图17，及从GBM患者血清的HCMV gp64实时PCR的PCR扩增循环坐标图显示于图18。
[0330] 而且，使用1∶5，1∶10，及1∶20的样品：缓冲液比比较了样品与组织裂解缓冲液的比，及通过使用gB引物组(B-i1i2；表1)在34个已知的阳性样品上PCR检测CMV DNA来评估。如表6中所示，1∶5的样品与缓冲液比给出有适当尺寸(122bp)的强，清晰条带的检测，而其他比例或者给出降低的强度的条带信号或导致检测出非特异性条带。
[0331] 表6：CMV DNA检测中提取缓冲液及缓冲液：样品比的比较。
[0332]
[0333] 在全部病例中，主条带对应于gB基因产物。而且，SYBR金核酸凝胶染色(Invitrogen，Carlsbad，CA)相比溴化乙锭染色给出病毒DNA条带的增强的可视化(未显示)。选择1∶5比用于全部随后分析。
[0334] 本文所述的单个步骤流程内从样品基因组DNA提取期间无病毒DNA的损失，及这特异性地对于检测样品中低水平的病毒DNA是非常重要，由此节省珍贵的患者样品。对于TM全部血，血清及组织采用GenScript TissueDirect Multiplex PCR系统以确保病毒DNA完全释放进入裂解缓冲液(TD-A/B)。因此，我们能获得无病毒DNA损失及限制针对PCR的抑制剂。而且，设计PCR引物以制备有高基因特异性的更小的扩增子(小于200bp)，及无与人基因组的交叉结合，用于在高人基因组含量内更有效及敏感的PCR扩增，及无纯化，以移除针对PCR的抑制剂。PCR条件以非常低水平的靶DNA扩增基因特异性产物。相比常规用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶电泳后检测灵敏度增加至少10倍。将SYBR金染色及数字照片一并优化，由此避免将分离的PCR产物从琼脂糖凝胶转移到用于基因特异性探针杂交的膜，以检测病毒DNA或NEST PCR。
[0335] 【实施例13】定量CMV检测
[0336] 为提供用于特异性地测量患者样品中的CMV DNA水平的定量PCR测定，就定量CMV DNA拷贝数使用实时PCR评价了添加了CMV全基因组DNA的全血中的15种基因-特异性引物及探针组合(表2)的作为阳性对照标准物。
[0337] 在 Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems，Foster City，CA)中根据生产商的使用说明运行实时PCR检测。跨5种CMV基因的15种不同基因-特异性引物&探针组选自公开文献或在实验室用引物3.0软件(Applied Biosystems，Foster City，CA)设计，及通过集成的DNA技术(IDT，Coralville，IA)合成。将来自2～5μl的样品(全血，血清，或血浆)的DNA加入各50μL PCR反应。PCR在7900HT(Applied Biosystems，Foster City，CA)上根据生产商的标准流程以指定的退火温度运行。拷贝数用SDS 2.3软件(AppliedBiosystems，Foster City，CA)基于标准曲线从CMV定量的病毒DNA分析。
[0338] 如表2中所示，gB引物/探针组gB21/22/23显示：用于使用基因组CMV DNA的有限稀释液检测CMV标准品的最低阈值，来自患GBM的患者的外周血样本中CMV DNA检测的最大频率，及评估的探针及引物组的最早的对数扩增循环(Ct值)。
[0339] 评估的15种引物/探针组合中有显著不同的Ct值，Ct值变动于31.5～38.1。此显示检测血中同一浓度的CMV DNA标准品中各引物/探针的灵敏度中超过100倍的差异。引物/探针组之间的灵敏度差异导致使用欠敏感的探针组合以有限水平的CMV标准品假阴性及也导致来自患GBM的患者的血样品中的假阴性(表2)。
[0340] 【实施例14】经历同种异体骨髓移植物的患者中病毒复活的检测
[0341] 为进一步检查描述于实施例12及13的定性和/或定量PCR方法，就经历同种异体骨髓移植(aBMT)后的病毒复活，评价了连续监控患者中CMV病毒血症的检测。
[0342] 使用本发明的定性及定量PCR测定，及也在Duke临床微生物学实验室使用CMV UL54分析物-特异性试剂(ASR)测试(Roche诊断，Indianapolis，IN)评价了aBMT后从5名患者连续得到的30个血清样品。测试实验室盲于ASR测试结果，及通过凝胶电泳分析后定性实验室PCR测定评价患者样品是否它们是阳性或阴性，及使用定量实验室PCR测定测定了拷贝数/ml的血中病毒载量。
[0343] 由Duke大学医学中心的临床微生物学实验室进行通过ASR测试的CMV DNA检测，及定性及定量PCR测试显示于表7。
[0344] 表7：实验室PCR测试与诊断性PCR测定的比较
[0345]# 患者 收集日 Roche UL54 ASR 实验室定量PCR gB 实验室定性PCR gB
1 AB 6月20日 1121 424 阳性
2 AB 6月27日 2998 254 阳性
3 AB 7月4日 3150 237 阳性
4 AW 1月10日 0 187 阳性
5 AW 2月7日 0 45 阳性
6 BH 5月30日 0 0 阴性
7 BH 6月6日 0 0 阴性
8 BH 6月13日 0 0 阴性
9 BH 6月20日 0 375 阳性
10 BH 6月27日 0 0 阴性
11 BH 7月4日 0 0 阴性
12 BH 7月11日 0 0 阴性
13 BH 7月18日 0 1781 阳性
14 BH 7月25日 0 196 阳性
15 BH 8月1日 1561 262 阳性
16 FD 6月27日 0 0 阴性
17 FD 7月11日 0 0 阴性
18 FD 7月18日 0 0 阴性
19 FD 7月25日 6335 649 阳性
20 FD 8月1日 5705 1640 阳性
21 JAG 5月10日 0 0 阴性
22 JAG 7月18日 0 0 阳性
23 JAG 7月25日 0 0 阴性
24 JAG 8月1日 0 305 阴性
25 OptiQuant 5,000 nt 206 阳性
26 OptiQuant 500,000 nt 7739 阳性
27 TB 6月27日 0 0 阳性
28 TB 7月6日 0 0 阳性
29 TB 7月25日 0 0 阴性
30 TB 8月1日 0 0 阴性
1 AB 6月20日 1121 424 阳性
2 AB 6月27日 2998 254 阳性
3 AB 7月4日 3150 237 阳性
4 AW 1月10日 0 187 阳性
5 AW 2月7日 0 45 阳性
6 BH 5月30日 0 0 阴性
7 BH 6月6日 0 0 阴性
8 BH 6月13日 0 0 阴性
9 BH 6月20日 0 375 阳性
10 BH 6月27日 0 0 阴性
11 BH 7月4日 0 0 阴性
12 BH 7月11日 0 0 阴性
13 BH 7月18日 0 1781 阳性
14 BH 7月25日 0 196 阳性
15 BH 8月1日 1561 262 阳性
16 FD 6月27日 0 0 阴性
17 FD 7月11日 0 0 阴性
18 FD 7月18日 0 0 阴性
19 FD 7月25日 6335 649 阳性
20 FD 8月1日 5705 1640 阳性
21 JAG 5月10日 0 0 阴性
22 JAG 7月18日 0 0 阳性
23 JAG 7月25日 0 0 阴性
24 JAG 8月1日 0 305 阴性
25 OptiQuant 5,000 nt 206 阳性
26 OptiQuant 500,000 nt 7739 阳性
27 TB 6月27日 0 0 阳性
28 TB 7月6日 0 0 阳性
29 TB 7月25日 0 0 阴性
30 TB 8月1日 0 0 阴性
[0346] 通过凝胶电泳后分离DNA条带及DNA测序确认阳性结果，表明通过我们的PCR测试无假阳性。分析后，通过ASR测试的来自这些患者的临床诊断性评估的结果不盲。PCR测试在认为是阳性的CMV病毒血症的全部病例中是阳性的，通过由临床微生物学实验室进行的Roche CMV UL54 ASR qPCR测试表明，通过本发明的PCR测试无假阴性。但是，本发明的PCR测试在通过临床诊断性测试检测病毒复活之前在几个患者样品中检测病毒DNA(表7)。有时，病毒血症在第一阳性结果之前6周通过临床诊断性测定检测。这些结果通过扩增的条带的DNA测序确认为真阳性，及使用NCBI DNA数据库鉴定为CMV。
[0347] 这些结果显示，本发明的实验室PCR方法对于检测CMV DNA是精确的，及能检测经历Roche UL54ASP测定的检测阈值以下的aBMT的患者中的病毒复活。这些结果强调显示此测定作为更容易，更快的，及更敏感检测测定CMV DNA检测的实用性，及保证进一步研究以确证此测定用于预防性监控处于CMV疾病风险的患者，以及研究CMV与疾病(例如恶性肿瘤及动脉粥样硬化)的关联关系(其中检测已有争议)的用途。
[0348] 【实施例15】来自GBM肿瘤样本的gB(UL55)DNA测序鉴定病毒基因型
[0349] 通过gB(UL55)基因的株可变区的PCR扩增及DNA测序研究与GBM肿瘤相关的病毒株同一性。使用gBi1i2引物组扩增来自22个手术切除的GBM样本的CMV gB DNA，通过凝胶电泳分析DNA，及将扩增的条带切下及使其经历DNA测序。使用NCBI DNA数据库就序列同一性及与CMV gB匹配的全部DNA搜索DNA序列。通过检查NCBI数据库就DNA序列同一性测定株同一性及gB家族。有最高程度的同源性的株列于表8。
[0350] 表8：对于22名GBM患者的HCMV gBi1i2 PCR序列的同一性和株
[0351]
[0352] 来自GBM样本的病毒DNA序列比对揭示有DNA临床分离物之间的序列变化达17％的来自GBM样本的独特病毒分离物(图19；及表8)。也进行扩增的病毒DNA gB序列与NCBI数据库内的gB基因序列的比较，及与gB基因型的最高程度的同源性列于表8。揭示了与多于一种gB基因型的同源性的同一程度的情况，病毒株同一性用于测定gB基因型。几种分离物与多于一种株的CMV具有相同程度的同源性，及因此列出。来自GBM样本的株发现与Merlin(gB 1同种型)，N1(gB 1同种型)，Towne(gB 1同种型)，AD169(gB 2同种型)，及N12(gB 2同种型)株的CMV同源，表明在肿瘤样本中检测出不同病毒分离物，及也表明GBM肿瘤允许被gB1及gB2家族基因型的CMV病毒感染。观察到的gB基因型分布是gB116/22(72.7％)；gB26/22(27.3％)。
[0353] 这些结果至少展示，GBM样本更频繁地被gB1基因型的CMV株感染。几种患者肿瘤样品隔月再分析，始于从冷冻保存的全血或肿瘤样本DNA提取，PCR扩增，及gB扩增子的DNA测序，及得到同一病毒序列展示这些样品中病毒鉴定的保真度。
[0354] CMV与各疾病状态之间的关联关系的一致的检测已有争议，以由各实验室对于病理学损伤内有病毒DNA及蛋白的报道的冲突的发现。以上实施例说明基于PCR的测定及手术切除的GBM样本中检测的22种CMV临床株的株同一性。根据本发明的用于可靠的CMV检测的CMV PCR测试的开发也可尤其辅助研究CMV在神经胶质瘤发展及进展中起到的作用。发现GBM肿瘤被匹配gB1及gB2基因型(主要是gB1型)病毒株感染。gB1基因型是见于美国临床CMV感染的最普遍的病毒家族，但缺失任何用匹配gB3或gB4基因型的临床株的最高程度的同源性的检测提示，可有对于恶性神经胶质瘤的CMV感染的限制的向性。
[0355] 肿瘤样本中病毒DNA的检测不是平凡的问题，甚至在已良好建立关联关系的肿瘤(例如人乳头状瘤病毒相关的宫颈癌)的情况中，且检测可常在通过标准PCR测定的灵敏度限制或其以下。如上所述，测定增强患新-诊断的GBM的患者的血及肿瘤中的低水平的病毒DNA的检测的几种参数。
[0356] 跨gB基因内的相同DNA区且区别仅在于引物组之间的距离的引物展示扩增子尺寸依赖性病毒DNA检测频度。在此区内具有最小扩增子尺寸的gBi1i2及gB-i3i4也给出最高检测率，表明假阴性结果可由更大DNA片段的无效的扩增所致，且不是当病毒DNA可有限时样品中病毒DNA的缺乏所致。跨11种不同基因的29种独立来源的CMV引物组的分析展示扩增子尺寸与CMV DNA检测率之间的反相关。这些结果提示，通过其他有限量的病毒DNA的假阴性PCR检测可由于无效的提取及扩增条件所致，且不可必然被认为是结论性的。而且，提取及扩增条件可解释假阴性导致病毒DNA检测。
[0357] 大部分扩增产物通过DNA测序确认，且在全部病例中，CMV特异性DNA扩增。而且，为从样品更有效释放病毒DNA，将血在液氮中速冻，然后在添加裂解缓冲液后，以相比推荐TM的温度65℃的更高温度(95℃)，通过TissueDirect 试剂盒温育。也为浓缩DNA及消除常存在于粗样品提取物中的PCR抑制剂，在DNA提取后合并EtOH沉淀步骤。就定性PCR而言，聚丙烯酰胺凝胶与SYBR金染色的组合提供相比用溴化乙锭染色的常规琼脂糖凝胶至少10倍的增加的PCR检测灵敏度。此增加的灵敏度使不使用更集约化的流程(例如套式PCR或印迹的DNA的基因特异性探针杂交)而检测。此测定具有能利用小体积的样本(10～
20μL)的附加的优势，使样品的重复分析及可有限的患者样品的保存。此外，经历骨髓移植的患者中的评估展示测定能相比目前可用的诊断性PCR测试早先检测免疫抑制的患者中的病毒复活。
20μL)的附加的优势，使样品的重复分析及可有限的患者样品的保存。此外，经历骨髓移植的患者中的评估展示测定能相比目前可用的诊断性PCR测试早先检测免疫抑制的患者中的病毒复活。
[0358] 已报道，CMV在许多疾病过程包括癌，动脉粥样硬化，及炎性肠病中具有关联关系及可能的病原性作用。但是，CMV及这些疾病的检测在研究者的实验室之间有变化显著。可利用小体积的血及组织样本的相对简单及增强的扩增检测方法可使CMV与所述疾病过程的关联关系的更可靠的确定。
[0359] 【序列表】
[0360] <110>Duke University
[0361] Sampson，John
[0362] Mitchell，Duane
[0363] <120>用于引发免疫应答的组合物，方法及试剂盒
[0364] <130>D118 1050PCT
[0365] <150>61/074,582
[0366] <151>2008-06-20
[0367] <160>109
[0368] <170>PatentIn版3.5
[0369] <210>1
[0370] <211>561
[0371] <212>PRT
[0372] <213>人巨细胞病毒
[0373] <400>1
[0374] Met Glu Ser Arg Gly Arg Arg Cys Pro Glu Met Ile Ser Val Leu Gly[0375] 1 5 10 15
[0376] Pro Ile Ser Gly His Val Leu Lys Ala Val Phe Ser Arg Gly Asp Thr[0377] 20 25 30
[0378] Pro Val Leu Pro His Glu Thr Arg Leu Leu Gln Thr Gly Ile His Val[0379] 35 40 45
[0380] Arg Val Ser Gln Pro Ser Leu Ile Leu Val Ser Gln Tyr Thr Pro Asp[0381] 50 55 60
[0382] Ser Thr Pro Cys His Arg Gly Asp Asn Gln Leu Gln Val Gln His Thr[0383] 65 70 75 80
[0384] Tyr Phe Thr Gly Ser Glu Val Glu Asn Val Ser Val Asn Val His Asn[0385] 85 90 95
[0386] Pro Thr Gly Arg Ser Ile Cys Pro Ser Gln Glu Pro Met Ser Ile Tyr[0387] 100 105 110
[0388] Val Tyr Ala Leu Pro Leu Lys Met Leu Asn Ile Pro Ser Ile Asn Val[0389] 115 120 125
[0390] His His Tyr Pro Ser Ala Ala Glu Arg Lys His Arg His Leu Pro Val[0391] 130 135 140
[0392] Ala Asp Ala Val Ile His Ala Ser Gly Lys Gln Met Trp Gln Ala Arg[0393] 145 150 155 160[0394] Leu Thr Val Ser Gly Leu Ala Trp Thr Arg Gln Gln Asn Gln Trp Lys[0395] 165 170 175
[0396] Glu Pro Asp Val Tyr Tyr Thr Ser Ala Phe Val Phe Pro Thr Lys Asp[0397] 180 185 190
[0398] Val Ala Leu Arg His Val Val Cys Ala His Glu Leu Val Cys Ser Met[0399] 195 200 205
[0400] Glu Asn Thr Arg Ala Thr Lys Met Gln Val Ile Gly Asp Gln Tyr Val[0401] 210 215 220
[0402] Lys Val Tyr Leu Glu Ser Phe Cys Glu Asp Val Pro Ser Gly Lys Leu[0403] 225 230 235 240[0404] Phe Met His Val Thr Leu Gly Ser Asp Val Glu Glu Asp Leu Thr Met[0405] 245 250 255
[0406] Thr Arg Asn Pro Gln Pro Phe Met Arg Pro His Glu Arg Asn Gly Phe[0407] 260 265 270
[0408] Thr Val Leu Cys Pro Lys Asn Met Ile Ile Lys Pro Gly Lys Ile Ser[0409] 275 280 285
[0410] His Ile Met Leu Asp Val Ala Phe Thr Ser His Glu His Phe Gly Leu[0411] 290 295 300
[0412] Leu Cys Pro Lys Ser Ile Pro Gly Leu Ser Ile Ser Gly Asn Leu Leu[0413] 305 310 315 320[0414] Met Asn Gly Gln Gln Ile Phe Leu Glu Val Gln Ala Ile Arg Glu Thr[0415] 325 330 335
[0416] Val Glu Leu Arg Gln Tyr Asp Pro Val Ala Ala Leu Phe Phe Phe Asp[0417] 340 345 350
[0418] Ile Asp Leu Leu Leu Gln Arg Gly Pro Gln Tyr Ser Glu His Pro Thr[0419] 355 360 365
[0420] Phe Thr Ser Gln Tyr Arg Ile Gln Gly Lys Leu Glu Tyr Arg His Thr[0421] 370 375 380
[0422] Trp Asp Arg His Asp Glu Gly Ala Ala Gln Gly Asp Asp Asp Val Trp[0423] 385 390 395 400[0424] Thr Ser Gly Ser Asp Ser Asp Glu Glu Leu Val Thr Thr Glu Arg Lys[0425] 405 410 415
[0426] Thr Pro Arg Val Thr Gly Gly Gly Ala Met Ala Gly Ala Ser Thr Ser[0427] 420 425 430
[0428] Ala Gly Arg Lys Arg Lys Ser Ala Ser Ser Ala Thr Ala Cys Thr Ser[0429] 435 440 445
[0430] Gly Val Met Thr Arg Gly Arg Leu Lys Ala Glu Ser Thr Val Ala Pro[0431] 450 455 460
[0432] Glu Glu Asp Thr Asp Glu Asp Ser Asp Asn Glu Ile His Asn Pro Ala[0433] 465 470 475 480[0434] Val Phe Thr Trp Pro Pro Trp Gln Ala Gly Ile Leu Ala Arg Asn Leu[0435] 485 490 495
[0436] Val Pro Met Val Ala Thr Val Gln Gly Gln Asn Leu Lys Tyr Gln Glu[0437] 500 505 510
[0438] Phe Phe Trp Asp Ala Asn Asp Ile Tyr Arg Ile Phe Ala Glu Leu Glu[0439] 515 520 525
[0440] Gly Val Trp Gln Pro Ala Ala Gln Pro Lys Arg Arg Arg His Arg Gln[0441] 530 535 540
[0442] Asp Ala Leu Pro Gly Pro Cys Ile Ala Ser Thr Pro Lys Lys His Arg[0443] 545 550 555 560[0444] Gly
[0445] <210>2
[0446] <211>906
[0447] <212>PRT
[0448] <213>人巨细胞病毒
[0449] <400>2
[0450] Met Glu Ser Arg Ile Trp Cys Leu Val Val Cys Val Asn Leu Cys Ile[0451] 1 5 10 15
[0452] Val Cys Leu Gly Ala Ala Val Ser Ser Ser Ser Thr Ser His Ala Thr[0453] 20 25 30
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[0478] Arg Tyr Val Thr Val Lys Asp Gln Trp His Ser Arg Gly Ser Thr Trp[0479] 225 230 235 240[0480] Leu Tyr Arg Glu Thr Cys Asn Leu Asn Cys Met Leu Thr Ile Thr Thr[0481] 245 250 255
[0482] Ala Arg Ser Lys Tyr Pro Tyr His Phe Phe Ala Thr Ser Thr Gly Asp[0483] 260 265 270
[0484] Val Val Tyr Ile Ser Pro Phe Tyr Asn Gly Thr Asn Arg Asn Ala Ser[0485] 275 280 285
[0486] Tyr Phe Gly Glu Asn Ala Asp Lys Phe Phe Ile Phe Pro Asn Tyr Thr[0487] 290 295 300
[0488] Ile Val Ser Asp Phe Gly Arg Pro Asn Ala Ala Pro Glu Thr His Arg[0489] 305 310 315 320[0490] Leu Val Ala Phe Leu Glu Arg Ala Asp Ser Val Ile Ser Trp Asp Ile[0491] 325 330 335
[0492] Gln Asp Glu Lys Asn Val Thr Cys Gln Leu Thr Phe Trp Glu Ala Ser[0493] 340 345 350
[0494] Glu Arg Thr Ile Arg Ser Glu Ala Glu Asp Ser Tyr His Phe Ser Ser[0495] 355 360 365
[0496] Ala Lys Met Thr Ala Thr Phe Leu Ser Lys Lys Gln Glu Val Asn Met[0497] 370 375 380
[0498] Ser Asp Ser Ala Leu Asp Cys Val Arg Asp Glu Ala Ile Asn Lys Leu[0499] 385 390 395 400[0500] Gln Gln Ile Phe Asn Thr Ser Tyr Asn Gln Thr Tyr Glu Lys Tyr Gly[0501] 405 410 415
[0502] Asn Val Ser Val Phe Glu Thr Ser Gly Gly Leu Val Val Phe Trp Gln[0503] 420 425 430
[0504] Gly Ile Lys Gln Lys Ser Leu Val Glu Leu Glu Arg Leu Ala Asn Arg[0505] 435 440 445
[0506] Ser Ser Leu Asn Ile Thr His Arg Thr Arg Arg Ser Thr Ser Asp Asn[0507] 450 455 460
[0508] Asn Thr Thr His Leu Ser Ser Met Glu Ser Val His Asn Leu Val Tyr[0509] 465 470 475 480[0510] Ala Gln Leu Gln Phe Thr Tyr Asp Thr Leu Arg Gly Tyr Ile Asn Arg[0511] 485 490 495
[0512] Ala Leu Ala Gln Ile Ala Glu Ala Trp Cys Val Asp Gln Arg Arg Thr[0513] 500 505 510
[0514] Leu Glu Val Phe Lys Glu Leu Ser Lys Ile Asn Pro Ser Ala Ile Leu[0515] 515 520 525
[0516] Ser Ala Ile Tyr Asn Lys Pro Ile Ala Ala Arg Phe Met Gly Asp Val[0517] 530 535 540
[0518] Leu Gly Leu Ala Ser Cys Val Thr Ile Asn Gln Thr Ser Val Lys Val[0519] 545 550 555 560[0520] Leu Arg Asp Met Asn Val Lys Glu Ser Pro Gly Arg Cys Tyr Ser Arg[0521] 565 570 575
[0522] Pro Val Val Ile Phe Asn Phe Ala Asn Ser Ser Tyr Val Gln Tyr Gly[0523] 580 585 590
[0524] Gln Leu Gly Glu Asp Asn Glu Ile Leu Leu Gly Asn His Arg Thr Glu[0525] 595 600 605
[0526] Glu Cys Gln Leu Pro Ser Leu Lys Ile Phe Ile Ala Gly Asn Ser Ala[0527] 610 615 620
[0528] Tyr Glu Tyr Val Asp Tyr Leu Phe Lys Arg Met Ile Asp Leu Ser Ser[0529] 625 630 635 640[0530] Ile Ser Thr Val Asp Ser Met Ile Ala Leu Asp Ile Asp Pro Leu Glu[0531] 645 650 655
[0532] Asn Thr Asp Phe Arg Val Leu Glu Leu Tyr Ser Gln Lys Glu Leu Arg[0533] 660 665 670
[0534] Ser Ser Asn Val Phe Asp Leu Glu Glu Ile Met Arg Glu Phe Asn Ser[0535] 675 680 685
[0536] Tyr Lys Gln Arg Val Lys Tyr Val Glu Asp Lys Val Val Asp Pro Leu[0537] 690 695 700
[0538] Pro Pro Tyr Leu Lys Gly Leu Asp Asp Leu Met Ser Gly Leu Gly Ala[0539] 705 710 715 720[0540] Ala Gly Lys Ala Val Gly Val Ala Ile Gly Ala Val Gly Gly Ala Val[0541] 725 730 735
[0542] Ala Ser Val Val Glu Gly Val Ala Thr Phe Leu Lys Asn Pro Phe Gly[0543] 740 745 750
[0544] Ala Phe Thr Ile Ile Leu Val Ala Ile Ala Val Val Ile Ile Thr Tyr[0545] 755 760 765
[0546] Leu Ile Tyr Thr Arg Gln Arg Arg Leu Cys Thr Gln Pro Leu Gln Asn[0547] 770 775 780
[0548] Leu Phe Pro Tyr Leu Val Ser Ala Asp Gly Thr Thr Val Thr Ser Gly[0549] 785 790 795 800[0550] Ser Thr Lys Asp Thr Ser Leu Gln Ala Pro Pro Ser Tyr Glu Glu Ser[0551] 805 810 815
[0552] Val Tyr Asn Ser Gly Arg Lys Gly Pro Gly Pro Pro Ser Ser Asp Ala[0553] 820 825 830
[0554] Ser Thr Ala Ala Pro Pro Tyr Thr Asn Glu Gln Ala Tyr Gln Met Leu[0555] 835 840 845
[0556] Leu Ala Leu Ala Arg Leu Asp Ala Glu Gln Arg Ala Gln Gln Asn Gly[0557] 850 855 860
[0558] Thr Asp Ser Leu Asp Gly Gln Thr Gly Thr Gln Asp Lys Gly Gln Lys[0559] 865 870 875 880[0560] Pro Asn Leu Leu Asp Arg Leu Arg His Arg Lys Asn Gly Tyr Arg His[0561] 885 890 895
[0562] Leu Lys Asp Ser Asp Glu Glu Glu Asn Val
[0563] 900 905
[0564] <210>3
[0565] <211>491
[0566] <212>PRT
[0567] <213>人巨细胞病毒
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[1055] tcgttgtttg tgatgttgga cgcc 24
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[1060] <220>
[1061] <223>寡核苷酸
[1062] <400>51
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[1065] <211>24
[1066] <212>DNA
[1067] <213>人工序列
[1068] <220>
[1069] <223>寡核苷酸
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[1073] <211>24
[1074] <212>DNA
[1075] <213>人工序列
[1076] <220>
[1077] <223>寡核苷酸
[1078] <400>53
[1079] tgaagtgcaa ctgggcaatg agtg 24
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[1081] <211>24
[1082] <212>DNA
[1083] <213>人工序列
[1084] <220>
[1085] <223>寡核苷酸
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[1092] <220>
[1093] <223>寡核苷酸
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[1098] <212>DNA
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[1106] <212>DNA
[1107] <213>人工序列
[1108] <220>
[1109] <223>寡核苷酸
[1110] <400>57
[1111] tgaagtgcaa ctgggcaatg agtg 24
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[1113] <211>24
[1114] <212>DNA
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[1124] <220>
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[1132] <220>
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[1154] <212>DNA
[1155] <213>人工序列
[1156] <220>
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[1162] <212>DNA
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[1203] <213>人工序列
[1204] <220>
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[1355] <213>人工序列
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[1506] <212>DNA
[1507] <213>人工序列
[1508] <220>
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[1514] <212>DNA
[1515] <213>人工序列
[1516] <220>
[1517] <223>寡核苷酸
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[1529] 1 5