用于蛋白质、肽和其他分子的改进的F-18标记方法和组合物

摘要

本申请公开了用于例如PET成像技术的F-18标记分子的组合物和合成方法以及用途。在特定的实施方式中，标记的分子可以是肽或蛋白质，虽然其他类型的分子(包括但不限于核酸适体、寡核苷酸和核酸)可被标记并用于此类成像研究。在优选的实施方式中，F-18标记可通过形成金属络合物并将F-18-金属络合物结合至螯合部分(比如DOTA，NOTA，DTPA，TETA或NETA)而与靶向分子缀合。在其他的实施方式中，金属可首先与螯合基团缀合，随后F-18结合至金属。在其他优选的实施方式中，F-18标记的部分可包含可靶向的缀合物，其可与双特异性或多特异性抗体联合使用，以将F-18靶向至与疾病、医疗状况或病原体相关的细胞或组织上表达的抗原。示例性结果显示F-18标记的可靶向缀合物肽于37℃下可在人血清中稳定数小时，有足够的时间进行PET成像分析。

权利要求

1.一种用F-18标记分子的方法，其包括：

a)使F-18和金属反应形成F-18金属络合物；和

b)将F-18金属络合物连接至分子，形成一种或多种可施用于受试者的F-18标记的分子。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述络合物连接至所述分子上的螯合部分。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述分子是蛋白质或肽。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述金属选自：铝、镓、铟、镥和铊。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述的F-18标记的分子在水溶液中稳定。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述的F-18标记的分子在血清中稳定。

7.如权利要求2所述的方法，其中螯合部分选自：DOTA，TETA，NOTA，NETA或NOTA的衍生物。

8.如权利要求3所述的方法，其中所述肽是IMP 449(NOTA-ITC苄基-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2)。

9.如权利要求1所述的方法，其进一步包括：不从未标记的分子中分离所述F-18标记的分子而将所述F-18标记的分子施用于受试者。

10.如权利要求1所述的方法，进一步包括：

c)从未标记的分子中分离所述F-18标记的分子得到纯化的F-18标记的分子；和d)将纯化的F-18标记的分子施用于受试者。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述纯化的F-18标记的分子从所述方法一开始的

1小时内制备得到。

12.如权利要求10所述的方法，进一步包括利用PET扫描使受试者体内纯化的F-18标记的分子的分布进行成像。

13.一种用F-18标记分子的方法，其包括：

a)使F-18和硼反应形成F-18硼络合物；和

b)将F-18硼络合物连接至分子，形成一种或多种可施用于受试者的F-18标记的分子。

14.一种用F-18标记分子的方法，其包括在允许F-18与金属结合的条件下将F-18添加至所述金属标记的分子。

15.一种用F-18标记分子的方法，其包括在允许F-18与硼结合的条件下将F-18添加至硼标记的分子。

16.一种F-18标记的蛋白质或肽，其包括连接至所述蛋白质或肽的F-18金属络合物。

17.如权利要求16所述的F-18标记的蛋白质或肽，其中所述的金属选自：铝、镓、铟、镥和铊。

18.一种F-18标记的蛋白质或肽，其包括连接至所述蛋白质或肽的F-18硼络合物。

19.一种通过正电子成像术(PET)的F-18成像方法，其包括：a)使F-18和铝、镓、铟、镥或铊反应形成F-18络合物；

b)将F-18络合物连接至分子，形成一种或多种F-18标记的分子；

c)在其中所述标记的分子被定位至一种或多种细胞、组织或器官的条件下，将所述F-18标记的分子施用于受试者；和d)通过PET扫描对所述F-18标记的分子的分布进行成像。

20.如权利要求19所述的方法，其中不从未标记的分子中分离所述F-18标记的分子而将所述F-18标记的分子施用于受试者。

21.如权利要求19所述的方法，进一步包括：

e)在F-18标记的分子施用于受试者之前，将所述F-18标记的分子从未标记的分子中分离得到纯化的F-18标记的分子。

22.如权利要求19所述的方法，其中所述F-18标记的分子的成像分布可以表明是否存在疾病。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述疾病选自：实体瘤(癌、肉瘤、黑素瘤、神经胶质瘤、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、前列腺癌)、造血癌(白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)、自身免疫疾病、神经退行性疾病、阿尔茨海默病、心脏病、心肌梗塞、充血性心力衰竭、心肌坏死、血栓症、中风、炎症、动脉硬化、类风湿性关节炎、红斑狼疮、AIDS和病原体感染。

24.如权利要求19所述的方法，其中所述的F-18标记的分子用于受体成像。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述受体是血管形成受体，所述F-18标记的分子

18

是缀合Al- F的RGD-NOTA。

26.如权利要求19所述的方法，其中所述F-18标记的分子用于肿瘤成像。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述F-18标记的分子是F-18标记的蛙皮素。

28.如权利要求26所述的方法，其中所述F-18标记的分子是抗体或其片段，选自如：hLL1、hLL2、hImmu31、hPAM4、hRS7、hA19、hA20、hMN-14、hMu-9、hMN-3、hMN-15和hL243。

29.如权利要求19所述的方法，其中所述F-18标记的分子是F-18标记的NOTA，所述F-18标记的NOTA用于肾血流成像。

29.如权利要求19所述的方法，其中所述F-18标记的分子使用抗体、抗体片段、或抗体构建体靶向目标位点。

30.如权利要求19所述的方法，其中所述F-18标记的分子使用双特异性抗体靶向目标位点。

31.如权利要求30所述的方法，进一步包括：

i)将双特异性抗体施用于受试者，所述双特异性抗体具有至少一个针对可靶向构建体的结合位点和至少一个针对靶向抗原的结合位点，其中所述靶向抗原的存在指示疾病或病症，所述可靶向构建体是F-18标记的分子；和ii)在施用可靶向构建体之前，允许足量的时间以使未与靶向抗原结合的双特异性抗体从循环中清除。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述靶向抗原是肿瘤相关抗原。

33.如权利要求31所述的方法，其中所述靶向抗原存在于病原生物上。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述病原体是病毒、细菌、真菌、酵母或微生物。

35.如权利要求34所述的方法，其中，

所述病毒选自：人免疫缺陷病毒(HIV)、疱症病毒、巨细胞病毒、狂犬病病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、仙台病毒、猫白血病病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、人血清细小样病毒、猿猴病毒40、呼吸道合胞病病毒、小鼠乳癌病毒、水痘带状疱疹病毒、登革热病毒、风疹病毒、麻疹病毒、腺病毒、人T细胞白血病病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、水泡性口炎病毒、辛德比斯病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、疣病毒和蓝舌病毒；或所述细菌选自：无乳链球菌、嗜肺军团菌、化脓性链球菌、大肠杆菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎球菌、乙型流感嗜血杆菌、梅毒螺旋体、莱姆病螺旋体、铜绿假单胞菌、麻风分支杆菌、流产布鲁杆菌、结核分枝杆菌和破伤风梭菌。

36.如权利要求32所述的方法，其中靶向抗原选自：结肠特异性抗原-p(CSAp)、癌胚抗原(CEA)、CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD45、CD66a-d、CD67、CD74、CD79a、CD80、CD138、HLA-DR、Ia、Ii、MUC 1、MUC 2、MUC3、MUC 4、NCA、EGFR、HER 2/neu受体、TAG-72、EGP-1、EGP-2、A3、KS-1、Le(y)、S100、PSMA、PSA、腱糖蛋白、叶酸受体、VEGFR、EGFR、PDGFR、FGFR、PlGF、ILGF-1、坏死抗原、IL-2、IL-6、T101、MAGE或这些抗原的组合。

37.如权利要求36所述的方法，其中所述的双特异性抗体包括抗体或其片段，选自：hLL1、hLL2、hImmu31、hPAM4、hRS7、hA19、hA20、hMN-14、hMu-9、hMN-3、hMN-15和hL243。

38.一种用于F-18标记的试剂盒，包括：

a)金属或硼，以与F-18形成络合物；

b)任选地，包含一个或多个螯合部分的靶向肽，以与F-18络合物结合。

39.如权利要求38所述的试剂盒，进一步包括一种或多种缓冲剂。

40.如权利要求38所述的试剂盒，进一步包括辐射分解保护剂。

41.如权利要求40所述的试剂盒，其中所述辐射分解保护剂是抗坏血酸。

42.如权利要求38所述的试剂盒，其中所述肽是IMP 449。

43.如权利要求38所述的试剂盒，其中所述金属是铝、镓、铟、镥或铊。

44.如权利要求38所述的试剂盒，进一步包括一种双特异性抗体，所述抗体具有一个针对靶向肽的结合特异性和另一个针对靶抗原的结合特异性。

45.如权利要求44所述的试剂盒，其中所述靶抗原是肿瘤相关抗原。

46.如权利要求45所述的试剂盒，其中所述靶抗原选自：结肠特异性抗原-p(CSAp)、癌胚抗原(CEA)、CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD45、CD66a-d、CD67、CD74、CD79a、CD80、CD138、HLA-DR、Ia、Ii、MUC 1、MUC 2、MUC3、MUC 4、NCA、EGFR、HER 2/neu受体、TAG-72、EGP-1、EGP-2、A3、KS-1、Le(y)、S100、PSMA、PSA、腱糖蛋白、叶酸受体、VEGFR、EGFR、PDGFR、FGFR、PlGF、ILGF-1、坏死抗原、IL-2、IL-6、T101、MAGE或这些抗原的组合。

47.如权利要求44所述的试剂盒，进一步包括从循环中清除未与靶抗原结合的双特性抗体的清除剂。

说明书

用于蛋白质、肽和其他分子的改进的F-18标记方法和组合

物

[0001] 相关申请

[0002] 本申请是于2007年12月19日递交的美国专利申请号为11/960,262申请的部分继续申请，该申请根据U.S.C.§119(e)要求2007年1月11日提交的美国临时专利申请第60/884,521号的权利，两者的全部内容均通过参考予以援引。

技术领域

[0003] 在某些实施方式中，本发明涉及用F-18标记肽的简单方法，其可用于体内成像。施用于受试者时，F-18标记肽的优选比活性为约1,000至2,000Ci/mol。也可使用100至数万Ci/mmol范围内的比活性。虽然在某些成像应用中优选更高比活性，但是在其他替代实施方式中，可以使用较低比活性的NOTA(1，4，7-三氮杂-环壬烷-N，N’，N”-三乙酸)或另一螯合部分与金属-F-18络合物，例如，肾血流成像剂或用于对血流成像的心脏和脑成像剂。优选地，F-18标记的完成不需要纯化步骤来从标记的肽分离未标记的肽。更优选地，F-18标记的肽在体内状况下是稳定的，诸如在人血清中。

背景技术

[0004] 正电子成像术(PET)成像提供了高分辨率和从PET图定量。肽或其他小分子可用18 64 66 68 76 94m 86 124
正电子发射体(仅举几例，F，Cu，Ga，Ga，Br， Tc，Y和 I)标记。从同位素的核发射的正电子根据使用的同位素以不同能量喷射。当正电子与电子反应时，两种511keVγ射线以相反的方向发射。喷射的正电子的能量控制正电子在其通过撞击电子而被湮灭之前飞行平均距离。喷射能越高，正电子与电子碰撞前飞行的越远。希望PET同位素具有低喷射能，以使正电子在其产生被PET照相机成像的两种511keVγ射线前从靶位点飞行的距离最小。发射正电子的许多同位素在其衰变链中也具有其他发射，诸如γ射线、α粒子或β粒子。希望具有纯的正电子发射体的PET同位素，以便将任何发射量测定问题减至最小。

[0005] 同位素的半衰期也是重要的，因为半衰期必须足够长，以便将同位素连接至靶向分子、分析产物、将其注射于患者、允许产物定位、从非靶组织中清除和然后成像。如果半衰期太长，则比活性可能不够高以获得足够的光子来得到清晰的图，而如果半衰期太短，则生产、商业分配和生物分配需要的时间可能不够。F-18(β+635keV 97％，t1/2 110分钟)由于它的低正电子发射能、无侧向发射和合适的半衰期，而成为最广泛使用的PET发射同位素之一。产生的F-18具有高比活性。当同位素连接至分子用于靶向时，通常需要一些未反应的靶向剂来完成，其经常相比于放射性标记的产物是以摩尔过量形式存在的。通常，标记产物和未标记产物在体内对同一靶点存在竞争，因而冷的靶向剂可以降低靶向剂的有效比活性。如果将F-18连接至具有非常高吸收的分子(诸如2-氟-2-脱氧葡萄糖(FDG))，则比活性就不是那么重要了。不过，如果技术人员用标记的肽靶向受体或用有限量的有效结合位点进行免疫PET预靶向研究，则当冷的靶向剂过量存在时，其能够潜在地阻断发射标记剂的吸收。

[0006] 肽的常规F-18标记包括标记具有低比活性的试剂和HPLC纯化剂，然后与目标肽缀合。缀合获得所需比活性的标记肽后，通常缀合物需要再提纯。一个实例是Poethko等18
人的标记方法(J.Nucl.Med.2004；45：892-902)，其中首先合成和纯化了4-[ F]氟苯甲醛(Wilson等人，J.LabeledCompounds and Radiopharm.1990；XXVIII：1189-1199)，然后将其与肽缀合。然后通过HPLC纯化肽缀合物，以除去用来驱动缀合完成的多余的肽。如果F-18具有长的半衰期，所述两个反应和纯化不会成问题。但是，F-18的半衰期只有2小时，因此将F-18连接至肽需要的所有操作是很显著的负担。

[0007] 这些方法进行时间长，并且需要使用特殊设计的设备来产生标记的产物和/或专业化学家的努力。它们不是可以在临床环境中常规使用的试剂盒制剂。需要一种快速、简单的18-F-标记靶向部分如蛋白质或肽的方法，获得具有合适的比活性和在体内检测和/或成像的稳定性，同时对特殊设备或专门人才的需求降至最低限度，以及减少操作人员受到的高强度辐射的靶向构建体。进一步需要预先包装好的试剂盒，用于提供实现所述新方法所需的组成成份。

发明内容

[0008] 氟化物与事实上所有其他元素结合，并且其中的一些键相对稳定。已知携带金属结合配体的肽稳定地且以非常高的比活性结合放射性金属。本方法采用的途径是首先使F-18与金属结合，然后用肽上的配体螯合F-18金属络合物。那么问题就是选择哪种金属(或其他元素，例如硼)。根据对文献的快速检索，IIIA族的元素(硼、铝、镓、铟和铊)成为首选。也可以使用镥。

[0009] 另外，技术人员可首先将金属或其他原子连接至肽，然后加入F-18。对于例如氟化硼连接，第二个方法可能更加有效。

[0010] 已报道氟化铝络合物在体外稳定(Martinez等人，Inorg.Chem.1999；38：4765-4660；Antonny等人.J.Biol.Chem.1992；267：6710-6718)。将氟化铝掺入骨和牙齿的釉质，则所述络合物在体内也是稳定地(Li，Crit.Rev.Oral Biol.Med.2003；14：
100-114)。

[0011] 熟练的技术人员将理解，几乎任何递送分子都可连接F-18用于成像目的，只要其含有可被修饰而不影响递送分子与细胞或组织靶受体之间的配体-受体结合相互作用的可衍生基团。虽然下面的实施例涉及F-18标记的肽部分，但是许多其他类型的递送分子均可被F-18标记并用于成像目的，其他类型的递送分子诸如寡核苷酸、激素、生长因子、细胞因子、趋化因子、血管生长因子、抗血管生成因子、免疫调节剂、蛋白质、核酸、抗体、抗体片段、药物、白细胞介素、干扰素、寡糖、多糖、脂质等。相似地，可被成像的疾病或病症的类型仅受合适靶向与疾病或病症相关的细胞或组织的递送分子有效性的限制。许多这样的递送分子是已知的，在下述实例中举例说明。例如，任何与疾病组织或靶点如癌结合的蛋白质或肽可利用已知的方法用F-18标记，用于检测和/或成像。在某些实施方式中，这样的蛋白质或肽可以包括但不限于：结合肿瘤-相关抗原(TTAs)的抗体或抗体片段。任何已知的TTA-结合抗体或片段通过描述的方法用F-18标记，并用于肿瘤的成像和/或检测，例如通过PET扫描或其他已知技术。

[0012] 在下面的某些实施例中，示例性的F-18标记的肽可作为使用双特异性或多特异性抗体或抗体片段的预靶向方法中的可靶向的构建体用于成像目的。这种情况下，抗体或抗体片段将包含针对与疾病或病症相关的靶的一个或多个结合位点，所述靶诸如肿瘤-相关抗原或自身免疫疾病相关抗原或由病原生物(诸如病毒、细菌、真菌或其他微生物)产生或展示的抗原。第二个结合位点将特异性结合可靶向的构建体。使用双特异性或多特异性抗体的预靶向方法是本领域公知的(参见，例如美国专利第6,962,702号，其完整内容通过引用并入本文)。相似地，与可靶向的构建体结合的抗体或其片段也是本领域公知的(同上)，诸如与HSG(组胺琥珀酰甘氨酸)结合的679单克隆抗体。一般而言，在预靶向方法中，首先施用双特异性或多特异性抗体，并让其与细胞或组织靶抗原结合。经过合适量的时间让未结合的抗体从循环中清除后，例如F-18标记的可靶向的构建体施用于患者并与定位至靶细胞或组织的抗体结合，然后例如通过PET扫描拍摄图像。

[0013] 在示例性实施方式中，诸如叶酸的非肽受体靶向剂可与DOTA缀合，然后用例如与NOTA结合的F-18金属络合物标记。此类非肽受体靶向剂可包括，例如TA138(整联蛋白αγβ3受体的一种非肽拮抗剂)(Liu等，2003，Bioconj.Chem.14：1052-56)。本领域已知的可与DOTA、NOTA或F-18金属络合物的另外的螯合剂缀合的相似的非肽靶向剂可用于要求保护的方法。其他受体靶向剂是本领域已知的，诸如生长抑素受体靶向剂In-DTPA奥曲肽 如下文所述，F-18金属络合物可潜在地使用DTPA螯合并用于成像目的。NODAGATOC肽可以AlF-18进行标记用于生长抑素受体靶向(Eisenwiener等人，Bioconj.Chem.2002，13(3)：530-41)。使用金属螯合物的受体靶向成像的其他方法是本领域已知的，并可用于实施要求保护的方法(参见，例如Andre等人，2002，J.Inorg.Biochem.88：1-6；
Pearsonet al.，1996，J.Med.，Chem.39：1361-71)。

[0014] 用于通过PET扫描的F-18成像的成像技术和装置也是本领域公知的(参见，例如美国专利第6,358,489；6,953,567号；Page等人，NuclearMedicine And Biology，21：911-919，1994；Choi 等 人，Cancer Research55：5323-5329，1995；Zalutsky 等 人，J.Nuclear Med.，33：575-582，1992)且可使用任何此类已知的PET成像技术活装置。

[0015] 虽然下述实施例表明F-18金属络合物可用于PET成像，然而技术人员将意识到稳定的金属-氟络合物诸如非放射性的Al-27和F-19络合物也可以连接至NOTA或其他螯合剂和连接至肽或其他靶向剂用作MRI造影剂。所述AlF NOTA络合物还可连接至聚合物而用于MRI成像。所述AlFNOTA衍生物也可用作PARACEST MRI成像剂(Woessner et al.，Magn.Reson.Med.2005，53：790-99)。

附图说明

[0016] 包括下列图以说明本发明的特定实施方式，但其并不意味着限制要求保护的主题的范围。

[0017] 图1.示例性肽IMP272。

[0018] 图2.示例性肽IMP288。

[0019] 图3.示例性肽IMP326。

[0020] 图4.示例性肽IMP329。

[0021] 图5.示例性肽IMP331。

[0022] 图6.示例性肽IMP332。

[0023] 图7.示例性肽IMP333。

[0024] 图8.示例性肽IMP334。

[0025] 图9.示例性肽IMP349。

[0026] 图10.示例性肽IMP368。

[0027] 图11.示例性肽IMP375。

[0028] 图12.示例性肽IMP384。

[0029] 图13.示例性肽IMP386。

[0030] 图14.示例性肽IMP389。

[0031] 图15.示例性肽IMP449。

[0032] 图16.附加的示例性肽IMP422、IMP426、IMP428。

[0033] 图17.示例性NOTA衍生物。

[0034] 图18.示例性NODA-肽结构。

[0035] 图19.具有或不具有TF2双特异性抗体的In-111和F-18标记的IMP449在小鼠中的比较生物分布。

[0036] 图20.利用具有或不具有预靶向TF10双特异性抗MUC-1抗体的111In-标记的双HSG肽(IMP 288)在体内的肿瘤成像。

[0037] 图21.利用124I-标记肽和TF2双特异性抗-CEA抗体预靶向在裸鼠的肺中微转移人类结肠癌的PET成像。

[0038] 图22A-22D.附加的示例性用于F-18标记的螯合部分。

具体实施方式

[0039] 在下面的描述中，使用了大量术语，提供以下定义以便于理解本文的公开内容。未明确定义的术语根据其明显的和普通含义使用。

[0040] 如本文所用，“一个”或“一种”可指一个/一种或多于一个/一种。

[0041] 如本文所用，术语“和”和“或”可用于指合取的或析取的。即除非另外声明，两个术语均应理解为等同于“和/或”。

[0042] 如本文所用，“约”指数字的加或减10％的范围内。例如，“约100”是指90至110之间的任何数字。

[0043] 如本文所用，“肽”指长度介于2个和100个氨基酸残基之间、更优选地长度介于2个和10个氨基酸残基之间、更优选地长度介于2个和6个氨基酸残基之间的天然存在或非天然存在的氨基酸的任何序列。“氨基酸”可以是L-氨基酸、D-氨基酸、氨基酸类似物、氨基酸衍生物或氨基酸模拟物。

[0044] 如本文所用，部分地或全部地从未标记的分子中分离得到的所述标记分子是“纯化的”，因而所述标记分子级分相对于起始混合物而言是富集的。一种“纯化的”标记分子可以是包括几乎任何比率的标记和未标记分子的混合物，包括但不限于约5∶95；10∶90；15∶85；20∶80；25 ∶75；30∶ 70；40∶60；50∶50；60∶40；70∶30；75 ∶25；
80∶20；85∶15；90∶10；95∶5；97∶3；98∶2；99∶1或100∶0。

[0045] 如本文所用，术语“病原体”包括但不限于真菌、病毒、寄生虫和细菌，包括但不限于人免疫缺陷病毒(HIV)、疱症病毒、巨细胞病毒、狂犬病病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、仙台病毒、猫白血病病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、人血清细小样病毒、猿猴病毒40、呼吸道合胞病病毒、小鼠乳癌病毒、水痘带状疱疹病毒、登革热病毒、风疹病毒、麻疹病毒、腺病毒、人T细胞白血病病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、水泡性口炎病毒、辛德比斯病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、疣病毒和蓝舌病毒、无乳链球菌、嗜肺军团菌、化脓性链球菌、大肠杆菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎球菌、乙型流感嗜血杆菌、梅毒螺旋体、莱姆病螺旋体、铜绿假单胞菌、麻风分支杆菌、流产布鲁杆菌、结核分枝杆菌和破伤风梭菌。

[0046] 如本文所用，“辐射分解保护剂”是指任何分子、化合物或组合物，其可被添加到F-18标记络合物或分子中，以减低F-18标记的络合物或分子被辐射分解的速度。可以使用任何已知的辐射分解保护剂，包括但不限于抗坏血酸。

[0047] 靶向的构建体肽

[0048] 在某些实施方式中，F-18标记的部分可以包含肽或其他可靶向的构建体。F-18标记的肽(或蛋白质)可被选择直接与靶向细胞、组织、病原生物或其他用于成像和/或检测的靶点结合。在其他实施方式中，F-18标记的肽可被选择间接结合，例如利用双特异性抗体与一个或多个针对可靶向的构建体肽的结合位点，和与一个或多个针对与疾病或病症相关的靶抗原的结合位点。双特异性抗体可以用于例如预靶向技术中，其中抗体可先施用于受试者。需要充足的时间以使双特异性抗体与靶抗原结合以及使未结合抗体从循环中清除。可靶向的构建体如F-18标记的肽可施用于受试者，并可与双特异性抗体结合，定位在病态细胞或组织中，然后F-18标记的可靶向的构建体的分布可以通过PET扫描或其他已知技术进行测定。

[0049] 这些可靶向的构建体可以具有多种结构，其选择不仅根据抗体或片段与可靶向的构建体的高亲和力结合的有效性，而且根据当用于预靶向方法和双特异性抗体(bsAb)或多特异性抗体时能快速从体内消除。疏水剂在引起强免疫应答方面最佳，而亲水剂是快速体内消除所优选的。因此，建立了疏水和亲水特性之间的平衡。这可以部分地通过使用亲水螯合剂以抵消许多有机部分固有的疏水性来实现。另外，可选择具有相反溶解性质的可靶向的构建体的亚单元，例如选择含有氨基酸的肽，氨基酸中的一些是疏水性的、一些是亲水性的。除了肽以外，还可以使用糖类。

[0050] 可使用具有至少两个氨基酸残基的肽，优选地为2至10个残基，也可将肽与诸如螯合剂的其他部分偶连。接头应是低分子量缀合物，优选具有低于50,000道尔顿的分子量，并且有利地低于约20,000道尔顿、10,000道尔顿或5,000道尔顿的分子量(包括螯合物中的金属离子)。更常见地，可靶向构建体肽将具有四个或更多残基，诸如肽DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQ ID NO：1)，其中DOTA是1，4，7，10-四氮杂环十二烷四乙酸，而HSG是组胺琥珀酰甘氨酰基团。另外，DOTA可被NOTA(1，4，7-三氮杂-环壬烷-N，N’，N”-三乙酸)或TETA(对-溴乙酰氨基-苄基-四乙胺四乙酸)部分取代。

[0051] 可靶向的构建体还可在主链结构中包含非天然氨基酸(例如，D-氨基酸)以增加肽在体内的稳定性。在可选的实施方式中，其他主链结构，诸如从非天然氨基酸和拟肽构建的那些。

[0052] 使用固相支持体和重复正交脱保护和偶联的标准技术在自动肽合成仪上方便地合成用作可靶向构建体的肽。肽中以后用于螯合物缀合的游离氨基用标准的保护基团(诸如Boc基团)有利地封闭，而N-末端残基可被乙酰化以增加血清稳定性。此类保护基团是熟练的技术人员已知的。参见Greene和Wuts，有机合成中的保护基团，1999(John Wiley and Sons，N.Y.)。当肽准备以后用于双特异性抗体系统时，它们被有利地从树脂中切割下，产生相应的C-末端酰胺，以便抑制体内羧肽酶的活性。

[0053] 免疫原的半抗原包含免疫原识别部分，例如化学半抗原。使用化学半抗原，优选地HSG半抗原，接头显示出对抗体的高特异性。HSG半抗原产生的抗体是已知的，并可容易地掺入适当的双特异性抗体(参见，例如美国专利号6,962,702；7,138,103和7,300,644，它们的完整内容均通过引用并入本文)。因此，接头与连接的半抗原的结合是对抗体或抗体片段高度特异性的。

[0054] 螯合部分

[0055] 在一些实施方式中，F-18标记的分子可包含一个或多个亲水螯合部分，其结合金属离子并且还有助于确保快速的体内清除。螯合剂可根据其特定的金属结合性质进行选择，并且可容易地被交换。

[0056] 特别有用的金属-螯合物组合包括2-苄基-DTPA和其单甲基和环己基类似物。诸如NOTA(1，4，7-三氮杂-环壬烷-N，N’，N”-三乙酸)、DOTA和TETA(对-溴乙酰氨基-苄基-四乙胺四乙酸)的大环螯合剂也可与可潜在地用作F-18缀合配体的多种金属一起使用。

[0057] 其中配体包括硬碱螯合功能诸如羧酸或胺基的DTPA和DOTA-型螯合剂对于螯合硬酸阳离子、尤其是IIa族和IIIa族金属阳离子最为有效。通过调整目标金属的环的大小，可使此类金属-螯合物络合物非常稳定。诸如大环聚醚的其他环型螯合剂由于稳定结合核素而受到关注。卟啉螯合剂可与许多金属络合物一起使用。可将不止一种类型的螯合剂与载体缀合以结合多种金属离子。诸如美国专利第5,753,206号中公开的那些螯合剂，尤其是缩氨基硫脲基乙醛酰半胱氨酸(Tscg-Cys)和缩氨基硫脲基乙酰半胱氨酸(Tsca-Cys)螯合剂有利地用于结合Tc，Re，Bi和其他过渡金属元素、镧系元素和锕系元素的软酸阳离子，所述软酸阳离子紧密地结合软碱配体。将不止一种类型的螯合剂与肽连接是有用的。由于双-DTPA半抗原的抗体是已知的(Barbet等人，美国专利第5,256,395号)并且容易偶联至靶向抗体形成双特异性抗体，因此，在预靶向实验方案中使用带有冷的双DTPA螯合剂和用于结合F-18络合物的另一螯合剂的肽半抗原是可能的。此类肽的一个实例是Ac-Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQ IDNO：2)。其他硬酸螯合剂(诸如DOTA、TETA等)可取代DTPA和/或Tscg-Cys基团，并且可使用用来产生抗-双-DTPA Mab的技术类似的技术来产生特异于这些硬酸螯合剂的Mab。

[0058] 另一种有用的螯合剂可含有NOTA-型部分，例如，如Chong等人(用于抗体靶向的发射癌症疗法的双模态双功能配体的合理设计和产生，J.Med.Chem.，电子出版于12-7-07，通过引用并入本文)中所公开的。Chong等人公开了基于NOTA结构的双功能C-NETA配体177 205/206
的产生和用途，所述配体在与 Lu或 Bi络合时显示在血清中高达14天的稳定性。

[0059] 应理解，可将两种不同的硬酸或软酸螯合剂(例如具有不同的螯合环大小)掺入可靶向的构建体，以优先结合两种不同的硬酸或软酸阳离子(根据阳离子的不同大小、螯合环的几何学和阳离子的优选络合物离子结构)。这将允许两种不同的金属(其中一种或两种可与F-18连接)掺入可靶向的构建体，以被预靶向的双特异性抗体最终捕获。

[0060] 施用方法

[0061] 在不同的实施方案中，双特异性抗体和可靶向的构建体可用于成像正常或病态组织和器官(参见，例如美国专利第6,126,916；6,077,499；6,010,680；5,776,095；5,776,094；5,776,093；5,772,981；5,753,206；5,746,996；5,697,902；5,328,679；
5,128,119；5,101,827；和4,735,210号，它们的完整内容均通过引用并入本文)。

[0062] 双特异性抗体(bsAb)和F-18标记的可靶向构建体的施用可通过在施用可靶向的构建体之前某些时间施用bsAb抗体来执行。试剂的剂量和施用时间可由熟练得技术人员容易地设计，并依赖于所用试剂的具体性质。如果首先施予bsAb-F(ab’)2衍生物，则施用可靶向构建体之前24-72小时(或者48-96小时)的等待时间将是适当的。如果IgG-Fab’bsAb缀合物是最初的靶向载体，则施用可靶向的构建体之前将需要3-10天范围内的更长的等待时间。经过充分的时间让bsAb靶向病态组织之后，施用F-18标记的可靶向的构建体。施用可靶向的构建体之后，即可进行成像。

[0063] 某些实施方式涉及具有至少三个不同的靶结合位点的多价靶结合蛋白质的使用，如序号为60/220,782的专利申请所述。已通过经由化学接头交联几个Fab-样片段制备了多价靶结合蛋白质。参见美国专利第5,262,524；5,091,542号和Landsdorp等人，Euro.J.Immunol.，16：679-83(1986)。也已通过共价连接几个单链Fv分子(scFv)以形成单个多肽来制备多价靶结合蛋白质。参见美国专利第5,892,020号。一种基本上是scFv分子聚集体的多价靶结合蛋白质已公开于美国专利第6,025,165和5,837,242号。包含三个scFv分子的三价靶结合蛋白质已公开于Krott等人Protein Engineering，10(4)：423-433(1997)。

[0064] 可选地，一种称为“对接和锁定”(DNL)的技术已被证实可以简单地和可重现地构建各种多价络合物，包括含有2个或多个不同抗体或抗体片段的络合物。(参见，例如，2006年3月24日提交的美国专利申请11/389,358；2006年3月28日提交的11/391,584；2006年6月29日提交的11/478,021；2006年12月5日提交的11/633,729；和2007年10月26日提交的11/925,408，它们的完整内容均通过引用并入本文)。这些构建体也可应用于本文所述要求保护的方法和组合物。

[0065] 可使用可在双特异性抗体(bsAb)和可靶向构建体的给药之间施予的清除剂。可使用具有新机制作用的清除剂，即被靶向bsAb的疾病靶向臂的糖基化的抗基因型Fab’片段。在一个实例中，施予抗CEA(MN 14ab)x抗肽bsAb，并允许其最大程度地附着于疾病靶点。为了清除残留的bsAb，施予MN-14的抗基因型Ab(称为WI2)，优选地作为糖基化的Fab’片段。清除剂以单价方式与bsAb结合，而其附着的糖残基将整个复合物引向肝脏，在肝脏中发生快速的代谢。然后将F-18标记的可靶向构建体施予受治疗者。bsAb的MN-14臂的WI2Ab具有高亲和力，并且其清除机制不同于其他公开的机制(参见Goodwin等人，同上)，原因是其不涉及交联，因为WI2-Fab’是单价部分。然而，可选的用于清除剂的方法和组合物是已知的，并且可以使用任何已知的清除剂。

[0066] 制剂和施用

[0067] F-18标记分子可以制备得到包含一种或多种药学上适当的赋形剂，一种或多种额外成分或它们的混合物的组合物。这些组合物可采用已知的方法制成药学上有用的剂量，使活性成份(即F-18标记分子)与一种或多种药学上适合的赋形剂组合成混合物。无菌磷酸缓冲盐水是药学上适合的赋形剂的一例。现有技术中还有其他合适的赋形剂。参见，例如Ansel等人，药品剂型与药物输送系统，第5版(Lea & Febiger 1990)和Gennaro(编辑)，雷明顿的制药科学，第18版(Mack出版公司1990)及它们的修订版。

[0068] 本文所述的组合物的优选给药途径是parental注射。注射可以是静脉注射、动脉注射、淋巴管注射、鞘内注射、腔内注射(即非口服注射)。非口服施用中，组合物与药学上可接受的赋形剂被制成单元计量注射形式(例如溶液、悬浊液或乳剂)。这些赋形剂本身是无毒和无疗效的。这些赋形剂例如盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和汉克氏溶液。也可以使用无水赋形剂诸如固定油和油酸乙酯。优选赋形剂是5％葡萄糖盐水。所述赋形剂可以包含少量添加剂，如提高渗透压和化学稳定性的物质，其包括缓冲剂和防腐剂。包括口服给药的其他给药方式也在考虑范围内。

[0069] 包含F-18标记分子的制剂组合物可以通过例如团注或连续输注进行静脉给药。注射用组合物可以添加防腐剂，在例如安瓿或多剂量容器中以单元剂量形式存在。组合物也可以在油性或水性媒质中的悬浮液、溶液或乳液形式存在，且含有如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂的成型剂。可选地，所述组合物可以以粉末形式在使用前与合适的媒质例如灭菌无热原水混合。

[0070] 组合物可以以溶液形式给药。溶液的pH应当在pH 5至9.5范围内，优选pH 6.5至7.5。因而制剂应当在含有适当的药学上可接受缓冲剂(例如磷酸、TRIS(羟甲基)氨基甲烷-HCl或柠檬酸等)的溶液中。缓冲液浓度应当在1至100mM范围。制剂溶液也可以含有盐，例如浓度50至150mM的氯化钠或氯化钾。还可以包含有效量的稳定剂，例如甘油、白蛋白，球蛋白、去污剂、明胶、鱼精蛋白或鱼精蛋白的盐。组合物可以给药至哺乳动物皮下、静脉内、肌肉内或其他非口服途径。此外，给药方式可以通过连续注输或通过单次或多次团注。

[0071] 当施用双特异性抗体时，例如在预靶向技术中，人类给药抗体的剂量取决于各种因素，例如患者的年龄、体重、身高、性别、日常身体状况和先前病史。典型地，为达到靶向的目的，需要为受者提供一定剂量的双特异性抗体，其以约1mg至200mg范围作为单次静脉输注，也可根据情况指示施予更低或更高的剂量。典型地，需要提供受者一定剂量，即在约10mg每平方米体表面积或一般成年人17至18mg抗体的范围内，也可以根据情况施用更低或更高的剂量。可以成像目的施用于人受试者的双特异性抗体剂量的例子为1～200mg，优选1～70mg，最优选1～20mg，尽管可使用更高或更低的剂量。

[0072] 通常，施予F-18标记的剂量取决于各种因素，例如患者的年龄、体重、身高、性别、日常身体状况和先前病史。优选地，施予患者F-18标记分子的饱和剂量。F-18标记分子的给药剂量可以以毫居里来衡量。F-18成像研究的典型范围是5至10mCi。

[0073] 肽的施用

[0074] 要求保护的方法和/或组合物的各种实施方式可以涉及待施予受试者的一种或多种F-18标记肽。给药方式可以采用任何现有技术的方式，包括但不限于口服、经鼻、含服、吸入、直肠、阴道、局部、正位、皮内、皮下、肌肉内、腹膜内、动脉内、鞘内或静脉注射。例如，当F-18标记肽在预靶向协议中施用时，肽优先以静脉注射方式给药。

[0075] 以口服方式施用于受试者的未修饰的肽可在消化道中降解，根据序列和结构可以穿过肠道内膜表现出弱的吸收。然而，以化学的方式修饰肽使得它们受内源性蛋白酶降解的影响降低或通过消化道时吸收增加的方法是已知的(参见，例如，Blondelle等人，1995，Biophys.J.69：604-11；Ecker和Crooke，1995，Biotechnology 13：351-69；Goodman和Ro，1995，BURGER′S MEDICINAL CHEMISTRY AND DRUG DISCOVERY，VOL.I，Wollf编，John Wiley & Sons；Goodman和Shao，1996，Pure & Appl.Chem.68：1303-08)。用于制备肽类似物库的方法，例如含有D-氨基酸的肽；由模拟肽结构的有机分子组成的肽模拟物；或类肽诸如插烯加成的类肽，这些方法也已被描述，可以用于构建适合口服施用于受试者的基于F-18标记分子的肽。

[0076] 在某些实施方式中，标准的肽键连接可以被一个或多个替代性连接基团所取代，诸如CH2-NH，CH2-S，CH2-CH2，CH＝CH，CO-CH2，CHOH-CH2等。用于制备肽模拟物的方法式已知的(例如，Hruby，1982，Life Sd 31：189-99；Holladay等人，1983，Tetrahedron Lett.24：4401-04；Jennings-White 等 人，1982，Tetrahedron Lett.23：2533；Almquiest 等 人，
1980，J.Med.Chem.23：1392-98；Hudson等人，1979，Int.J.Pept.Res.14：177-185；Spatola等人，1986，Life Sci 38：1243-49；美 国专 利号 5,169,862；5,539,085；5,576,423，
5,051,448，5,559,103，分别通过引用并入本文)。肽模拟物可以表现出相比它们的肽类似物更高的体内稳定性和/或吸收。

[0077] 可选地，利用给N端和/或C端加帽来阻止外肽酶活性，从而肽可以通过口服递送给药。例如，C端可利用酰胺肽加帽，N端可通过肽的乙酰化作用加帽。肽也可以环化以阻断外肽酶，例如形成环酰胺、二硫化物、醚类、硫化物等。

[0078] 肽的稳定性还可以通过将D-氨基酸替代天然形成的L-氨基酸，尤其是在内肽酶会起作用的位置。内肽酶的结合和切割序列是现有技术已知的，制备和利用掺入D-氨基酸的肽的方法已被描述(参见，McBride等人，2004年6月14提交的美国专利申请号20050025709，其通过引用并入本文)。在某些实施方式中，通过与蛋白酶和/或肽酶抑制剂联合制剂，肽和/或蛋白质可以口服给药。

[0079] 其它口服递送治疗肽的方法公开在Metha(“Oral delivery andrecombinant production of peptide hormones”，2004年6月，BioPharmInternational)。肽与赋形剂以肠溶包衣固体剂型给药，所述赋形剂可以调节肠蛋白水解活性和提高肽转运穿越肠壁。利用该技术的完整肽的相对生物利用度可达到给药剂量的1％至10％范围内。胰岛素利用与胆酸钠和蛋白酶抑制剂的肠溶包衣微囊剂已经成功施用于狗(Ziv等人，1994，J.BoneMiner.Res.18(Suppl.2)：792-94.Oral administration of peptides has beenperformed using acylcamitine as a permeation enhancer and an enteric coating(Eudragit L30D-55，Rohm Pharma Polymers，参见Mehta，2004)。用于口服给药的肽的赋形剂通常包含一种或多种肠蛋白酶/肽酶抑制剂，并伴有去污剂或其他试剂以提高肽的溶解性或吸收，其可被包装成肠溶包衣胶囊或药片(Mehta，2004)。有机酸可以包含在胶囊中以酸化肠道，当胶囊溶解于肠道时抑制肠蛋白酶活性(Mehta，2004)。其余可选的用于口服递送的肽可以包含与基于聚乙二醇(PEG)的两亲性寡聚物缀合，增加吸收和阻止酶促降解(Soltero and Ekwuribe，2001，Pharm.Technol.6：110)。

[0080] 产生抗体的方法

[0081] 肽主链的Ab可通过公知的Ab生产方法产生。例如，向免疫活性动物中注射于完全弗氏佐剂中的免疫原(诸如(肽)n-KLH(其中KLH是钥孔血蓝蛋白，并且n＝1-30))，接下来再两次注射悬于不完全弗氏佐剂中的同一免疫原，在静脉推注抗原后三天收获脾细胞。然后将收获的脾细胞与Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞融合，并使用直接结合ELISA分析所得克隆的培养上清液的抗肽反应性。产生的Ab的特异性可通过使用原始免疫原的肽片段进行分析。这些片段可使用自动肽合成仪容易地制备。对于Ab生产，分离酶缺陷的杂交瘤以便能够选择融合的细胞系。此技术也可用于产生针对包含可靶向构建体的一种或多种螯合物(例如，In(III)-DTPA螯合物)的抗体。In(III)-双-DTPA的单克隆小鼠抗体是已知的(Barbet’395见上)。

[0082] 使用的靶向抗体，例如作为双特异性抗体的组分，可以对作为标志物质的多种细胞表面或细胞内肿瘤相关抗原具有特异性。这些标志物可以是肿瘤产生的物质，或可以是在肿瘤部位、在肿瘤细胞表面或在肿瘤细胞内(无论是在细胞质、核还是在各种细胞器或亚细胞结构中)积累的物质。此类肿瘤相关标志物包括由He内erman，“Immunodiagnosis of Cacer”(癌症的免疫诊断)，Fleisher编，“The Clinical Biochemistry of Cancer”(癌症的临床生物学)，第347页(American Association of Clinical Chemists，1979)和在美国专利第4,150,149；4,361,544；和4,444,744号中公开的那些，分别通过引用并入本文。关于肿瘤相关抗原的最新报道包括Mizukami等人(2005，Nature Med.11：992-97)；Hatfield等人(2005，Curr.Cancer DrugTargets 5：229-48)；Vallbohmer等人(2005，J.Clin.Oncol.23：3536-44)；和Ren等人(2005，Ann.Surg.242：55-63)，分别通过引用并入全文。

[0083] Herbeman(见上)已将肿瘤相关标志物分为许多类别，包括瘤胚抗原、胎盘抗原、致癌或肿瘤病毒相关抗原、组织相关抗原、器官相关抗原、异位激素和正常抗原或其变体。有时，肿瘤相关标志物的亚基有利地用于产生具有更高肿瘤特异性的抗体，例如，人绒毛膜促性腺激素(HCG)的β亚基或癌胚抗原(CEA)的γ区，其刺激对非肿瘤物质具有大大降低的交叉反应性的抗体的产生，如美国专利第4,361,644和4,444,744号所公开。

[0084] 感兴趣的另一种标志物是跨膜激活剂及CAML-相互作用分子(TACI)。参见，Yu等人Nat.Immunol.，1：252-256(2000)。简单地说，TACI是B细胞恶性肿瘤(例如，淋巴瘤)的标志物。进一步，已知TACI和B细胞成熟抗原(BCMA)被肿瘤坏死因子同系物(一种增殖诱导配体(APRIL))结合。APRIL刺激原B细胞和T细胞的体外增殖，并由于B细胞在体内的积累而增加脾的重量。APRIL还与TALL-I(也称为Blys或BAFF)竞争受体的结合。可溶性BCMA和TACI特异性防止APRIL的结合，并阻断APRIL-刺激的原B细胞的增殖。BCMA-Fc还抑制小鼠中针对钥孔血蓝蛋白和肺炎疫苗(Pneumovax)的抗体的产生，表明经由BCMA和/或TACI的APRIL和/或TALL-1信号转导是产生体液免疫必需的。因此，APRIL-TALL-I和BCMA-TACI形成参与B细胞和T细胞功能刺激的两配体-两受体途径。

[0085] 用于成像各种疾病或疾患(诸如恶性疾病、心血管疾病、传染病、炎性疾病、自身免疫病或神经疾病)的示例性靶抗原可包括结肠特异性抗原-p(CSAp)、癌胚抗原(CEA)、CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD45、CD74、CD79a、CD80、HLA-DR、Ia、Ii、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、NCA(CEACAM6或CD66a-d和CD67以及CD138)、EGFR、HER 2/neu、TAG-72、EGP-1、EGP-2、A3、KS-1、Le(y)、S100、PSMA、PSA、腱糖蛋白、叶酸受体、VEGFR、PlGF、ILGF-1、坏死抗原、IL-2、IL-6、T101、MAGE或这些抗原的组合。尤其是，抗原可包括癌胚抗原(CEA)、腱糖蛋白、表皮生长因子受体、血小板衍生生长因子受体、成纤维细胞生长因子受体、血管内皮生长因子受体、神经节苷脂、HER/2neu受体和这些抗原的组合。

[0086] 当涉及淋巴瘤、白血病或自身免疫失调的成像或检测时，靶向抗原可以选自：CD4，CD5，CD8，CD14，CD15，CD 19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD25，CD33，CD37，CD38，CD40，CD40L，CD46，CD52，CD54，CD67，CD74，CD79a，CD80，CD126，CD138，CD154，B7，MUC1，Ia，Ii，HM 1.24，HLA-DR，腱糖蛋白，VEGF，PlGF，ED-B纤连蛋白，癌基因，癌基因产物，CD66a-d，坏死抗原，IL-2，T 101，TAG，IL-6，MIF，TRAIL-R1(DR4)和TRAIL-R2(DR5)。

[0087] 最初产生针对免疫原的抗体后，可对抗体进行测序，并随后通过重组技术制备。鼠抗体和抗体片段的人源化和嵌合是本领域技术人员公知的。例如，通过以下制备人源化单克隆抗体：将来自小鼠免疫球蛋白重链和轻链可变链的小鼠互补决定区转移到人可变区，然后在框架区内用鼠对应残基置换人残基。使用衍生自人源化单克隆抗体的抗体组分消除了与鼠恒定区的免疫原性相关的潜在问题。克隆鼠免疫球蛋白可变区的一般技术描述于例如以下出版物：Orlandi等人，Proc.Nat’1Acad.Sci.USA，86：3833(1989)，其通过引用整体并入本文。生产人源化Mab的技术描述于例如Jones等人，Nature，321：522(1986)，Riechmann 等 人，Nature，332：323(1988)，Verhoeyen 等 人，Science，239：1534(1988)，Carter等人，Proc.Nat’1Acad.Sci.USA，89：4285(1992)，Sandhu，Crit.Rev.Biotech.，12：437(1992)和Singer等人，J.Immun.，150：2844(1993)，其每个通过引用整体并入本文。

[0088] 可选地，完全人抗体可从转基因非人的动物获得。参见，例如，Mendez等人，Nature Genetics，15：146-156(1997)；美国专利第5,633,425号。例如，可从具有人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中回收人抗体。小鼠体液免疫系统通过灭活内源免疫球蛋白基因并引入人免疫球蛋白基因座而被人源化。人免疫球蛋白基因座极其复杂，并包含总共占人类基因组近0.2％的大量离散区段。为了确保转基因小鼠能够产生足够的抗体谱，必须将人重链和轻链基因座的大部分引入小鼠基因组。这是以逐步过程实现的，开始于形成含有胚系构型的人重链或轻链免疫球蛋白基因座的酵母人工染色体(YAC)。由于每个插入物的大小是大约1Mb，YAC的构建要求免疫球蛋白基因座的重叠片断的同源重组。经由含有YAC的酵母球芽与小鼠胚胎干细胞的融合，将两个YAC(一个含有重链基因座而一个含有轻链基因座)分别引入小鼠。然后将胚胎干细胞克隆微注射于小鼠胚泡。得到的嵌合雄性根据其通过其种系递送YAC的能力进行筛选，并将其与具有鼠抗体产生缺陷的小鼠杂交。繁殖两个转基因品系(一个含有人重链基因座而另一个含有人轻链基因座)产生响应于免疫接种而产生人抗体的子代。

[0089] 未重排的人免疫球蛋白基因也可经由微细胞介导的染色体转移(MMCT)被引入小鼠胚胎干细胞。参见，例如，Tomizuka等人，NatureGenetics，16：133(1997)。在此方法中，含有人染色体的微细胞与小鼠胚胎干细胞融合。转移的染色体被稳定地保持，并且成年嵌合体显示适当的组织特异性表达。

[0090] 作为替代方案，抗体或抗体片段可从分离自组合免疫球蛋白库的人抗体片段衍生。参见，例如，Barbas等人，METHODS：A Companion to Methodsin Enzymology 2(方法：与酶学方法的比较2)：119(1991)，和Winter等人，Ann.Rev.Immunol，12：433(1994)，其通过引用并入本文。与通过B细胞永生产生单克隆抗体相关的许多困难可通过使用噬菌体展示在大肠杆菌中改造和表达抗体片段来克服。

[0091] 可采用相似的策略获得高亲和力scFv。参见，例如，Vaughn等人，Nat.Biotechnol，14：309-314(1996)。通过使用对应于所有已知VH、Vκ和V80基因家族的PCR引物从未免疫的人供体分离V基因，可构建大库藏的scFv库。扩增之后，Vκ和Vλ库被合并形成一个库。将这些片断连接入噬菌粒载体。然后将scFv接头(Gly4，Ser)3连接于噬菌粒中VL片段的上游。扩增VH和接头-VL片段并在JH区上装配。将得到的VH-接头-VL片段连接于噬菌粒载体。可使用如上所述的过滤器或使用免疫管(
)淘选噬菌粒库。相似的结果可通过从免疫的兔的淋巴细胞或脾细胞构建组合免疫球蛋白库和通过在巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)中表达scFv构建体来实现。参见，例如，Ridder等人，Biotechnology，13：255-260(1995)。另外，分离适当的scFv后，具有更高的结合亲和力和更慢的解离速率的抗体片段可通过亲和力成熟过程(诸如CDR3诱变和链改组)获得。参见，例如，Jackson等人，Br.J.Cancer，78：181-188(1998)；Osbourn等人，Immunotechenology，2：181-196(1996)。

[0092] 抗体片段的另一形式是编码单个CDR的肽。CDR肽(“最小识别单位”)可通过构建编码目标抗体的CDR的基因来获得。此类基因例如通过使用聚合酶链式反应来制备，以从产生抗体的细胞的RNA合成可变区。参见，例如，Larrick等人，METHODS：A Companion to Methods inEnzymology 2(方法：与酶学方法的比较)2：106(1991)；Courtenay-Luck，“Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies”(单克隆抗体的遗传操作)，选自单克隆抗体：产生、改造和临床应用(MONOCLONALANTIBODIES：PRODUCTION，ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION)，Ritter等人(编)，第166-179页(Cambridge University Press1995)；和Ward等人，“Genetic Manipulation and Expression of Antibodies”(抗体的遗传操作和表达)，选自MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLES ANDAPPLICATIONS(单克隆抗体：原理和应用)，Brich等人(编)，第137-185页(Wiley-Liss，Inc.1995)。

[0093] 双特异性抗体可通过本领域已知的技术制备，例如，抗CEA肿瘤Ab和抗肽Ab二者分别用胃蛋白酶消化为它们各自的F(ab’)2片段。用半胱氨酸还原抗CEA-Ab-F(ab’)2以产生Fab’单体单元，其进一步与交联剂双(马来酰亚胺基)己烷反应以产生Fab’-马来酰亚胺部分。用半胱氨酸还原抗肽Ab-F(ab’)2，并且纯化的、回收的抗肽Fab’-SH与抗CEA-Fab’-马来酰亚胺反应以产生Fab’x Fab’双特异性Ab。可选地，抗肽Fab’-SH片段可与抗CEA F(ab’)2偶联以产生F(ab’)2xFab’构建体，或与抗CEA IgG偶联以产生IgG x Fab’双特异性构建体。在一个实施方案中，IgG x Fab’构建体可如下以位点特异性的方式制备：将抗肽Fab’巯基与已用高碘酸盐氧化的抗CEAIgG重链碳水化合物连接，然后通过与可商业化获得的酰肼-马来酰亚胺交联剂反应而活化。使用的组分Ab可通过已知技术被嵌合或人源化。嵌合抗体是含有来自啮齿类动物抗体的可变区和互补决定区的重组蛋白，而抗体分子的剩余部分衍生自人抗体。人源化抗体是其中单克隆抗体的鼠互补决定区被从鼠免疫球蛋白的重链和轻链可变链转移至人可变区的重组蛋白。

[0094] 嵌合Ab是通过连接编码小鼠轻链可变区和重链可变区的cDNA片段与编码人抗体C结构域的片段而构建的。由于C结构域不参与抗原结合，因此嵌合抗体将保留与原始小鼠Ab相同的抗原特异性，但在序列上将更接近人抗体。不过，嵌合Ab仍还有一些小鼠序列，并且仍可以是免疫原性的。人源化Ab仅含有识别抗原必需的那些小鼠氨基酸。此产物是通过将小鼠互补决定区的氨基酸结合于人抗体框架内而构建的。

[0095] 产生双特异性抗体的其他最近方法包括具有额外的半胱氨酸残基以便他们比更常见的免疫球蛋白同种型更强地交联的改造的重组Ab。参见，例如，FitGerald等人，Protein Eng.，10：1221-1225，1997。另一途径是改造重组融合蛋白质，连接具有需要的双特异性的两个或多个不同的单链抗体或抗体片段区段。参见，例如，Coloma等人，Nature Biotech.，5：159-163，1997。使用分子工程可产生多种双特异性融合蛋白质。在一种形式中，双特异性融合蛋白质是单价的，由例如具有一个抗原的单个结合位点的scFv和具有第二抗原的单个结合位点的Fab片段组成。在另一种形式中，双特异性融合蛋白质是二价的，由例如具有一个抗原的两个结合位点的IgG和具有第二抗原的两个结合位点的两个scFv组成。

[0096] 功能性双特异性单链抗体(bscAb)(也称为双抗体)可使用重组方法在哺乳动物细胞中产生。参见，例如，Mack等人，Proc.Natl.Acad.Sci，92：7021-7025，1995。

[0097] 优选的双特异性抗体是包括MAb Mu-9的Fv和MAb 679的Fv、或MAb MN-14的Fv和MAb 679的Fv，及其人、嵌合化或人源化对应物的那些抗体。MN-14以及其嵌合化和人源化对应物公开于美国专利第5,874,540号。另外优选的是包括Mu-9或679的一个或多个CDR的双特异性抗体。抗体还可以是包括III类抗CEA抗体和679III类抗体的Fv的融合蛋白质或双特异性抗体。包括III类抗CEA的III类抗体在美国专利第4,818,709号中详细讨论。

[0098] 技术人员将意识到双特异性抗体可以结合任何现有技术中已知的抗体或片段，所述抗体或片段具有已知与疾病情形或状况相关的靶抗原的结合特异性。这些已知抗体包括但不限于LL1(抗-CD74)，LL2和RFB4(抗-CD22)，hA20(抗-CD20)，RS7(抗上皮糖蛋白-1(EGP-1))，PAM-4和KC4(均抗粘蛋白)，MN-14(抗癌胚抗原(CEA，也称作CD66e))，MN-3或MN-15(NCA或CEACAM6)，Mu-9(抗结肠特异性抗原p)，Immu 31(抗甲胎蛋白)，TAG-72(如CC49)，Tn，J591(抗-PSMA(前列腺特异性膜抗原))，G250(抗碳酸酐酶IX MAb)和L243(抗-HLA-DR).所述抗体在现有技术中已知(如美国专利号5,686,072；5,874,540；6,107,090；6,183,744；6,306,393；6,653,104；6,730.300；6,899,864；6,926,893；
6.962,702；7,074,403；7,230,084；7,238,785；7,238,786；7,256,004；7,282,567；
7,300,655；7,312,318；和美国专利申请公开号20040185053；20040202666；20050271671；
20060193865；20060210475；20070087001；全部内容通过引用并入本文)。这些已知抗体用于检测和/或成像各种疾病情形或状况(例如hMN-14或TF2bsMAb(CEA-表达癌)，hA20bsMab(TF-4-淋巴瘤)，hPAM4(TF-10胰腺癌)，RS7bsMAb(肺、乳腺、卵巢、前列腺癌)，hMN-15或hMN3bsMAb(炎症)，人类gp120和/或gp41bsMAbs(HIV)，抗血小板bsMab和抗凝血酶bsMAb(凝块成像)，抗肌球蛋白bsMAb(心肌坏死))。

[0099] 候选的抗HIV抗体包括Johansson等人(AIDS.2006Oct 3；20(15)：1911-5)所述的抗包膜抗体，和Polymun(Vienna，Austria)描述和销售的抗HIV抗体，以及美国专利5,831,034，美国专利5,911,989，和Vcelar等人，AIDS 2007；21(16)：2161-2170和Joos等人，Antimicrob.Agens Chemother.2006；50(5)：1773-9中描述的，全部内容通过引用并入本文。

[0100] 在某些实施方案中，上面讨论的bsAb F-18标记的可靶向的构建体可用于手术中、血管内和/或内窥镜肿瘤以及损伤检测、活组织检查和治疗，如美国专利第6,096,289号所述。

[0101] 用标记的分子成像

[0102] 利用标记分子的成像方法在现有技术中已知，且任何这样已知的方法可以使用本文所述的氟-标记分子。参见，例如美国专利号6,241,964；6,358,489；6,953,567和公开的美国专利申请公开号20050003403；20040018557；20060140936，全部内容通过引用并入本文。也可参见，Page等人，Nuclear Medicine And Biology，21：911-919，1994；Choi等人，CancerResearch 55：5323-5329，1995；Zalutsky等人，J.Nuclear Med.，33：575-582，1992；Woessner等人.Magn.Reson.Med.2005，53：790-99。

[0103] 在某些实施方式中，F-18标记分子可以用于正常或患病组织和器官的成像，例如利用美国专利号6,126,916；6,077,499；6,010,680；5,776,095；5,776,094；5,776,093；5,772,981；5,753,206；5,746,996；5,697,902；5,328,679；5,128,119；5,101,827 和
4,735,210中所描述的方法，分别通过引用并入本文。其他的方法在1999年6月22日提交的美国申请号09/337,756和2001年4月3日提交的美国申请号09/823,746中描述。所述成像可以通过直接F-18标记合适的靶向分子或通过预靶向成像方法实现，如Goldenberg等 人 (2007，Update Cancer Ther.2：19-31)；Sharkey 等 人 (2008，Radiology246：
497-507)；Goldenberg 等 人 (2008，J.Nucl.Med.49：158-63)；Sharkey 等 人 (2007，Clin.Cancer Res.13：5777s-5585s)；McBride 等 人 (2006，J.Nucl.Med.47：1678-88)；
Goldenberg等人(2006，J.Clin.Oncol.24：823-85)中所描述，也可参见美国专利申请号
20050002945，20040018557，20030148409和20050014207，分别通过引用并入本文。

[0104] 用标记肽或Mabs诊断成像的方法是已知的。例如，在免疫闪烁成像技术中，配体或抗体以伽马射线放射性同位素标记和施用于患者。伽马射线照相
机用于检测伽马射线放射性同位素的位置和分布。参见，例如Srivastava(编
辑 )，RADIOLABELED MONOCLONAL ANHBODIES FORIMAGING AND THERAPY(Plenum
Press 1988)，Chase， ″ MedicalApplications of Radioisotopes， ″ in
REMINGTON ′ S PHARMACEUTICALSCIENCES，18th Edition，Gennaro 等 人 ( 编 辑 )，pp.624-652(Mack PublishingCo.，1990) 和 Brown， ″ Clinical Use of Monoclonal Antibodies，″inBIOTECHNOLOGY AND PHARMACY 227-49，Pezzuto等人(编辑)(Chapman & Hall 1993)。同样优选使用正电子发射放射性同位素(PET同位素)，诸如用511keV的
18 68 64 124
能量，如 F，Ga，Cu，和 I。这些放射性同位素可以通过众所周知的PET扫描技术进行成像。

[0105] 实施例

[0106] 实施例1.肽IMP272的F-18标记

[0107] 使用的第一个肽是IMP272：

[0108] DTPA-Gln-Ala-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2MH+1512

[0109] 乙酸盐缓冲溶液-乙酸1.509g于～160ml水中稀释，并通过加入1MNaOH调节pH然后稀释至250ml以获得pH 4.03的0.1M溶液。

[0110] 乙酸铝缓冲溶液：铝溶液通过将0.1028g的AlCl3六水合物溶解于42.6ml DI水中来制备。4ml等份的铝溶液与16ml的0.1M NaOAc溶液(pH 4)混合，以提供2mM Al贮存溶液。

[0111] IMP 272乙酸盐缓冲溶液：将肽0.0011g、7.28×10-7molIMP 272溶解于364μL的0.1M pH 4的乙酸盐缓冲溶液，以获得肽的2mM的贮存溶液。

[0112] F-18标记IMP 272：3μL等份的铝贮存溶液置于REACTI-VIALTM并与50μL F-18(原始样品)和3μL的IMP 272溶液混合。溶液在加热器中于110℃加热15分钟，并通过反相HPLC分析。HPLC谱图(未显示)显示93％的游离F-18和7％与肽结合的F-18。向所述反应中加入另外10μL的IMP 272溶液，并再次加热和通过反相HPLC分析(未显示)。HPLC谱图显示8％的F-18处于空体积，而92％的活性连接至肽。剩余的肽溶液在室温下与150μL PBS温育～1小时，然后通过反相HPLC分析。HPLC(未显示)显示58％的F-18未结合，而42％的F-18仍连接至肽。数据表明F-18-Al-DTPA络合物在与磷酸盐混合时可能不稳定。

[0113] 反相HPLC：反相HPLC分析在下列条件下进行：

[0114] 柱：WATERS XTERRATM MS C185μm，4.6×250mm

[0115] 流速：1mL/分钟

[0116] 梯度缓冲液：缓冲液C，于DI水中的0.1％NH4OAc，缓冲液D，90％乙腈、10％水和0.1％NH4OAc

[0117] 梯度：100％缓冲液C至100％缓冲液D，使用30分钟的线性梯度。

[0118] 运行时间：30分钟

[0119] 尺寸排阻HPLC：尺寸排阻HPLC在下列条件下进行：

[0120] 柱： BIO-SILTM SEC 250，300×7.8mm

[0121] 梯度：等度

[0122] 洗脱缓冲液：0.2M磷酸盐pH 6.8

[0123] 流速：1mL/分钟

[0124] 运行时间：30分钟

[0125] 所有放射谱图都是使用PERKIN 610Tr监测F-18的发射获得的。表1-3分别列表呈现数据。

[0126] 表1F-18+IMP 272+AlCl3在110℃下加热15分钟，接着通过反相HPLC分析。

[0127] 区：F-18 检测器：FSA

[0128]开始 结束 保留 高度 面积 ％ROI ％总
名称
(分钟) (分钟) (分钟) (CPM) (CPM) (％) (％)
Bkg 1 2.20 2.30 2.20 130.0
区1 2.30 3.30 2.60 85270.0 200050.0 93.15 96.31
Bkg 2 4.40 4.50 4.40 210.0
区2 8.70 9.80 9.00 5590.0 14720.0 6.85 7.09
2个峰 214770.0 100.00 103.40

[0129] 表2F-18+过量IMP 272+AlCl3在110℃下加热15分钟，接着通过反相HPLC分析。

[0130] 区：F-18 检测器：FSA

[0131]开始 结束 保留 高度 面积 ％ROI ％总
名称
(分钟) (分钟) (分钟) (CPM) (CPM) (％) (％)
Bkg 1 2.20 2.30 2.20 340.0
区1 2.40 3.20 2.70 6450.0 20549.6 7.76 8.23
Bkg 2 7.10 7.20 7.10 630.0
区2 7.30 8.70 8.50 3140.0 13113.6 4.95 5.25
区3 8.70 10.00 9.00 93700.0 231023.9 87.28 92.57
Bkg 3 10.70 10.80 10.70 520.0
3个峰 264687.1 100.00 106.06

[0132] 表3在PBS中于室温下用磷酸处理90分钟。F-18+过量IMP 272+AlCl3的等份在110℃下加热15分钟，接着通过反相HPLC分析。

[0133] 区：F-18 检测器：FSA

[0134]开始 结束 保留 高度 面积 ％R0I ％总
名称
(分钟) (分钟) (分钟) (CPM) (CPM) (％) (％)
Bkg 1 2.00 2.10 2.00 350.0
区1 2.40 3.30 2.70 81930.0 162403.6 58.23 62.44
Bkg 2 4.20 4.30 4.20 410.0
Bkg 3 7.50 7.60 7.50 780.0
区2 7.80 8.60 8.40 2110.0 5564.7 2.00 2.14
区3 8.60 9.80 8.90 44590.0 110942.0 39.78 42.66
Bkg 4 10.50 10.60 10.50 460.0
3个峰 278910.3 100.00 107.24

[0135]

[0136] 标记的肽通过以下方法纯化：将标记的肽溶液应用到1cc(30mg)HLB柱(部件#186001879)并用300μL水洗涤以除去未结合的F-18。通过用2×100μL
1∶1MeOH/H2O洗涤柱来洗脱肽。纯化的肽在水中于25℃温育并通过反相HPLC分析(未显示)。HPLC分析显示F-18标记的IMP 272在水中不稳定。在水中温育40分钟后，约17％的F-18从所述肽释放，而83％保留下来(未显示)。

[0137] 实施例2.F-18IMP 272的免疫反应性

[0138] 肽(16μL 2mM IMP 272，48μg)用F-18标记并通过尺寸排阻HPLC分析抗体结合。尺寸排阻HPLC显示所述肽结合hMN-14×679，但不与无关的双特异性抗体hMN-14×734结合(未显示)。

[0139] 实施例3.用其它金属标记的IMP 272F-18

[0140] ～3μL等份的金属贮存溶液(6×10-9mol)置于聚丙烯锥形管，并与75μL F-18(原始样品)混合，在室温下温育～2分钟，然后与20μL的于0.1M NaOAc pH 4缓冲-8液中的2mM(4×10 mol)IMP 272溶液混合。溶液在加热器中于100℃加热15分钟，并通过反相HPLC分析。IMP272用铟(24％)，镓(36％)，锆(15％)，镥(37％)和钇(2％)标记(未显示)。

[0141] 实施例4.用于筛选Al-18F结合的其他肽的标准F-18肽标记条件

[0142] 3μL等份的2mM铝贮存溶液置于聚丙烯锥形管，并与50μL F-18(原始样品)混合，在室温下温育～2分钟，然后与16μL至20μL的于0.1MNaOAc pH 4缓冲液中的2mM肽溶液混合。溶液在加热器中于100℃加热15分钟，并通过反相HPLC(PHENOMENEXTM，
5μ，C-18，110A，250×4.6mm HPLC柱)分析。

[0143] 测试的肽

[0144] IMP 272：DTPA-Gln-Ala-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2MH+1512(图1)

[0145] IMP 288DOTA-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2MH+1453(图2)

[0146] IMP 326DTPA-ITC-NH-NH-Phe-CO-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2MH+1477(图3)

[0147] IMP 329去铁胺-NH-CS-NH-NH-Ph-CO-D-Tyr-DLys(HSG)-D-Glu-D-LyS(HSG)-NH2 +MH1804(图4)

[0148] IMP 331NTA-iAsp-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2MH+1240(图5)[0149] IMP 332EDTADpr-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lsy(HSG)-NH2MH+1327(图6)[0150] IMP 333DTPA-Dpr(DTPA)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2 MH+1845(图7)

[0151] IMP 334(H2O3P)2-C(OH)-(CH2)3-NH-Gly-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2MH+1192(图8)

[0152] IMP 337Ac-D-Ser(PO3H2)-D-Ser(PO3H2)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-N+H2MH1291

[0153] IMP 338Ac-D-Ser(PO3H2)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2 MH+1126[0154] IMP 345DTPA-D-Ser(PO3H2)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2 MH+1459[0155] IMP 349DTPA-D-CyS((H2O3P)2-CH-CH2-S)-D-Ala-D-LyS(HSG)-D-Ala-D-LyS(HSG)-+NH2 MH1583(图9)

[0156] IMP 361DTPA-Dpr(BrCH2CO-)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1498[0157] IMP 366DTPA-Dpr(Ph-S-CH2CO-)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2M+H1528

[0158] IMP 368Sym-DTPA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2 MH+1292(图10)[0159] IMP 369Sym-DTPA-NH-CH(2-Br-Phe-)-CH2-CO-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(+HSG)-NH2 MH1517

[0160] IMP 370Sym-DTPA-NH-CH(2-O2N-Phe-)-CH2-CO-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(+HSG)-NH2 MH1484

[0161] IMP 371DTPA-NH-CH(2-O2N-Phe-)-CH2-CO-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)+-NH2 MH1484

[0162] IMP 372DTPA-Dpr(Ser)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1465[0163] IMP 373DTPA-Dpr(Sym-DTPA)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1753[0164] IMP 374DTPA-Dpr(Cl-CH2CO-Cys(Et)-)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-+NH2MH1585

[0165] IMP 375DTPA-Dpr(2-Br-Phe-CHNH2-CH2-CO-)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-LyS(H+SG)-NH2 MH1603(图11)

[0166] IMP 376DTPA-Cys(HO3S-S)-D-Tyr-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2M+H1558

[0167] IMP 379DTPA-Dpr(2-H2N-Phe-CO-)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2M+H1497

[0168] IMP 382DTPA-Dpr(H)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2 MH+1378[0169] IMP 383DTPA-Dpr(Gla-)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2 MH+1507[0170] IMP 384DTPA-Dpr(2-HO-Phe-CHNH2-CH2-CO-)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(H+SG)-NH2 MH1541(图12)

[0171] IMP 385DTPA-Dpr(Dpr)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2 MH+1464[0172] IMP 386DTPA-Dpr(2-吡啶基-CH2-CHNH2-CO-)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-LYs(H+SG)-NH2 MH1526(图13)

[0173] IMP 387DTPA-Dpr(D-9-蒽基丙氨酸)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2+MH1625

[0174] IMP 389DTPA-Dpr(2-羧基哌嗪基)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-LyS(HSG)-NH2MH+1490(图14)

[0175] IMP 460NODA-GA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2 MH+1366

[0176] 进一步的可利用的肽的实例如表15和16所示。表16所示为IMP 422，IMP 426和IMP 428的结构。如下所述，IMP449(图15)在体内条件下表现出缀合F-18的肽特有的稳定性，可用于标记和成像技术。

[0177] 图17显示NOTA型配体可选择的构型。NOTA部分可由D或L对硝基苯丙氨酸制得，亚氨基二乙酸部分可来自于D或L的二氨基丙酸。此外，乙烯桥的位置可通过二氨基丙酸转换，得到在配体上不同构型的基团。所有这些修饰可能影响随后形成的络合物的结合动力学和稳定性。图18阐明了可被例如Ga-68或F-18标记的NODA-Ga肽的结构。

[0178] 在某些实施方式中，可选择的螯合物部分可用于结合18F-金属或18F-硼络合物。图22A-D阐明了一些例示潜在的基于NETA结构的螯合物部分。如上所述，Chong等人(2007)报道了NETA配体与各种金属络合时，表现出改进的血清稳定性。优化螯合剂的设计以提高
18
肽对 F-金属的结合亲和力。

[0179] 肽标记筛选研究的结果

[0180] 大多数DTPA衍生物显示出与IMP 272标记相当的标记。例外的是，在半胱氨酸l8侧链上携带双磷酸盐基团的IMP 349标记非常差。DOTA配体未结合Al- F。IMP 326的
18 18
ITC DTPA配体未结合Al- F以及DTPA。IMP 331的NTA配体未结合Al- F。IMP 332的
18 18
EDTA配体结合Al- F但不如DTPA。对称DTPA配体未结合Al- F。测试的膦酸盐和磷酸盐
18
基团在测试的条件下与Al- F结合得不好。筛选确实显示连接于DTPA附近的基团可影响
18
Al- F-DTPA络合物的稳定性。筛选显示IMP 375标记得更好并形成比IMP272显著更稳定的络合物。IMP 375标记得良好并且在水中稳定，25℃下5小时后表现出95.4％的剩余结合(未显示)。在体内优选施用高血清稳定性的肽。

[0181] 肽标记筛选研究仅考察了Al-18F的结合。一些用Al-18F标记得不好的肽可用另一种结合F-18的金属更好地标记。

[0182] 肽合成

[0183] 通过使用Fmoc策略的固相肽合成来合成肽。通过使用Fmoc/Aloc保护基团以允许差异的脱保护而将基团加至二氨基氨基酸的侧链。通过Dangles等人(J.Org.Chem.1987，52：4984-4993)的方法除去Aloc基团，不同的是将哌啶以1∶1的比例加入使用的乙酸。不对称四叔丁基DTPA的制备如McBride等人所述(美国专利申请公布第US 2005/0002945A1号，申请第10/776,470号，公布日期2005年1月6日)。三叔丁基DOTA、对称四叔丁基DTPA和ITC-苄基DTPA获自 Aloc/Fmoc赖氨酸和Dap(二氨
基丙酸衍生物(也称为Dpr))获自 或 Sieber酰胺树脂
获自 其余的Fmoc氨基酸获自
或

[0184] IMP 272根据描述合成(McBride等人，美国专利申请公布第20040241158A1号，申请第10/768,707号，2004年12月2日)。IMP 288根据描述制备(McBride等人，J.Nucl Med.，2006，47：1678-1688)。

[0185] IMP 326肼肽 (IMP 319)使用 Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Glu(OBut)-OH、Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Tyr(But)-OH和4-(Boc-NH-NH-)C6H4-CO2H以所述顺序在Sieber酰胺树脂上制备。4-(Boc-NH-NH-)C6H4-CO2H通过将Boc二碳酸盐加入于二噁烷氢氧化钠溶液中的4-肼基苯甲酸来制备。

[0186] 添加Boc-酰肼后，除去侧链Aloc基团，并将三苯甲基-HSG-OH基团加到赖氨酸的侧链上。然后用TFA从树脂解离肽，并通过HPLC纯化，以获得需要的肼二-HSG肽IMP +319(MH1201)。然后将酰肼肽(0.0914g)与于3mL 0.1M磷酸钠pH 8.2中的0.0650g ITC-苄基DTPA混合。用1M NaOH调节所述溶液的pH，以使pH保持在pH 8.2。肽和ITC-苄基DTPA之间的反应完成后，通过HPLC纯化肽缀合物。

[0187] IMP 329：通过将1.0422g的甲磺酸去铁胺(1.59×10-3mol)和于10mL 1∶1甲醇-3/水中的0.2835g(1.59×10 mol)的硫代羰基二咪唑混合来制备异硫氰酸去铁胺。加入三+
乙胺0.23mL，2.5小时后通过反相HPLC纯化反应，以获得异硫氰酸去铁胺MNa625。

[0188] 肼肽IMP 319(0.0533g、4.4×10-5mol，MH+1201)与于磷酸钠缓冲液pH 8.1中的0.0291g异硫氰酸去铁胺混合两小时，然后通过HPLC纯化以获得需要的产物MH+1804。

[0189] IMP 331下列氨基酸以所示顺序连接至Sieber酰胺树脂(0.58mmol/g)Sieber酰胺树脂：Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Tyr(But)-OH和Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH。除去Aloc基团，并将Trt-HSG-OH加至赖氨酸的侧链。除去Fmoc，然后以所述顺序添加Fmoc-D-Ala-OH和Fmoc-Asp-OBut(0.5g树脂)。除去Fmoc，并用3mL叔丁基溴乙酸酯和3.6mL二异丙基乙胺在3.4mL NMP中使Asp的氮烷基化过夜。用TFA从树脂切割下肽，并通过反相HPLC纯化，+以获得需要的肽MH1240。

[0190] IMP 332：肽在3g Sieber酰胺树脂(0.58mmol/g)上制备。下列氨基酸以所示顺序添加至树脂：Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Tyr(But)-OH、Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH和Fmoc-Dpr(Fmoc)-OH。树脂分成几部分以用于后续合成。取出一克树脂，并除去二氨基丙酸上的Fmoc基团。用3mL叔丁基溴乙酸酯、3.6mL二异丙基乙胺和3.4mLNMP使肽烷基化过夜。然后除去侧链Aloc基团并添加Trt-HSG-OH基团。然后将肽从+
树脂切割下，并通过HPLC纯化以获得产物MH1327。

[0191] IMP 333：肽使用1g与用于制备IMP 332相同的树脂制备。将DTPA四叔丁基酯(美国专利公布第20050002945号)添加至Dpr基团的两个胺上。然后除去Aloc基团，并+添加Trt-HSG-OH。然后将肽切割下，并通过HPLC纯化以获得需要的产物MH1845。

[0192] IMP 334：肽在1g Rink酰胺树脂(0.7mmol/g)上制备，并以所示顺序添加下 列 氨 基 酸：Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Glu(But)-OH、Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Boc-Ser(But)-OH。除去Aloc基团，并添加三苯甲基-HSG-OH。用TFA从树脂切割下肽。通过从醚中沉淀收集粗肽并干燥。高碘酸钠0.33g溶于15mL水。粗品肽溶于1mL 0.5M磷酸钠pH 7.6、3mL水和1mL高碘酸盐溶液。在～2小时内以一毫升的增量另外添加3mL高碘酸盐。然后通过反相HPLC纯化所述混合物，并冻干以获得醛IMP 289HCO-CO-D-Lys(HSG)+-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2MH959。阿伦膦酸盐(0.0295g， )溶于150μL
0.1M NaOAc pH 4。肽IMP 289(0.0500g)溶于100μL 13％于水中的异丙醇。添加氰基硼+
氢化钠，并通过HPLC纯化所述混合物以获得需要的产物MH1192。

[0193] IMP 337和IMP 338：肽在Sieber酰胺树脂上制备，使用以所示顺序添加的下列氨基酸：Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Ser(PO(OBzl)OH)-OH、Fmoc-D-Ser(PO(OBzl)OH)-OH和Ac2O。除去Aloc基团，并向赖氨酸的侧链添加Trt-HSG-OH基团。将肽从树脂切割下，并通过HPLC纯化以获得需要的+ +产物：IMP 337MH1291和IMP 338MH1126。

[0194] IMP345：肽在Sieber酰胺树脂上制备，使用以所示顺序添加的下列氨基酸：Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Ser(PO(OBzl)OH)-OH和四叔丁基DTPA。除去Aloc基团，并向赖氨酸的侧链添加Trt-HSG-OH基团。将肽从树脂切割下，并通过HPLC纯化以获得需要的产物：IMP +
345MH1459。

[0195] IMP 349： 肽 IMP 347DTPA-D-Cys-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2在Sieber酰胺树脂上制备，使用以所示顺序添加的下列氨基酸：Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH，切割aloc，添加Fmoc-D-Ala-OH、Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH，切割aloc，添加Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH和四叔丁基DTPA。将肽从树脂切割下，+ -5并通过HPLC纯化以获得需要的产物：IMP 347MH1395。肽IMP 347O.0446g(3.2×10 mol)-3
与于3mL水中的0.4605g(2.4×10 mol)亚乙烯基双(膦酸)(Degenhardt等人，J.Org.Chem.1986，51：3488-3490)混合，并用逐滴添加的1M NaOH将所述溶液调节至pH 6.5。反应搅拌过夜，并通过添加过量的亚乙烯基双(膦酸)将反应溶液调节至pH 1.49。混合物在+
室温下搅拌过夜，然后通过HPLC纯化以获得需要的肽IMP 349MH1583。

[0196] IMP361：肽在Sieber酰胺树脂上制备，使用以所示顺序添加的下列氨 基 酸：Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH，切 割 aloc，添 加 Fmoc-D-Ala-OH、Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH，切割aloc，添加Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Dap(Aloc)-OH和四叔丁基DTPA。除去Dap侧链上的Aloc，并用溴乙酸酐添加溴乙酰基。粗产物通过HPLC+
纯化以获得需要的肽IMP 361(MH1498)。

[0197] IMP366：肽通过与IMP 361相同的方法制备，最后添加苯硫乙酸。粗产物通过HPLC+纯化以获得产物IMP 366MH1528。

[0198] IMP 368：肽的制备参见IMP 349，除了未添加半胱氨酸残基，并且使用对称四叔丁基DTPA 替代非对称DTPA，以在纯化后获得需要的产物IMP+
368MH1292。

[0199] IMP 369：肽的制备参见IMP 349，但是添加Fmoc-R-3-氨基-3-(2-溴苯基)丙酸替代D-Cys和添加对称四叔丁基DTPA替代DTPA四叔丁基酯的非对称形式。纯化粗肽以获+得需要的产物MH1517。

[0200] IMP 370：肽的制备参见IMP 369，除了使用Fmoc-R-3-氨基-3-(2-硝基苯基)丙+酸替代溴。通过HPLC纯化后获得需要的产物MH1484。

[0201] IMP 371：肽的制备参见IMP 370，除了使用非对称四叔丁基DTPA替代对称形式。+
通过HPLC纯化后获得需要的产物MH1484。

[0202] IMP 372：肽的制备参见IMP 361，但是使用Fmoc-Ser(But)-OH将Ser连接至Dap+侧链。除去Fmoc，将肽从树脂切割下，并纯化以获得需要的产物MH1465。

[0203] IMP 373：肽的制备参见IMP 361，但是使用对称四叔丁基酯DTPA将Sym-DTPA连+接至Dap侧链。将肽从树脂切割下，并纯化以获得需要的产物MH1753。

[0204] IMP 374：肽的制备参见IMP 361，但是将Fmoc-S-乙基半胱氨酸添加至Dap侧链，然后经由氯乙酸酐添加氯乙酰基(于半胱氨酸氮上)。将肽从树脂切割下，并纯化以获得需+要的产物MH1585。

[0205] IMP 375：肽的制备参见IMP 361，但是将Fmoc-R-3-氨基-3-(2-溴苯基)丙酸添+加至Dap侧链，然后切割Fmoc基团。将肽从树脂切割下，并纯化以获得需要的产物MH1603。

[0206] IMP 376：肽 的 制 备 参 见IMP 361，但 是 在 第 二 个 丙 氨 酸 后 添 加Fmoc-D-Tyr(But)-OH，然后是Fmoc-Cys(SO3H)和四叔丁基DTPA。将肽从树脂切割下，并纯+化以获得需要的产物MH1558。

[0207] IMP 379：肽的制备参见IMP 361，但是将Boc-2-Abz-OH添加至Dap的侧链。将肽+从树脂切割下，并纯化以获得需要的产物MH1497。

[0208] IMP 382肽的制备参见IMP 361，但是从Dap的侧链除去Aloc。将肽从树脂切割+下，并纯化以获得需要的产物MH1378。

[0209] IMP 383：肽的制备参见IMP 361，但是将Fmoc-Gla(OBut)2-OH添加至Dap的侧链。+
将肽从树脂切割下，并纯化以获得需要的产物MH-CO21507。

[0210] IMP 384：肽的制备参见IMP 361，但是将Fmoc-Boc-S-3-氨基-3-(2-羟基苯基)+丙酸添加至Dap的侧链。将肽从树脂切割下，并纯化以获得需要的产物MH1541。

[0211] IMP 385：肽的制备参见IMP 361，但是将Fmoc-Dpr(Fmoc)-OH添加至Dap的侧链。+
将肽从树脂切割下，并纯化以获得需要的产物MH1464。

[0212] IMP 386肽的制备参见IMP 361，但是将Boc-D-2-吡啶基丙氨酸-OH添加至Dap+的侧链。将肽从树脂切割下，并纯化以获得需要的产物MH1526。

[0213] IMP 387：肽的制备参见IMP 361，但是将Fmoc-D-9-蒽基丙氨酸-OH添加至Dap的+侧链。将肽从树脂切割下，并纯化以获得需要的产物MH1625。

[0214] IMP 389肽的制备参见IMP 361，但是将双-Boc-哌嗪-2-羧酸酯添加至Dap的侧+链。将肽从树脂切割下，并纯化以获得需要的产物MH1664。

[0215] 实施例5制备和分离F-18标记肽的替代方法

[0216] 在某些实施方式中，通过加热使得Al-F-18络合物进入NOTA螯合基团。可选地，ITC苄基NOTA(大环的)可用Al-F-18标记，然后在标记后与其他热敏性分子(如蛋白质)缀合。如果需要高比活性，则ITC苄基NOTA络合物可从冷配体中分离纯化。

[0217] 肽中加入Al，其HPLC图谱与空NOTA肽和Al-F-18肽进行对比。Al肽和Al-F-18肽TM具有实质上相同的HPLC保留时间，未标记肽的RT长～1分钟。肽在PHENOMENEX
整体式C-18100×4.5mm柱中以3ml/min的流速进行纯化。缓冲液A是在水中的0.1％TFA，缓冲液B是90％CH3CN、10％水和0.1％TFA。线性梯度在15分钟期间从100％缓冲液A至
75∶25A/B。由于Al络合物和Al-F-18络合物共洗脱，Al和F-18的加入量将决定比活性。

[0218] IMP449根据如下实施例7制备，接着标记。F-18接收至2.0ml的费希尔微量离心瓶中(02-681-374)，其中含有15mCi F-18溶在～325μL水中。F-18溶液中加入3μL 0.1M pH 4NaOAc中的2mM AlCl3，然后涡旋混合。在约4分钟后，加入10μL pH40.5M NaOAc中的0.05M IMP 449。所述样品再次涡旋混合，用加热器在102℃下加热17分钟。然后反应简单冷却，转移瓶内容物，通过上述HPLC进行纯化。

[0219] 在 ALLIANCETM分析系统上独立地确定洗脱条件，并将标记的肽洗脱7.5～8.5分钟。分析HPLC显示，标记的肽含Al-F IMP 449(UV220nm)，不含未络合肽，导致比活性增加。

[0220] 将肽用水稀释，并使其通过 OASIS PLUS HLBTM提取柱。标记肽用3mL1∶1的EtOH/H2O洗脱。洗脱物的HPLC分析证实柱有效捕获了标记肽，其允许乙腈和TFA从肽中被洗掉。HPLC还显示1∶1的EtOH/H2O洗脱物含所需产物(适用于稀释后注射的溶剂中无游离的F-18)。明显的纯化后产量是11％。

[0221] 实施例6.体内研究

[0222] 向携带GW-39人结肠异种移植肿瘤(100-500mg)的裸鼠注射双特异性抗体-10 -11
hMN-14x m679(1.5×10 mol)。在注射F-18标记的带有HSG的肽(8.8μCi，1.5×10 mol)之前，允许抗体清除24小时。在注射后3、24和48小时对所述动物成像。异种移植肿瘤通过PET扫描检测与双特异性hMN-14x m679结合的F-18标记的肽而被清晰成像，双特异性hMN-14xm679通过hMN-14与肿瘤抗原的结合而定位于肿瘤。

[0223] 实施例7.血清稳定的F-18标记肽的制备和用途

[0224] IMP 449NOTA-ITC苄 基-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2MH+1459( 图15)

[0225] 肽IMP 448D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2MH+1009在Sieber酰胺树脂上制备，通过以所示的顺序向树脂添加下列氨基酸：Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、切 割 Aloc、Fmoc-D-Tyr(But)-OH、Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、 切 割 Aloc、Fmoc-D-Ala-OH，最后切割Fmoc以制备需要的肽。然后将肽从树脂切割下，并通过HPLC纯-5化以制备IMP 448，其然后与ITC-苄基NOTA偶联。肽IMP 4480.0757g(7.5×10 mol)与-5
0.0509g(9.09×10 mol)ITC苄基NOTA混合，并溶于1mL水。然后向搅拌的肽/NOTA溶液缓慢加入无水碳酸钾(0.2171g)。在加入所有碳酸盐后反应溶液为pH 10.6。允许反应在室温搅拌过夜。14小时后用1MHCl小心猝灭反应，并通过HPLC纯化以获得48mg需要的产物IMP 449(图15)。

[0226] IMP 449的F-18标记

[0227] 肽IMP449(0.002g，1.37×10-6mol)溶于686μL(2mM 肽溶 液)0.1M NaOAc pH4.02。三微升于pH 4乙酸盐缓冲液中的2mM Al溶液与15μL、1.3mCi的F-18混合。所述溶液然后与20μL的2mM IMP 449溶液混合，并在105℃加热15分钟。反相HPLC分析显示35％(RT～10分钟)的活性连接至肽，而65％的活性在柱的空体积洗脱(3.1分钟，未显示)，表明大部分活性与所述肽无关。粗标记的混合物(5μL)与收集的人血清混合，并在
37℃温育。15分钟后取出等份并通过HPLC分析。HPLC显示9.8％的活性仍连接至肽(从
35％下降)。1小时后取出另一等份并通过HPLC分析。HPLC显示7.6％的活性仍连接至肽(从35％下降)，这基本上与15分钟的谱图相同(数据未显示)。

[0228] 高剂量F-18标记

[0229] 使用纯化的IMP 449的进一步研究证明，F-18标记的肽在人血清中于37℃下至少一小时内是高度稳定的(91％，未显示)，并且在人血清中于37℃下至少四小时内是部分稳定的(76％，未显示)。这些结果证明，本文公开的F-18标记的肽在接近体内的条件下显示充分的稳定性以用于F-18成像研究。

[0230] 于～400μL水中～21mCi的F-18与于0.1M pH 4NaOAc中的9μL 2mM AlCl3混-7合。加入肽IMP 449 60μL(0.01M，6×10 mol，于0.5NaOH中，pH 4.13)，并将溶液加热至
110℃，15分钟。然后如下纯化粗标记的肽：将反应溶液置于1cc HLB柱的管
中，并用水洗脱以除去未结合的F-18，然后用1∶1EtOH/H2O以洗脱F-18标记的肽。粗反应溶液通过所述柱进入废液瓶，并用三个1毫升水的级分(18.97mCi)洗涤柱。然后将HLB柱置于新瓶上，并用2×200μL 1∶1EtOH/H2O洗脱来收集标记的肽(1.83mCi)。在所有的洗脱完成后柱保留0.1mCi的活性。等份的纯化的F-18标记肽(20μL)与200μL合并的人血清混合，并在37℃加热。等份通过反相HPLC分析(如上所述)。结果显示在37℃下在人血清中温育零时、1小时(91％标记的肽)、2小时(77％标记的肽)和4小时(76％标记的肽)的F-18标记的纯化IMP 449的相对稳定性(未显示)。还观察到F-18标记的IMP
449在TFA溶液中稳定，其有时用于反相HPLC色谱。观察到的本文所述示例性F-18标记的分子在TFA中的稳定性与在人血清中的稳定性之间显示普遍相关性。这些结果表明根据本文所述的方法制备的F-18标记肽在人血清中表现出足够的稳定性，可成功地用于体内标记和成像研究，例如利用PET扫描检测标记的细胞或组织。

[0231] 实施例8F-18标记IMP449在SCID小鼠中的体内生物分布

[0232] F-18标记的IMP449如上所述制备(实施例7)。所得物质在 HLB柱( Milford，MA)进行纯化。未结合的物质用水冲洗，结合在柱上的标记肽用
1∶1的乙醇∶水的混合液进行洗脱。两级分均用反相C18HPLC进行分析。纯化肽在反相HPLC柱上洗脱形成几个峰(未显示)。从 柱收集的未结合部分从C18柱的低回
收率，仅7％(未显示)。

[0233] “未结合”级分和纯化的18F-IMP 449注射入预先皮下注射SU-DHL6淋巴瘤细胞的SCID小鼠体内。仅少数小鼠具有可见的肿瘤。生物分布数据表明在“未结合”F-18级分和纯化的18F-IMP 449之间存在显著差异。数据如下表4-6所示。注意在此研究中，在标记肽之前没有给动物注射预靶向双特异性抗体。这些结果表明标记肽与游离F-18在体内的分布。

[0234] 未缀合F-18在体内表现出对骨骼组织的高水平分布。正如所料，注射20分钟后吸收主要在骨骼中(脊柱)，约为12-15％注射剂量每克(ID/g)，接着是肾脏，约为4％ID/g。通过与靶向肽缀合，F-18标记对骨骼组织的定位实质性降低。当连接至IMP449，骨骼中的吸收在注射后20分钟降至～1％ID/g，1小时时降至0.3％，肾脏吸收在20分钟时为11％，
1小时为3.3％ID/g。肾脏对仅肽的吸收与对预靶向18F-IMP 449肽(见下列实例)的吸收相似，提示其吸收是肽的功能，而非18小时前施予动物bsMAb的结果。与未结合F-18相比，F-18标记肽在脊柱和股骨的非特异性吸收相对较低。

[0235] 表4.F-18“未结合”级分注射后20分钟：％ID/g平均值和个体动物。

[0236]组织 n 平均值 SD 动物1 动物2 动物3
肿瘤 1 -- -- 0.902 -- --
肝 3 2.056 0.244 1.895 2.338 1.937
脾 3 1.869 0.434 1.677 2.366 1.564
肾 3 4.326 0.536 3.931 4.936 4.111
肺 3 2.021 0.149 1.903 2.188 1.972
血液 3 2.421 0.248 2.355 2.696 2.212
胃 3 0.777 0.409 0.421 1.224 0.687
小肠 3 2.185 0.142 2.042 2.325 2.187
大肠 3 1.403 0.069 1.482 1.356 1.372
股骨 3 11.688 1.519 11.502 13.292 10.270
脊柱 3 14.343 2.757 17.506 13.072 12.452
肌肉 3 1.375 0.160 1.191 1.457 1.478

[0237] 表5.纯化的18F-IMP 449，80μCi，1×10-8mol注射后20分钟：％ID/g平均值和个体动物。

[0238]组织 n 平均值 SD 动物1 动物2 动物3 动物4 动物5
肿瘤 1 -- -- 0.891 -- -- -- --
肝 5 2.050 0.312 1.672 1.801 2.211 2.129 2.440
脾 5 1.297 0.259 0.948 1.348 1.144 1.621 1.425
肾 5 12.120 4.128 8.354 7.518 12.492 15.535 16.702
肺 5 2.580 0.518 2.034 2.103 2.804 2.678 3.278
血液 5 3.230 0.638 2.608 2.524 3.516 3.512 3.992
胃 5 1.017 0.907 0.805 0.775 0.344 0.557 2.605
小肠 5 1.212 0.636 0.896 0.921 0.927 0.967 2.349
大肠 5 0.709 0.220 0.526 0.568 0.599 0.793 1.057
股骨 5 0.804 0.389 0.314 0.560 1.280 0.776 1.087
脊柱 5 3.915 6.384 0.819 0.923 1.325 1.177 15.330#
肌肉 5 0.668 0.226 0.457 0.439 0.960 0.673 0.814

[0239] #统计确认动物#5的高脊柱吸收。

[0240] 表6.纯化的18F-IMP 449，80μCi，1×10-8mol注射后1小时：％ID/g平均值和个体动物。

[0241]组织 n 平均值 SD 动物1 动物2 动物3 动物4
肿瘤 1 0.032 0.064 0.000 0.127 0.000 0.000
肝 4 0.883 0.308 1.103 0.632 0.604 1.191
脾 4 1.061 0.702 1.598 0.631 0.301 1.713
肾 4 3.256 0.591 3.606 2.392 3.362 3.666
肺 4 0.324 0.094 0.411 0.232 0.256 0.399
血液 4 0.285 0.104 0.378 0.153 0.250 0.358
4 0.152 0.082 0.225 0.041 0.199 0.142
胃
小肠 4 1.290 0.228 1.124 1.247 1.166 1.624
大肠 4 0.115 0.035 0.167 0.091 0.094 0.109
股骨 4 1.006 0.876 2.266 0.448 0.939 0.374
脊柱 4 0.314 0.076 0.423 0.257 0.268 0.306
肌肉 4 0.591 0.946 0.205 0.077 2.008 0.075

[0242] 我们认为F-18标记肽显示出足够的体内稳定性，能成功进行标记和成像研究。

[0243] 实施例9.预靶向抗体的体内研究

[0244] F-18标记IMP449如下制备。～0.5mL，54.7mCi的F-18与3μL 2mMAl的0.1M NaOAc pH 4缓冲液混合。3分钟后，加入10μL 0.05M IMP449的0.5M pH 4NaOAc缓冲液，反应在加热器上96℃加热15分钟。反应内容物用注射器移出。然后粗标记肽通过HPLC在Phenomenex Onyx整体式C18，100×4.6mm柱No.CHO-7643部分进行纯化。流速为3mL/分钟。缓冲液A是0.1％TFA的水溶液，缓冲液B是含有0.1％TFA的90％乙腈水溶液。梯度在15分钟期间从100％A至75/25A∶B。先洗脱得到的标记肽与未标记肽的RT存在1分钟差别。收集HPLC洗脱液0.5分钟的级分。标记肽根据所使用的HPLC在6至9分钟时间流出。HPLC纯化肽样品通过将感兴趣的级分在水中稀释2倍，并将溶液置于1cc WatersHLB柱的管中进行进一步加工。滤芯用3×1mL水进行洗脱以除去乙腈和TFA，接着用400μL1∶1EtOH/H2O洗脱F-18标记肽。

[0245] 纯化的18F-IMP 449在分析HPLC C18柱上洗脱成单峰。

[0246] 使用4只带有在皮下缓慢生长的CaPanl异种移植物的泰康丽裸鼠。其中3只小鼠18
注射TF10(162μg)，18小时后注射 F-IMP 449。TF10是用于肿瘤成像研究的人性化双特异性抗体，二价结合PAM-4确定的MUC 1肿瘤抗原和一价结合HSG(参见，例如Gold等人，
2007，J Clin Oncol.25(18S)：4564)。1只小鼠仅注射肽。所有的小鼠在注射后1小时进行解剖。组织立即进行计数。动物#2在股骨中表现出高吸收。股骨转移至新的瓶中，与旧的空瓶重新计数。重计数表明数量集中在组织上。该股骨已经破裂，大块的肌肉与之粘连。
相比于平均分布表明，在肿瘤靶向双特异性抗体的存在下，定位于肿瘤处的F-18标记肽水平实质上高于任何正常组织。

[0247] 仅18F-IMP 449给药或以预靶向方式，其在动物体内的组织吸收类似。与仅肽给药相比，预靶向动物在人类胰腺癌异种移植物CaPanl的吸收1小时增加了5倍(46±0.9％ID/g对比089％ID/g)。此时得到特殊肿瘤/非肿瘤比率(例如，肿瘤/血液和肝脏比率分别是23.4±2.0和23.5±2.8)。

[0248] 表7.注射肽1小时后的组织吸收，平均值和个体动物：

[0249]

[0250]

[0251] *将股骨转移至新瓶后，通过重计数确认动物#2股骨的高计数。动物#2显示在正常组织吸收高于动物#1和#3。111 18

[0252] 实施例10. In-IMP 449对比 F-IMP 449和预靶向抗体的生物分布比较111 18

[0253] 研究的目的是为了比较 In-IMP 449和 F-IMP 449在以双特异性抗体TF2预靶向后皮下带有LS174异种移植物的裸鼠中的生物分布。TF2抗体用对接和锁定方法制得，包含与CEA肿瘤抗原和HSG半抗原的结合位点(参见，例如Sharkey等人，Radiology 2008，246：497-507；Rossi等人，PNAS USA 2006，103：6841-46)。由于同一时间没有足够数量的具有肿瘤的小鼠，研究分在2个不同周进行。
111 111

[0254] In-IMP 449：In标记采用与标记IMP288相同的过程进行，但是比活性较低。ITLC和C-18RP HPLC表现出～30％未结合(未显示)。标记肽在HLB柱(1mL，30mg)上纯化。所得纯化产物在饱和氯化钠中开发的ITLC分析仍显示33％未连接(最高20％带状)。
RP HPLC在纯化前后显示多重峰(未显示)。当混合有20×摩尔过量的TF2时，纯化后的SE HPLC显示47％活性转移至HMW(未显示)。

[0255] 18F-IMP 449：标记如上所述方法进行，但是如其他所述(Kim等人，Applied Radiation and Isotopes 61，2004，1241-46)，F-18在标记前先在QMA滤芯上纯化。简言之， Light Waters AccellTM Plus QMA滤芯先用10mL 0.4M KHCO3冲洗，而后用18
10mL DI水洗涤来制备。 F(42mCi)的2mL水加载到QMA滤芯上。滤芯用10mL DI水洗脱以除去杂质。随后用1mL 0.4M KHCO3的200μL级分洗脱柱体。级分2含有大部分活性，
18
33mCi。F-18溶液的pH用10μL冰醋酸调节。级分#2中的 F与3μL的2mM Al的0.1M pH 4NaOAc缓冲液中混合。样品与10μL的0.05MIMP 449的pH40.5M NaOAc缓冲液混合，
18
且反应溶液在94℃加热15分钟。 F-IMP 449用RP HPLC纯化。包含产品的级分通过HLB柱来交换缓冲液。柱加载样品后用水洗涤。产品用400μL体积的1∶1的水∶乙醇进行洗脱。产品的RP HPLC显示一个有肩主峰(未显示)。由于产率低，比活性低，需要往小鼠注射更多的肽，从而导致bsMAb：肽的比率为6.9∶1而非10∶1。

[0256] 结果111 111

[0257] IMP449用 In标记可能得到多种产品。其中一些可能为双核络合物。 In-IMP111
449表现出高肾脏吸收和高血药浓度。虽然有多种类别，但是当以TF2预靶向时， In-IMP
449仍表现对肿瘤的定位。

[0258] 图19表明在小鼠体内In-111和F-18标记的IMP 449的比较生物分布。当存在双特异性TF2抗体时，两种标记肽表现出对肿瘤组织类似的高定位水平。当存在或不存在TF2抗体时，In-111标记类别比F-18标记类别在肾脏显示出更高的浓度。数据汇总在下列表8-11中。-9

[0259] 表 8. 小 鼠 静 脉 注 射 TF2(163.2ug，1.035×10 mol)， 接 着 注 射111 -10
In-IMP449(1.035×10 mol)16小时后。注射肽后1小时的肽组织吸收(％ID/g)如下所示。

[0260]组织 n 平均值 SD 动物1 动物2 动物3 动物4 动物5
肿瘤 5 9.18 1.02 9.22 8.47 8.04 9.45 10.70
肝 5 1.15 0.09 1.03 1.25 1.20 1.21 1.08
脾 5 0.48 0.06 0.43 0.49 0.58 0.50 0.42
肾 5 6.63 1.38 8.81 6.21 7.03 5.85 5.23
肺 5 1.03 0.14 0.92 1.14 1.18 1.04 0.86
血液 5 0.99 0.15 1.04 1.13 1.12 0.83 0.83
胃 5 0.16 0.05 0.25 0.17 0.16 0.13 0.12
小肠 5 2.33 0.65 2.21 2.51 2.01 3.33 1.59
大肠 5 0.20 0.04 0.21 0.25 0.18 0.21 0.14
股骨 5 1.45 0.87 0.59 1.30 0.71 2.02 2.62
脊柱 5 1.18 1.23 0.89 3.35 0.76 0.47 0.43
脑 5 0.14 0.16 0.05 0.06 0.13 0.04 0.43
肌肉 5 0.83 0.66 0.25 1.30 0.23 0.65 1.73
体重 5 25.49 1.41 27.89 24.14 25.27 25.10 25.06

[0261]111 -10

[0262] 表9.给一组2只小鼠注射不含预靶向抗体的 In-IMP449(1.035×10 mol)。注射肽后1小时的肽组织吸收(％ID/g)如下所示。

[0263]组织 n 平均值 SD 动物1 动物2
肿瘤 2 0.922 0.195 0.784 1.060
肝 2 1.033 0.048 0.999 1.067
脾 2 0.409 0.067 0.362 0.456
肾 2 6.046 0.449 5.729 6.364
肺 2 0.695 0.032 0.672 0.717
血液 2 0.805 0.182 0.934 0.676
胃 2 0.290 0.055 0.251 0.329
小肠 2 2.234 0.594 1.814 2.654
大肠 2 0.237 0.022 0.253 0.222
股骨 2 1.210 1.072 1.968 0.453
脊柱 2 1.463 1.213 2.320 0.605
脑 2 0.133 0.091 0.068 0.197
肌肉 2 1.005 1.148 1.817 0.193
体重. 2 26.65 3.19 28.90 24.39

[0264] 表10.小鼠静脉注射TF2(163.2ug，1.035×10-9mol)，接着在16小时后注射18 -10
F-IMP 449(1.5×10 mol)。注射肽后1小时的肽组织吸收(％ID/g)如下所示。

[0265]组织 n 平均值 SD 动物1 动物2 动物3 动物4 动物5
肿瘤 5 7.624 3.080 5.298 7.848 12.719 5.118 7.136
肝 5 0.172 0.033 0.208 0.143 0.196 0.131 0.180
脾 5 0.142 0.059 0.239 0.081 0.132 0.118 0.140
肾 5 2.191 0.125 2.313 2.141 2.154 2.319 2.027
肺 5 0.315 0.094 0.474 0.230 0.300 0.305 0.265
血液 5 0.269 0.143 0.431 0.395 0.132 0.126 0.260
胃 5 0.218 0.341 0.827 0.041 0.098 0.054 0.070
小肠 5 0.351 0.313 0.903 0.185 0.297 0.170 0.198
大肠 5 0.069 0.028 0.076 0.043 0.111 0.073 0.042
股骨 5 0.625 0.358 0.869 0.146 0.811 0.957 0.344
脊柱 5 0.585 0.569 0.159 0.119 0.493 1.526 0.626
脑 5 0.029 0.005 0.033 0.021 0.035 0.026 0.028
肌肉 5 0.736 0.970 0.190 0.064 0.494 2.438 0.496
体重. 5 24.69 1.20 23.05 26.36 24.45 24.48 25.11

[0266]

[0267] 表11.小鼠注射不含预靶向抗体的18F-IMP 449(1.5×10-10mol)。注射肽后1小时的肽组织吸收(％ID/g)如下所示。

[0268]组织 n 平均值 SD 动物1 动物2 动物3 动物4 动物5
肿瘤 5 0.472 0.201 0.256 0.344 0.533 0.447 0.779
肝 5 0.177 0.035 0.141 0.200 0.141 0.185 0.217
脾 5 0.118 0.027 0.098 0.094 0.101 0.144 0.151
肾 5 2.727 0.367 2.430 2.452 2.500 3.080 3.173
肺 5 0.246 0.082 0.206 0.209 0.156 0.301 0.358
血液 5 0.167 0.072 0.110 0.135 0.104 0.217 0.267
胃 5 0.114 0.083 0.149 0.241 0.037 0.067 0.074
小肠 5 0.277 0.081 0.407 0.286 0.206 0.213 0.271
大肠 5 0.072 0.029 0.061 0.052 0.047 0.083 0.118
股骨 5 0.100 0.032 0.080 0.144 0.110 0.109 0.059
脊柱 5 0.305 0.268 0.104 0.647 0.099 0.132 0.545
脑 5 0.034 0.025 0.018 0.018 0.022 0.034 0.077
肌肉 5 0.088 0.022 0.087 0.069 0.069 0.122 0.092
体重. 5 25.34 1.72 25.05 26.88 26.40 25.88 22.51

[0269] 总之，本文所述简单的可重现的方法和组合物用于制备F-18标记靶向肽，其可用于各种疾病状况的体内成像。技术人员能够意识到上述双特异性抗体不受限制，而是可以包括任何已知的可对抗各种疾病或病原体靶抗原的抗体。所述方法也不限于双特异性抗体预靶向。在其他实施方式中，直接连接至待成像的靶向细胞、组织或器官的分子或络合物可以采用本文所述的方法用F-18进行标记，施用于受试者进行PET呈像(参见下列实施例)。

[0270] Al-F-18标记肽，例示IMP449，在体内状况下足够稳定，可在已知成像方法中利用，诸如PET扫描。如上所述方法制备的放射性标记的肽的现有收率在5到20％之间，即使使用HPLC纯化步骤将标记肽从未标记肽中分离出来，最终收率约为5％。进一步，要求保护的方法可在1小时制备时间内制备可注射的F-18标记靶向肽，并在F-18的衰变时间内使合适的成像过程进行。最后，相比制备用于成像研究的F-18标记化合物的已知方法，描述的和要求保护的方法使操作者最小程度的暴露于放射性同位素下。

[0271] 实施例11.F-18标记试剂盒

[0272] F-18标记的试剂盒通过混合8.0mg的IMP 449和0.1549g的抗坏血酸制备得到。两种试剂溶解在10.5mL水中，溶液以1.0mL等分入10小瓶。pH未调节。溶液在真空下冷冻、冻干、密封。

[0273] 实施例12.利用标记肽和双特异性抗体预靶向在体内进行肿瘤成像

[0274] 当前实施例表明利用双特异性抗体预靶向和标记的靶向肽的体内成像技术可以成功地用于检测相对小尺寸的肿瘤。使用的预靶向抗体可以是如上所述的TF2或者TF10抗体。

[0275] 制剂缓冲液：

[0276] 制剂缓冲液是将0.3023g抗坏血酸，18.4mL DI水和1.6mL 1MNaOH混合，调节pH至pH6.61。缓冲液等分为20小瓶1mL，然后冻干。根据文献记载，F-18在TM
ACCELL Plus QMA轻质滤芯上纯化，其中滤芯先用10mL 0.4M KHCO3洗涤，接着用10mL DI水洗涤。含有F-18的2mL水通过滤芯，然后用10mL水洗涤。F-18从滤芯上洗脱下来成含有
0.4M KHCO3的5×200μL等分。大部分活性洗脱至第二级分。第二级分的活性与3μL 2mM Al的pH4乙酸缓冲液混合。然后将Al-F-18溶液注射入抗坏血酸IMP449标记瓶，加热至
105℃15分钟。冷却反应溶液，与0.8mL DI水混合。反应内容物置于
IccHLB柱，洗脱至废物瓶中。柱体用3×1mL DI水洗涤。柱体转移至含有抗坏血酸的制剂瓶中。柱体用2×200μL 1∶1EtOH/H2O洗脱，洗脱得到标记肽。

[0277] 利用DNL技术制备TF10双特异性抗体

[0278] TF10中的癌靶向抗体成份是从hPAM4中得到的，这是一种已作为放射性标记的Mab进行详细研究的人源化抗-MUC 1Mab(例如，Gold等人，Clin.Cancer Res.13：7380-7387，2007)。半抗原连接成份是一种从h679中得到的如上所述的人源化抗组胺琥珀酰甘氨酸(HSG)。TF10双特异性([hPAM4]2x h679)抗体用已知制备(抗CEA)2x抗HSG bsAb TF2的方法(Rossi等人，2006)制备。TF10构建体具有两个人源化PAM4Fab和一个人源化
679Fab。

[0279] 对于TF10，人源化hPAM4抗体Fab使用肽间隔子连接至α-序列。由于α-序列是唯一的，其可自发地与另一α-序列连接形成二聚体。在TF10中，含有2hPAM4抗-MUC1Fabs的结构通过2α-序列(称作hPAM4-DDD)相互连接。TF10的其他组分是通过连接β-序列至人源化抗HSG抗体的Fab’来制备。与α-序列不同，β-序列不能自身连接，但是可以与2α-序列(h679-AD)形成的二聚结构连接。因此，当这些2独立制备蛋白相互混合时，它们可立即形成‘a2p’结构，各Fab’定向为与其抗原无阻碍连接的方式。此结合相互作用的稳定性已经通过在各α-和β-序列(β-序列中的2个，和α-序列中的1个)中重要的定位半胱氨酸得到进一步改进。由于′b′以高特异性定位连接至′a2′，a2b一旦被组装，即可在α-和β-部分形成二硫桥，从而共价结合这些2蛋白质。α-和β-序列均可在人蛋白中找到，因而不期望被加入络合物的免疫原性。

[0280] 抗MUCI融合蛋白hPAM4-α是通过α序列融合至Fd链的C端形成的。抗HSG融合蛋白h679-β是通过β序列连接至Fd链的C端形成的。稳定连接的多价bsMAb Tf10是通过hPAM4-α与h679-β配对形成。

[0281] 两种融合蛋白(hPAM4-DDD和h679-AD2)在稳定转染骨髓瘤细胞中各自独立表达。合并组织培养上清液，得到2倍摩尔过量的hPAM4-α。反应混合物在使用1mM还原谷胱甘肽的温和还原条件下，室温温育24小时。还原后，利用2mM氧化谷胱甘肽的温和氧化条件完成DNL反应。TF10通过使用IMP 291-affigel树脂的亲和色谱法进行分离，它与h679Fab高特异性结合。

[0282] 全组织学和血细胞结合样本已用于检测hPAM4IgG和抗CEA x抗HSG bsMAb，现已进入临床实验。hPAM4结合仅限于在1/3样本中对膀胱和胃的微弱结合(体内未见结合)，对正常组织没有结合归因于抗CEAx抗HSG bsMAb。此外，对带有H1和H2阻胺受体的细胞系的体外研究表明，IMP-288二-HSG肽没有拮抗或激动活性，而在2不同类别的动物研究中表明，与阻胺成份相关肽在剂量为用于成像的20,000倍时没有药理活性。因此，HSG-组胺衍生物不具有药理学活性。

[0283] 生物分布：TF10双特异性抗体的靶向和剂量研究

[0284] 测定了用渐增的TF10剂量的TF10的生物分布和肿瘤靶向。这些研究提供了TF10在一定范围剂量内的基础PK数据。主要剂量范围模拟人等价剂量(HED)是约1.0至50mg给予70kg的患者。基于FDA对转化给予动物的剂量至HED的指导方针[即，(mg/kg小鼠体内/12.3)＝mg/kgHED]，那么将1mg(6.37nmol)Tf10剂量给予70kg人相当于3.5μg(0.022nmol)剂量在20g的小鼠体内。

[0285] 总之，动物静脉注射3.5，17.5，35和70的TF10(加入追踪125I-TF10)。给予17.5，35和70μg剂量(HED＝1，5，10和20mg)的动物在1，6，16，48和72小时进行解剖(n＝5每次观测，总的N＝75动物/细胞线)。目前很多TF10的研究表明在小鼠体内快速消除，与上述的TF2抗-CEA构建体类似。

[0286] Pk研究也用131I-TF10在兔子中进行。之前关于TF2抗-CEA bsMAb的研究表明，兔子可能能够更好的预测在患者中观察到的Pk行为，因为它们以在患者中发现的相同的方式清除人源化抗-CEA，而小鼠以更快的速度清除人源化IgG。这些研究涉及4只兔子，2只131
施予5～mg HED和2只施予20～mg加入 I-TF10(～700μCi)的TF10的HED。兔子在
5分钟，1，3，6，24，48，72，96，120和168小时进行抽血。用装有高能量准直仪的ADACSolus
131
伽马照相机拍摄完整体像。 I-标准物(～20μCi在10mL注射器中)置于每只兔子可见
131
范围内，在3，24，48，120和168小时进行成像。然后利用标准物提供关于 I-TF10分布的半定量数据。

[0287] 利用TF2和TF10双特异性抗体和标记肽的预靶向的成像研究

[0288] 下述研究表明利用双特异性抗体和标记肽的预靶向技术的体内成像的可行性。利18
用如上所述的 F-金属标记肽无法获得成像，而双特异性抗体的预靶向技术通常适用于任何种类的标记。因此，本研究是代表利用要求保护的F-18标记肽获得的结果。

[0289] 图20和图21表明利用bsMAb预靶向方法，以111In-标记的二-HSG肽，IMP-288，是检测动物模型中以何种程度清晰描绘的肿瘤的实施例。在图20中，利用TF10和111
In-IMP-288肽的预靶向对具有0.2至0.3g人胰腺癌异种移植物的裸鼠进行成像。在图形上部的6只动物接受两种不同剂量的TF10(相对所给肽的摩尔数，摩尔比为10∶1
111
和20∶1)，第二天它们施予 In-标记的二HSG肽(IMP-288)。另外3只动物仅给
111
予 In-IMP-288(未预靶向)。注射标记肽后3小时成像，在预靶向动物中清晰显示出
111
0.2-0.3g肿瘤的定位，而仅给予 I-肽的动物没有定位。

[0290] 本研究中，肿瘤吸收平均为20-25％ID/g，肿瘤/血比率超过2000∶1，肿瘤/肝18
脏比率为170∶1，肿瘤/肾脏比率为18/1。如上述实施例中所示的肿瘤吸收，Al- F-标记的IMP 449在相同的CaPanl异种移植物模型中平均仅为约4-5％ID/g，可见低吸收的
18 18 18
F-标记肽仅仅反映Al- F-标记的IMP 449的低比活性。然而，Al- F-标记IMP 449数据显示出预靶向的氟化肽的显著潜能，当所述氟化肽与TF10bsMAb的特异性结合将成为胰腺
18
或者其他癌成像的极好的工具。 F-标记肽的生物分布数据大大超出直接放射性标记的抗
18
体和直接用 F标记的小改造抗体构建体的靶向能力(Cai等人，J.Nucl.Med.48：304-310，
2007)。

[0291] 图21所示数据进一步强调了用于检测癌的预靶向方法的灵敏度。这里，从静脉注射了人结肠癌细胞系和肺中有0.2-0.3mm微转移肿瘤的裸鼠获得微型PET成像图。动物施124
予抗CEA bsMAb TF2，然后是预靶向 I-标记肽。成像显示横断面和冠状横切面在1.5小时甚至到21小时均具有强烈的吸收。冠状横切面是后观图，表明注射后1.5小时在胃和
124
肾脏中也可见 I-肽。当解剖直径不大于0.3mm时(上图，穿过胸的横切面)，成像显示何为在肺中的个体损伤(箭头)(Sharkey等人，Radiology，246(2)：497-507，2008)。以抗
124
CD22TF6bsMAb预靶向和给予相同的 I-标记肽的对照动物(左侧，中图)显示，此时抗CEA bsMAb定位的特异性。抗CEA预靶向动物的冠状横切面显示在胸和肾中的吸收，以及胃中的
18
一些活性。显著地，给予 F-FDG的动物中没有显示肺中相同尺寸的损伤。因而，相比于目前用于肿瘤PET成像的标准的F-18-标记的氟脱氧葡萄糖探针，预靶向抗体的使用提供了更好的检测特异性和灵敏度。

[0292] 这些数据进一步表明利用双特异性抗体预靶向和18F-标记肽进行成像的可行性。

[0293] 实施例13.叶酸NOTA缀合物的合成

[0294] 叶酸如所述激活(Wang等人，Bioconjugate Chem.1996，7，56-62)，并缀合至BoC-NH-CH2-CH2-NH2。缀合物通过色谱法进行纯化。然后Boc基团用TFA处理而除去。氨基叶酸衍生物在碳酸盐缓冲溶液中与p-SCN-Bn-NOTA(大环的)混合。产物用HPLC进行纯18 18
化。叶酸-NOTA衍生物如实施例10所述用Al- F标记，接着HPLC纯化。 F-标记叶酸静脉注射入受试者，并且成功用于叶酸受体分布的成像，例如癌或炎症疾病(参见，例如，Ke等人，Advanced Drug Delivery Reviews，56：1143-60，2004)。

[0295] 实施例14.在人体内的预靶向PET成像

[0296] 给有疑似再发性肿瘤的患者(1.7m2体表面积)注射17mg双特异性单克隆抗体(bsMab)。bsMab允许定位在靶点并从血液中清除。当99％的bsMab从血液中清除后，注射-9F-18标记肽(5～10mCi在5.7×10 mol)。PET成像显示微转移肿瘤的存在。

[0297] 实施例15.用F-18标记的血管形成受体的成像

[0298] 标记的Arg-Gly-Asp(RGD)肽已被用于血管形成的成像，例如在涉及αγβ3整合蛋白的缺血性组织中。(Jeong等人，J.Nucl.Med.2008，Apr.15电子公开)。根据Jeong等18
人(2008)RGD缀合至SCN-Bz-NOTA。如上实施例10所述的Al- F连接至NOTA-衍生的RGD肽，将铝贮存溶液与F-18和衍生的RGD肽混合，110℃加热15分钟，利用过量肽使得标记反应如实施例10所述进行完全。F-18标记RGD肽如Jeong等人(2008)所述的用于体内生物
18
分布和PET成像。RGD-NOTA的Al- F缀合物进入缺血性组织，提供血管形成的PET成像。

[0299] 实施例16.利用F-18标记的蛙皮素的肿瘤成像

[0300] 缀合NOTA的蛙皮素衍生物(NOTA-8-Aoc-BBN(7-14)NH2)根据Prasanphanich等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2007，104：12462-467)制备。NOTA-蛙皮素衍生物根据上述18
实施例10用Al- F进行标记。如实施例10所述，F-18标记的蛙皮素衍生物在 柱
(Waters，Milford，MA)上从未标记蛙皮素中分离出来。根据Prasanphanich等人(2007)，
18
Al- F标记的NOTA-蛙皮素缀合物成功地用于促胃液素释放肽受体表达肿瘤的PET成像。

[0301] 实施例17.利用F-18标记的可靶向缀合物的肿瘤成像

[0302] 肽、多肽、蛋白质、糖类、细胞因子、激素或细胞受体结合剂的NOTA衍生物是根据美国专利号7,011,816(通过引用全文并入本文)进行制备的。NOTA衍生的可靶向缀合物18
如实施例10所述用Al- F进行标记。缀合物体内给药，成功用于肿瘤的F-18PET成像。

[0303] 实施例18.利用双特异性抗体的肿瘤成像

[0304] 具有至少一个特异性结合靶向组织的臂，至少另一个特异性结合可靶向缀合物的臂的双特异性抗体的制备是根据引用并入本文的美国专利号7,052,872进行的。可靶向缀18
合物包含一种或多种NOTA螯合部分。可靶向缀合物如实施例10所述方法用Al- F进行标记。患病的受试者注射双特异性抗体。在足够时间后使游离的双特异性抗体从循环中清除，受试者注射F-18标记的可靶向缀合物。F-18标记分布的成像通过PET扫描进行。

[0305] 在另一个实施方式中，人源化或嵌合内化的抗-CD74抗体如美国专利号18 18
7,312,318所述进行制备。p-SCN-bn-NOTA前体如权利要求7所述用Al- F进行标记。Al- F NOTA采用标准技术缀合至抗体。在对有CD74表达的肿瘤的受试者进行静脉注射后，抗CD74抗体定位于肿瘤处，允许通过PET扫描使肿瘤成像。在替代性实施方式中，F-18标记抗体的制备是利用甲胎蛋白结合抗体Immu31，hPAM4，cPAM4，RS7，抗-CD20，抗-CD19，抗-CEA和抗-CD22，如美国专利号7,300,655；7,282,567；7,238,786；7,238,785；7,151,164；
7,109,304；6,676,924；6,306,393和6,183,744所描述。抗体根据标准技术缀合至NOTA，
18
如抗CD74抗体所述的用Al- F进行标记。F-18标记抗体。F-18标记抗体注射入受试者，提供通过PET扫描的成功的肿瘤成像。

[0306] 实施例19.18F标记的NOTA用于肾血流成像

[0307] 铝贮存溶液(20μL 0.05M在pH 4NaOAc缓冲液中)与200μL QMA纯化的F-18(如实施例10)混合。AlF-18溶液接着与500μL pH 4，0.2MNOTA混合，加热15分钟。样品稀释在5mL PBS中用于注射。F-18标记NOTA直接地用于成功的肾血流成像。

[0308] 实施例20.用Al-18F的进一步的肽标记研究

[0309] IMP 460NODA-GA-D-Ala-D-LyS(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2与如上所述的IMP361类似的方法来制备。NODA-Ga配体从Chematech购买，连接至肽合成器如其他氨基酸。
+
纯化粗品肽获得期望的肽MH1366。

[0310] IMP460的放射标记

[0311] IMP460(0.0020g)溶于732μL，pH 4，0.1M NaOAc中。F-18如实施例10所述方法进行纯化，用冰醋酸中和，与Al溶液混合。然后加入20μL肽溶液，溶液在99℃加热25分钟。粗产品随后如上所述在Waters HLB柱上进行纯化。Al-F-18标记肽在1∶1EtOH/H2O柱洗脱液中。0.1％TFA缓冲液中的反相HPLC跟踪显示在标记肽的预期位置产生清晰的单HPLC峰。

[0312] 实施例21.糖类标记

[0313] NOTA氨基硫脲衍生物是通过p-SCN-bn-NOTA与肼反应制得的，然后用HPLC纯化配体。Al-F-18如实施例10所述制备，Al-F-18加入NOTA氨基硫脲，加热15分钟。可选地Al-F-18氨基硫脲络合物用HPLC纯化。Al-F-18氨基硫脲以已知的方法缀合至氧化糖类。F-18标记糖成功地用于利用PET扫描的成像研究中。

[0314] 实施例22.脂类标记

[0315] 含有醛的脂类缀合至实施例21的Al-F-18NOTA氨基硫脲，F-18标记脂类成功地用于利用PET扫描的成像研究中。

[0316] 另一个可供选择的实施方式，含有氨基的脂类与p-SCN-bn-NOTA反应。NOTA-标记的脂类与上述实施例中的Al-F-18反应。F-18标记脂类成功地用于利用PET扫描的成像研究中。

[0317] 实施例23.适体标记

[0318] 包含醛的适体与实施例21中Al-F-18NOTA氨基硫脲缀合。F-18标记的适体施予受试者，成功地用于利用PET扫描的成像研究中。