诊断由分枝杆菌引起的感染的方法和针对其的试剂转让专利
申请号 : CN200980129242.8
文献号 : CN102124029A
文献日 : 2011-07-13
发明人 : 伊恩·加思韦特 , 罗宾·林德纳 , 苏珊妮·佩德森
申请人 : 泰里安诊断有限公司
摘要 :
本发明提供了分离的结核分枝杆菌蛋白，其为推定的乙酮醇酸还原异构酶(KARI；SEQ ID NO：1)及其免疫原性肽片段，以及针对所述全长蛋白和免疫原性肽片段产生的抗体用于在人中诊断由一种或多种结核分枝杆菌复合菌组的分枝杆菌造成的感染和/或结核病，例如使用基于抗原的夹心ELISA形式。本发明还提供了多分析物测定法，其中本发明基于KARI的诊断测定法与检测一种或多种来自一种或多种所述分枝杆菌的其他蛋白的免疫原性表位多路并联(multiplex)，所述其他蛋白例如SEQ ID NO：2、14、21、28-29、36或44中任一，包括其任意组合。
权利要求 :
1.一种结核分枝杆菌复合菌组的分枝杆菌的分离的或重组的免疫原性蛋白，其为推定的乙酮醇酸还原异构酶(下文中称作“KARI”)，或其免疫原性肽或免疫原性片段或表位。
2.权利要求1的分离的或重组的免疫原性KARI蛋白，其中所述蛋白包含SEQ ID NO：
1所述的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1至少约95％相同的氨基酸序列。
3.权利要求1的免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，其中所述肽、片段或表位包含SEQ ID NO：1所述序列中的至少约5个连续氨基酸残基。
4.权利要求1-3任一项所述的免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，其中所述肽、片段或表位包含一个或多个标记或可检测部分。
5.一种融合蛋白，其包含一个或多个权利要求1-3任一项所述的免疫原性KARI肽、片段或表位，和接头。
6.一种融合蛋白，其包含多个权利要求1-3任一项所述的免疫原性KARI肽、片段或表位。
7.一种融合蛋白，其包含融合于载体蛋白、可检测标记或报道分子的权利要求1-3任一项所述的分离的或重组的免疫原性KARI蛋白、免疫原性KARI肽、免疫原性KARI片段或表位。
8.权利要求1-4任一项所述的分离的或重组的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位在检测受试者中由结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌造成的过去的感染、活动的感染或潜在的感染中的用途，其中所述感染是通过在从所述受试者获得的样品中的抗体与所述分离的或重组的免疫原性KARI蛋白或免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位的结合来确定的。
9.一种分离的或重组的抗体，其特异性结合于权利要求1-4任一项所述的分离的或重组的免疫原性KARI蛋白、免疫原性KARI肽、免疫原性KARI片段或表位，或特异性结合于包含所述免疫原性KARI蛋白、肽、片段或表位的融合蛋白或蛋白聚集体。
10.权利要求9的分离的或重组的抗体，其中所述抗体是多克隆抗体。
11.权利要求9的分离的或重组的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
12.权利要求9的分离的或重组的抗体，其中所述抗体是重组抗体。
13.权利要求11-14任一项所述的分离的或重组的抗体，其中所述抗体用报道分子标记。
14.权利要求13的分离的或重组的抗体，其中所述报道分子是生物素。
15.一种分离的抗体产生细胞或抗体产生细胞群体，其产生权利要求9-12任一项所述的抗体。
16.权利要求9-14任一项所述的分离的或重组的抗体，或其免疫反应性片段在受试者中诊断结核病和/或检测由结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌造成的过去的或现在的感染或潜在的感染中的用途，其中所述感染是通过所述抗体或片段与从所述受试者获得的生物样品中存在的KARI蛋白或其免疫原性片段或表位的结合来确定的。
17.权利要求9-14任一项所述的分离的或重组的抗体或其免疫反应性片段在鉴定结核分枝杆菌复合菌组的细菌或由结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌感染的细胞或者在对所述细菌或所述细胞进行分选或计数中的用途。
18.权利要求9-14任一项所述的分离的或重组的抗体或其免疫反应性片段在医药中的用途。
19.一种组合物，其包含权利要求9-14任一项所述的分离的或重组的抗体，和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
20.一种在受试者中诊断结核病或由结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌造成的感染的方法，包括在来自所述受试者的生物样品中检测针对权利要求1-4任一项所述的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位的抗体，其中所述抗体在样品中的存在指示感染。
21.权利要求20的方法，包括将来源于所述受试者的生物样品与所述分离的或重组的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位在足以使得抗原-抗体复合物形成的条件下接触一段时间，然后检测抗原-抗体复合物的形成。
22.权利要求21的方法，其中检测抗原-抗体复合物的形成包括检测抗原-抗体复合物中的人免疫球蛋白。
23.权利要求22的方法，其中检测人免疫球蛋白包括将所述抗原-抗体复合物与包含抗人免疫球蛋白的第二抗体在足以使得所述第二抗体与复合物中的人免疫球蛋白结合的条件下接触一段时间，然后检测结合的抗人免疫球蛋白。
24.权利要求23的方法，其中所述第二抗体用可检测标志物或报道分子标记。
25.权利要求21-24任一项所述的方法，其中将来源于受试者的生物样品与所述分离的或重组的免疫原性KARI蛋白相接触，所述蛋白包含SEQ IDNO：1所述的氨基酸序列。
26.权利要求21-24任一项所述的方法，其中将来源于受试者的生物样品与SEQ ID NO：1的免疫原性KARI肽片段相接触。
27.权利要求21-25任一项所述的方法，还包括将来源于受试者的生物样品与除了分离的或重组的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位之外来自结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌的免疫原性蛋白或肽相接触。
28.权利要求27的方法，其中所述除了分离的或重组的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位之外的免疫原性蛋白或肽选自下组：BSX蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号A5TZK2；SEQ IDNO：2)和/或核糖体蛋白S9(UniProtKB/Swiss-Prot登录号A5U8B8；SEQ IDNO：14)和/或蛋白Rv1265(UniProtKB/Swiss-Prot登录号P64789；SEQ ID NO：21)和/或延伸因子-Tu(EF-Tu)蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot登录号A5U071；SEQ ID NO：28-29)和/或P5CR蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q11141；
SEQ ID NO：36)和/或TetR样蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号A1QW92；SEQ ID NO：44)和/或谷氨酰胺合酶(GS)蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号O33342)，来源于所述BSX蛋白的免疫原性肽，来源于所述S9的免疫原性肽，来源于所述Rv1265的免疫原性肽，来源于所述EF-Tu蛋白的免疫原性肽，来源于所述P5CR蛋白的免疫原性肽，来源于所述TetR样蛋白的免疫原性肽和来源于GS蛋白的免疫原性肽，及其组合。
29.权利要求29的方法，其中所述除了分离的或重组的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位之外的免疫原性蛋白或肽选自下组：BSX蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号A5TZK2；SEQ IDNO：2)，核糖体蛋白S9(UniProtKB/Swiss-Prot登录号A5U8B8；SEQ ID NO：14)，蛋白Rv1265(UniProtKB/Swiss-Prot登录号P64789；SEQ ID NO：21)，来源于所述BSX蛋白的免疫原性肽，来源于所述S9的免疫原性肽和来源于所述Rv1265的免疫原性肽，及其组合。
30.权利要求29的方法，其中所述除了分离的或重组的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位之外的免疫原性蛋白或肽选自下组：BSX蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号A5TZK2；SEQ IDNO：2)，蛋白Rv1265(UniProtKB/Swiss-Prot登录号P64789；SEQ ID NO：21)，来源于所述BSX蛋白的免疫原性肽和来源于所述Rv1265的免疫原性肽，及其组合。
31.一种在受试者中诊断结核病或由结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌造成的感染的方法，包括在来自所述受试者的生物样品中使用权利要求9-14任一项所述的分离的或重组的抗体检测免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，其中在样品中所述蛋白或免疫原性片段或表位的存在指示疾病、疾病进展或感染。
32.权利要求31的方法，包括将来源于所述受试者的生物样品与分离的或重组的抗体在足以使得抗原-抗体复合物形成的条件下相接触一段时间，然后检测抗原-抗体复合物的形成。
33.权利要求32的方法，包括进行酶联免疫吸附测定(ELISA)。
34.权利要求33的方法，其中所述ELISA是使用捕捉抗体和检测抗体的夹心ELISA。
35.权利要求31-34任一项所述的方法，其中所述样品包括来自脑、乳房、卵巢、肺、结肠、胰、睾丸、肝、肌肉、骨的提取物或其混合物。
36.权利要求31-34任一项所述的方法，其中所述样品包括体液。
37.权利要求36的方法，其中所述体液为痰、血清、血浆、全血、唾液、尿、胸膜液或其混合物或其衍生物。
38.权利要求31-37任一项所述的方法，包括将样品与结合于KARI或免疫原性KARI肽或片段或表位的抗体相接触以及与结合于来自结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌的一种或多种蛋白的抗体相接触，其中所述一种或多种蛋白选自下组：BSX蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号A5TZK2；SEQ ID NO：2)和/或核糖体蛋白S9(UniProtKB/Swiss-Prot登录号A5U8B8；SEQ ID NO：14)和/或蛋白Rv1265(UniProtKB/Swiss-Prot登录号P64789；SEQ ID NO：21)和/或延伸因子-Tu(EF-Tu)蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot登录号A5U071；SEQ ID NO：28-29)和/或P5CR蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q11141；
SEQ ID NO：36)和/或TetR样蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号A1QW92；SEQ ID NO：44)和/或谷氨酰胺合酶(GS)蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号O33342)，来源于所述BSX蛋白的免疫原性肽，来源于所述S9的免疫原性肽，来源于所述Rv1265的免疫原性肽，来源于所述EF-Tu蛋白的免疫原性肽，来源于所述P5CR蛋白的免疫原性肽，来源于所述TetR样蛋白的免疫原性肽和来源于GS蛋白的免疫原性肽，及其组合。
39.权利要求31-38任一项所述的方法，包括将样品与结合于KARI或免疫原性KARI肽或片段或表位的抗体相接触以及与结合于来自于结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌的一种或多种蛋白的抗体相接触，其中所述一种或多种蛋白选自下组：BSX蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号A5TZK2；SEQ ID NO：2)，核糖体蛋白S9(UniProtKB/Swiss-Prot登录号A5U8B8；SEQ ID NO：14)，蛋白Rv1265(UniProtKB/Swiss-Prot登录号P64789；SEQ ID NO：21)，来源于所述BSX蛋白的免疫原性肽，来源于所述S9的免疫原性肽和来源于所述Rv1265的免疫原性肽，及其组合。
40.权利要求31-38任一项所述的方法，包括将样品与结合于KARI或免疫原性KARI肽或片段或表位的抗体相接触以及与结合于来自结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌的一种或多种蛋白的抗体相接触，其中所述一种或多种蛋白选自下组：BSX蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号A5TZK2；SEQ ID NO：2)，蛋白Rv1265(UniProtKB/Swiss-Prot登录号P64789；SEQ ID NO：21)，来源于所述BSX蛋白的免疫原性肽和来源于所述Rv1265的免疫原性肽，及其组合。
41.权利要求31-40任一项所述的方法，其中所述受试者是免疫妥协的或免疫缺陷的受试者。
42.权利要求41的方法，其中所述免疫妥协的或免疫缺陷的受试者受人免疫缺陷病毒(HIV)感染。
43.一种确定具有结核病或由结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌造成的感染的受试者对用治疗性化合物治疗所述结核病或感染的响应的方法，所述方法包括使用权利要求9-14任一项所述的分离的或重组的抗体在来自所述受试者的生物样品中检测KARI蛋白或其免疫原性片段或表位，其中与在正常或健康受试者中可检测出的蛋白或片段或表位的水平相比，增强、或未减弱、或未正在减弱的蛋白或片段或表位的水平指示所述受试者未响应所述治疗，或尚未摆脱疾病或感染。
44.权利要求43的方法，包括将来源于所述受试者的生物样品与一种或多种分离的或重组的抗体相接触并检测抗原-抗体复合物的形成。
45.权利要求44的方法，包括进行酶联免疫吸附测定(ELISA)。
46.权利要求45的方法，其中所述ELISA是使用捕捉抗体和检测抗体的夹心ELISA。
47.权利要求43-46任一项所述的方法，其中所述样品包括来自脑、乳房、卵巢、肺、结肠、胰、睾丸、肝、肌肉、骨的提取物或其混合物。
48.权利要求43-46任一项所述的方法，其中所述样品包括体液。
49.权利要求48的方法，其中所述体液为痰、血清、血浆、全血、唾液、尿、胸膜液或其混合物或其衍生物。
50.权利要求43-49任一项所述的方法，包括将样品与结合于KARI或免疫原性KARI肽或片段或表位的抗体相接触以及与结合于来自结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌的一种或多种蛋白的抗体相接触，其中所述一种或多种蛋白选自下组：BSX蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号A5TZK2；SEQ ID NO：2)和/或核糖体蛋白S9(UniProtKB/Swiss-Prot登录号A5U8B8；SEQ ID NO：14)和/或蛋白Rv1265(UniProtKB/Swiss-Prot登录号P64789；SEQ ID NO：21)和/或延伸因子-Tu(EF-Tu)蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot登录号A5U071；SEQ ID NO：28-29)和/或P5CR蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q11141；
SEQ ID NO：36)和/或TetR样蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号A1QW92；SEQ ID NO：44)和/或谷氨酰胺合酶(GS)蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号O33342)，来源于所述BSX蛋白的免疫原性肽，来源于所述S9的免疫原性肽，来源于所述Rv1265的免疫原性肽，来源于所述EF-Tu蛋白的免疫原性肽，来源于所述P5CR蛋白的免疫原性肽，来源于所述TetR样蛋白的免疫原性肽和来源于GS蛋白的免疫原性肽，及其组合。
51.权利要求43-50任一项所述的方法，包括将样品与结合于KARI或免疫原性KARI肽或片段或表位的抗体相接触以及与结合于来自结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌的一种或多种蛋白的抗体相接触，其中所述一种或多种蛋白选自下组：BSX蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号A5TZK2；SEQ ID NO：2)，核糖体蛋白S9(UniProtKB/Swiss-Prot登录号A5U8B8；SEQ ID NO：14)，蛋白Rv1265(UniProtKB/Swiss-Prot登录号P64789；SEQ ID NO：21)，来源于所述BSX蛋白的免疫原性肽，来源于所述S9的免疫原性肽和来源于所述Rv1265的免疫原性肽，及其组合。
52.权利要求43-50任一项所述的方法，包括将样品与结合于KARI或免疫原性KARI肽或片段或表位的抗体相接触以及与结合于来自结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌的一种或多种蛋白的抗体相接触，其中所述一种或多种蛋白选自下组：BSX蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号A5TZK2；SEQ ID NO：2)，蛋白Rv1265(UniProtKB/Swiss-Prot登录号P64789；SEQ ID NO：21)，来源于所述BSX蛋白的免疫原性肽和来源于所述Rv1265的免疫原性肽，及其组合。
53.权利要求43-52任一项所述的方法，其中所述受试者是免疫妥协的或免疫缺陷的受试者。
54.权利要求53的方法，其中所述免疫妥协的或免疫缺陷的受试者受人免疫缺陷病毒(HIV)感染。
55.一种确定具有结核病或由结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌造成的感染的受试者对用治疗性化合物治疗所述结核病或感染的响应的方法，所述方法包括在来自所述受试者的生物样品中检测KARI蛋白或其免疫原性片段或表位，其中与罹患结核病或由所述一种或多种分枝杆菌造成的感染的受试者中可检测出的蛋白或片段或表位的水平相比，较低的蛋白或片段或表位的水平指示所述受试者响应所述治疗，或已摆脱疾病或感染。
56.权利要求55的方法，包括将来源于所述受试者的生物样品与一种或多种分离的或重组的抗体相接触并检测抗原-抗体复合物的形成。
57.权利要求56的方法，包括进行酶联免疫吸附测定(ELISA)。
58.权利要求57的方法，其中所述ELISA是使用捕捉抗体和检测抗体的夹心ELISA。
59.权利要求55-58任一项所述的方法，其中所述样品包括来自脑、乳房、卵巢、肺、结肠、胰、睾丸、肝、肌肉、骨的提取物或其混合物。
60.权利要求55-58任一项所述的方法，其中所述样品包括体液。
61.权利要求60的方法，其中所述体液为痰、血清、血浆、全血、唾液、尿、胸膜液或其混合物或其衍生物。
62.权利要求55-61任一项所述的方法，包括将样品与结合于KARI或免疫原性KARI肽或片段或表位的抗体相接触以及与结合于来自结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌的一种或多种蛋白的抗体相接触，其中所述一种或多种蛋白选自下组：BSX蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号A5TZK2；SEQ ID NO：2)和/或核糖体蛋白S9(UniProtKB/Swiss-Prot登录号A5U8B8；SEQ ID NO：14)和/或蛋白Rv1265(UniProtKB/Swiss-Prot登录号P64789；SEQ ID NO：21)和/或延伸因子-Tu(EF-Tu)蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot登录号A5U071；SEQ ID NO：28-29)和/或P5CR蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q11141；
SEQ ID NO：36)和/或TetR样蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号A1QW92；SEQ ID NO：44)和/或谷氨酰胺合酶(GS)蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号O33342)，来源于所述BSX蛋白的免疫原性肽，来源于所述S9的免疫原性肽，来源于所述Rv1265的免疫原性肽，来源于所述EF-Tu蛋白的免疫原性肽，来源于所述P5CR蛋白的免疫原性肽，来源于所述TetR样蛋白的免疫原性肽和来源于GS蛋白的免疫原性肽，及其组合。
63.权利要求55-61任一项所述的方法，包括将样品与结合于KARI或免疫原性KARI肽或片段或表位的抗体相接触以及与结合于来自结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌的一种或多种蛋白的抗体相接触，其中所述一种或多种蛋白选自下组：BSX蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号A5TZK2；SEQ ID NO：2)，核糖体蛋白S9(UniProtKB/Swiss-Prot登录号A5U8B8；SEQ ID NO：14)，蛋白Rv1265(UniProtKB/Swiss-Prot登录号P64789；SEQ ID NO：21)，来源于所述BSX蛋白的免疫原性肽，来源于所述S9的免疫原性肽和来源于所述Rv1265的免疫原性肽，及其组合。
64.权利要求55-61任一项所述的方法，包括将样品与结合于KARI或免疫原性KARI肽或片段或表位的抗体相接触以及与结合于来自结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌的一种或多种蛋白的抗体相接触，其中所述一种或多种蛋白选自下组：BSX蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号A5TZK2；SEQ ID NO：2)，蛋白Rv1265(UniProtKB/Swiss-Prot登录号P64789；SEQ ID NO：21)，来源于所述BSX蛋白的免疫原性肽和来源于所述Rv1265的免疫原性肽，及其组合。
65.权利要求55-64任一项所述的方法，其中所述受试者是免疫妥协的或免疫缺陷的受试者。
66.权利要求65的方法，其中所述免疫妥协的或免疫缺陷的受试者受人免疫缺陷病毒(HIV)感染。
67.一种在受试者中监测疾病进展、对治疗的响应或由结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌造成的感染状态的方法，所述方法包括使用权利要求9-14任一项所述的分离的或重组的抗体在不同时间在来自所述受试者的生物样品中确定结核分枝杆菌KARI蛋白或其免疫原性片段或表位水平，其中所述KARI蛋白、片段或表位水平的变化指示所述受试者的疾病进展、对治疗的响应或感染状态的变化。
68.权利要求67的方法，还包括当KARI蛋白、片段或表位的水平随时间增加而增加时，施用用于治疗由一种或多种所述分枝杆菌造成的感染或结核病的化合物。
69.权利要求67的方法，包括将来源于所述受试者的生物样品与一种或多种分离的或重组的抗体相接触并检测抗原-抗体复合物的形成。
70.权利要求69的方法，包括进行酶联免疫吸附测定(ELISA)。
71.权利要求70的方法，其中所述ELISA是使用捕捉抗体和检测抗体的夹心ELISA。
72.权利要求67-71任一项所述的方法，其中所述样品包括来自脑、乳房、卵巢、肺、结肠、胰、睾丸、肝、肌肉、骨的提取物或其混合物。
73.权利要求67-71任一项所述的方法，其中所述样品包括体液。
74.权利要求73的方法，其中所述体液为痰、血清、血浆、全血、唾液、尿、胸膜液或其混合物或其衍生物。
75.权利要求67-74任一项所述的方法，包括将样品与结合于KARI或免疫原性KARI肽或片段或表位的抗体相接触以及与结合于来自结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌的一种或多种蛋白的抗体相接触，其中所述一种或多种蛋白选自下组：BSX蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号A5TZK2；SEQ ID NO：2)和/或核糖体蛋白S9(UniProtKB/Swiss-Prot登录号A5U8B8；SEQ ID NO：14)和/或蛋白Rv1265(UniProtKB/Swiss-Prot登录号P64789；SEQ ID NO：21)和/或延伸因子-Tu(EF-Tu)蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot登录号A5U071；SEQ ID NO：28-29)和/或P5CR蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q11141；
SEQ ID NO：36)和/或TetR样蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号A1QW92；SEQ ID NO：44)和/或谷氨酰胺合酶(GS)蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号O33342)，来源于所述BSX蛋白的免疫原性肽，来源于所述S9的免疫原性肽，来源于所述Rv1265的免疫原性肽，来源于所述EF-Tu蛋白的免疫原性肽，来源于所述P5CR蛋白的免疫原性肽，来源于所述TetR样蛋白的免疫原性肽和来源于GS蛋白的免疫原性肽，及其组合。
76.权利要求67-74任一项所述的方法，包括将样品与结合于KARI或免疫原性KARI肽或片段或表位的抗体相接触以及与结合于来自结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌的一种或多种蛋白的抗体相接触，其中所述一种或多种蛋白选自下组：BSX蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号A5TZK2；SEQ ID NO：2)，核糖体蛋白S9(UniProtKB/Swiss-Prot登录号A5U8B8；SEQ ID NO：14)，蛋白Rv1265(UniProtKB/Swiss-Prot登录号P64789；SEQ ID NO：21)，来源于所述BSX蛋白的免疫原性肽，来源于所述S9的免疫原性肽和来源于所述Rv1265的免疫原性肽，及其组合。
77.权利要求67-74任一项所述的方法，包括将样品与结合于KARI或免疫原性KARI肽或片段或表位的抗体相接触以及与结合于来自结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌的一种或多种蛋白的抗体相接触，其中所述一种或多种蛋白选自下组：BSX蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号A5TZK2；SEQ ID NO：2)，蛋白Rv1265(UniProtKB/Swiss-Prot登录号P64789；SEQ ID NO：21)，来源于所述BSX蛋白的免疫原性肽和来源于所述Rv1265的免疫原性肽，及其组合。
78.权利要求67-77任一项所述的方法，其中所述受试者是免疫妥协的或免疫缺陷的受试者。
79.权利要求78的方法，其中所述免疫妥协的或免疫缺陷的受试者受人免疫缺陷病毒(HIV)感染。
80.一种治疗由结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌造成的感染或结核病的方法，包括：
(i)进行权利要求20-79任一项所述的方法，由此在来自受试者的生物样品中检测一种或多种所述分枝杆菌的存在；和(ii)施用治疗有效量的药物组合物以减少所述受试者的肺、血液或淋巴系统中的病原性杆菌数。
81.一种治疗由结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌造成的感染或结核病的方法，包括：
(i)进行权利要求43-66任一项所述的方法，由此在来自正用第一药物组合物治疗的受试者的生物样品中检测一种或多种所述分枝杆菌的存在；和(ii)施用治疗有效量的第二药物组合物以减少所述受试者的肺、血液或淋巴系统中的病原性杆菌数。
82.一种用于在生物样品中诊断结核病和/或检测结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌的试剂盒，所述试剂盒包含：(i)权利要求9-14任一项所述的一种或多种分离的或重组的抗体或其免疫反应性片段，其特异性结合于所述分离的或重组的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，或特异性结合于包含所述免疫原性KARI蛋白、肽、片段或表位的融合蛋白或蛋白聚集体；和(ii)用于检测抗原-抗体复合物的形成的装置，任选地与使用说明一同包装。
83.权利要求82的试剂盒，其包含多种分离的或重组的抗体，其特异性结合于所述分离的或重组的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，或特异性结合于包含所述免疫原性KARI蛋白、肽、片段或表位的融合蛋白或蛋白聚集体。
84.权利要求83的试剂盒，其中所述多种分离的或重组的抗体的至少一种固定于固体支持物上。
85.一种用于在生物样品中检测结核分枝杆菌感染的试剂盒，所述试剂盒包含：
(i)权利要求1-4任一项所述的分离的或重组的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位；和(ii)用于检测抗原-抗体复合物的形成的装置，任选地与使用说明一同包装。
86.一种固体基质，包含吸附于其上的权利要求1-4任一项所述的分离的或重组的KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，或包含所述免疫原性KARI蛋白、肽、片段或表位的融合蛋白或蛋白聚集体。
87.一种固体基质，包含吸附于其上的权利要求9-14任一项所述的分离的或重组的抗体。
88.权利要求87的固体基质，其包含结合于KARI或免疫原性KARI肽或片段或表位的抗体以及结合于来自结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌的一种或多种蛋白的抗体，其中所述一种或多种蛋白选自下组：BSX蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号A5TZK2；
SEQ ID NO：2)和/或核糖体蛋白S9(UniProtKB/Swiss-Prot登录号A5U8B8；SEQ ID NO：
14)和/或蛋白Rv1265(UniProtKB/Swiss-Prot登录号P64789；SEQ ID NO：21)和/或延伸因子-Tu(EF-Tu)蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot登录号A5U071；SEQ ID NO：28-29)和/或P5CR蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q11141；SEQ ID NO：36)和/或TetR样蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号A1QW92；SEQ ID NO：44)和/或谷氨酰胺合酶(GS)蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号O33342)，来源于所述BSX蛋白的免疫原性肽，来源于所述S9的免疫原性肽，来源于所述Rv1265的免疫原性肽，来源于所述EF-Tu蛋白的免疫原性肽，来源于所述P5CR蛋白的免疫原性肽，来源于所述TetR样蛋白的免疫原性肽和来源于GS蛋白的免疫原性肽，及其组合。
89.权利要求87的固体基质，其包含结合于KARI或免疫原性KARI肽或片段或表位的抗体以及结合于来自结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌的一种或多种蛋白的抗体，其中所述一种或多种蛋白选自下组：BSX蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号A5TZK2；
SEQ ID NO：2)，核糖体蛋白S9(UniProtKB/Swiss-Prot登录号A5U8B8；SEQ ID NO：14)，蛋白Rv1265(UniProtKB/Swiss-Prot登录号P64789；SEQ ID NO：21)，来源于所述BSX蛋白的免疫原性肽，来源于所述S9的免疫原性肽和来源于所述Rv1265的免疫原性肽，及其组合。
90.权利要求87的固体基质，其包含结合于KARI或免疫原性KARI肽或片段或表位的抗体以及结合于来自结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌的一种或多种蛋白的抗体，其中所述一种或多种蛋白选自下组：BSX蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号A5TZK2；
SEQ ID NO：2)，蛋白Rv1265(UniProtKB/Swiss-Prot登录号P64789；SEQ ID NO：21)，来源于所述BSX蛋白的免疫原性肽和来源于所述Rv1265的免疫原性肽，及其组合。
91.权利要求87-90任一项所述的固体基质，包含膜。
92.权利要求91的固体基质，其中所述膜包含尼龙或硝酸纤维素。
93.权利要求87-90任一项所述的固体基质，包含聚苯乙烯或聚碳酸酯微孔板。
94.权利要求87-90任一项所述的固体基质，包含浸渍片。
95.权利要求87-90任一项所述的固体基质，包含玻璃支持物。
96.权利要求87-90任一项所述的固体基质，包含层析树脂。
说明书 :
诊断由分枝杆菌引起的感染的方法和针对其的试剂
[0001] 相关申请数据
[0002] 本申请要求2008年5月26日提交的澳大利亚专利申请2008902611号的优先权，其内容以全文提述的方式并入本文。
技术领域
[0003] 本发明涉及新的针对由结核分枝杆菌(M.tuberculosis)造成的动物受试者(如人)的感染和与该感染相关的病状(如，例如，结核病)的诊断性、预后性和治疗性试剂。更具体而言，本发明提供了第一个能够实现的对如下内容的公开，即在受感染的受试者中表达适用于制备免疫性(immune-logical)试剂，如，例如，抗原性蛋白/肽和/或抗体的结核分枝杆菌的乙酮醇酸还原异构酶(Ketol-acid reductoisomerase，KARI)蛋白(SEQ ID NO：1)及其免疫原性表位以供感染的诊断、预后和治疗，以及疫苗开发。
[0004] 发明背景
[0005] 相关技术的描述
[0006] 结 核 病 是 慢 性 的 传 染 性 疾 病，其 通 常 由 结 核 分 枝 杆 菌(Mycobacteriumtuberculosis)或结核分枝杆菌复合菌组(complex)中的一种或多种生物的感染而导致。本文中使用的术语“结核分枝杆菌复合菌组”指一种或多种选自下组的生物：结核分枝杆菌、牛分枝杆菌(M.bovis)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、M.canetti和田鼠分枝杆菌(M.microti)。本领域技术人员还知道所述结核分枝杆菌复合菌组与所谓的鸟分枝杆菌(M.avium)复合菌组(包括鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌(M.intracellulaire))不同，后者为称作类结核病的不相关疾病(例如，在农用动物中)的病原体。
[0007] 结核病是发展中国家中的主要疾病，并在世界上发达区域也日渐称为问题，每年有8百万新病例以及3百万死亡。虽然感染可在相当时间内无症状，该疾病最常见地表现为肺的急性炎症，导致发烧和排痰性咳嗽。如果放置不予治疗，结核分枝杆菌可进展至肺中的原发感染位点以外的身体中的其他器官，并通常导致严重的并发症和死亡。
[0008] 医疗工业的许多从业人员常常描述全球结核病发病率和微生物抗性正在快速增长的问题，所述问题对于本领域技术人员是公知的。具体而言，越来越认识到迫切需要新的诊断方法、药物和疫苗。
[0009] 对结核分枝杆菌在宿主体内维持并繁殖的免疫学机理所知不多。因此，关于肺结核和宿主之间的免疫性关系的任何新信息显然可以以许多不同的方式用于促进该疾病的诊断、治疗和处理。
[0010] 结核病在晚期AIDS患者中的发病特别常见，大部分患者罹患该病。事实上，HIV感染是在纯化的蛋白衍生物(PPD)-结核菌素-阳性受试者中形成活性结核病(active tuberculosis)的最重要的风险因素(risk factor)，且在经HIV感染的免疫抑制个体中与未经HIV感染的个体相比较可显著地增强遭受结核病感染的风险。还可能HIV-1和结核分枝杆菌的共感染介导了缩短的无HIV症状期，并缩短了受试者的存活时间，这可能是通过触发病毒复制和病毒载量的增加，其导致CD4+T细胞耗尽和免疫缺陷或免疫抑制(Corbett等，2003；Ho，Mem.Inst.Oswaldo Cruz，91，385-387，1996)。
[0011] 结核分枝杆菌基因组的测序促进了大量鉴定可由结核分枝杆菌表达的潜在的结核分枝杆菌蛋白的研究努力。然而，序列数据本身并不足以得出该生物在体内表达任何具体蛋白的结论，更遑论得出在对人或其他动物受试者的感染过程中表达所述蛋白的结论了。同样，阐明结核分枝杆菌基因组的开放阅读框也不表明由该细菌编码或实际表达的任何特定蛋白包含任何免疫显性(immune dominant)B细胞表位或T细胞表位，其为制备诊断性、预后性和治疗性免疫试剂所需。举例而言，要得出结核分枝杆菌的具体蛋白或来源于该蛋白的肽片段在免疫测定法形式下具有作为诊断试剂的效力，或适用于疫苗制备物中的结论，必需显示该蛋白在所述细菌的感染循环中表达，且宿主生物对该蛋白和/或包含B细胞+表位或T细胞表位的肽片段(例如，CD8-限制性CTL表位)进行免疫应答。
[0012] 结核分枝杆菌在培养中生长的能力提供了方便的模型以供在体外鉴定表达的结核病蛋白。然而，培养环境与在体内发现结核分枝杆菌的人巨噬细胞、肺或肺外位点的环境迥然有异。近来证据表明胞内寄生物(如，例如结核分枝杆菌)的蛋白表达概貌根据环境信号显著变动，从而使得所述生物体外的表达概貌可能并不准确地反映其在自然位置(in situ)的表达概貌。
[0013] 结核分枝杆菌感染，或潜在性感染的重激活，诱导宿主反应，其包括将单核细胞和巨噬细胞募集(recruitment)至感染位点。随着更多免疫细胞的积聚，形成肉芽肿(granulomata)的结，其包含免疫细胞和由巨噬细胞的细胞毒性产物摧毁的宿主组织。随着疾病的进展，巨噬细胞的酶造成蛋白、脂质和核酸的水解，导致周围组织的液化和肉芽肿的形成。最终，该损伤(lesion)破裂，而杆菌释放至周围的肺、血液或淋巴系统中。
[0014] 在该感染循环中，杆菌暴露于四种不同的宿主环境，即肺泡巨噬细胞(alveoli macrophage)、干酪样肉芽肿(caseous granuloma)、胞外的肺部和肺外位点，例如肾或腹膜腔、淋巴、骨或脊柱。
[0015] 认为杆菌可在所有这些环境中复制至不同的程度，然而，对于在每个位点的环境条件所知甚少。所有四种宿主环境迥然有别，表明在每种环境下结核分枝杆菌的表达概貌并不相同。
[0016] 相应地，从对数期的培养物中鉴定结核分枝杆菌蛋白并不一定表明在体内的各种环境中何种蛋白被表达或具高免疫原性。类似地，在体外生长的巨噬细胞中鉴定结核分枝杆菌蛋白并不一定表明其类似于结核分枝杆菌在干酪样肉芽肿、高度充气的肺部或具有低氧气含量的肺外位置处的蛋白表达概貌。
[0017] 此外，结核分枝杆菌在宿主内的感染可视为动态过程，其中宿主免疫系统持续地尝试包裹(encapsulate)杆菌并通过破坏受感染的巨噬细胞来摧毁杆菌。因此，结核分枝杆菌经历胞内生长、破坏(此时胞内和分泌的细菌蛋白遭暴露和摧毁)和快速胞外繁殖的循环。宿主和病原体的相互作用是多种因素的结果，其无法在体外复制。
[0018] 相应地，在本发明之前，并不清楚何种结核分枝杆菌蛋白在体内任何具体环境中为最高度表达的和/或最具免疫活性或免疫原性的结核分枝杆菌蛋白。
[0019] 显然，仍有对快速并划算地用于确定由结核分枝杆菌造成的感染和/或与之相关的疾病状况的诊断和预后试剂的需要。
[0020] 分子生物学、微生物学、蛋白组学、病毒学、重组DNA技术、溶液中的肽合成、固相肽合成和免疫学的常规技术描述于，例如下述文献：
[0021] 1.Sambrook，Fritsch & Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，第二版(1989)，第I，II和III卷全文；
[0022] 2.DNA Cloning：A Practical Approach，Vols.I and II(D.N.Glover，ed.，1985)，IRL Press，Oxford，全文；
[0023] 3.Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach(M.J.Gait编，1984)IRL Press，Oxford，全文，且特别是其中Gait，pp1-22；Atkinson等，pp35-81；Sproat等，pp83-115；和Wu等，pp 135-151的论文；
[0024] 4.Nucleic Acid Hybridization：A Practical Approach(B.D.Hames &S.J.Higgins编，1985)IRL Press，Oxford，全文；
[0025] 5.Immobilized Cells and Enzymes：A Practical Approach(1986)IRL Press，Oxford，全文；
[0026] 6.Perbal，B.，A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；
[0027] 7.Methods In Enzymology(S.Colowick and N.Kaplan，编，Academic Press，Inc.)，全系列；
[0028] 8.J.F.Ramalho “The Chemistry of Peptide Synthesis”In：Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website(Interactiva，Germany)；
[0029] 9.Sakakibara，D.，Teichman，J.，Lien，E.Land Fenichel，R.L.(1976).Biochem.Biophys.Res.Commun.73 336-342
[0030] 10.Merrifield，R.B.(1963).J.Am.Chem.Soc.85，2149-2154.
[0031] 11.Barany，G.and Merrifield，R.B.(1979)in The Peptides(Gross，E.andMeienhofer，J.eds.)，vol.2，pp.1-284，Academic Press，New York.
[0032] 12.Wünsch，E.编(1974)Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metodender Organischen Chemie(Müler，E.，ed.)，vol.15，4th edn.，Parts 1 and 2，Thieme，Stuttgart.
[0033] 13.Bodanszky，M.(1984)Principles of Peptide Synthesis，Springer-Verlag，Heidelberg.
[0034] 14.Bodanszky，M.& Bodanszky，A.(1984)The Practice of Peptide Synthesis，Springer-Verlag，Heidelberg.
[0035] 15.Bodanszky，M.(1985)Int.J.Peptide Protein Res.25，449-474.
[0036] 16.Handbook of Diagnostic testal Immune-logy，Vols.I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell，编，1986，Blackwell Scientific Publications).
[0037] 17.Wilkins M.R.，Williams K.L.，Appel R.D.andHochstrasser( 编)1997Proteome Research：New Frontiers in Functional Genomics Springer，Berlin.
发明内容
[0038] 1.背景介绍
[0039] 在导致本发明的研究中，发明人寻求阐明在体内多种环境下由结核分枝杆菌复合菌组生物表达的蛋白的范围，并由此鉴定高度表达的和/或高度免疫原性的结核分枝杆菌及其他结核分枝杆菌复合菌组生物的蛋白。
[0040] 本发明人使用蛋白组学方法来鉴定在体内表达并存在于一群患病的患者体液中的结核分枝杆菌复合菌组蛋白，所述体液包括痰、胸膜液、血浆和血清。结核分枝杆菌复合菌组蛋白在体内通过对含免疫球蛋白(特别是IgG)的样品进行二维电泳来鉴定，所述样品为之前从一群诊断为罹患结核病的患者获得，例如，被结核分枝杆菌或结核分枝杆菌复合菌组的其他生物感染的患者。鉴定出肽片段，且通过对胰蛋白酶消化片段的质谱法确定肽片段的氨基酸序列，显示其与乙酮醇酸-还原异构酶(Ketol-Acid Reducto Isomerase，KARI)蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)对齐。具体而言，匹配的肽与KARI蛋白序列中的区域对齐。
[0041] 在一个实施例中，发明人制备了超过10个不同的与重组全长KARI蛋白和所述全长KARI蛋白中的肽区结合的抗体的制备物，以供开发基于抗原的诊断和预后测定法，其包括命名为“Ch34/35”的多克隆抗体制备物，其在鸡中针对偶合于六组氨酸标记的全长重组KARI蛋白(SEQ ID NO：1)制备；三个命名为“Mo1283F”、“Mo2B1”和“Mo1F6”的单克隆抗体，其针对偶合于六组氨酸标记的全长重组KARI蛋白(SEQ ID NO：1)；两个命名为“Mo4F7”和“Mo4C10”的单克隆抗体，其针对SEQ ID NO：1的残基40-56制备；一个命名为“Mo2D6”的单克隆抗体，其针对SEQ ID NO：1的残基290-300制备；以及两个针对SEQ ID NO：1的残基298-310制备的单克隆抗体。如本领域技术人员所知，抗体也可针对全长KARI蛋白的其他免疫原性肽片段制备，而无需不必要的实验尝试。
[0042] 如本文中例示，抗体是针对临床样品中重组蛋白和结合于重组KARI蛋白的肽以及结合于内源KARI蛋白的肽培育的，所述样品来自之前通过培养和涂片(smear)测试诊断为具有结核病的患者，例如，被结核分枝杆菌或结核分枝杆菌复合菌组的其他生物感染的患者。所述抗体还检测结核分枝杆菌的临床和实验室菌株表达的内源KARI蛋白，并与其他微生物(包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌或铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))具有低交叉反应性。针对KARI制备的抗体也能够在夹心(sandwich)ELISA和定制的(point-of-need)测定法中检测出低水平的KARI蛋白，所述测定法描述于例如美国专利号7205159和欧洲专利号1461615，在本文中以提述的方式并入。
[0043] 亦考虑到选择能够在亚皮克/ml水平在患者体液(如痰、唾液、胸膜液、血清、血浆等)中检测结核分枝杆菌KARI的高亲和性抗体而获得抗体。
[0044] 同样，考虑到选择能够依赖于由结核分枝杆菌表达的KARI蛋白与由选自牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、M.canetti和田鼠分枝杆菌的生物表达的KARI蛋白的高度序列同一性，以及其间B细胞表位的保守性使得一种或多种所述生物之间的交叉反应性成为可能，来检测来自一种或多种结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种其他生物的KARI的高亲和性抗体，从而获得抗体。
[0045] 这些发现提供了手段用于产生新的基于抗原的诊断以供诊断结核病，例如，依赖在受试者中对结核分枝杆菌或其他结核分枝杆菌复合菌组生物的检测，和产生新的基于抗原的预后指示剂用于感染或与其相关的疾病状态的进展。优选地，一种或多种结合于KARI蛋白或其B细胞表位的抗体可用于早期诊断感染或疾病。上述诊断和预后测试可与针对结核病或与其相关的感染的治疗性处理一同使用，例如，用于确定治疗介入的效力，这对于本领域技术人员也是显而易见的。
[0046] 在本文中所述的另一个实施例中，多分析物测定法(multianalyte assay)提供了高敏感性和特异性，所述多分析物测定法例如，使用结合于KARI蛋白的一种或多种抗体，和结合于结核分枝杆菌或结核分枝杆菌复合菌组的其他生物的其他蛋白的一种或多种抗体，所述蛋白例如选自下组的蛋白：BSX蛋白、S9蛋白、Rv1265蛋白、EF-Tu蛋白、P5CR蛋白、TetR样蛋白、谷氨酰胺合成酶蛋白及其组合。
[0047] 在另一个实施例中，上述基于抗原的诊断和预后测定法与供诊断结核病的标准培养测试(例如依赖于在临床样品中检测结核分枝杆菌或结核分枝杆菌复合菌组的其他生物的存在)相组合，以例如确证起初的诊断和/或表明涉及的具体病原体。在一个实例中，培养测试确证了结核分枝杆菌，而非另一种分枝杆菌病原体在临床样品中的存在。在另一个实施例中，培养测试确证了结核分枝杆菌或其他分枝杆菌病原体菌株在从受试者获得的临床样本中的存在。
[0048] 尽管涂片测试不如培养测试准确，应理解该测试，正如任何其他本领域已知的供诊断结核病或在来自怀疑受感染，或具有受感染的风险的受试者的样本中确定或检测结核病致病因子(例如，结核分枝杆菌或结核分枝杆菌复合菌组的其他生物)的存在的手段一样，可方便地与本发明的基于抗原的测定法相组合，而无需不必要的实验尝试。
[0049] 在另一个实施例中，结合于SEQ ID NO：1所述氨基酸序列或其来自结核分枝杆菌复合菌组的生物的变体，并在罹患肺外结核病的受试者中存在的抗体提供了供诊断由结核分枝杆菌复合菌组的分枝杆菌造成的活动的(active)及过去的感染的其他手段。为了测定上述抗体在受试者中的存在，在基于抗体的测定法中使用包含SEQ ID NO：1所示的序列的重组KARI蛋白或其变体，或源自所述全长蛋白序列的免疫原性肽作为检测试剂以供鉴定抗体在从所述受试者获取的含抗体的样品中的存在，所述样品例如血、血清、血清级分等。正如基于抗原的测定法，将在受试者中检测结核分枝杆菌复合菌组的抗-KARI抗体方便地与对针对结核分枝杆菌复合菌组的其他免疫原性蛋白的抗体的检测相结合，例如，通过还检测针对结核分枝杆菌的一种或多种蛋白或结核病的其他致病因子，或其一种或多种B细胞表位的抗体，其中所述蛋白选自下组：BSX蛋白、S9蛋白、Rv1265蛋白、EF-Tu蛋白、P5CR蛋白、TetR样蛋白、谷氨酰胺合成酶蛋白及其组合；其通过使用源自上述免疫原性蛋白全长蛋白序列的免疫原性肽作为检测试剂以供筛选含抗体的样品。上述多分析物的基于抗体的测定法提供了高敏感性和特异性。
[0050] 基于抗体的单分析物和多分析物诊断和预后测定法还可方便地与任何本领域已知的手段相结合，例如，供确定或诊断结核病的培养测试，例如，其通过在来自疑似受感染或具有受感染风险的受试者的样本中检测结核分枝杆菌或结核分枝杆菌复合菌组的其他生物的存在，例如，以确证初始诊断和/或指示涉及的具体病原体。在一个实施例中，培养测试确证在临床样品中结核分枝杆菌而非另一种并非引起结核病的病原体的分枝杆菌的存在。在另一个实施例中，培养测试确证在从受试者获得的临床样本中存在结核分枝杆菌或结核病的其他分枝杆菌因素的菌株。
[0051] 优选的基于抗体的测试，当与供结核病或与其相关的感染的治疗性处理一同使用时，提供了对感染或疾病的早期检测和/或对治疗方案效力的监测。
[0052] 2.具体实例
[0053] 本发明的范围就在实施例之后本申请中提交的权利要求来看是显而易见的。在本申请中提交的权利要求在此以提述的方式并入本说明书。本发明的范围就下述对具体实例的描述来看是显而易见的。
[0054] 在一个实例中，本发明提供了分离的或重组的结核分枝杆菌免疫原性KARI蛋白或免疫原性KARI肽或免疫原性KARI蛋白片段或其表位。
[0055] 优选地，所述分离的或重组的结核分枝杆菌免疫原性KARI蛋白包含SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO：1至少约95％相同的氨基酸序列，包括来自结核分枝杆菌复合菌组的生物的同源序列。
[0056] 优选地，所述免疫原性KARI肽是合成肽。优选地，所述KARI肽、片段或表位包含SEQ ID NO：1所述的序列中至少约5个连续的氨基酸残基，更优选SEQ ID NO：1所述的序列中至少约10个连续的氨基酸残基，甚至更优选SEQ ID NO：1所述的序列中至少约15个连续的氨基酸残基，并仍更优选SEQ ID NO：1所述的序列中至少约5个连续的氨基酸残基在N-端和/或C-端融合约1-5个其他氨基酸残基。这明确地包括分离自或源自结核分枝杆菌复合菌组的任何生物的KARI蛋白的任何合成肽、片段或表位。
[0057] 在另一个实例中，所述免疫原性KARI肽是包含单独地或共同地选自下组的氨基酸残基或由所述氨基酸残基组成的合成肽：
[0058] a)SEQ ID NO：1的残基1-23；
[0059] b)SEQ ID NO：1的残基40-71，并优选SEQ ID NO：1的残基57-71；
[0060] c)SEQ ID NO：1的残基97-111；
[0061] d)SEQ ID NO：1的残基169-199；
[0062] e)SEQ ID NO：1的残基265-279；
[0063] f)SEQ ID NO：1的残基290-300，优选SEQ ID NO：1的残基298-300；和
[0064] g)SEQ ID NO：1的残基313-333。
[0065] 还在另一个实施例中，提供了由SEQ ID NO：1的残基40-71，或SEQ IDNO：1的残基57-71或SEQ ID NO：1的残基290-300或SEQ ID NO：1的残基298-300组成的合成肽，或包含SEQ ID NO：1的残基40-71，或SEQ ID NO：1的残基57-71或SEQ ID NO：1的残基290-300或SEQ ID NO：1的残基298-300的合成肽，例如，以供产生适于免疫测定法的抗体，或作为阳性对照肽用于免疫测定法(如为了表明抗体结合)的抗体。
[0066] 包含一种或多种标签或可检测的部分(例如，为了便于检测或分离或固定化)的结核分枝杆菌或结核分枝杆菌复合菌组的其他生物的分离的或重组的免疫原性KARI蛋白，或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位明确地落在本发明的范围内。优选的标签包括，例如生物素、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、FLAG表位、六组氨酸、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、链霉抗生物素蛋白或金。
[0067] 本发明还提供了根据本文中任何实施例，包含一种或多种免疫原性KARI肽、片段或表位的融合蛋白。举例而言，KARI蛋白的N-端或C-端部分可融合。本领域技术人员会明白，优选在上述物质的组成中包含内部的连接残基，例如，半胱氨酸。或者，优选的融合蛋白包含将免疫原性KARI肽与一种或多种其他肽部分分开的接头，例如，单一氨基酸残基(例如，甘氨酸、半胱氨酸、赖氨酸)，肽接头(例如，非免疫原性肽，如多赖氨酸或多甘氨酸)，包含高至约6或8或10或12个碳残基的多碳接头(poly-carbon linker)，或化学接头。上述接头通过例如使得与脂质或半抗原的结合成为可能，或使得与配体的交联或结合成为可能，可便于抗体产生或疫苗配制。蛋白作为融合物表达还可增强其可溶性。
[0068] 优选的融合蛋白包含融合于载体蛋白、可检测的标签或报道分子(例如，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、FLAG表位、六组氨酸、β-半乳糖苷酶、硫氧还蛋白(TRX)(La Vallie等，Bio/Technology 11，187-193，1993)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、大肠杆菌NusA蛋白(Fayard，E.M.S.，论文，University of Oklahoma，USA，1999；Harrison，inNovations11，4-7，2000)、大 肠 杆 菌 BFR(Harrison，inNovations 11，4-7，2000)或 大 肠 杆 菌GrpE(Harrison，inNovations 11，4-7，2000))的所述KARI蛋白、肽、片段或表位。
[0069] 本发明还提供了根据本文中的任何实施例包含一种或多种免疫原性KARI肽、片段或表位的分离的蛋白聚集体。优选的蛋白聚集体包括与免疫球蛋白，例如IgA、IgM或IgG复合的蛋白、肽、片段或表位，例如，作为循环免疫复合物(CIC)。示例性的蛋白聚集体可源自，例如，受试者的含抗体生物样品。
[0070] 本发明还涵盖根据本文中的任何实施例的结核分枝杆菌或结核分枝杆菌复合菌组的其他生物的分离的或重组的免疫原性KARI蛋白，其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，或所述蛋白、肽或表位或片段的组合或混合物用于在受试者中检测结核分枝杆菌造成的过去的或现在的感染或潜在的感染中的用途，其中所述感染由抗体在从受试者获得的样品中与所述分离的或重组的免疫原性KARI蛋白或免疫原性KARI肽或免疫原性片段或表位的结合来确定。
[0071] 本发明还涵盖根据本文中的任何实施例的结核分枝杆菌或结核分枝杆菌复合菌组的其他生物的分离的或重组的免疫原性KARI蛋白，其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，或所述蛋白、肽或表位或片段的组合或混合物用于引发(elicit)结合于结核分枝杆菌KARI蛋白的抗体的产生的用途。
[0072] 本发明还涵盖根据本文中的任何实施例的结核分枝杆菌或结核分枝杆菌复合菌组的其他生物的分离的或重组的免疫原性KARI蛋白，其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，或所述蛋白、肽或表位或片段的组合或混合物在制备使受试者针对结核分枝杆菌的感染免疫的药物中的用途。
[0073] 本发明还提供药物组合物，所述药物组合物包含与药学上可接受的稀释剂(例如，佐剂)组合的根据本文中的任何实施例的结核分枝杆菌或结核分枝杆菌复合菌组的其他生物的分离的或重组的免疫原性KARI蛋白，其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，或所述蛋白、肽或表位或片段的组合或混合物。
[0074] 编码SEQ ID NO：1的KARI蛋白或本发明范围内的其任何变体的核酸，由结核分枝杆菌的ilvC基因或同源物、类似物或其其他序列变体来编码。本发明还提供分离的核酸，其编码根据本发明任何实施例的结核分枝杆菌的分离的或重组的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，或编码所述肽或表位或片段的组合或混合物(例如作为融合蛋白)，所述分离的核酸例如用于制备基于核酸的疫苗或是为了以其他方式表达所述免疫原性多肽、蛋白、肽、片段或表位。举例而言，所述分离的核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO：1中所述的氨基酸序列或其来自结核分枝杆菌复合菌组的生物的同源物。
[0075] 本发明还提供细胞，所述细胞表达根据本文任何实施例的结核分枝杆菌或结核分枝杆菌复合菌组的其他生物的分离的或重组的免疫原性KARI蛋白，或表达其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，或表达所述蛋白、肽或表位或片段的组合或混合物。所述细胞可优选地由抗原呈递细胞(APC)组成，所述抗原呈递细胞(例如在其表面上)表达所述分离的或重组的免疫原性KARI蛋白或免疫原性KARI肽或其免疫原性片段或表位。
[0076] 本发明还提供分离的配体，例如，小分子、肽、抗体或抗体的免疫反应性片段，所述配体特异性结合于根据本文任何实施例的结核分枝杆菌或结核分枝杆菌复合菌组的其他生物的分离的或重组的免疫原性KARI蛋白，其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，或所述蛋白、肽或表位或片段的组合或混合物，或结合于包含所述免疫原性KARI蛋白、肽、片段或表位的融合蛋白或蛋白聚集体。优选的配体为肽或抗体。优选的抗体包括，例如，单克隆或多克隆抗体制备物。这延及任何分离的抗体产生细胞或抗体产生细胞群，例如，产生抗体的杂交瘤或浆细胞瘤，其中所述抗体结合KARI蛋白或KARI蛋白的免疫原性片段或其他包含源自KARI蛋白序列的序列的免疫原性肽。
[0077] 举例而言，本发明提供了由分离的抗体组成或包含分离的抗体的分离的配体，所述分离的抗体结合于免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位。在一个实例中，所述抗体是多克隆抗体(例如，通过对鸡进行免疫而获得的)，如具有在本文中命名为Ch34或Ch35的多克隆抗体制备物或命名为Ch34/35的两者的汇集的结合特征(例如，特异性)的抗体。在另一个实例中，所述抗体是单克隆抗体，例如，通过用SEQ ID NO：1的全长KARI蛋白进行免疫，或通过用添加了任选的C-端半胱氨酸残基的SEQ ID NO：1的残基40-56进行免疫，或通过用添加了任选的C-端半胱氨酸残基的SEQ ID NO：1的残基290-300进行免疫，或通过用添加了任选的C-端半胱氨酸残基的SEQ ID NO：1的残基298-310进行免疫而制备的单克隆抗体，例如，具有单独地或共同地选自下组的抗体的结合特征(例如特异性)的单克隆抗体：Mo1283F、Mo1E7、Mo2C7、Mo3A2、Mo2B1、Mo4F7、Mo3C3、Mo1C10、Mo4C10、Mo1F6、Mo2D6、Mo3H3和Mo4D11及其混合物，且优选具有单独地或共同地选自下组的抗体的结合特征(例如特异性)的单克隆抗体：Mo1283F、Mo2B1、Mo4F7、Mo4C10、Mo1F6、Mo2D6、Mo3H3和Mo4D11及其混合物。
[0078] 在另一实例中，本发明提供了由分离的单克隆抗体组成的或包含分离的单克隆抗体的分离的配体，所述单克隆抗体结合于免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或其免疫原性KARI片段或表位，其中所述单克隆抗体具有单独地或共同地选自下组的抗体的结合特征(例如特异性)：Mo1283F、Mo2B1、Mo1F6和Mo2D6及其混合物。
[0079] 还在另一个实施例中，本发明提供了一对选自下组的抗体：
[0080] (a)具有本文中命名为Ch34/35的多克隆抗体制备物的结合特征(例如特异性)的多克隆抗体和具有选自Mo1823F和Mo2B1及其混合物的抗体的结合特征(例如特异性)的单克隆抗体；和
[0081] (b)一对单独地或共同地选自具有选自下组的抗体的结合特征(例如特异性)的单克隆抗体的单克隆抗体：Mo1283F、Mo2B1、Mo1F6和Mo2D6。
[0082] 在另一个实例中，本发明提供了如根据本文任何实施例所述由杂交瘤2B1C11产生的抗体，所述杂交瘤在2009年5月21日保藏于ATCC。本发明明确地延及根据本文任何实施例所述的分离的杂交瘤，以及任何组的产生上述抗体的杂交瘤，只要至少一个上述杂交瘤表达结合于KARI蛋白的抗体。
[0083] 在另一个实施例中，本发明提供了一组抗体，其包含至少一个根据本文任何实施例所述结合于KARI蛋白的抗体，特别是结合于结核分枝杆菌KARI蛋白的抗体，例如，与根据本文任何实施例所述结合于一种或多种其他结核分枝杆菌抗原的一种或多种抗体组合，如结合于BSX和/或S9和/或Ef-Tu和/或Rv1265的抗体组合。
[0084] 本发明还提供了根据本文任何实施例的分离的配体，特别是任何肽配体、抗体或其免疫反应性片段在医药中的用途。
[0085] 本发明还提供了根据本文任何实施例的分离的配体或所述配体的组合，特别是任何肽配体、抗体或其免疫反应性片段用于在受试者中检测由结核分枝杆菌复合菌组的生物(例如，结核分枝杆菌)造成的过去或现在(即，活动的)感染或潜在的感染中的用途，其中所述感染通过将所述配体结合于在从所述受试者获取的生物样品中存在的KARI蛋白或其免疫原性片段或表位来确定。
[0086] 本发明还提供了根据本文任何实施例的分离的配体或所述配体的组合，特别是任何肽配体、抗体或其免疫反应性片段用于鉴定结核分枝杆菌复合菌组的细菌或受结核分枝杆菌复合菌组的细菌感染的细胞或用于对所述细菌或所述细胞进行分选或计数的用途。该实施例明确地包括鉴定结核分枝杆菌复合菌组的多种细菌，例如结核分枝杆菌和/或牛分枝杆菌和/或非洲分枝杆菌和/或M.canetti和/或田鼠分枝杆菌。
[0087] 根据本文任何实施例的分离的配体，特别是任何肽配体、抗体或其免疫反应性片段或其组合，也可用于治疗、诊断和研究应用，以供通过在来自受试者的生物样品中根据本文任何实施例将所述配体结合于本发明的KARI蛋白或免疫原性片段或表位来检测由结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌造成的过去或现在的感染，或潜在的感染(即，基于抗原的免疫测定法)。
[0088] 主题配体的其他应用包括纯化和研究诊断性/预后性KARI蛋白，鉴定受结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌(例如，结核分枝杆菌和/或牛分枝杆菌和/或非洲分枝杆菌和/或M.canetti和/或田鼠分枝杆菌)造成的细胞感染，或对上述细胞进行分选或计数。
[0089] 所述配体还可用于治疗，包括结核病的预防、诊断或预后，和上述配体在制备用于治疗结核病的药物中的使用。举例而言，产生结合并中和本发明的KARI蛋白(特别是在体内)的特异性人源化抗体或其他配体。所述人源化抗体或其他配体用于制备供治疗由结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌在人受试者中造成的TB特异性疾病或感染(例如，治疗由结核分枝杆菌和/或牛分枝杆菌和/或非洲分枝杆菌和/或M.canetti和/或田鼠分枝杆菌造成的活性或慢性感染)的药物。
[0090] 本发明还提供组合物，所述组合物包含根据本文任何实施例的分离的配体或包含所述配体，特别是任何肽配体、抗体或其免疫反应性片段与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合。
[0091] 本发明还提供在受试者中诊断由结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌造成的结核病或感染的方法，包括在来自所述受试者的生物样品中检测结合于免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位的抗体，所述抗体在所述样品中的存在指示感染。所述感染可为过去的或活动的感染，或潜在的感染；然而该测定法形式对检测活动的感染和/或最近的感染是特别有用的。
[0092] 举例而言，所述方法可为免疫测定法，例如，包括将源自受试者的生物样品与根据本发明任何实施例的分离的或重组的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位或所述肽或表位或片段的组合或混合物在足以使抗原-抗体复合物形成的条件下接触一段时间，并然后检测抗原-抗体复合物的形成。所述样品为从所述受试者获得的含抗体的样品，例如，包含血或血清或血浆或免疫球蛋白级分的样品。所述样品可包含以与KARI抗原性片段的复合物的形式存在的循环抗体。一般而言，在这类测定形式中使用能够结合于患者的免疫球蛋白的抗体(例如，抗人Ig抗体)检测所述抗原-抗体复合物。
[0093] 在本发明的测定法中，KARI蛋白，及任选地一种或多种其他结核分枝杆菌蛋白的检测指示活性TB。任选地，上述测试结果通过测试一种或多种其他TB特异性分析物(例如，本文中描述的蛋白标志物)来确证。确证对于TB的涂片测试数据或培养测试数据的测定法发明也落在本发明的范围内。
[0094] 所述免疫测定法可为使用多个抗体(例如，捕捉抗体和检测抗体)的双位测定法或夹心测定法。在一个实施例中，将具有源自小鼠的单克隆抗体Mo1283F的特异性的抗体或抗体Mo1283F自身用作捕捉抗体，而将具有源自鸡的多克隆抗体Ch34/35的特异性的抗体，或所述Ch34/35抗体制备物自身用作检测抗体。在另一个实施例中，将具有源自小鼠的单克隆抗体Mo2B1(或简称“2B1”)的特异性的抗体或抗体Mo2B1自身用作捕捉抗体，而将具有源自鸡的抗体Ch34/35的特异性的抗体，或所述Ch34/35抗体制备物自身用作检测抗体。在另一个实施例中，将具有源自小鼠的单克隆抗体Mo1F6(或简称“1F6”)的特异性的抗体或抗体Mo1F6自身用作捕捉抗体，而将具有源自小鼠的单克隆抗体Mo2B1的特异性的抗体或抗体Mo2B1自身用作检测抗体。在另一个实施例中，将具有源自小鼠的单克隆抗体Mo2D6(或简称“2D6”)的特异性的抗体或抗体Mo2D6自身用作捕捉抗体，而将具有源自小鼠的单克隆抗体Mo2B1的特异性的抗体或抗体Mo2B1自身用作检测抗体。在另一个实施例中，将具有源自鸡的抗体Ch34/35的特异性的抗体，或所述Ch34/35抗体制备物自身用作捕捉抗体，而将具有单克隆抗体Mo2B1的特异性的抗体或抗体Mo2B1自身用作检测抗体。在另一个实施例中，将具有单克隆抗体2B1的特异性的抗体或抗体Mo2B1自身用作捕捉抗体，而将具有单克隆抗体1F6的特异性的抗体或抗体Mo1F6自身用作检测抗体。在另一个实施例中，将具有单克隆抗体2B1的特异性的抗体或抗体Mo2B1自身用作捕捉抗体，而将具有单克隆抗体2D6的特异性的抗体或抗体Mo2D6自身用作检测抗体。在另一个实施例中，将具有单克隆抗体2D6的特异性的抗体或抗体Mo2D6自身用作捕捉抗体，而将具有单克隆抗体1F6的特异性的抗体或抗体Mo1F6自身用作检测抗体。在另一个实施例中，将具有单克隆抗体1F6的特异性的抗体或抗体Mo1F6自身用作捕捉抗体，而将具有单克隆抗体2D6的特异性的抗体或抗体Mo2D6自身用作检测抗体。应理解这些实施例延及抗体片段及与本文例示的那些抗体的等价抗体的用途，且数据明确地表明其无需不必要的实验尝试或实施创造性劳动即可产生。并不排除其他的排列和抗体组合。
[0095] 在一个优选的实施例中，所述受试者疑似罹患由结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌造成的感染或结核病和/或所述受试者有受所述一种或多种分枝杆菌(例如结核分枝杆菌和/或牛分枝杆菌和/或非洲分枝杆菌和/或M.canetti和/或田鼠分枝杆菌)感染的风险。
[0096] 怀疑罹患由结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌造成的感染或结核病的受试者显示一种或多种结核病或上述感染的症状，例如发烧、排痰性咳嗽、咯血(痰中有血)、胸疼、盗汗、体重减轻、不适(malaise)、肺的空洞形成和/或结钙化。怀疑罹患结核病或上述感染的受试者可能暴露于结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种细菌(例如结核分枝杆菌和/或牛分枝杆菌和/或非洲分枝杆菌和/或M.canetti和/或田鼠分枝杆菌)，例如由于与罹患结核病的人相接触。
[0097] 有形成结核病风险的受试者为暴露于如下环境或遭受如下环境的受试者，所述环境增加形成结核病或由结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种细菌感染的风险，上述受试者包括与罹患结核病的人接触的受试者，旅行至结核病常见并为流行致病因子的国家或地区(例如，南非)的受试者，在医院或护理机构工作的受试者，受HIV-1或HIV-2感染的受试者，使用皮质类固醇的受试者，免疫妥协或免疫受抑制的受试者，罹患硅肺病(silicosis)的受试者或罹患由结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌造成的潜在感染的受试者，所述分枝杆菌例如结核分枝杆菌和/或牛分枝杆菌和/或非洲分枝杆菌和/或M.canetti和/或田鼠分枝杆菌。
[0098] 在该测定法形式中包含多分析物测试，其中将源自由结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌表达的多抗原表位用于确证使用KARI或由其衍生的肽获得的诊断，这落在本发明的范围内。举例而言，所述源自其他结核分枝杆菌复合菌组的蛋白选自下组：BSX蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号A5TZK2；SEQ ID NO：2)、核糖体蛋白S9(UniProtKB/Swiss-Prot登录号A5U8B8；SEQ ID NO：14)、蛋白Rv1265(UniProtKB/Swiss-Prot登录号P64789；SEQ ID NO：21)、延伸因子-Tu(EF-Tu)蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot登录号A5U071；SEQ ID NO：28-29)、P5CR蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q11141；SEQ ID NO：
36)、TetR样蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号A1QW92；SEQ ID NO：44)谷氨酰胺合酶(GS)蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号O33342)、源自所述BSX蛋白的免疫原性肽、源自所述S9的免疫原性肽、源自所述Rv1265的免疫原性肽、源自所述EF-Tu蛋白的免疫原性肽、源自所述PC5R蛋白的免疫原性肽、源自所述TetR样蛋白的免疫原性肽和源自所述GS蛋白的免疫原性肽及其组合。应理解在此语境下，所述的蛋白包括由序列表的方式例示的示例蛋白的同源物，其中所述同源物由结核分枝杆菌复合菌组中一种或多种细菌(例如结核分枝杆菌和/或牛分枝杆菌和/或非洲分枝杆菌和/或M.canetti和/或田鼠分枝杆菌)表达。
36)、TetR样蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号A1QW92；SEQ ID NO：44)谷氨酰胺合酶(GS)蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号O33342)、源自所述BSX蛋白的免疫原性肽、源自所述S9的免疫原性肽、源自所述Rv1265的免疫原性肽、源自所述EF-Tu蛋白的免疫原性肽、源自所述PC5R蛋白的免疫原性肽、源自所述TetR样蛋白的免疫原性肽和源自所述GS蛋白的免疫原性肽及其组合。应理解在此语境下，所述的蛋白包括由序列表的方式例示的示例蛋白的同源物，其中所述同源物由结核分枝杆菌复合菌组中一种或多种细菌(例如结核分枝杆菌和/或牛分枝杆菌和/或非洲分枝杆菌和/或M.canetti和/或田鼠分枝杆菌)表达。
[0099] 在一个实施例中，使用针对KARI蛋白的抗体的免疫测定法与对TB的涂片测试和/或对TB的培养测试和/或检测另一种TB蛋白(例如，BSX和/或Rv1265和/或Ef-Tu和/或S9蛋白)的免疫测定法同时或顺序进行，如为了减少测试KARI蛋白和测试S9蛋白的阳性组合以减少假阳性检测，或为了另外地增强测定的特异性和/或敏感度，其中对一种或两种或三种或四种除KARI蛋白之外的蛋白的阴性结果表明或确证阴性涂片结果和/或指示在受试者中无具活性的TB。在一个实施例中，测试KARI蛋白和测试BSX蛋白的组合减少假阳性检测，其中对BSX的阴性结果或BSX及KARI蛋白的阴性结果表明或确证阴性涂片结果和/或指示在受试者中无具活性的TB。在另一个实施例中，测试KARI蛋白和测试Rv1265蛋白的组合减少假阳性检测，其中对Rv1265的阴性结果或Rv1265及KARI蛋白的阴性结果表明或确证阴性涂片结果和/或指示在受试者中无具活性的TB。在另一个实施例中，测试KARI蛋白和测试S9蛋白和测试BSX蛋白的组合减少假阳性检测，其中对BSX和S9蛋白的阴性结果或BSX和S9和KARI蛋白的阴性结果表明或确证阴性涂片结果和/或指示在受试者中无具活性的TB。
[0100] 本 领 域 技 术 人 员 明 白 UniProtKB/Swiss-Prot 为 Swiss Institute ofBioinformatics的治疗性(curated)的蛋白序列数据库，提供关于蛋白功能、域结构、翻译后修饰和变体的数据；且UniProtKB/TrEMBL为经计算机注释的Swiss-Prot的增补，其包含尚未整合入Swiss-Prot的EMBL核苷酸序列条目的翻译。对UniProtKB/Swiss-Prot和UniProtKB/TrEMBL数据的访问权(access)可方便地例如通过Swiss Institute of Bioinformatics的ExPASy(Expert ProteinAnalysis System)蛋白组学服务器获得。
[0101] 举例而言，患者的样品可与KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或片段或表位相接触，并与结核分枝杆菌BSX蛋白(例如UnitProtKB/TrEMBL登录号A5TZK2；SEQ ID NO：2)或由其来源的免疫原性肽，例如，来源于BSX蛋白的肽，或包含选自SEQ ID NO：3-13的序列的肽，及其混合物/组合相接触。供检测由结核分枝杆菌造成的感染或结核病的免疫原性结核分枝杆菌BSX和肽衍生物还详细描述于本发明人于2005年8月19日提交的国际专利申请PCT/AU2005/001254(WO2006/01792)，其公开以全文提述的方式并入本文。
[0102] 作为替代或附加手段，所述患者的样品可与KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或片段或表位相接触，并与结核分枝杆菌核糖体蛋白S9(例如UnitProtKB/Swiss-Plot登录号A5U8B8；SEQ ID NO：14)，或由其来源的免疫原性肽，例如，来源于S9蛋白的肽，或包含选自SEQ ID NO：15-20的序列的肽，及其混合物/组合相接触。用于检测由结核分枝杆菌造成的感染或结核病的免疫原性结核分枝杆菌S9和肽衍生物还详细描述于2007年1月31日提交的国际专利申请PCT/AU2007/000093(WO2007/087679)，其全文提述的方式并入本文。
[0103] 作为替代或附加手段，所述患者的样品可与KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或片段或表位相接触，并与结核分枝杆菌蛋白Rv1265(例如UnitProtKB/Swiss-Plot登录号P64789；SEQ ID NO：21)或由其来源的免疫原性肽，例如，来源于Rv1265蛋白的肽，或包含选自SEQ ID NO：22-27的序列的肽，及其混合物/组合相接触。用于检测由结核分枝杆菌造成的感染或结核病的免疫原性结核分枝杆菌Rv1265蛋白和肽衍生物还详细描述于2007年5月16日提交的国际专利申请PCT/AU2007/000662(WO2007/131291)，其全文提述的方式并入本文。
[0104] 作为替代或附加手段，所述患者的样品可与KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或片段或表位相接触，并与结核分枝杆菌延伸因子Tu(EF-Tu)蛋白(例如UnitProtKB/Swiss-Plot登录号A5U071；SEQ ID NO：28-29)或由其来源的免疫原性肽，例如，来源于EF-Tu蛋白的肽，或包含选自SEQ ID NO：30-35的序列的肽，及其混合物/组合相接触。用于检测由结核分枝杆菌造成的感染或结核病的免疫原性结核分枝杆菌EF-Tu蛋白和肽衍生物还详细描述于2007年6月8日提交的国际专利申请PCT/AU2007/000810(WO2007/140545)，其全文提述的方式并入本文。
[0105] 作为替代或附加手段，所述患者的样品可与KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或片段或表位相接触，并与结核分枝杆菌二氢吡咯-5-羧酸还原酶(P5CR)蛋白(例
如UnitProtKB/Swiss-Plot登录号Q11141；SEQ ID NO：36)或由其来源的免疫原性
肽，例如来源于P5CR蛋白的肽，或包含选自SEQ ID NO：37-43的序列的肽，及其混合物/组合相接触。用于检测由结核分枝杆菌造成的感染或结核病的免疫原性结核分枝杆菌P5CR蛋白和肽衍生物还详细描述于2007年5月16日提交的国际专利申请PCT/
AU2007/000664(WO2007/140545)，其全文提述的方式并入本文。
如UnitProtKB/Swiss-Plot登录号Q11141；SEQ ID NO：36)或由其来源的免疫原性
肽，例如来源于P5CR蛋白的肽，或包含选自SEQ ID NO：37-43的序列的肽，及其混合物/组合相接触。用于检测由结核分枝杆菌造成的感染或结核病的免疫原性结核分枝杆菌P5CR蛋白和肽衍生物还详细描述于2007年5月16日提交的国际专利申请PCT/
AU2007/000664(WO2007/140545)，其全文提述的方式并入本文。
[0106] 作为替代或附加手段，所述患者的样品可与KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或片段或表位相接触，并与结核分枝杆菌推定的TetR样蛋白家族的调节蛋白(TetR样蛋白)(例如UnitProtKB/TrEMBL登录号A1QW92；SEQ IDNO：44)或由其来源的免疫原性肽，例如，来源于TetR样蛋白的肽，或包含选SEQ ID NO：45-56的序列的肽，及其混合物/组合相接触。用于检测由结核分枝杆菌造成的感染或结核病的免疫原性结核分枝杆菌TetR样蛋白和肽衍生物还详细描述于2007年5月16日提交的国际专利申请PCT/
AU2007/000663(WO2007/131292)，其全文提述的方式并入本文。
AU2007/000663(WO2007/131292)，其全文提述的方式并入本文。
[0107] 作为替代或附加手段，所述患者的样品可与KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或片段或表位相接触，并与结核分枝杆菌谷氨酰胺合成酶(GS)蛋白(例如UnitProtKB/TrEMBL登录号O33342)，或由其来源的免疫原性肽，例如，来源于GS蛋白表面暴露区域的肽，或包含选自SEQ ID NO：57-60的序列的肽，及其混合物/组合相接触。用于检测由结核分枝杆菌造成的感染或结核病的免疫原性结核分枝杆菌GS和肽衍生物还详细描述于2007年6月24日提交的国际专利申请PCT/AU2005/000930(WO2006/000045)，其全文提述的方式并入本文。
[0108] 其他在这种测定法形式中的多分析物测试的具体实施例包括来源于结核分枝杆菌KARI蛋白和/或结核分枝杆菌BSX蛋白和/或结核分枝杆菌核糖体蛋白S9和/或结核分枝杆菌蛋白Rv1265的抗原表位的使用，或者可供选择地，来源于结核分枝杆菌KARI蛋白和/或结核分枝杆菌BSX蛋白和/或结核分枝杆菌蛋白Rv1265的抗原表位的使用。
[0109] 对于一种或多种第二分析物(例如结合于BSX和/或谷氨酰胺合成酶)的测定法以与供检测在血清或血浆或其他体液中结合于KARI蛋白的抗体相同的方式方便地进行。所述测定法可同时进行或在不同时间进行，并使用相同或不同的患者样品。所述测定法还可在相同的反应容器中进行，只要不同的检测系统用于检测不同的抗体，例如，使用不同报道分子(如不同颜色的染料、荧光团、放射性核苷酸或酶)标记的抗人Ig。
[0110] 另外进行一种或多种本领域已知的测试以供确定由一种或多种分枝杆菌病原菌(例如，结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌)造成的感染也落在本发明的保护范围内，如为了确证使用本发明的方法获得的初始或预先诊断，和/或确定在临床样品中的具体传染因子(infectious agent)。与本发明基于抗体的测定法一起使用的示例性的替代测试(surrogate test)包括培养测试和/或涂片测试，然而除了那些具体描述之外的基于抗体的测试也明确地由本发明涵盖，唯一的要求是检测出结合于分枝杆菌KARI蛋白和/或其一种或多种免疫原性片段的一种或多种抗体。
[0111] 本文中使用的术语“感染”应理解为意指在受体呼吸道中微生物和/或多种微生物(特别是细菌或病毒)的侵袭和/或定殖(colonisation)。上述感染可为不显著的或导致局部细胞损伤。所述感染可为局限性的(localised)、亚临床的(subclinical)和暂时的，或者可通过延伸成为急性或慢性的临床感染而扩散。所述感染还可为过去的感染，其中残余的KARI抗原，或者与分离的KARI蛋白或肽结合的反应性宿主抗体，遗留在宿主中。所述感染还可为潜在的感染，其中所述微生物存在于受试者中，然而所述受试者并不显示与所述生物相关疾病的症状。优选地，所述感染是结核分枝杆菌造成的肺部或肺外感染，并更优选肺外感染。“肺部”感染指肺中气道的感染，例如，肺组织、支气管、细支气管、呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡囊或肺泡的感染。“肺外”指肺以外，涵盖例如肾、淋巴、尿道、骨、皮肤、脊髓液、肠、腹膜、胸膜和心包腔。
[0112] 本发明的多肽还可用于诊断结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌造成的感染或结核病。举例而言，本发明还提供在受试者中诊断由结核分枝杆菌造成的感染或结核病的方法，包括在来自所述受试者的生物样品中检测免疫原性KARI蛋白或免疫原性KARI肽或其免疫原性KARI片段或表位，其中所述蛋白或免疫原性片段或表位在样品中的存在指明疾病、疾病进展或感染。在相关的实施例中，所述蛋白或免疫原性片段或表位在所述样品中的存在指明感染。
[0113] 优选地，怀疑所述受试者罹患由结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌造成的感染或结核病，和/或所述受试者有形成结核病或被感染的风险。
[0114] 举例而言，所述方法可为免疫测定法，例如，包括将来源于受试者的生物样品与根据本文任何实施例的结合于结核分枝杆菌内源KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位或所述肽或表位或片段的组合或混合物的抗体，在足以使抗原-抗体复合物形成的条件下接触一段时间，然后检测抗原-抗体复合物的形成。根据该实施例的优选样品为其中很可能发现结核分枝杆菌或来自细菌碎片的肽片段的样品，或包含免疫球蛋白的级分，例如，来自脑、乳房、卵巢、肺、结肠、胰、睾丸、肝、肌肉、骨的提取物或其混合物；体液如痰、血清、血浆、全血、唾液、尿、胸膜液或其混合物或其衍生物，例如痰、血清、血浆、全血、唾液、尿、胸膜液衍生物等。所述样品可包含与KARI抗原性片段复合的循环抗体。
[0115] 在该测定法形式中包含多分析物测试，其中使用多种抗体以确证使用结合于KARI蛋白或表位的抗体获得的诊断，这落在本发明的保护范围内。举例而言，所述患者的样品可与结合于KARI蛋白或免疫原性KARI肽或片段或表位相接触，并与结合
另一种结核分枝杆菌蛋白的抗体相接触，所述蛋白例如选自下组的蛋白：结核分枝杆菌BSX蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号A5TZK2；SEQ ID NO：2)、结核分枝杆菌核糖体蛋白S9(UniProtKB/Swiss-Prot登录号A5U8B8；SEQ ID NO：14)、结核分枝杆菌蛋白Rv1265(UniProtKB/Swiss-Prot登录号P64789；SEQ ID NO：21)、结核分枝杆菌延伸因子-Tu(EF-Tu)蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot登录号A5U071；SEQID NO：28-29)、结核分枝杆菌P5CR蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q11141；SEQ ID NO：36)、结核分枝杆菌TetR样蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号A1QW92；SEQ ID NO：44)结核分枝杆菌谷氨酰胺合酶(GS)蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号O33342)、源自所述BSX蛋白的免疫原性肽、源自所述S9的免疫原性肽、源自所述Rv1265的免疫原性肽、源自所述EF-Tu蛋白的免疫原性肽、源自所述PC5R蛋白的免疫原性肽和源自所述TetR样蛋白的免疫原性肽、源自所述GS蛋白的免疫原性肽及其组合。
另一种结核分枝杆菌蛋白的抗体相接触，所述蛋白例如选自下组的蛋白：结核分枝杆菌BSX蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号A5TZK2；SEQ ID NO：2)、结核分枝杆菌核糖体蛋白S9(UniProtKB/Swiss-Prot登录号A5U8B8；SEQ ID NO：14)、结核分枝杆菌蛋白Rv1265(UniProtKB/Swiss-Prot登录号P64789；SEQ ID NO：21)、结核分枝杆菌延伸因子-Tu(EF-Tu)蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot登录号A5U071；SEQID NO：28-29)、结核分枝杆菌P5CR蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q11141；SEQ ID NO：36)、结核分枝杆菌TetR样蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号A1QW92；SEQ ID NO：44)结核分枝杆菌谷氨酰胺合酶(GS)蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号O33342)、源自所述BSX蛋白的免疫原性肽、源自所述S9的免疫原性肽、源自所述Rv1265的免疫原性肽、源自所述EF-Tu蛋白的免疫原性肽、源自所述PC5R蛋白的免疫原性肽和源自所述TetR样蛋白的免疫原性肽、源自所述GS蛋白的免疫原性肽及其组合。
[0116] 举例而言，所述患者样品可与结合于KARI蛋白或免疫原性KARI肽或片段或表位相接触，并与结合于结核分枝杆菌BSX蛋白(例如UnitProtKB/TrEMBL登录号A5TZK2；SEQ ID NO：2)的抗体和/或结合于来源于BSX蛋白的免疫原性肽的抗体(例如与包含选自下组的序列的肽结合的抗体：SEQ ID NO：3-13)相接触。示例性的抗体描述于本文，和申请人提交于2005年8月19日的国际专利申请PCT/AU2005/001254号(WO2006/01792)，其公开以全文提述的方式并入本文。
[0117] 作为替代或附加手段，所述患者的样品可与结合于KARI蛋白或免疫原性KARI肽或片段或表位相接触，并与结合于结核分枝杆菌核糖体蛋白S9(例如UniProtKB/Swiss-Prot登录号A5U8B8；SEQ ID NO：14)的抗体和/或结合于来源于S9蛋白的免疫原性肽的抗体(例如与包含选自下组的序列的肽结合的抗体：SEQ ID NO：15-20)相接触。示例性的抗体描述于本文，和申请人提交于2007年1月31日的国际专利申请PCT/AU2007/000093号(WO2007/087679)，其公开以全文提述的方式并入本文。
[0118] 作为替代或附加手段，所述患者的样品可与结合于KARI蛋白或免疫原性KARI肽或片段或表位相接触，并与结合于结核分枝杆菌蛋白Rv1265(例如UniProtKB/Swiss-Prot登录号P64789；SEQ ID NO：21)的抗体和/或结合于来源于Rv1265蛋白的免疫原性肽的抗体(例如与包含选自下组的序列的肽结合的抗体：SEQ ID NO：22-27)相接触。示例性的抗体描述于本文，和申请人提交于2007年5月16日的国际专利申请PCT/AU AU2007/000662号(WO2007/131291)，其公开以全文提述的方式并入本文。
[0119] 作为替代或附加手段，所述患者的样品可与结合于KARI蛋白或免疫原性KARI肽或片段或表位相接触，并与结合于结核分枝杆菌蛋白EF-Tu(例如UniProtKB/Swiss-Prot登录号A5U071；SEQ ID NO：28-29)的抗体和/或结合于来源于EF-Tu蛋白的免疫原性肽的抗体(例如与包含选自下组的序列的肽结合的抗体：SEQ ID NO：30-35)相接触。示例性的抗体描述于本文，和申请人提交于2007年6月8日的国际专利申请PCT/AU AU2007/000810号(WO2007/140545)，其公开以全文提述的方式并入本文。
[0120] 作为替代或附加手段，所述患者的样品可与结合于KARI蛋白或免疫原性KARI肽或片段或表位相接触，并与结合于结核分枝杆菌蛋白P5CR(例如UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q11141；SEQ ID NO：36)的抗体和/或结合于来源于P5CR蛋白的免疫原性肽的抗体(例如与包含选自下组的序列的肽结合的抗体：SEQ ID NO：37-43)相接触。示例性的抗体描述于本文，和申请人提交于2007年5月16日的国际专利申请PCT/AU2007/000664号(WO2007/131293)，其公开以全文提述的方式并入本文。
[0121] 作为替代或附加手段，所述患者的样品可与结合于KARI蛋白或免疫原性KARI肽或片段或表位相接触，并与结合于结核分枝杆菌TetR样蛋白(例如UniProtKB/TrEMBL登录号A1QW92；SEQ ID NO：44)的抗体和/或结合于来源于TetR样蛋白的免疫原性肽的抗体(例如与包含选自下组的序列的肽结合的抗体：SEQ ID NO：45-56)相接触。示例性的抗体描述于本文，和申请人提交于2007年5月16日的国际专利申请PCT/AU2007/000663号(WO2007/131292)，其公开以全文提述的方式并入本文。
[0122] 作为替代或附加手段，所述患者的样品可与结合于KARI蛋白或免疫原性KARI肽或片段或表位相接触，并与结合于结核分枝杆菌GS蛋白(例如UniProtKB/TrEMBL登录号O33342)的抗体和/或结合于来源于GS蛋白的免疫原性肽的抗体(例如与包含选自下组的序列的肽结合的抗体：SEQ ID NO：57-60)相接触。示例性的抗体描述于本文，和申请人提交于2005年6月24日的国际专利申请PCT/AU2005/000930号(WO2006/000045)，其公开以全文提述的方式并入本文。
[0123] 其他在该测定法形式中的多分析物测试的具体实施例包括使用结合于结核分枝杆菌KARI蛋白或其免疫原性片段或表位和/或结核分枝杆菌BSX蛋白或其免疫原性片段或表位和/或结核分枝杆菌核糖体蛋白S9或其免疫原性片段或表位和/或结核分枝杆菌蛋白Rv1265或其免疫原性片段或表位的抗体，或者，使用结合于结核分枝杆菌KARI蛋白或其免疫原性片段或表位和/或结核分枝杆菌BSX蛋白或其免疫原性片段或表位和/或结核分枝杆菌蛋白Rv1265或其免疫原性片段或表位的抗体。
[0124] 对于一种或多种第二分析物(例如BSX和/或谷氨酰胺合成酶和/或S9)的测定法以与在样品中检测KARI蛋白相同的方式方便地进行。所述测定法可同时进行或在不同时间进行，并使用相同或不同的患者样品。所述测定法还可在相同的反应容器中进行，只要不同的检测系统用于检测结合的抗体，例如，结合于抗KARI抗体的第二抗体和结合于所述第二分析物的抗体。
[0125] 与基于抗体的测定法类似，基于抗原的测定系统可包括免疫测定法，例如，将来源于所述受试者的生物样品与根据本文任何实施例的一种或多种分离的配体，特别是任何能够结合于KARI蛋白或其免疫原性片段或表位的肽配体、抗体或其免疫反应性片段相接触，并检测复合物，例如抗原-抗体复合物的形成。在一个特别优选的实施例中，所述配体是抗体，优选特异性结合于根据本文任何实施例的结核分枝杆菌的分离的或重组的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，或结合于所述肽或表位或片段的组合或混合物，或结合于包含所述免疫原性KARI蛋白、肽、片段或表位的融合蛋白或蛋白聚集体的多克隆或单克隆抗体或抗体片段。虽然所述测定法可用于非免疫妥协的受试者(例如HIV阴性受试者)，其对于在免疫妥协或免疫缺陷的受试者(例如，被人免疫缺陷病毒感染(即，“HIV+”)的受试者)中检测TB也是特别有用的。用于进行上述测定法的样品包括，例如，(i)来自选自下组的组织的提取物：脑、乳房、卵巢、肺、结肠、胰、睾丸、肝、肌肉、骨，和其混合物；(ii)选自下组的体液：痰、血清、血浆、全血、唾液、尿、胸膜液或其混合物；和(iii)来源于选自下组体液的样品：痰、血清、血浆、全血、唾液、尿、胸膜液和其混合物。
[0126] 本发明还提供用于确定具有由结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌造成的感染或结核病的受试者对于用治疗性化合物治疗所述结核病或感染的应答的方法，所述方法包括在来自所述受试者的生物样品中检测KARI蛋白或其免疫原性片段或表位，其中所述蛋白或片段或表位的水平与该蛋白或片段或表位在正常或健康受试者中可检测到的水平相比较增加，或尚未减少或未在减少表明所述受试者并未对所述治疗有应答，或并未摆脱疾病或感染。举例而言，所述方法可包括免疫测定法，例如将来源于所述受试者的生物样品与一种或多种能够结合于KARI蛋白或其免疫原性片段或表位的抗体接触，并检测抗原-抗体复合物的形成。在一个特别优选的实施例中，抗体为根据本文任何实施例特异性结合于结核分枝杆菌分离的或重组的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，或结合于所述肽或表位或片段的组合或混合物，或结合于包含所述免疫原性KARI蛋白、肽、片段或表位的融合蛋白或蛋白聚集体的分离的或重组的抗体或抗体的免疫反应性片段。虽然本发明的诊断测定法可用于非免疫妥协的受试者(例如HIV阴性受试者)，其对于在免疫妥协或免疫缺陷的受试者(例如，HIV+的受试者)中检测TB是特别有用的。用于进行上述测定法的样品包括，例如，(i)来自选自下组的组织的提取物：脑、乳房、卵巢、肺、结肠、胰、睾丸、肝、肌肉、骨，和其混合物；(ii)选自下组的体液：痰、血清、血浆、全血、唾液、尿、胸膜液和其混合物；和(iii)来源于选自下组体液的样品：痰、血清、血浆、全血、唾液、尿、胸膜液和其混合物。
[0127] 本发明还提供用于确定具有由结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌造成的感染或结核病的受试者对于用治疗性化合物治疗所述结核病或感染的应答的方法，所述方法包括在来自所述受试者的生物样品中检测KARI蛋白或其免疫原性片段或表位，其中所述蛋白或片段或表位的水平与该蛋白或片段或表位在罹患结核病或上述感染的受试者中可检测到的水平相比较低表明所述受试者对所述治疗有所应答，或摆脱了疾病或感染。举例而言，所述方法可包括免疫测定法，例如将来源于所述受试者的生物样品与一种或多种能够结合于KARI蛋白或其免疫原性片段或表位的抗体接触，并检测抗原-抗体复合物的形成。在一个特别优选的实施例中，抗体为根据本文任何实施例特异性结合于结核分枝杆菌的分离的或重组的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，或结合于包含所述免疫原性KARI蛋白、肽、片段或表位的融合蛋白或蛋白聚集体的分离的或重组的抗体或抗体的免疫反应性片段。虽然本发明的诊断测定法可用于非免疫妥协的受试者(例如HIV阴性受试者)，其对于在免疫妥协或免疫缺陷的受试者(例如，HIV+的受试者)中检测TB是特别有用的。用于进行上述测定法的样品包括，例如，(i)来自选自下组的组织的提取物：脑、乳房、卵巢、肺、结肠、胰、睾丸、肝、肌肉、骨，和其混合物；(ii)选自下组的体液：痰、血清、血浆、全血、唾液、尿、胸膜液和其混合物；和(iii)来源于选自下组体液的样品：痰、血清、血浆、全血、唾液、尿、胸膜液和其混合物。
[0128] 本发明还提供在受试者中监测由结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌造成的疾病进展、对疗法的应答或感染状态的方法，其包括在不同时间在来自所述受试者的生物样品中确定KARI蛋白或其免疫原性片段或表位的水平，其中所述KARI蛋白、片段或表位的水平的变化表明受试者疾病进展、对疗法的应答或感染状态的变化。在一个优选实施例中，所述方法还包括当KARI蛋白、片段或表位水平随时间提高时，施用供治疗结核病或结核分枝杆菌感染的化合物。举例而言，所述方法可包括免疫测定法，例如将来源于所述受试者的生物样品与一种或多种能够结合于KARI蛋白或其免疫原性片段或表位的抗体接触，并检测抗原-抗体复合物的形成。在一个特别优选的实施例中，抗体为根据本文任何实施例特异性结合于结核分枝杆菌的分离的或重组的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，或结合于所述肽或表位或片段的组合或混合物，或结合于包含所述免疫原性KARI蛋白、肽、片段或表位的融合蛋白或蛋白聚集体的分离的或重组的抗体或抗体的免疫反应性片段。虽然本发明的诊断测定法可用于非免疫妥协的受试者(例如HIV阴性受试者)，其对于在免疫妥协或免疫缺陷的受试者(例如，HIV+的受试者)中检测TB是特别有用的。用于进行上述测定法的样品包括，例如，(i)来自选自下组的组织的提取物：脑、乳房、卵巢、肺、结肠、胰、睾丸、肝、肌肉、骨，和其混合物；(ii)选自下组的体液：痰、血清、血浆、全血、唾液、尿、胸膜液和其混合物；和(iii)来源于选自下组体液的样品：痰、血清、血浆、全血、唾液、尿、胸膜液和其混合物。
[0129] 在一个特别优选的实施例中，在基于抗原的测定平台(assay platform)或基于抗体的测定平台中检测循环免疫复合物(CIC)。对于基于抗原的测定平台，CIC的检测可依赖于检测所述CIC的免疫球蛋白部分来针对循环中分离的抗原的检测提供信号扩增。根据该实施例，使用捕捉试剂(例如，捕捉抗体)从而除了捕捉在受试者循环中的分离的抗原之外，还捕捉与受试者的免疫球蛋白复合的KARI抗原(KARI多肽或其免疫反应性片段或表位)。使用任选地与可检测的标记偶合的抗Ig抗体以特异性结合受捕捉的CIC，由此检测CIC患者样品。在本发明的保护范围内，抗Ig抗体优先结合样品中的IgM、IgA或IgG。在一个特别优选的实施例中，所述抗Ig抗体结合于人Ig，例如人IgA、人IgG或人IgM。所述抗Ig抗体可偶合于任何本领域已知的标准可检测标记。这对于检测由致病体(pathogenic agent)(例如，细菌或病毒)造成的感染，或对于诊断任何与CIC相关的疾病或病症是特别有用的。相应地，可对根据本文任何实施例所述的诊断方法进行修饰，其中来源于受试者的样品包含一种或多种循环的免疫复合物，所述免疫复合物包含结合于结核分枝杆菌的KARI蛋白或一种或多种免疫原性KARI肽或其片段或表位的免疫球蛋白(Ig)，且其中检测抗原-抗体复合物的形成包括将抗Ig抗体与循环免疫复合物的免疫球蛋白部分在足以使复合物形成的条件下接触一段时间，然后检测结合的抗Ig抗体。
[0130] 供监测疾病进展和/或疗法效力的基于抗原的多分析物测试明确地落在本发明的保护范围内，且其基本上如本文上面对于对感染诊断的描述进行，只不过使用来自已知受感染(例如，由于之前使用一种或多种前述基于抗原的测定法形式诊断出来)的患者的样品进行。与其他多分析物测试一样，在为了监测疾病进展和/或对于感染的治疗的效力的背景下使用具有不同特异性的多个抗体，例如，使用选自下组的抗体：结合于结核分枝杆菌BSX蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号A5TZK2；SEQ ID NO：2)和/或结核分枝杆菌核糖体蛋白S9(UniProtKB/Swiss-Prot登录号A5U8B8；SEQ ID NO：14)和/或结核分枝杆菌蛋白Rv1265(UniProtKB/Swiss-Prot登录号P64789；SEQ IDNO：21)和/或结核分枝杆菌延伸因子-Tu(EF-Tu)蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot登录号A5U071；SEQ ID NO：28-29)和/或结核分枝杆菌P5CR蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q11141；SEQ ID NO：36)和/或结核分枝杆菌TetR样蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号A1QW92；SEQ ID NO：44)和/或谷氨酰胺合酶(GS)蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登录号O33342)和/或源自所述BSX蛋白的免疫原性肽和/或源自所述S9的免疫原性肽和/或源自所述Rv1265的免疫原性肽和/或源自所述EF-Tu蛋白的免疫原性肽和/或源自所述PC5R蛋白的免疫原性肽和/或源自所述TetR样蛋白的免疫原性肽和/或源自GS蛋白的免疫原性肽及其组合的抗体，或所述抗体的任意组合，以确证使用针对KARI培育的抗体和/或针对KARI肽培育的抗体获得的诊断，由此增强特异性和/或选择性。同样，使用结合于结核分枝杆菌复合菌组一种或多种分枝杆菌的同源物的交叉反应性抗体可用于进行本发明。
[0131] 然后使用能够结合于每种蛋白分析物的抗体，或者，在CIC检测的情况下，使用能够结合于人免疫球蛋白的抗体来检测形成的抗原-抗体复合物。所述测定法可同时进行或在不同时间进行，并使用相同或不同的患者样品。所述测定法还可在同一个反应容器中进行，只要使用不同的检测系统来检测不同的抗原或包含不同抗原的CIC，例如，使用不同报道分子(如不同颜色的染料、荧光团、放射性核苷酸、酶或胶体金颗粒)标记的抗人Ig，或差异标记的(differentially-labelled)抗KARI抗体、抗BSX抗体和抗GS抗体。与其他本文中所述的免疫测定法一样，所述二抗任选地偶合于合适的可检测标记，例如，辣根过氧化物酶(HRP)或β-半乳糖苷酶或β-葡糖苷酶，胶体金颗粒等。使用这样的标记检测形成的复合物的标准方法对本领域技术人员是显而易见的。
[0132] 还进行一种或多种本领域已知测试以确定由结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌或其他病原菌(例如，鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌)造成的感染，所述测试如为了确证使用本发明的方法获得的初始或预先诊断和/或在临床样品中确定具体的传染原，这也落在本发明的保护范围内。用于本发明的基于抗原的测定法的示例性的替代性测试包括培养测试和/或涂片测试，然而除了那些具体描述的测试之外的基于抗原的测试也明确地由本发明所涵盖，只要其满足检测分枝杆菌KARI蛋白和/或其一种或多种免疫原性片段的要求即可。上述实施例在本文末尾的实施例部分中详细描述。
[0133] 本发明还提供了治疗由结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌造成的感染或结核病的方法，包括：
[0134] (i)根据本文任何实施例进行诊断方法，由此检测来自受试者的生物样品中结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌的存在；和
[0135] (ii)施用治疗上有效量的药物组合物以在受试者的肺、血液或淋巴系统中减少病原性杆菌数。
[0136] 本发明还提供了治疗由结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌造成的感染或结核病的方法，包括：
[0137] (i)根据本文任何实施例进行诊断方法，由此检测来自经第一药物组合物治疗的受试者的生物样品中结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌的存在；和
[0138] (ii)施用治疗上有效量的第二药物组合物以在受试者的肺、血液或淋巴系统中减少病原性杆菌数。
[0139] 本发明还提供了在受试者中治疗结核病的方法，其包括进行如本文所述的诊断方法或预后方法。在一个实施例中，本发明提供了预防方法，包括：
[0140] (i)在来自受试者的生物样品中检测结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌感染的存在；和
[0141] (ii)施用治疗上有效量的药物组合物以在受试者的肺、血液或淋巴系统中减少病原性杆菌数。
[0142] 更具体而言，免疫原性KARI蛋白或一种或多种免疫原性KARI肽、或其片段或表位当施用于动物受试者时，诱导高效价抗体的特异性产生。
[0143] 相应地，本发明还提供了引发针对结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌的抗体产生的方法，包括在足以引发抗体产生的条件下将免疫原性KARI蛋白或一种或多种其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位施与所述受试者一段时间，所述抗体例如结合于结核分枝杆菌的中和抗体。
[0144] 本发明明确地涵盖免疫原性KARI蛋白或一种或多种其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位在中制备针对在人或其他动物受试者中结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌的治疗性或预防性亚单位疫苗的用途。
[0145] 相应地，本发明还提供了包含免疫原性KARI蛋白或一种或多种其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位与药学上可接受的稀释剂组合的疫苗。优选地，所述蛋白或肽或片段或表位与合适的佐剂一起配制。
[0146] 或者，所述肽或衍生物或变体通过施用在体外经处理从而在其表面呈递所述肽的自体的或同种异体的抗原呈递细胞(APC)或树突状细胞来配制为细胞疫苗。
[0147] 还涵盖了包含克隆入合适载体(例如，牛痘、金丝雀痘(canary pox)、腺病毒或其他真核病毒载体)的编码免疫原性KARI蛋白或一种或多种其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位的核酸(例如，DNA或RNA)的基于核酸的疫苗。优选地，将编码免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位的DNA配制入DNA疫苗，例如，与现存的卡介苗(BCG)或免疫佐剂(如牛痘病毒、弗氏佐剂或其他免疫刺激剂(immunestimulant))结合配制。
[0148] 本发明还提供了免疫原性KARI蛋白或其一种或多种免疫原性KARI肽或一种或多种免疫原性KARI片段或一种或多种表位在制备组合物中的用途，所述组合物供在受试者(例如，受HIV-1和/或HIV-2感染的受试者，或具有形成结核病或受结核分枝杆菌感染的风险的受试者)中预防或治疗或诊断由结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌造成的感染或结核病，包括在人受试者中治疗潜在的感染。
[0149] 在另一个实施例中，本发明提供了免疫原性KARI蛋白或一种或多种免疫原性KARI肽或其一种或多种免疫原性KARI片段或一种或多种表位在制备组合物中的用途，所述组合物供在受试者中预防或治疗或诊断由结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌造成的感染或结核病，其中所述受试者之前接受过针对HIV-1和/或HIV-2的抗病毒疗法。
[0150] 本发明还提供了供在生物样品中检测结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌的试剂盒，所述试剂盒包含：
[0151] (i)根据本文任何实施例特异性结合结核分枝杆菌复合菌组中的于一种或多种分枝杆菌的分离或重组的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI片段或表位或片段或结合于包含所述免疫原性KARI蛋白、肽、片段或表位的融合蛋白或蛋白聚集体的一种或多种分离的抗体或其免疫反应性片段；和
[0152] (ii)供检测抗原-抗体复合物的形成的工具，
[0153] 任选地，所述试剂盒与使用说明一同包装。
[0154] 本发明还提供了用于在生物样品中检测结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌的试剂盒，所述试剂盒包含：
[0155] (i)根据本文任何实施例的结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌的分离的或重组的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，或所述肽或表位或片段的组合；和
[0156] (ii)供检测抗原-抗体复合物形成的工具，
[0157] 任选地，所述试剂盒与使用说明一同包装。
[0158] 可将本文中所述的测定法修改用于任何测定法形式，且特别地用于固相ELISA、流通免疫测定法(flow through immune-assay)形式、侧流(lateral flow)形式、毛细管(capillary)形式，以供纯化或分离免疫原性蛋白、肽、片段(例如，使用偶合于抗体、蛋白G或蛋白A的固相基质)。
[0159] 相应地，本发明还提供了具有根据本文中所述任何实施例的分离的或重组的KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位或包含所述免疫原性KARI蛋白、肽、片段或表位的融合蛋白或蛋白聚集体吸附其上的固相基质。举例而言，所述固相基质可包括膜，例如尼龙膜或硝酸纤维素膜。或者，所述固相基质可包括聚苯乙烯或聚碳酸酯微孔板或其部分(例如，微滴定板的一个或多个孔)、浸渍片、玻璃支持物或层析树脂。
[0160] 在另一个实施例中，本发明还提供了具有根据本文任何实施例的分离的或重组的KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位或所述肽或表位或片段的组合或混合物或包含所述免疫原性KARI蛋白、肽、片段或表位的融合蛋白或蛋白聚集体吸附其上的固相基质。举例而言，所述固相基质可包括膜，例如尼龙膜或硝酸纤维素膜。或者，所述固相基质可包括聚苯乙烯或聚碳酸酯微孔板或其部分(例如，微滴定板的一个或多个孔)、浸渍片、玻璃支持物或层析树脂。
[0161] 包含需用于进行本文中所述的测定法(特别是用于使用多个抗原或多个抗体的多分析物测试)的其他抗原和/或抗体的上述固相基质也明确地落在本发明的保护范围内。
[0162] 3.定义
[0163] 本文中使用的术语“乙酮醇酸还原异构酶”或“KARI”是指包含或具有与SEQ ID NO：1至少约80％同一性或与本申请SEQ ID NO：1所述的序列实质上相同的序列，和/或包含或具有与结核分枝杆菌ilvC基因编码的序列至少约80％相同的序列的蛋白组合物，所述组合物适用于产生免疫原性肽或制备抗体的目的，其与结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌或来自收到所述一种或多种分支杆菌感染的受试者的临床基质(clinical matrix)交叉反应，且无需其他任何功能(例如，在蛋白翻译中起作用)。在本发明之前，并未显示SEQ ID NO：1所述的结核分枝杆菌蛋白在体内表达，或具有免疫原性，或免疫上与其他生物并不交叉反应，且涉及所述KARI蛋白的信息来源于对结核分枝杆菌基因组中编码SEQ ID NO：1的多肽的开放阅读框的生物信息学分析。
[0164] 本文中使用的的术语“来源于”是为了表明可从特定的来源获取特定的整体，但并不需要直接来自该来源。
[0165] 除非上下文另有指示，或明确表示相反含意，本文中记载为单数的整体、步骤或要素的本发明的整体、步骤或要素明确地涵盖所记载的整体、步骤或要素的单数和复数形式。
[0166] 本文中所述的针对任何单一实施例的本发明的实施例，具体而言，针对任何蛋白或其在诊断、预后或治疗结核分枝杆菌中的用途应理解为可根据情况适当变动以适用于(mutatis mutandis)本文中所述的任何其他实施例。
[0167] 本文描述的用于个体受试者的诊断实施例明确地可可根据情况适当变动以适用于群体、种族集团或亚集团的流行病学或针对具有特定MHC限制(restriction)的个体的诊断或预后。所有上述本发明的变化可由本领域技术人员基于本文中所述的主题容易地推出。
[0168] 本文中所提及的检测或鉴定结核分枝杆菌和/或所提及的诊断、预后或监测由结核分枝杆菌造成的感染或结核病明确地延及对结核分枝杆菌复合菌组中任何一种或多种生物的检测，但不延及对类结核病和/或一种或多种鸟分枝杆菌复合菌组的生物的诊断，除非上下文另行表明。举例而言，如本文所述，本发明涵盖使用与结核分枝杆菌KARI和片段以及一种或多种鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌交叉反应的抗体作为对分支杆菌属的筛选，其与使用一种或多种替代性测定法以供检测结核病和/或检测结核分枝杆菌复合菌组的一种或多种分枝杆菌相偶联(但并不与任何供诊断类结核病和/或检测一种或多种鸟分枝杆菌复合菌组的分枝杆菌的替代性测定法相偶联)。
[0169] 在整个本说明书中，除非上下文另行表明，单词“包括/包含(comprise)”或其变化形式如“comprises”或“comprising”，应理解为暗示包括所述步骤或要素或整体或者一组步骤或要素或整体，但并不排除任何其他步骤或要素或整体或者一组要素或整体。
[0170] 本领域技术人员应理解，可对本文中所述的本发明进行除了那些经具体描述的变化和修饰之外的变化和修饰。应理解本发明包含所有上述变化和修饰。本发明还包括在本说明书中个别地或整体地所提及或表明的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何两个或更多个所述步骤或特征的任何和全部组合。
[0171] 本发明的保护范围并不受本文中所述的具体实施例的限制。如本文中所述，功能上等同的产物、组合物和方法明确地落在本发明的保护范围内。
[0172] 本发明的实施无需不必要的实验尝试，除非另行指明，使用分子生物学、微生物学、蛋白组学、病毒学、重组DNA技术、溶液中肽合成、固相肽合成和免疫学的常规方法。教导上述常规技术的下文中的文献1-17以全文提述的方式并入本文。
[0173] 附图简述
[0174] 图1是显示供检测结核分枝杆菌乙酮醇酸还原异构酶(KARI)的扩增的夹心ELISA标准曲线的图示。标准曲线是使用供在缓冲液中如实施例中所述检测KARI的优化ELISA条件生成的。重组KARI蛋白的浓度(pg/ml)以对数尺度标于X轴[ilvC]，而平均OD示于Y轴。分别使用5和2.5μg/mL的捕捉和检测抗体(分别为Mo1283F和Ch34/35)。使用4-参数对数方程将代表性ELISA(n＝2)的数据拟合于标准曲线(#1217；LOD＝1690pg/mL)。
[0175] 图2是显示在结核分枝杆菌的一个实验室菌株(H37Rv)和两个临床菌株(CSU93和HN878)中KARI蛋白表达(相对于总细胞蛋白)的图示，其由夹心ELISA确定。通过夹心ELISA分析来自结核分枝杆菌菌株H37Rv(左)、结核分枝杆菌菌株CSU93(中)和
HN878(右)的全细胞裂解液(WCL)。内源蛋白的浓度通过从标准曲线内插来计算，并就添加水平(spiking level)加以校正。从每个样品重复两次进行分析的重复实验获得数据。
将内源蛋白的水平(表示为pg/μg总细胞蛋白)就三个培养菌株中每一个的平均值±SD进行作图。结核分枝杆菌菌株承蒙Colorado State University的好意而获得。
HN878(右)的全细胞裂解液(WCL)。内源蛋白的浓度通过从标准曲线内插来计算，并就添加水平(spiking level)加以校正。从每个样品重复两次进行分析的重复实验获得数据。
将内源蛋白的水平(表示为pg/μg总细胞蛋白)就三个培养菌株中每一个的平均值±SD进行作图。结核分枝杆菌菌株承蒙Colorado State University的好意而获得。
[0176] 图3是显示结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌中KARI蛋白表达(相对于总细胞蛋白)的图示，其通过夹心ELISA确定。在两个独立实验中重复两次测定来自结核分枝杆菌H35Rv(左边)，和鸟分枝杆菌(中间)和胞内分枝杆菌(右边)的全细胞裂解液。内源蛋白的浓度通过从标准曲线内插来计算，并就稀释因子加以校正。表示为pg/μg总细胞蛋白的内源蛋白水平对于三个测试的分枝杆菌中的每一个就平均值±SD进行作图。
[0177] 图4是显示从结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌的全细胞裂解液获得的滤过物中KARI蛋白的表达的图示，其通过夹心ELISA确定。将从结核分枝杆菌菌株H35Rv(左边)、鸟分枝杆菌(中间)和胞内分枝杆菌(右边)全细胞裂解液获得的滤过物重复两次进行测定。内源蛋白的浓度通过从标准曲线内插来计算，并就稀释因子(如果存在)加以校正。表示为pg/μL滤过物的内源蛋白水平对于三个分枝杆菌中的每一个就平均值±SD进行作图。
[0178] 图5是显示针对结核分枝杆菌KARI蛋白的抗体与来自非分枝杆菌病原菌大肠杆菌(柱1和2)、枯草芽孢杆菌(柱3和4)和铜绿假单胞菌(柱5和6)的0.1μg/ml(柱2、4、6)或100μg/ml(柱1、3、5)全细胞裂解液缺乏显著交叉反应性的夹心ELISA结果的图示。
全细胞裂解液在两个单独实验中重复两次进行测定。作为对照，使用分别为0ng/ml(柱7)、
0.12ng/ml(柱8)、0.49ng/ml(柱9)、1.95ng/ml(柱10)、7.8ng/ml(柱11)、31.3ng/ml(柱
12)或125ng/ml(柱13)的纯化的重组KARI蛋白，其通过将重组蛋白在封闭缓冲液中系列稀释制备。对样品和对照就平均值±SD进行作图。
全细胞裂解液在两个单独实验中重复两次进行测定。作为对照，使用分别为0ng/ml(柱7)、
0.12ng/ml(柱8)、0.49ng/ml(柱9)、1.95ng/ml(柱10)、7.8ng/ml(柱11)、31.3ng/ml(柱
12)或125ng/ml(柱13)的纯化的重组KARI蛋白，其通过将重组蛋白在封闭缓冲液中系列稀释制备。对样品和对照就平均值±SD进行作图。
[0179] 图6是显示从根据其TB涂片测试结果、TB培养测试结果和HIV状态分类的患者获得的临床痰中KARI蛋白的表达的图示。附图左侧系列的直方图显示校准标样中存在的KARI蛋白进行ELISA测定法的平均OD值，所述标样包括结核分枝杆菌菌株H37Rv全细胞裂解液的下述系列稀释：60μg/ml，柱1；20μg/ml，柱2；6.67μg/ml，柱3；2.22μg/ml，柱4；0.74μg/ml，柱5；0.25μg/ml，柱6；0.08μg/ml，柱7；0μg/ml，柱8。附图左侧的系列直方图显示如伴随的实施例中所述制备的患者样品中存在的KARI蛋白进行ELISA测定法所得的平均OD值(方法3：4.5mL痰-C1，17x150μL替代扩增(replacement amplification)ELISA)。“MPC”表明样品的识别码；“涂片”表明涂片测试结果；“培养”表明培养测试结果；
而“HIV”表明HIV状态。空心柱表明涂片阴性/培养阴性样品。实心柱表明涂片阳性/培养阳性样品。数据显示在涂片阳性/培养阳性样品中，无论受试者的HIV状态，KARI蛋白交叉反应性的水平显著更高。
而“HIV”表明HIV状态。空心柱表明涂片阴性/培养阴性样品。实心柱表明涂片阳性/培养阳性样品。数据显示在涂片阳性/培养阳性样品中，无论受试者的HIV状态，KARI蛋白交叉反应性的水平显著更高。
[0180] 图7是显示从根据其TB涂片测试结果、TB培养测试结果和HIV状态分类的患者获得的临床痰中的表达的图示，表示为pg KARI蛋白/ml样品体积。将示于图6的数据基于其中的KARI蛋白校准值转换为pg抗原，这使得将结核分枝杆菌H37Rv的全细胞提取物的μg/ml KARI蛋白内插为pg/mLrKARI蛋白成为可能。“MPC”表明样品的识别码；“涂片”表明涂片测试结果；“培养”表明培养测试结果；而“HIV”表明HIV状态。空心柱表明涂片阴性/培养测试阴性样品。实心柱表明涂片阳性/培养阳性样品。数据显示在涂片阳性/培养阳性样品中，无论受试者的HIV状态，KARI蛋白交叉反应性的水平显著更高。测定法的LOD＝～900pg/mL。
[0181] 图8是显示未稀释的痰在本文中所述的扩增的夹心ELISA测定法中对内源结核分枝杆菌KARI蛋白检测的掩蔽和/或淬灭作用，以及通过稀释痰回收失去的信号的图示。将足以提供1.2ng/ml KARI蛋白的结核分枝杆菌H37Rv全细胞裂解液掺入未稀释的封闭溶液或痰中，并在测定之前温育16小时，或者直接测定。还将该样品在测定之前用封闭溶液进行系列稀释，其中稀释的范围为从1∶3(v/v)封闭∶“纯粹的(neat)”样品至1∶27(v/v)封闭∶“纯粹的”样品，如x-轴所示。对于测定法，用捕捉抗体Mo1283F将ELISA板包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体之后，将每一个未稀释的样品(“纯粹的”)或1∶3(v/v)稀释(“1∶3”)、1∶9(v/v)稀释(“1∶9“)或1∶27(v/v)稀释(“1∶27”)的50μl等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将抗体Ch34/35与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，并用50μl经1∶50000(v/v)稀释的由生物素化的驴抗鸡IgG组成的二抗进行温育。
在室温再温育1小时之后，如前所述洗涤板。然后将HRP80-链霉抗生物素蛋白(扩增的ELISA)添加至板，并在室温再温育1小时，如前所述进行洗涤，并最终与TMB温育30分钟。
在450-620nm确定吸光度(y轴)。数据显示痰对信号有显著的减弱/抑制，无论样品是立刻进行测定或在测定之前温育了较长时间，如前两个柱的“纯粹的”样品的信号与封闭缓冲液中的信号相比无法检测到所示。通过将样品在封闭缓冲液中稀释恢复了高至约50-75％的信号，且该恢复甚至可在测定之前样品在痰中温育了16小时的情况下仍然发生，表明在痰中信号的丧失大部分可归结于痰对信号的遮掩和淬灭。
在室温再温育1小时之后，如前所述洗涤板。然后将HRP80-链霉抗生物素蛋白(扩增的ELISA)添加至板，并在室温再温育1小时，如前所述进行洗涤，并最终与TMB温育30分钟。
在450-620nm确定吸光度(y轴)。数据显示痰对信号有显著的减弱/抑制，无论样品是立刻进行测定或在测定之前温育了较长时间，如前两个柱的“纯粹的”样品的信号与封闭缓冲液中的信号相比无法检测到所示。通过将样品在封闭缓冲液中稀释恢复了高至约50-75％的信号，且该恢复甚至可在测定之前样品在痰中温育了16小时的情况下仍然发生，表明在痰中信号的丧失大部分可归结于痰对信号的遮掩和淬灭。
[0182] 图9是显示未稀释的痰在本文中所述的扩增的夹心ELISA测定法中对重组结核分枝杆菌KARI蛋白检测的掩蔽和/或淬灭作用，以及通过稀释痰回收失去的信号的图示。将KARI蛋白以终浓度10ng/ml掺入未稀释的封闭缓冲液或痰，并将样品在测定之前温育
16小时，或者直接测定。还将该样品在测定之前用封闭溶液进行系列稀释，其中稀释范围为从1∶3(v/v)封闭∶“纯粹的”样品至1∶27(v/v)封闭∶“纯粹的”样品，如x-轴所示。对于测定法，用捕捉抗体Mo1283F将ELISA板包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体之后，将每一个未稀释的样品(“纯粹的”)或1∶3(v/v)稀释(“1∶3”)、1∶9(v/v)稀释(“1∶9“)或1∶27(v/v)稀释(“1∶27”)的50μl等分试样添加至经抗体包被
的ELISA板孔中。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将抗体Ch34/35与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，并用50μl经1∶50000(v/v)稀释的由生物素化的驴抗鸡IgG组成的二抗进行温育。在室温再温育1小时之后，如前所述洗涤板。然后将HRP80-链霉抗生物素蛋白(扩增的ELISA)添加至板，并在室温再温育
1小时，如前所述进行洗涤，并最终与TMB温育30分钟。在450-620nm确定吸光度(y轴)。
数据显示痰对信号有显著的减弱/抑制，无论样品是立刻进行测定或在测定之前温育了较长时间，如前两个柱的“纯粹的”样品的信号与封闭缓冲液中的信号相比无法检测到所示。
通过将样品在封闭缓冲液中稀释恢复了信号，尽管所述样品在痰中已温育了长时间，表明在痰中信号的丧失大部分可归结于痰对信号的遮掩和淬灭。
16小时，或者直接测定。还将该样品在测定之前用封闭溶液进行系列稀释，其中稀释范围为从1∶3(v/v)封闭∶“纯粹的”样品至1∶27(v/v)封闭∶“纯粹的”样品，如x-轴所示。对于测定法，用捕捉抗体Mo1283F将ELISA板包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体之后，将每一个未稀释的样品(“纯粹的”)或1∶3(v/v)稀释(“1∶3”)、1∶9(v/v)稀释(“1∶9“)或1∶27(v/v)稀释(“1∶27”)的50μl等分试样添加至经抗体包被
的ELISA板孔中。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将抗体Ch34/35与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，并用50μl经1∶50000(v/v)稀释的由生物素化的驴抗鸡IgG组成的二抗进行温育。在室温再温育1小时之后，如前所述洗涤板。然后将HRP80-链霉抗生物素蛋白(扩增的ELISA)添加至板，并在室温再温育
1小时，如前所述进行洗涤，并最终与TMB温育30分钟。在450-620nm确定吸光度(y轴)。
数据显示痰对信号有显著的减弱/抑制，无论样品是立刻进行测定或在测定之前温育了较长时间，如前两个柱的“纯粹的”样品的信号与封闭缓冲液中的信号相比无法检测到所示。
通过将样品在封闭缓冲液中稀释恢复了信号，尽管所述样品在痰中已温育了长时间，表明在痰中信号的丧失大部分可归结于痰对信号的遮掩和淬灭。
[0183] 图10是使用KARI作为靶抗原，抗体Mo1283F作为捕捉抗体而Ch34/35作为检测抗体对临床涂片阳性的痰样品进行筛选的结果的图示。从左至右为下述样品：(i)包含具有标出的蛋白浓度(μg蛋白/ml)的结核分枝杆菌H37Rv全细胞裂解液系列稀释的阳性对照样品；(ii)两个涂片阳性样品(MPC306和MPC315)，每个均用封闭缓冲液配为1∶1(v/v)稀释、或1∶3(v/v)稀释或1∶9(v/v)稀释，即标于x轴的稀释因子；(iii)阴性对照(BD_1)，用封闭缓冲液配为1∶1(v/v)稀释、或1∶3(v/v)稀释或1∶9(v/v)稀释，即标于x轴的稀释因子；和(iv)另一个阳性对照，其包含掺入30μg/ml重组KARI蛋白的样品BD_1，然后用封闭缓冲液系列稀释为1∶1(v/v)稀释、或1∶3(v/v)稀释或1∶9(v/v)稀释，即标于x轴的稀释因子。ELISA信号示于y轴。数据显示阴性对照具有背景信号，而两个涂片阳性样品具有超过背景的可检测信号。
[0184] 图11是使用KARI作为靶抗原，抗体Mo1283F作为捕捉抗体而Ch34/35作为检测抗体对临床涂片阳性的痰样品进行筛选的结果的图示。其为数据示于图10的实验的继续。从左至右为下述样品：(i)包含具有标出的蛋白浓度(μg蛋白/ml)的结核分枝杆菌H37Rv全细胞裂解液系列稀释的阳性对照样品；(ii)两个涂片阳性样品(MPC305和MPC316)，每个均用封闭缓冲液配为1∶1(v/v)稀释、1∶3(v/v)稀释或1∶9(v/v)稀释，即标于x轴的稀释因子；(iii)涂片阴性样品(MPC313)，用封闭缓冲液配为1∶1(v/v)稀释、1∶3(v/v)稀释或1∶9(v/v)稀释，即标于x轴的稀释因子；和(iv)阴性对照样品(BD_1)，用封闭缓冲液配为1∶1(v/v)稀释、1∶3(v/v)稀释或1∶9(v/v)稀释，即标于x轴的稀释因子。
ELISA信号示于y轴。数据显示阴性对照具有背景信号，而两个涂片阳性样品和一个涂片阴性样品具有超过背景的可检测信号。
ELISA信号示于y轴。数据显示阴性对照具有背景信号，而两个涂片阳性样品和一个涂片阴性样品具有超过背景的可检测信号。
[0185] 图12是使用KARI作为靶抗原，抗体Mo1283F作为捕捉抗体而Ch34/35作为检测抗体对临床涂片阳性的痰样品进行筛选的结果的图示，其为数据示于图10的实验的继续。从左至右为下述样品：(i)包含具有标出的蛋白浓度(μg蛋白/ml)的结核分枝杆菌H37Rv全细胞裂解液系列稀释的阳性对照样品；和(ii)两个涂片阳性样品(MPC309和MPC307)，每个均用封闭缓冲液配为1∶1(v/v)稀释或10∶1(v/v)稀释，即标于x轴的稀释因子；
和(iii)涂片阴性对照(MPC311)，用封闭缓冲液配为1∶1(v/v)稀释、3∶1(v/v)稀释或
9∶1(v/v)稀释，即标于x轴的稀释因子。ELISA信号示于y轴。数据显示阴性对照具有背景信号，而两个涂片阳性样品和一个涂片阴性样品具有超过背景的可检测信号。
和(iii)涂片阴性对照(MPC311)，用封闭缓冲液配为1∶1(v/v)稀释、3∶1(v/v)稀释或
9∶1(v/v)稀释，即标于x轴的稀释因子。ELISA信号示于y轴。数据显示阴性对照具有背景信号，而两个涂片阳性样品和一个涂片阴性样品具有超过背景的可检测信号。
[0186] 图13提供了显示使用多克隆Ch34/35抗体(左边小图)和单克隆Mo1283F抗体(右边小图)通过Western印迹分析检测重组KARI蛋白和内源结核分枝杆菌KARI蛋白的图示。将重组KARI蛋白(rilvC，10ng)和来自经培养的结核分枝杆菌菌株H35Rv、CSU93或HN878的10μg全细胞裂解液(WCL)通过SDS-PAGE分辨，转移至硝酸纤维素膜，并用Ch34/35多克隆一抗继以抗鸡二抗(标题为“鸡34/35”的左边小图)或用单克隆Mo1283F抗体继以抗小鼠二抗(标题为“小鼠1283F”的左边小图)进行探测。还将重复的印迹用Ch34/35在1μg/ml未标记的重组KARI蛋白存在下(标题为“鸡34/35”的中间小图)，或者，仅用二抗(标题为鸡“34/35”的右边小图和标记为“小鼠1283F”的右边小图)进行探测。方框标记的区域标明KARI蛋白条带。蛋白的分子量标于每组小图的左侧。数据显示两种抗体均能够在全部三个测试的菌株中结合重组KARI蛋白，且所述多克隆抗体能够在Western印迹中检测测试浓度的内源蛋白。数据还显示过量未标记的蛋白能够阻止抗体结合。
[0187] 图14是使用不同的抗体制备物通过Western印迹分析检测重组KARI蛋白和内源KARI蛋白的照片表示。分子量标记蛋白(泳道1)、1ng重组KARI蛋白(泳道2)和5mg经培养的结核分枝杆菌H37Rv的全细胞裂解液(MCL)(泳道3)通过SDS-PAGE分辨。将蛋白转移至硝酸纤维素膜，并使用标于每个小图上的一抗进行探测。数据显示，使用Ch35抗体制备物、汇集的Ch34/35抗体制备物、单克隆抗体2B1和单克隆抗体3A2可检测出对重组和内源KARI蛋白的结合，而使用单克隆抗体制备物Mo1E7和Mo2C7可检测出对内源KARI蛋白的结合。
[0188] 图15是显示KARI蛋白对不同结核分枝杆菌菌株的交叉反应性的图示，其通过扩增的夹心ELISA确定。将ELISA板用由浆细胞瘤2B1C11产生的捕捉抗体Mo2B1包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体之后，将从ColoradoUniversity或在Tyrian Diagnostics内部(in-house)获得的结核分枝杆菌菌株H37Rv的全细胞裂解液和结核分枝杆菌菌株HN878和CDC1551的细胞裂解液系列稀释的50μl等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将抗体Ch34/35与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，并用50μl经1∶50000(v/v)稀释的由生物素化的驴抗鸡IgG组成的二抗进行温育。在室温再温育1小时之后，如前所述洗涤板。然后将HRP80-链霉抗生物素蛋白(扩增的ELISA)添加至板，并在室温再温育1小时，如前所述进行洗涤，并最终与TMB温育30分钟。在450-620nm确定吸光度(y轴)。数据显示使用该抗体组合在菌株之间有显著的交叉反应性。
[0189] 图16是显示在来自不同结核分枝杆菌菌株的细胞裂解液胞质溶胶级分的KARI蛋白的图示，其通过扩增的夹心ELISA确定。将ELISA板用由浆细胞瘤2B1C11产生的捕捉抗体Mo2B1包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体之后，将来自结核分枝杆菌H35Rv、HN878和CDC1551的胞质溶胶蛋白的系列稀释的50μl等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将抗体Ch34/35与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，并用50μl经1∶50000(v/v)稀释的由生物素化的驴抗鸡IgG组成的二抗进行温育。在室温再温育1小时之后，如前所述洗涤板。然后将HRP80-链霉抗生物素蛋白(扩增的ELISA)添加至板，并在室温再温育1小时，如前所述进行洗涤，并最终与TMB温育30分钟。在450-620nm确定吸光度(y轴)。数据显示使用该抗体组合，在所有三种测试的菌株的胞质溶胶中可检测出KARI蛋白，在H37Rv中其水平较高，而在CDC1551中其水平较低。
[0190] 图17是显示在来自不同结核分枝杆菌菌株的细胞裂解液的细胞膜级分中的KARI蛋白的图示，其通过扩增的夹心ELISA确定。将ELISA板用由浆细胞瘤2B1C11产生的捕捉抗体Mo2B1包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体之后，将来自结核分枝杆菌H35Rv、HN878和CDC1551的溶解的细胞膜蛋白的系列稀释的50μl等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将抗体Ch34/35与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，并用50μl经1∶50000(v/v)稀释的由生物素化的驴抗鸡IgG组成的二抗进行温育。在室温再温育1小时之后，如前所述洗涤板。然后将HRP80-链霉抗生物素蛋白(扩增的ELISA)添加至板，并在室温再温育1小时，如前所述进行洗涤，并最终与TMB温育30分钟。在450-620nm确定吸光度(y轴)。数据显示使用该抗体组合，在所有三种测试的菌株的细胞膜中可检测出KARI蛋白，在H37Rv中其水平较高，而在CDC1551和HN878中其水平较低。
[0191] 图18是显示在来自不同结核分枝杆菌菌株的细胞裂解液的细胞壁级分中的KARI蛋白的图示，其通过扩增的夹心ELISA确定。将ELISA板用由浆细胞瘤2B1C11产生的捕捉抗体Mo2B1包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体之后，将来自结核分枝杆菌H35Rv、HN878和CDC1551的溶解的细胞壁蛋白的系列稀释的50μl等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将抗体Ch34/35与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，并用50μl经1∶50000(v/v)稀释的由生物素化的驴抗鸡IgG组成的二抗进行温育。在室温再温育1小时之后，如前所述洗涤板。然后将HRP80-链霉抗生物素蛋白(扩增的ELISA)添加至板，并在室温再温育1小时，如前所述进行洗涤，并最终与TMB温育30分钟。在450-620nm确定吸光度(y轴)。数据显示使用该抗体组合，在所有三种测试的菌株的细胞壁中可检测出KARI蛋白，在H37Rv中其水平较高，而在CDC1551中其水平较低。
[0192] 图19是显示结核分枝杆菌菌株H37Rv全细胞裂解液(右边曲线)和重组KARI蛋白(左边曲线)的ELISA信号的图示，其通过扩增的夹心ELISA确定。将ELISA板用由浆细胞瘤2B1C11产生的捕捉抗体Mo2B1包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体之后，将来自Tyrian Diagnostics内部的结核分枝杆菌H37Rv的全细胞裂解液的系列稀释的50μl等分试样和重组KARI蛋白系列稀释的50μl等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将抗体Ch34/35与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，并用50μl经1∶50000(v/v)稀释的由生物素化的驴抗鸡IgG组成的二抗进行温育。在室温再温育1小时之后，如前所述洗涤板。然后将HRP80-链霉抗生物素蛋白(扩增的ELISA)添加至板，并在室温再温育1小时，如前所述进行洗涤，并最终与TMB温育30分钟。在450-620nm确定吸光度(y轴)。数据显示内源和重组KARI蛋白的效价值(titration value)。数据还显示可明确地检出内源蛋白，尽管在全细胞裂解液中内源蛋白可受遮掩和/或淬灭。
[0193] 图20是显示内源结核分枝杆菌KARI蛋白与大肠杆菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母细胞裂解液中的蛋白缺乏可检测出的交叉反应性的图示。将ELISA板用由浆细胞瘤2B1C11产生的捕捉抗体Mo2B1包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体之后，将来自结核分枝杆菌H37Rv、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母的全细胞裂解液的系列稀释的50μl等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将抗体Ch34/35与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，并用50μl经1∶50000(v/v)稀释的由生物素化的驴抗鸡IgG组成的二抗进行温育。在室温再温育1小时之后，如前所述洗涤板。然后将HRP80-链霉抗生物素蛋白(扩增的ELISA)添加至板，并在室温再温育1小时，如前所述进行洗涤，并最终与TMB温育30分钟。在450-620nm确定吸光度(y轴)。数据显示对于结核分枝杆菌KARI蛋白生成了可检测出的信号，而对于其他生物的全细胞裂解液中的蛋白缺乏显著的信号，这表明使用该抗体对的该测定法的特异性。
[0194] 图21是显示内源结核分枝杆菌KARI蛋白与大肠杆菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母细胞裂解液中的蛋白缺乏可检测出的交叉反应性，以及结核分枝杆菌KARI蛋白和胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌KARI蛋白之间具有弱交叉反应性的图示。将ELISA板用由浆细胞瘤2B1C11产生的捕捉抗体Mo2B1包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体之后，将来自结核分枝杆菌菌株H37Rv(M.tb裂解液)、大肠杆菌(E.coli)、铜绿假单胞菌(Pseud)、枯草芽孢杆菌(B.sub)和酿酒酵母(酵母)、胞内分枝杆菌(Intrce.Lys)和鸟分枝杆菌(Avium Lys)的全细胞裂解液的系列稀释的50μl等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将抗体Ch34/35与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，并用50μl经1∶50000(v/v)稀释的由生物素化的驴抗鸡IgG组成的二抗进行温育。在室温再温育1小时之后，如前所述洗涤板。然后将HRP80-链霉抗生物素蛋白(扩增的ELISA)添加至板，并在室温再温育1小时，如前所述进行洗涤，并最终与TMB温育30分钟。在450-620nm确定吸光度(y轴)。数据显示对于结核分枝杆菌KARI蛋白生成了可检测出的信号，对于胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌蛋白生成了弱得多的信号(敏感度大约为1/100)，而对于其他生物的全细胞裂解液中的蛋白缺乏显著的信号，这表明使用该抗体对的该测定法的特异性。
[0195] 图22故意忽略。
[0196] 图23a-e提供了显示使用KARI作为靶抗原、抗体Mo2B1作为捕捉抗体而C34/35作为检测抗体对临床涂片阳性的痰样品进行筛选的结果的图示。在图23a-e中，左边系列的柱提供了用具有标示的蛋白浓度(μg蛋白/ml)的结核分枝杆菌H37Rv全细胞裂解液的系列稀释对KARI蛋白的标准校准，和包含封闭缓冲液的空白阴性对照；而最右边的柱提供了对于阴性对照痰或对于包含10μg/ml重组KARI蛋白，然后用封闭缓冲液系列稀释至1∶1(v/v)稀释或1∶3(v/v)稀释的该阴性对照痰的信号。每个图中的样品包括如下所述的涂片阴性和涂片阳性样品：
[0197] 图23a中涂片阴性：BD1229；BD1288；MPC364；BD1287；BD1187；MPC363；
[0198] 图23a中涂片阳性：MPC360；MPC374；MPC366；MPC357；MPC356；
[0199] 图23b中涂片阴性：CGS123；MPC375；Phru0905；CGS119；和MPC388；
[0200] 图23b中涂片阳性：MPC381；MPC380；MPC379；MPC378；
[0201] 图23c中涂片阴性：BD505；MPC339；
[0202] 图23c中涂片阳性：MPC370；MPC365；MPC335；MPC372；MPC342；MPC377；MPC324；MPC367；MPC359；MPC368；
[0203] 图23d中涂片阴性：所有列举的样品
[0204] 图23d中涂片阳性：所有列举的样品均不是
[0205] 图23e中涂片阴性：3-D；3-E；3-H；3-J；3-L；和
[0206] 图23e中涂片阳性：3-A；3-B；3-C；3-E；3-F；3-G；3-I；3-K。
[0207] 对所述样品在标示的稀释如前述附图图例所述使用单克隆抗体Mo2B1作为捕捉抗体而多克隆Ch34/35血清作为检测抗体进行扩增的ELISA测定法。样品编码和涂片测试的值示于x轴。ELISA信号在y轴上标为平均值±SD(n＝2)。数据显示对于阴性对照的背景信号，以及包含全细胞裂解液或重组KARI蛋白的阳性对照超过背景的可检测出的信号。对于临床样品，对于所有涂片阳性的样品数据显示可检出显著高于背景的信号，而对于绝大多数涂片阴性的样品显示低于背景的信号。一些涂片阳性的样品也提供了高于背景的信号，例如MPC364、MPC363、MPC375、MPC388和MPC339，然而所有这些假阳性检测可通过使用一种或多种基于抗原的测定法使用针对Rv1265和/或BSX和/或S9蛋白的替代性测定法来分辨(数据未显示)。
[0208] 图24提供了显示使用单克隆抗体Mo1F6作为捕捉抗体而生物素化的单克隆抗体Mo2B1(2B1-Bi)作为检测抗体使用扩增的夹心ELISA对内源结核分枝杆菌KARI蛋白进行检测的图示。扩增的ELISA基本上如本文中所述在两个单独实验中进行。数据表明该测定法检测KARI蛋白。
[0209] 图25提供了使用针对包含KARI蛋白区域的肽(Mo4F7、Mo3C3、Mo4C10、Mo1C10)或重组KARI蛋白(Mo2B1)培育的单克隆抗体进行扩增的夹心ELISA以结合结核分枝杆菌全细胞裂解液中内源KARI蛋白的图示。每种单克隆抗体测试了两批。数据显示针对全长重组蛋白制备的单克隆抗体Mo2B1对内源KARI蛋白的结合最强，且可检测出针对包含SEQ ID NO：1的残基40-56的合成肽产生的单克隆抗体Mo4F7和Mo4C10对内源KARI蛋白的结合。
[0210] 图26提供了显示对单克隆抗体Mo1A4、Mo1H2、Mo2D6、Mo2E5、Mo2G2、Mo3H3、Mo4C3、Mo4D2和Mo4D11进行抗体滴定(antibody titration)的图示。抗体以标于x轴的稀释程度进行滴定，其中在每个测试的抗体稀释，生成的信号从左向右对应于下述抗体：1A4、1H2、2D6、2E5、2G2、3H3、4C3、4D2和4D11。数据显示抗体2D6、3H3和4D11具有最高效价，其顺序为2D63＞＞H3＞4D11。
[0211] 图27提供了显示单克隆抗体Mo1A4、Mo1H2、Mo2D6、Mo2E5、Mo2G2、Mo3H3、Mo4C3、Mo4D2和Mo4D11检测重组KARI蛋白的能力的图示。将抗体针对相同体积的具有标于x轴的浓度的重组KARI蛋白进行滴定，其中在每个测试的浓度，生成的信号从左向右对应于下述抗体：1A4、1H2、2D6、2E5、2G2、3H3、4C3、4D2和4D11。数据显示抗体2D6、3H3和4D11在微克至纳克浓度的范围内检测KARI蛋白。
[0212] 图28提供了显示使用单克隆抗体Mo1F6或Mo2D6作为捕捉抗体而生物素化的单克隆抗体Mo2B1(2B1-Bi)作为检测抗体使用扩增的夹心ELISA检测重组KARI蛋白的图示。对于每个抗体对扩增的ELISA基本上如本文中所述在两个单独实验中进行。数据显示两种测定法均检测KARI蛋白。
[0213] 图29提供了显示在定点的测定法形式(DiagnostIQTM，Tyrian Diagnostics，Australia)中在菌株H37Rv全细胞裂解液中内源结核分枝杆菌KARI蛋白的标准曲线的照片表示(上面)和图示(下面)。对于每个测定法，测试了500μL包含7.5-120μg/mL范围的蛋白的结核分枝杆菌菌株H37Rv全细胞裂解液(WCL)。使用命名为Ch34/35的鸡抗KARI多克隆抗体汇集来捕捉内源KARI，并使用与金偶合的单克隆抗体Mo2B1进行检测。每个测定点(assaypoint)重复两次进行。数据表明所述ELISA测定法可简化(reducible)为定点形式。
[0214] 图30是显示使用经与重组BSX预温育的鸡抗BSX多克隆抗体(实心菱形)；未经预温育的鸡抗BSX抗体(灰色正方形)；兔抗BSX多克隆抗体(实心三角形)和小鼠抗BSX单克隆抗体(实心正方形)检测出的重组BSX浓度的图示。重组蛋白的浓度标于X轴，而吸光度标于Y轴。
[0215] 图31是显示使用夹心ELISA检测重组BSX的图示，其中使用单克隆抗体Mo403B作为捕捉试剂而多克隆抗体C44作为检测试剂。筛选从50ng/ml低至0.39ng/ml滴定量的重组BSX。标出了检测和捕捉试剂的浓度。BSX浓度示于X轴，而平均OD示于Y轴。
[0216] 图32是显示使用夹心ELISA在TB和对照受试者的痰中检测BSX的图示。吸光度标于Y轴，而样品类型和编号标于X轴。
[0217] 图33是显示使用扩增的夹心ELISA检测重组BSX的图示，其中使用单克隆抗体Mo403B作为捕捉试剂或检测试剂(如标示)，而多克隆抗体C44作为检测试剂或捕捉试剂(如标示)。筛选从50ng/ml低至0.39ng/ml的滴定量的重组BSX。标出检测和捕捉试剂的浓度。BSX的浓度示于X轴，而平均OD示于Y轴。
[0218] 图34是显示使用扩增ELISA检测重组BSX的图示，其中C44用作捕捉试剂。将纯化的鸡抗BSX pAb C44作为捕捉抗体以20μg/ml的浓度使用每孔50μl固定在ELISA板上。通过顺序添加浓度为5μg/ml的纯化的兔抗BSX(肽28)pAb，然后添加1∶30000(v/v)或1∶60000(v/v)稀释的山羊抗兔IgG作为第二检测剂(detector)筛选从10ng/ml低至0.078ng/ml的滴定量的重组BSX。使用稀释为1∶5000(v/v)的驴抗山羊IgG HRP和TMB进行信号检测。
[0219] 图35是显示标准夹心ELISA与基于生物素的扩增系统的检出限比较测定的图示。将纯化的兔抗BSX pAb R16以20μg/ml的浓度固定于ELISA平板上。以从50ng/ml低至
0.39ng/ml的浓度添加滴定量的重组BSX 1小时，除非另行指明(即2小时)。抗原检测使用标准的夹心系统进行，其中以5μg/ml的浓度添加鸡抗BSX pAb C44，然后以1∶5000(v/v)的稀释程度添加偶合于HRP的绵羊抗鸡IgG，或使用扩增系统进行，其中首先以5μg/ml添加鸡抗BSX，然后以上述指明的多种稀释程度添加偶合于生物素的驴抗鸡IgG，最后以
1∶5000(v/v)的稀释程度添加链霉抗生物素蛋白-HRP。将背景(即BSX不存在时的信
号)从上述曲线中减去。
0.39ng/ml的浓度添加滴定量的重组BSX 1小时，除非另行指明(即2小时)。抗原检测使用标准的夹心系统进行，其中以5μg/ml的浓度添加鸡抗BSX pAb C44，然后以1∶5000(v/v)的稀释程度添加偶合于HRP的绵羊抗鸡IgG，或使用扩增系统进行，其中首先以5μg/ml添加鸡抗BSX，然后以上述指明的多种稀释程度添加偶合于生物素的驴抗鸡IgG，最后以
1∶5000(v/v)的稀释程度添加链霉抗生物素蛋白-HRP。将背景(即BSX不存在时的信
号)从上述曲线中减去。
[0220] 图36是显示使用基于生物素的扩增ELISA检测重组BSX滴定量的图示。将纯化的兔抗BSX(抗肽28)pAb R16作为捕捉抗体以20或40μg/ml的浓度固定于ELISA板上。然后通过顺序添加浓度为5μg/ml的纯化的鸡抗BSXpAb C44，然后添加以1∶20000(v/v)稀释程度添加偶合于生物素的驴抗鸡IgG作为第二检测剂来筛选从10ng/ml低至4.9pg/ml的重组BSX的滴定量。使用稀释为1∶5000(v/v)的偶合于HRP的链霉抗生物素蛋白和TMB进行信号检测。通过不添加重组BSX来获得对于两个兔抗BSX捕捉浓度的背景OD强度。
[0221] 图37是显示使用夹心ELISA用生物素扩增系统筛选痰中的内源BSX的图示。将来自南非的TB患者和分别来自南非(前缀“M”)和澳大利亚(前缀“CGS”)的罹患非TB呼吸道疾病的患者痰样品(50μl+50μl封闭缓冲液)通过夹心ELISA筛选BSX抗原的存在。将纯化的兔抗BSX(肽28)pAb作为捕捉抗体以20μg/ml的浓度固定于ELISA板上，使用浓度为5μg/ml的纯化的鸡抗BSX pAb，C44作为检测抗体。使用稀释为1∶20000(v/v)的生物素化的驴抗鸡IgG作为第二检测剂。使用稀释为1∶5000(v/v)的链霉抗生物素蛋白HRP和TMB进行信号检测。向来自对照患者CGS25的痰掺入5ng/ml和1ng/ml重组BSX作
为阳性对照。
为阳性对照。
[0222] 图38是显示多重样品上样对通过扩增的夹心ELISA检测BSX蛋白的作用的图示。将兔抗BSX pAb R16作为捕捉抗体以20μg/ml的浓度使用每孔50μl固定于ELISA板上。
将来自TB患者和非TB呼吸道疾病对照患者的痰样品以1∶1(v/v)比例用封闭溶液加以稀释。阳性对照为掺入1ng/ml重组BSX的CGS23痰样品。将痰样品(i)根据标准ELISA
温育1小时；(ii)温育2小时；或(iii)温育2小时，移除并添加新鲜痰再温育1小时。内源BSX使用纯化的鸡抗BSX pAb C44以5μg/ml继以稀释为1∶20000(v/v)的偶合于生
物素的驴抗鸡IgG并最后用稀释为1∶5000(v/v)的偶合于HRP的链霉抗生物素蛋白进行检测。
将来自TB患者和非TB呼吸道疾病对照患者的痰样品以1∶1(v/v)比例用封闭溶液加以稀释。阳性对照为掺入1ng/ml重组BSX的CGS23痰样品。将痰样品(i)根据标准ELISA
温育1小时；(ii)温育2小时；或(iii)温育2小时，移除并添加新鲜痰再温育1小时。内源BSX使用纯化的鸡抗BSX pAb C44以5μg/ml继以稀释为1∶20000(v/v)的偶合于生
物素的驴抗鸡IgG并最后用稀释为1∶5000(v/v)的偶合于HRP的链霉抗生物素蛋白进行检测。
[0223] 图39是显示供检测结核分枝杆菌BSX蛋白的标准和扩增的夹心ELISA标准曲线的图示。如实施例中所述，使用供检测缓冲液中的BSX的优化ELISA条件生成标准曲线。重组BSX蛋白的浓度(pg/ml)以对数尺度标于X轴，而平均OD示于Y轴。分别以2μg/mL和5μg/mL使用捕捉和检测抗体(分别为Mo639F和Ch12/13)。将数据就平均OD+SD(n＝3)针对rBSX的logpg/mL制作X-Y图，并使用曲线拟合确定所述测定法的LOD(#733标准和扩增的ELISA，LOD分别＝522和89pg/mL)。
[0224] 图40是显示BSX蛋白在结核分枝杆菌的一个实验室菌株(H37Rv)和两个临床菌株(CSU93和HN878)中的表达(相对于总细胞蛋白)的图示，其通过夹心ELISA确定。将来自结核分枝杆菌菌株H37Rv(左边)、结核分枝杆菌菌株CSU93(中间)和HN878(右边)的全细胞裂解液(WCL)通过夹心ELISA来进行分析。内源蛋白的浓度通过从标准曲线内插并就添加水平进行校正来进行计算。数据从重复实验中获得，其中每个样品重复两次进行分析。将内源蛋白的水平(表示为pg/μg总细胞蛋白)对于三个培养菌株中的每一个就平均值±SD进行作图。结核分枝杆菌菌株承蒙厚意由Calorado State University提供。
[0225] 图41a是显示BSX蛋白在结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌中的表达(相对于总细胞蛋白)的图示，其通过夹心ELISA确定。将来自结核分枝杆菌菌株H37Rv(左边)，和来自鸟分枝杆菌(中间)及胞内分枝杆菌(右边)的全细胞裂解液在两个独立实验中重复测定两次。内源蛋白的浓度通过从标准曲线内插并就稀释因子进行校正来进行计算。表达为pg/μg总细胞蛋白的内源蛋白的水平对于三个测试的分枝杆菌中的每一个就平均值±SD进行作图。
[0226] 图41b是显示BSX蛋白在从结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌全细胞裂解液获得的滤过物中的表达的图示，其通过夹心ELISA确定。将从结核分枝杆菌菌株H37Rv(左边)，鸟分枝杆菌(中间)及胞内分枝杆菌(右边)的全细胞裂解液获得的滤过物重复测定两次。内源蛋白的浓度通过从标准曲线内插并就稀释因子(如存在)进行校正来进行计算。表达为pg/μg滤过物的内源蛋白的水平对于三个分枝杆菌中的每一个就平均值±SD进行作图。
[0227] 图42是显示针对结核分枝杆菌BSX蛋白的抗体与来自非分枝杆菌病原菌大肠杆菌(柱1和2)、枯草芽孢杆菌(柱3和4)和铜绿假单胞菌(柱5和6)的0.1μg/ml(柱2、4、6)或100μg/ml(柱1、3、5)全细胞裂解液缺乏显著交叉反应性的夹心ELISA结果的图示。全细胞裂解液在两个单独实验中重复两次进行测定。作为对照，分别使用0ng/ml(柱
7)和3ng/ml(柱8)的纯化的重组BSX蛋白，其通过将重组蛋白在封闭缓冲液中系列稀释制备。对样品和对照就平均值±SD进行作图。
7)和3ng/ml(柱8)的纯化的重组BSX蛋白，其通过将重组蛋白在封闭缓冲液中系列稀释制备。对样品和对照就平均值±SD进行作图。
[0228] 图43是显示通过免疫磁珠测定法(immune magnetic bead assay)在来自临床样品的痰中检测结核分枝杆菌BSX蛋白的图示。将用1.8μg抗BSX Ch8pAb包被的总共7
1.2x10 个磁珠，用500μL TB阳性或阴性痰(痰-M1处理)温育过夜，之前对样品进行预处理：向各个样品添加10mM EDTA和1X蛋白酶抑制剂混合物，然后在冰上用10mM DTT还原1小时，在冰上用30mMIAA烷化1小时，在室温用0.25％ SDS旋转温育30分钟。将样品用样品稀释缓冲液(BNTT-1％ BSA、100mM NaCl、10mM Tris和0.05％ Tween 20)稀释为
1∶10(v/v)。将重组BSX蛋白(100pg)添加至500μL进行了相同预处理方法的Mitha对照汇集中，以制成供本测定法的阳性对照。结合的内源抗原使用1mL的5μg/mL用BNTT稀释的抗BSX抗体(Mo639F)作为检测抗体，继以添加100μL用偶合稀释缓冲液[0.1％(w/v)酪蛋白，0.1％(v/v)Tween 20]稀释为1∶5000(v/v)的抗小鼠HRP偶合抗体来进行检测。数据表示为OD450-620，并对样品和标准一起进行作图。
1.2x10 个磁珠，用500μL TB阳性或阴性痰(痰-M1处理)温育过夜，之前对样品进行预处理：向各个样品添加10mM EDTA和1X蛋白酶抑制剂混合物，然后在冰上用10mM DTT还原1小时，在冰上用30mMIAA烷化1小时，在室温用0.25％ SDS旋转温育30分钟。将样品用样品稀释缓冲液(BNTT-1％ BSA、100mM NaCl、10mM Tris和0.05％ Tween 20)稀释为
1∶10(v/v)。将重组BSX蛋白(100pg)添加至500μL进行了相同预处理方法的Mitha对照汇集中，以制成供本测定法的阳性对照。结合的内源抗原使用1mL的5μg/mL用BNTT稀释的抗BSX抗体(Mo639F)作为检测抗体，继以添加100μL用偶合稀释缓冲液[0.1％(w/v)酪蛋白，0.1％(v/v)Tween 20]稀释为1∶5000(v/v)的抗小鼠HRP偶合抗体来进行检测。数据表示为OD450-620，并对样品和标准一起进行作图。
[0229] 图44是显示从根据其TB涂片测试结果、TB培养测试结果和HIV状态分类的患者获得的临床痰中BSX蛋白的表达的图示。痰是从4个TB阳性和TB阴性受试者中的每一个收集至Cameroon中，并如实施例中所述(方法3：9.0mL痰-C1，4x150μL替代扩增ELISA)处理的。简言之，将痰-C1进行大小分级(size-fractionate)以去除小于100kDa分子量的污染物，用50mM Tris、pH 7.8、5mM MgCl2平衡，浓缩并以4x150μL等分试样通过替代扩增ELISA进行分析。附图左侧系列的直方图显示校准标样中存在的BSX蛋白进行ELISA测定法的平均OD值，所述标样包括结核分枝杆菌菌株H37Rv全细胞裂解液的下述系列稀释：60μg/ml，柱1；20μg/ml，柱2；6.67μg/ml，柱3；2.22μg/ml，柱4；0.74μg/ml，柱5；0.25μg/ml，柱6；0.08μg/ml，柱7；0μg/ml，柱8。附图左侧的系列直方图显示如实施例中所述制备的患者样品中存在的BSX蛋白进行ELISA测定法所得的平均OD值。“MPC”表明样品的识别码；“涂片”表明涂片测试结果；“培养”表明培养测试结果；而“HIV”表明HIV状态。空心柱表明涂片阴性/培养测试阴性样品。实心柱表明涂片阳性/培养阳性样品。
数据显示在涂片阳性/培养阳性样品中，BSX蛋白交叉反应性的水平显著更高。
数据显示在涂片阳性/培养阳性样品中，BSX蛋白交叉反应性的水平显著更高。
[0230] 图45是显示从根据其TB涂片测试结果、TB培养测试结果和HIV状态分类的患者获得的临床痰中的表达的图示，表示为pg BSX蛋白/ml样品体积。将示于图22的数据基于其中的BSX蛋白校准值转换为pg抗原，这使得将结核分枝杆菌H37Rv的全细胞提取物的μg/ml BSX蛋白内插为pg/mLrBSX蛋白成为可能。“MPC”表明样品的识别码；“涂片”表明涂片测试结果；“培养”表明培养测试结果；而“HIV”表明HIV状态。空心柱表明涂片阴性/培养测试阴性样品。实心柱表明涂片阳性/培养阳性样品。数据显示在涂片阳性/培养阳性样品中，无论受试者的HIV状态，BSX蛋白交叉反应性的水平显著更高。测定法的LOD＝～67pg/mL。
[0231] 图46是一张显示使用二维凝胶电泳将从分离自TB受试者的免疫球蛋白的级分分离的蛋白分开的聚丙烯酰胺凝胶的照片表示。标出了结核分枝杆菌核糖体蛋白S9的位置。
[0232] 图47是显示多克隆抗体R9滴定的图示，其相应的生物素化肽以3μg/ml包被于5μg/ml链霉抗生物素蛋白板上。
[0233] 图48是显示将包含氨基酸序列MTETT PAPQT PAAPA GPAQS FGSGL-生物素的肽以20480pg/ml至10pg/ml相对于针对连接于KHL的该肽培育的兔血清进行滴定的图示。实心菱形代表40μg/ml抗体。实心正方形代表20μg/ml抗体。灰色三角形代表10μg/ml抗体。灰色正方形代表0μg/ml抗体。
[0234] 图49是一张显示在来自罹患TB的受试者的样品中检测结核分枝杆菌核糖体蛋白S9的Western印迹的照片表示。对应于S9的条带位置通过附图右侧的箭头标示。样品编号标在附图顶部，而每个患者的HIV状态标在附图的底部。分子量标在附图的左侧。
[0235] 图50是一张显示在来自对照受试者(即，未罹患TB的受试者)的样品中检测结核分枝杆菌核糖体蛋白S9的Western印迹的照片表示。对应于S9的条带位置通过附图右侧的箭头标示。样品编号标在附图顶部，而分子量标在附图的左侧。
[0236] 图51是显示针对重组结核分枝杆菌核糖体蛋白S9制备的不同抗体对免疫接种抗原的结合亲和性的图示，其通过ELISA确定。将重组S9蛋白从500ng/ml的起始浓度1∶2(v/v)系列稀释至7.8ng/ml，并使用50μl每个稀释的等分试样包被ELISA板的孔(x轴)。在洗涤去除未结合的抗原之后，将通过对鸡(即，命名为Ch27的多克隆抗体)或对小鼠(即，命名为Mo1025F的抗体)用重组全长S9蛋白进行免疫接种制备的不同抗体分别与浓度为5μg/ml的吸附的抗原相接触。在室温下温育1小时后，洗涤板，用50μl稀释为
1∶5000(v/v)的偶合于辣根过氧化物酶(HRP)的二抗(即，对于检测结合的Ch27抗体，绵羊抗鸡IgG；而对于检测结合的Mo1205F抗体，驴抗小鼠IgG)温育，洗涤，用TMB温育30分钟，并确定在450-620nm的吸光度(y轴)。数据显示两种抗体均通过ELISA检测重组S9蛋白。
1∶5000(v/v)的偶合于辣根过氧化物酶(HRP)的二抗(即，对于检测结合的Ch27抗体，绵羊抗鸡IgG；而对于检测结合的Mo1205F抗体，驴抗小鼠IgG)温育，洗涤，用TMB温育30分钟，并确定在450-620nm的吸光度(y轴)。数据显示两种抗体均通过ELISA检测重组S9蛋白。
[0237] 图52是显示使用抗体Ch27作为捕捉抗体而抗体Mo1025F作为检测抗体测定重组结核分枝杆菌核糖体蛋白S9的夹心ELISA结果的图示。将ELISA板用捕捉抗体Ch27以5μg/ml和2.5μg/ml浓度包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体之后，将重组S9蛋白从
500ng/ml的起始浓度1∶2(v/v)系列稀释至7.8ng/ml，并将50μl每个稀释的等分试样添加至经抗体包被的ELISA板的孔(x轴)。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将检测抗体Mo1025F以1.25μg/ml至5μg/ml的浓度范围与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温下温育1小时后，洗涤板，用50μl稀释为1∶5000(v/v)的偶合于辣根过氧化物酶(HRP)的二抗(即，驴抗小鼠IgG)温育，洗涤，用TMB温育30分钟，并确定在450-620nm的吸光度(y轴)。数据显示该抗体组合并无背景信号。最优的信号是使用浓度为5μg/ml的捕捉抗体与浓度范围为1.25μg/ml至5μg/ml的检测抗体进行检测的，该条件对于结核分枝杆菌核糖体蛋白S9提供了约24ng/ml的半最大值检测(half-maximum detection)。
500ng/ml的起始浓度1∶2(v/v)系列稀释至7.8ng/ml，并将50μl每个稀释的等分试样添加至经抗体包被的ELISA板的孔(x轴)。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将检测抗体Mo1025F以1.25μg/ml至5μg/ml的浓度范围与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温下温育1小时后，洗涤板，用50μl稀释为1∶5000(v/v)的偶合于辣根过氧化物酶(HRP)的二抗(即，驴抗小鼠IgG)温育，洗涤，用TMB温育30分钟，并确定在450-620nm的吸光度(y轴)。数据显示该抗体组合并无背景信号。最优的信号是使用浓度为5μg/ml的捕捉抗体与浓度范围为1.25μg/ml至5μg/ml的检测抗体进行检测的，该条件对于结核分枝杆菌核糖体蛋白S9提供了约24ng/ml的半最大值检测(half-maximum detection)。
[0238] 图53是显示使用抗体Mo1025F作为捕捉抗体而抗体Ch27作为检测抗体测定重组结核分枝杆菌核糖体蛋白S9的夹心ELISA结果的图示。将ELISA板用捕捉抗体Mo1025F以5μg/ml和2.5μg/ml浓度包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体之后，将重组S9蛋白从500ng/ml的起始浓度1∶2(v/v)系列稀释至7.8ng/ml，并将50μl每个稀释的等分试样添加至经抗体包被的ELISA板的孔(x轴)。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将检测抗体Ch27与结合的抗原-抗体复合物以1.25μg/ml至5μg/ml的浓度范围相接触。
在室温下温育1小时后，洗涤板，用50μl稀释为1∶5000(v/v)的偶合于辣根过氧化物酶(HRP)的二抗(即，绵羊抗鸡IgG)温育，洗涤，用TMB温育30分钟，并确定在450-620nm的吸光度(y轴)。数据显示使用该抗体组合在不存在添加的抗原时，具有显著的背景交叉反应性。最优的信号是使用浓度为2.5μg/ml或5μg/ml的捕捉抗体与浓度为5μg/ml的检测抗体在测试的条件下进行检测的。
在室温下温育1小时后，洗涤板，用50μl稀释为1∶5000(v/v)的偶合于辣根过氧化物酶(HRP)的二抗(即，绵羊抗鸡IgG)温育，洗涤，用TMB温育30分钟，并确定在450-620nm的吸光度(y轴)。数据显示使用该抗体组合在不存在添加的抗原时，具有显著的背景交叉反应性。最优的信号是使用浓度为2.5μg/ml或5μg/ml的捕捉抗体与浓度为5μg/ml的检测抗体在测试的条件下进行检测的。
[0239] 图54是显示使用抗体Ch27作为捕捉抗体而抗体Mo1025F作为检测抗体，以及偶合于HRP的二抗测定低浓度重组结核分枝杆菌核糖体蛋白S9的夹心ELISA结果的图示。将ELISA板用捕捉抗体Ch27以5μg/ml的浓度包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体之后，将重组S9蛋白从150ng/ml的起始浓度1∶2(v/v)系列稀释至18.31pg/ml，并将50μl每个稀释的等分试样添加至经抗体包被的ELISA板的孔(x轴)。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将检测抗体Mo1025F以2.5μg/ml的浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温下温育1小时后，洗涤板，用50μl稀释为1∶5000(v/v)的偶合于辣根过氧化物酶(HRP)的二抗(即，驴抗小鼠IgG)温育，洗涤，用TMB温育30分钟，并确定在450-620nm的吸光度(y轴)。数据显示该抗体组合并无背景信号，在测试的条件下对于结核分枝杆菌核糖体蛋白S9，检出限为996pg/ml，而半最大值检测为约28ng/ml。误差棒显示平均值的一个标准偏差(n＝3)。
[0240] 图55是显示使用抗体Ch27作为捕捉抗体而抗体Mo1025F作为检测抗体，以及生物素化的二抗测定低浓度的重组结核分枝杆菌核糖体蛋白S9的夹心ELISA结果的图示。ELISA基本上如图32的图例所述进行，只不过重组S9蛋白以20ng/ml的起始浓度1∶2(v/v)系列稀释至4.77pg/ml(x轴)；与二抗的温育为用生物素化的驴抗小鼠IgG进行一小时，然后用稀释为1∶5000(v/v)的修饰的链霉抗生物素蛋白-HRP偶合物(poly-40)温育；
然后通过洗涤板，用TMB温育10分钟，并在450-620nm测定吸光度(y轴)来检测结合的抗体-抗原-抗体复合物。数据显示使用生物素化的二抗具有低背景信号，对于结核分枝杆菌核糖体蛋白S9，检出限为约150pg/ml，而半最大值检验为约6ng/ml。误差棒显示平均值的一个标准偏差(n＝3)。
然后通过洗涤板，用TMB温育10分钟，并在450-620nm测定吸光度(y轴)来检测结合的抗体-抗原-抗体复合物。数据显示使用生物素化的二抗具有低背景信号，对于结核分枝杆菌核糖体蛋白S9，检出限为约150pg/ml，而半最大值检验为约6ng/ml。误差棒显示平均值的一个标准偏差(n＝3)。
[0241] 图56是显示使用抗体Ch27作为捕捉抗体而抗体Mo1025F作为检测抗体，生物素化的二抗以及反复的(iterative)抗原结合(本文中也称作“替代扩增”)测定低浓度的重组结核分枝杆菌核糖体蛋白S9的夹心ELISA结果的图示。ELISA基本上如图33的图例所述进行，只不过重组S9蛋白以1.0μg/ml的起始浓度1∶2(v/v)系列稀释至0.238fg/ml(x轴)；且抗原结合重复5此，即，将封闭缓冲液中的抗原等分试样与固定的捕捉抗体温育1小时，去除，添加另一个等分试样，并重复该过程直至添加了5次等分试样。在450-620nm处的吸光度标于y轴。数据显示使用生物素化的二抗与反复的抗原结合具有低背景信号，对于结核分枝杆菌核糖体蛋白S9，检出限为约84pg/ml。误差棒显示平均值的一个标准偏差(n＝3)。
[0242] 图57是显示针对结核分枝杆菌核糖体蛋白S9的抗体与大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或铜绿假单胞菌缺乏显著交叉反应性的夹心ELISA结果的图示。测定条件基本上如图33图例中所述，只不过用如标于x轴的500ng/ml或50μg/ml的细胞提取物替代纯化的重组S9蛋白。作为阳性对照，使用来自结核分枝杆菌实验室菌株H37Rv的细胞提取物。作为每个测定法的阳性对照，使用不含细胞提取物的缓冲液。数据显示在450-620nm吸光度的变化，即对于每个样品减去背景吸光度之后的值。误差棒显示平均值的一个标准偏差(n＝3)。
[0243] 图58是显示在临床结核分枝杆菌分离株CSU93中检测结核分枝杆菌核糖体蛋白S9的夹心ELISA结果，以及血浆中缺乏信号抑制的图示。测定条件基本上如图58图例所述，只不过细胞提取物为来自结核分枝杆菌实验室菌株H37Rv和CSU93，如标示于x轴。为了确定血浆造成的信号抑制，将在所标示浓度的细胞提取物用血浆稀释，如标示于x轴。作为每个测定法的阴性对照，使用不含细胞提取物的缓冲液或血浆。在y轴显示在450-620nm吸光度的变化，即对于每个样品减去背景吸光度之后的值。误差棒显示平均值的一个标准偏差(n＝3)。数据显示血浆并不在该测定法中抑制信号，且该测定法能够检测结核分枝杆菌的临床和实验室分离株两者。
[0244] 图59是显示供检测结核分枝杆菌S9蛋白的标准和扩增的夹心ELISA的标准曲线的图示。标准曲线是使用供检测缓冲液中的S9而优化的ELISA条件如实施例所述生成的。重组S9蛋白的浓度(log pg/ml)标于X轴，即，以对数尺度，而平均OD标于Y轴。使用捕捉抗体(5μg/mL Ch27)和检测抗体(对于标准ELISA，2μg/mL Mo1025F，而对于扩增的ELISA，2μg/mL生物素化的Mo1025F(即“Mo1025F-bio”))。数据就平均OD+SD(n＝2或3)针对rS9的log pg/mL作为X-Y图进行作图，并使用曲线拟合以确定该测定法的LOD(#733标准和扩增的ELISA，LOD分别＝552和89pg/mL)。
[0245] 图60是显示S9蛋白在结核分枝杆菌的一个实验室菌株(H37Rv)和两个临床菌株(CSU93和HN878)中的表达(相对于总细胞蛋白)的图示，其通过夹心ELISA确定。将来自结核分枝杆菌菌株H37Rv(左边)、结核分枝杆菌菌株CSU93(中间)和HN878(右边)的全细胞裂解液(WCL)通过夹心ELISA来进行分析。内源蛋白的浓度通过从标准曲线内插并就添加水平进行校正来进行计算。数据从重复实验中获得，其中每个样品重复两次进行分析。将内源蛋白的水平(表示为pg/μg总细胞蛋白)对于三个培养菌株中的每一个就平均值±SD进行作图。结核分枝杆菌菌株承蒙厚意由Calorado State University提供。
[0246] 图61是显示S9蛋白在结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌中的表达(相对于总细胞蛋白)的图示，其通过夹心ELISA确定。将来自结核分枝杆菌菌株H37Rv(左边)、和来自鸟分枝杆菌(中间)和胞内分枝杆菌(右边)的全细胞裂解液(WCL)在两个独立实验中重复两次进行测定。内源蛋白的浓度通过从标准曲线内插并就稀释因子进行校正来进行计算。将表示为pg/μg总细胞蛋白的内源蛋白的水平对于三个测试菌株中的每一个就平均值±SD进行作图。
[0247] 图62是显示从根据其TB涂片测试结果、TB培养测试结果和HIV状态分类的患者获得的临床痰中S9蛋白的表达的图示。痰是从4个TB阳性和TB阴性受试者中的每一个收集并如实施例中所述(方法3：9.0mL痰-C1，4x150μL替代扩增ELISA)处理的。简言之，将样品进行大小分级以去除小于100kDa分子量的污染物，用50mM Tris、pH 7.8、5mM MgCl2平衡，浓缩并以4x150μL等分试样通过替代扩增ELISA进行分析。附图左侧系列的直方图显示校准标样中存在的S9蛋白进行ELISA测定法的平均OD值，所述标样包括结核分枝杆菌菌株H37Rv全细胞裂解液的下述系列稀释：60μg/ml，柱1；20μg/ml，柱2；6.67μg/ml，柱3；2.22μg/ml，柱4；0.74μg/ml，柱5；0.25μg/ml，柱6；0.08μg/ml，柱7；0μg/ml，柱8。
附图左侧的系列直方图显示如实施例中所述制备的患者样品中存在的S9蛋白进行ELISA测定法所得的平均OD值。“MPC”表明样品的识别码；“涂片”表明涂片测试结果；“培养”表明培养测试结果；而“HIV”表明HIV状态。空心柱表明涂片阴性/培养测试阴性样品。实心柱表明涂片阳性/培养阳性样品。数据显示在涂片阳性/培养阳性样品中，S9蛋白交叉反应性的水平显著更高。
附图左侧的系列直方图显示如实施例中所述制备的患者样品中存在的S9蛋白进行ELISA测定法所得的平均OD值。“MPC”表明样品的识别码；“涂片”表明涂片测试结果；“培养”表明培养测试结果；而“HIV”表明HIV状态。空心柱表明涂片阴性/培养测试阴性样品。实心柱表明涂片阳性/培养阳性样品。数据显示在涂片阳性/培养阳性样品中，S9蛋白交叉反应性的水平显著更高。
[0248] 图63是显示从根据其TB涂片测试结果、TB培养测试结果和HIV状态分类的患者获得的临床痰中的表达的图示，表示为pg S9蛋白/ml样品体积。将示于图40的数据基于其中的S9蛋白校准值转换为pg抗原，这使得将结核分枝杆菌H37Rv的全细胞提取物的μg/ml S9蛋白内插为pg/mL rS9蛋白成为可能。“MPC”表明样品的识别码；“涂片”表明涂片测试结果；“培养”表明培养测试结果；而“HIV”表明HIV状态。空心柱表明涂片阴性/培养测试阴性样品。实心柱表明涂片阳性/培养阳性样品。数据显示在涂片阳性/培养阳性样品中，无论受试者的HIV状态，S9蛋白交叉反应性的水平显著更高。测定法的LOD＝～55pg/mL。
[0249] 图64是显示从根据其TB涂片测试结果、TB培养测试结果和HIV状态分类的患者获得的临床痰中S9蛋白的表达的图示。痰是从4个TB阳性和TB阴性受试者中的每一个收集并如实施例中所述(方法2：1.8mL痰-C1，17x150μL替代扩增ELISA)处理的。简言之，使用丙酮沉淀样品，将其重新溶解并作为17x150μL等分试样通过替代扩增ELISA进行分析。附图左侧系列的直方图显示校准标样中存在的S9蛋白进行ELISA测定法的平均OD值，所述标样包括结核分枝杆菌菌株H37Rv全细胞裂解液的下述系列稀释：90μg/ml，柱1；45μg/ml，柱2；22.50μg/ml，柱3；11.25μg/ml，柱4；5.63μg/ml，柱5；2.81μg/ml，柱6；
1.41μg/ml，柱7；0μg/ml，柱8。附图左侧的系列直方图显示如实施例中所述制备的患者样品中存在的S9蛋白进行ELISA测定法所得的平均OD值。“MPC”表明样品的识别码；“涂片”表明涂片测试结果；“培养”表明培养测试结果；而“HIV”表明HIV状态。空心柱表明涂片阴性/培养测试阴性样品。实心柱表明涂片阳性/培养阳性样品。
1.41μg/ml，柱7；0μg/ml，柱8。附图左侧的系列直方图显示如实施例中所述制备的患者样品中存在的S9蛋白进行ELISA测定法所得的平均OD值。“MPC”表明样品的识别码；“涂片”表明涂片测试结果；“培养”表明培养测试结果；而“HIV”表明HIV状态。空心柱表明涂片阴性/培养测试阴性样品。实心柱表明涂片阳性/培养阳性样品。
[0250] 图65是显示从根据其TB涂片测试结果、TB培养测试结果和HIV状态分类的患者获得的临床痰中的表达的图示，表示为pg S9蛋白/ml样品体积。将示于图42的数据基于其中的S9蛋白校准值转换为pg抗原，这使得将结核分枝杆菌H37Rv的全细胞提取物的μg/ml S9蛋白内插为pg/mL rS9蛋白成为可能。“MPC”表明样品的识别码；“涂片”表明涂片测试结果；“培养”表明培养测试结果；而“HIV”表明HIV状态。空心柱表明涂片阴性/培养测试阴性样品。实心柱表明涂片阳性/培养阳性样品。测定法的LOD＝～100pg/mL。
[0251] 图66是显示从根据其TB涂片测试结果、TB培养测试结果和HIV状态分类的患者获得的临床痰中S9蛋白的表达的图示。痰是从4个TB阳性和TB阴性受试者中的每一个收集并如实施例中所述(方法3：9.0mL痰-C1，4x150μL替代扩增ELISA)处理的。简言之，将样品进行大小分级以去除小于100kDa分子量的污染物，用50mM Tris、pH 7.8、5mM MgCl2平衡，浓缩并以4x150μL等分试样通过替代扩增ELISA进行分析。附图左侧系列的直方图显示校准标样中存在的S9蛋白进行ELISA测定法的平均OD值，所述标样包括结核分枝杆菌菌株H37Rv全细胞裂解液的下述系列稀释：60μg/ml，柱1；20μg/ml，柱2；6.67μg/ml，柱3；2.22μg/ml，柱4；0.74μg/ml，柱5；0.25μg/ml，柱6；0.08μg/ml，柱7；0μg/ml，柱8。
附图左侧的系列直方图显示如实施例中所述制备的患者样品中存在的S9蛋白进行ELISA测定法所得的平均OD值。“MPC”表明样品的识别码；“涂片”表明涂片测试结果；“培养”表明培养测试结果；而“HIV”表明HIV状态。空心柱表明涂片阴性/培养测试阴性样品。实心柱表明涂片阳性/培养阳性样品。数据显示在涂片阳性/培养阳性样品中，S9蛋白交叉反应性的水平显著更高。
附图左侧的系列直方图显示如实施例中所述制备的患者样品中存在的S9蛋白进行ELISA测定法所得的平均OD值。“MPC”表明样品的识别码；“涂片”表明涂片测试结果；“培养”表明培养测试结果；而“HIV”表明HIV状态。空心柱表明涂片阴性/培养测试阴性样品。实心柱表明涂片阳性/培养阳性样品。数据显示在涂片阳性/培养阳性样品中，S9蛋白交叉反应性的水平显著更高。
[0252] 图67是显示从根据其TB涂片测试结果、TB培养测试结果和HIV状态分类的患者获得的临床痰中的表达的图示，表示为pg S9蛋白/ml样品体积。将示于图44的数据基于其中的S9蛋白校准值转换为pg抗原，这使得将结核分枝杆菌H37Rv的全细胞提取物的μg/ml S9蛋白内插为pg/mL rS9蛋白成为可能。“MPC”表明样品的识别码；“涂片”表明涂片测试结果；“培养”表明培养测试结果；而“HIV”表明HIV状态。空心柱表明涂片阴性/培养测试阴性样品。实心柱表明涂片阳性/培养阳性样品。数据显示在涂片阳性/培养阳性样品中，无论受试者的HIV状态，S9蛋白交叉反应性的水平显著更高。测定法的LOD＝～55pg/mL。
[0253] 图68是显示在鸡中针对SEQ ID NO：6制备的多克隆抗体的滴定的图示。将重组蛋白Rv1265/MT1303(SEQ ID NO：21)以5μg/ml的浓度固定于ELISA板上。将标于x轴上的命名为“粉红10”(■)和“粉红11”(×)的抗血清稀释液和标于x轴上的来自相同动物的免疫前血清稀释液(对于粉红10，◆；对于粉红11，▲)与固定的重组蛋白Rv1265/MT1303在足以形成抗原：抗体复合物的条件下接触一段时间。洗涤ELISA板，并通过结合稀释为1∶5000(v/v)的绵羊抗鸡IgG辣根过氧化物酶(HRP)偶合物使用TMB来检测结合的HRP活性。对每个样品确定吸光度(OD)(y轴)。数据表明对于粉红10，抗体效价为至少约1∶64000，而对于粉红11，抗体效价至少为约1∶128000。
[0254] 图69是显示在兔中针对SEQ ID NO：26制备的多克隆抗体的滴定的图示。将链霉抗生物素蛋白以5μg/ml浓度固定于ELISA板上。将偶合于由SEQID NO：26所示的序列组成的肽的生物素(3μg/ml)与所述板在足以将所述肽通过生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用固定的条件下接触一段时间。在足以形成抗原-抗体复合物的条件下添加一段时间的兔抗血清或免疫前血清的稀释液，然后如图46图例所述检测结合的抗体，只不过二抗为绵羊抗兔IgGHRP偶合物。兔血清命名为RCP25(对于免疫前血清，■；对于免疫血清，◆)和RCP26(对于免疫前血清，×；对于免疫血清，▲)。血清稀释程度标于x轴。吸光度(OD)标于y轴。数据表明对于两种制备物，抗体效价为至少约1∶64000(v/v)。
[0255] 图70是显示纯化的兔抗蛋白Rv1265/MT1303抗体制备物检出限的图示。将包含SEQ ID NO：21所述的序列的重组Rv1265/MT1303蛋白基本上如图47的图例所述结合于ELISA板，只不过蛋白浓度从19.6ng/ml变为200pg/ml(x轴)。然后将纯化的兔抗体以1.25μg/ml、2.5μg/ml或5μg/ml的浓度结合于重组蛋白，并使用偶合于HRP的绵羊抗兔IgG如图47的图例所述进行检测。数据表明所述兔抗体的检出限在所有测试的浓度约为
2.5ng/ml。
2.5ng/ml。
[0256] 图71是使用针对全长重组结核分枝杆菌RV1265蛋白(SEQ ID NO：21)制备的命名为Ch10(＝本文中提及的抗体“粉红10”)和Ch11(＝本文中提及的抗体“粉红11”)的多克隆抗体的Ch10/11汇集和命名为Mo788C的单克隆抗体进行的标准夹心ELISA的图示。该图显示以不同排列(即，作为捕捉和检测抗体)在夹心ELISA中使用这两个抗体的作用。
用50μl 5μg/ml浓度的Ch10/11或Mo788C抗体将ELISA板的孔包被过夜。在封闭并洗涤去除未结合的抗体之后，将重组Rv1265蛋白从500ng/ml起始浓度1∶3(v/v)系列稀释为22.86pg/ml，并将每个稀释的50μl等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中(x轴)。
在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将交叉使用的检测抗体(即，用Ch10/11检测Rv1265-Mo788C复合物和用Mo788C检测Rv1265-Ch10/11复合物)以2μg/ml的浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，用50μl 1∶5000(v/v)稀释的偶合于辣根过氧化物酶(HRP)的二抗(即，对于检测Ch10/11，绵羊抗鸡IgG，或对于检测Mo788C，绵羊抗小鼠IgG)温育，洗涤，用TMB温育30分钟，并在减去背景之后确定
450-620nm处的吸光度(y轴)。虽不欲限定本发明，但数据表明当在夹心ELISA中使用单克隆抗体Mo788C作为捕捉抗体并用多克隆抗体汇集Ch10/11作为检测试剂时，观察到较低的背景作用。
用50μl 5μg/ml浓度的Ch10/11或Mo788C抗体将ELISA板的孔包被过夜。在封闭并洗涤去除未结合的抗体之后，将重组Rv1265蛋白从500ng/ml起始浓度1∶3(v/v)系列稀释为22.86pg/ml，并将每个稀释的50μl等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中(x轴)。
在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将交叉使用的检测抗体(即，用Ch10/11检测Rv1265-Mo788C复合物和用Mo788C检测Rv1265-Ch10/11复合物)以2μg/ml的浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，用50μl 1∶5000(v/v)稀释的偶合于辣根过氧化物酶(HRP)的二抗(即，对于检测Ch10/11，绵羊抗鸡IgG，或对于检测Mo788C，绵羊抗小鼠IgG)温育，洗涤，用TMB温育30分钟，并在减去背景之后确定
450-620nm处的吸光度(y轴)。虽不欲限定本发明，但数据表明当在夹心ELISA中使用单克隆抗体Mo788C作为捕捉抗体并用多克隆抗体汇集Ch10/11作为检测试剂时，观察到较低的背景作用。
[0257] 图72是将扩增的夹心ELISA与标准夹心ELISA就检测重组结核分枝杆菌RV1265蛋白作比较的图示。将ELISA板用浓度为5μg/ml的捕捉抗体Mo788C包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体之后，将重组Rv1265蛋白从约10μg/ml起始浓度1∶10(v/v)系列稀释至约1.0pg/ml，并将每个稀释的50μl等分试样添加至经抗体包被的ELISA板的孔中(x轴)。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将抗体Ch10/11以2.0μg/ml的浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，并与50μl 1∶5000(v/v)稀释的由HRP偶合的绵羊抗鸡IgG(标准夹心ELISA)或50μl 1∶50000(v/v)稀释的生物素化的驴抗鸡IgG(扩增的夹心ELISA)组成的二抗温育。在室温再温育1小时之后，如前所述洗涤板。对于进行扩增ELISA的样品，然后将HRP-链霉抗生物素蛋白添加至板，并在室温再温育1小时，并如前所述洗涤板。最后，将所有样品用TMB温育5分钟。在450-620nm确定吸光度(y轴)。数据表明在这样的条件下使用扩增的夹心ELISA显著地增强检测：该扩增的夹心ELISA的检出限为约60pg/ml Rv1265蛋白，而半最大值检测为约5ng/ml Rv1265蛋白。这与标准夹心ELISA的检出限(约2.6ng/ml Rv1265蛋白)和半最大值检测(约
100ng/ml Rv1265蛋白)相比是有利的。
100ng/ml Rv1265蛋白)相比是有利的。
[0258] 图73是显示在临床结核分枝杆菌分离株CSU93和HN878，以及在实验室菌株H37Rv的全细胞提取物中检测结核分枝杆菌Rv1265蛋白的夹心ELISA结果的图示。扩增的夹心ELISA条件基本上如图50的图例所述，只不过下述方面有所不同：(i)细胞提取物如x轴所示进行测定；(ii)向全细胞提取物掺入重组Rv1265蛋白至终浓度为50、16.7、5.6和1.8μg总细胞蛋白/ml；和(iii)内源Rv1265蛋白的浓度通过从Rv1265浓度相对信号强度的标准曲线内插来确定，并就样品中掺入的重组Rv1265蛋白的水平进行校正(例如，就稀释因子进行校正)。数据表示为对于两个单独实验的每微克细胞提取物总蛋白的内源Rv1265蛋白的皮克数(y轴)。还标出了平均蛋白水平。
[0259] 图74是显示针对结核分枝杆菌Rv1265蛋白的抗体与来自酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或铜绿假单胞菌的全细胞裂解液缺乏显著的交叉反应性的夹心ELISA结果的图示。测定条件基本上如图51图例中所述，只不过测定的是0-20ng/ml纯化的重组Rv1265蛋白或100ng/ml或100μg/ml细胞提取物，如标于x轴。不含蛋白或细胞提取物的缓冲液用作阴性对照。数据显示在450-620nm的吸光度的变化，即，在对于每个样品减去背景吸光度之后。
[0260] 图75是显示未稀释的血浆对在前述图5中所述的扩增的夹心ELISA测定法中检测重组Rv1265蛋白的淬灭作用，以及通过稀释痰恢复丧失的信号的图示。将ELISA板用捕捉抗体Mo788C以5μg/ml浓度包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体之后，以标于图例的浓度将重组Rv1265蛋白掺入未稀释的封闭溶液(“封闭”或“封闭液”)，未稀释的血浆(“纯粹的血浆”)，或用封闭溶液以从1∶1(v/v)封闭液∶血浆至8∶1(v/v)封闭液∶血浆的范围的稀释的血浆，并将50μl每个样品等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中(x轴)。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将抗体Ch10/11以2.0μg/ml的浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，并与50μl1∶50000(v/v)稀释的由生物素化的驴抗鸡IgG组成的二抗温育。在室温再温育1小时后，如前所述洗涤板。然后将HRP80-链霉抗生物素蛋白(扩增ELISA)添加至板，将其在室温再温育1小时，如前所述洗涤，并最后用TMB温育30分钟。在450-620nm确定吸光度(y轴)。数据显示血浆对信号具有30％的减弱/抑制。
[0261] 图76是显示未稀释的痰对在前述图5中所述的扩增的夹心ELISA测定法中检测重组Rv1265蛋白的淬灭作用，以及通过稀释痰恢复丧失的信号的图示。将ELISA板用捕捉抗体Mo788C以5μg/ml浓度包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体之后，以标于图例的浓度将重组Rv1265蛋白掺入未稀释的封闭溶液(“封闭”或“封闭液”)，未稀释的痰(“纯粹的痰”)，或用封闭溶液以从1∶1(v/v)封闭液∶痰至8∶1(v/v)封闭液∶痰的范围稀释的痰，并将50μl每个样品的等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中(x轴)。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将抗体Ch10/11以2.0μg/ml的浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，并与50μl 1∶50000(v/v)稀释的由生物素化的驴抗鸡IgG组成的二抗温育。在室温再温育1小时后，如前所述洗涤板。然后将HRP80-链霉抗生物素蛋白(扩增ELISA)添加至板，将其在室温再温育1小时，如前所述洗涤，并最后用TMB温育30分钟。在450-620nm确定吸光度(y轴)。数据显示痰对信号无显著的减弱/抑制。
[0262] 图77是显示结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌中Rv1265蛋白表达(相对于总细胞蛋白)的图示，其通过夹心ELISA确定。在两个独立实验中重复两次测定来自结核分枝杆菌H35Rv(左边)，和鸟分枝杆菌(中间)和胞内分枝杆菌(右边)的全细胞裂解液。内源蛋白的浓度通过从标准曲线内插来计算，并就稀释因子加以校正。表示为pg/μg总细胞蛋白的内源蛋白水平对于三个测试的分枝杆菌中的每一个就平均值±SD进行作图。
[0263] 图78是显示从结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌的全细胞裂解液获得的滤过物中Rv1265蛋白的表达的图示，其通过夹心ELISA确定。将从结核分枝杆菌H35Rv(左边)、鸟分枝杆菌(中间)和胞内分枝杆菌(右边)全细胞裂解液获得的滤过物重复进行两次测定。内源蛋白的浓度通过从标准曲线内插来计算，并就稀释因子(如果存在)加以校正。表示为pg/μL滤过物的内源蛋白水平对于三个分枝杆菌中的每一个就平均值±SD进行作图。
[0264] 图79是显示从根据其TB涂片测试结果、TB培养测试结果和HIV状态分类的患者获得的临床痰中Rv1265蛋白的表达的图示。痰是从4个TB阳性和TB阴性受试者中的每一个收集并如实施例中所述(方法1：2.5mL痰-M1，17x150μL替代扩增ELISA)处理的。附图左侧系列的直方图显示校准标样中存在的Rv1265蛋白进行ELISA测定法的平均OD值，所述标样包括结核分枝杆菌菌株H37Rv全细胞裂解液的下述系列稀释：20μg/ml，柱1；10μg/ml，柱2；5μg/ml，柱3；2.5μg/ml，柱4；1.25μg/ml，柱5；0.625μg/ml，柱6；
0.313μg/ml，柱7；0.156μg/ml，柱8；0.078μg/ml，柱9；0.039μg/ml，柱10；0.02μg/ml，柱11；0.01μg/ml，柱12；0.005μg/ml，柱13；0.002μg/ml，柱14；0.001μg/ml，柱
15；0μg/ml，柱16。附图右侧的系列直方图显示如实施例中所述制备的患者样品中存在的Rv1265蛋白进行ELISA测定法所得的平均OD值。“MPC”表明样品的识别码；“涂片”表明涂片测试结果；“培养”表明培养测试结果；而“HIV”表明HIV状态。空心柱表明涂片阴性/培养测试阴性样品。实心柱表明涂片阳性/培养阳性样品。数据显示在涂片阳性/培养阳性样品中，Rv1265蛋白交叉反应性的水平显著更高。
0.313μg/ml，柱7；0.156μg/ml，柱8；0.078μg/ml，柱9；0.039μg/ml，柱10；0.02μg/ml，柱11；0.01μg/ml，柱12；0.005μg/ml，柱13；0.002μg/ml，柱14；0.001μg/ml，柱
15；0μg/ml，柱16。附图右侧的系列直方图显示如实施例中所述制备的患者样品中存在的Rv1265蛋白进行ELISA测定法所得的平均OD值。“MPC”表明样品的识别码；“涂片”表明涂片测试结果；“培养”表明培养测试结果；而“HIV”表明HIV状态。空心柱表明涂片阴性/培养测试阴性样品。实心柱表明涂片阳性/培养阳性样品。数据显示在涂片阳性/培养阳性样品中，Rv1265蛋白交叉反应性的水平显著更高。
[0265] 图80是显示从根据其TB涂片测试结果、TB培养测试结果和HIV状态分类的患者获得的临床痰中的表达的图示，表示为pg Rv1265蛋白/ml样品体积。将示于图57的数据基于其中的Rv1265蛋白校准值转换为pg抗原，这使得将结核分枝杆菌H37Rv的全细胞提取物的μg/ml Rv1265蛋白内插为pg/mL rRv1265蛋白成为可能。“MPC”表明样品的识别码；“涂片”表明涂片测试结果；“培养”表明培养测试结果；而“HIV”表明HIV状态。空心柱表明涂片阴性/培养测试阴性样品。实心柱表明涂片阳性/培养阳性样品。数据显示在涂片阳性/培养阳性样品中，无论受试者的HIV状态，Rv1265蛋白交叉反应性的水平显著更高。测定法的LOD＝～11.2pg/mL。
[0266] 图81是显示从根据其TB涂片测试结果、TB培养测试结果和HIV状态分类的患者获得的临床痰中Rv1265蛋白的表达的图示。痰是从4个TB阳性和TB阴性受试者中的每一个收集并如实施例中所述(方法2：1.8mL痰-C1，4x150μL替代扩增ELISA)处理的。简言之，使用丙酮沉淀样品，将其重新溶解并以4x150μL等分试样通过替代扩增ELISA进行分析。附图左侧系列的直方图显示校准标样中存在的Rv1265蛋白进行ELISA测定法的平均OD值，所述标样包括结核分枝杆菌菌株H37Rv全细胞裂解液的下述系列稀释：90μg/ml，柱1；45μg/ml，柱2；22.50μg/ml，柱3；11.25μg/ml，柱4；5.63μg/ml，柱5；2.81μg/ml，柱
6；1.41μg/ml，柱7；0μg/ml，柱8。附图右侧的系列直方图显示如实施例中所述制备的患者样品中存在的Rv1265蛋白进行ELISA测定法所得的平均OD值。“MPC”表明样品的识别码；“涂片”表明涂片测试结果；“培养”表明培养测试结果；而“HIV”表明HIV状态。空心柱表明涂片阴性/培养测试阴性样品。实心柱表明涂片阳性/培养阳性样品。
6；1.41μg/ml，柱7；0μg/ml，柱8。附图右侧的系列直方图显示如实施例中所述制备的患者样品中存在的Rv1265蛋白进行ELISA测定法所得的平均OD值。“MPC”表明样品的识别码；“涂片”表明涂片测试结果；“培养”表明培养测试结果；而“HIV”表明HIV状态。空心柱表明涂片阴性/培养测试阴性样品。实心柱表明涂片阳性/培养阳性样品。
[0267] 图82是显示从根据其TB涂片测试结果、TB培养测试结果和HIV状态分类的患者获得的临床痰中的表达的图示，表示为pg Rv1265蛋白/ml样品体积。将示于图59的数据基于其中的Rv1265蛋白校准值转换为pg抗原，这使得将结核分枝杆菌H37Rv的全细胞提取物的μg/ml Rv1265蛋白内插为pg/mL rRv1265蛋白成为可能。“MPC”表明样品的识别码；“涂片”表明涂片测试结果；“培养”表明培养测试结果；而“HIV”表明HIV状态。空心柱表明涂片阴性/培养测试阴性样品。实心柱表明涂片阳性/培养阳性样品。数据显示在涂片阳性/培养阳性样品中，无论受试者的HIV状态，Rv1265蛋白交叉反应性的水平显著更高。测定法的LOD＝～67pg/mL。
[0268] 图83是显示从根据其TB涂片测试结果、TB培养测试结果和HIV状态分类的患者获得的临床痰中Rv1265蛋白的表达的图示。痰是从4个TB阳性和TB阴性受试者中的每一个收集并如实施例中所述(方法3：9.0mL痰-C1，4x150μL替代扩增ELISA)处理的。简言之，将样品进行大小分级以去除小于100kDa分子量的污染物，用50mM Tris、pH 7.8、
5mM MgCl2平衡，浓缩并以4x150μL等分试样通过替代扩增ELISA进行分析。附图左侧系列的直方图显示校准标样中存在的Rv1265蛋白进行ELISA测定法的平均OD值，所述标样包括结核分枝杆菌菌株H37Rv全细胞裂解液的下述系列稀释：60μg/ml，柱1；20μg/ml，柱
2；6.67μg/ml，柱3；2.22μg/ml，柱4；0.74μg/ml，柱5；0.25μg/ml，柱6；0.08μg/ml，柱7；0μg/ml，柱8。附图右侧的系列直方图显示如实施例中所述制备的患者样品中存在的Rv1265蛋白进行ELISA测定法所得的平均OD值。“MPC”表明样品的识别码；“涂片”表明涂片测试结果；“培养”表明培养测试结果；而“HIV”表明HIV状态。空心柱表明涂片阴性/培养测试阴性样品。实心柱表明涂片阳性/培养阳性样品。
5mM MgCl2平衡，浓缩并以4x150μL等分试样通过替代扩增ELISA进行分析。附图左侧系列的直方图显示校准标样中存在的Rv1265蛋白进行ELISA测定法的平均OD值，所述标样包括结核分枝杆菌菌株H37Rv全细胞裂解液的下述系列稀释：60μg/ml，柱1；20μg/ml，柱
2；6.67μg/ml，柱3；2.22μg/ml，柱4；0.74μg/ml，柱5；0.25μg/ml，柱6；0.08μg/ml，柱7；0μg/ml，柱8。附图右侧的系列直方图显示如实施例中所述制备的患者样品中存在的Rv1265蛋白进行ELISA测定法所得的平均OD值。“MPC”表明样品的识别码；“涂片”表明涂片测试结果；“培养”表明培养测试结果；而“HIV”表明HIV状态。空心柱表明涂片阴性/培养测试阴性样品。实心柱表明涂片阳性/培养阳性样品。
[0269] 图84是显示从根据其TB涂片测试结果、TB培养测试结果和HIV状态分类的患者获得的临床痰中的表达的图示，表示为pg Rv1265蛋白/ml样品体积。将示于图61的数据基于其中的Rv1265蛋白校准值转换为pg抗原，这使得将结核分枝杆菌H37Rv的全细胞提取物的μg/ml Rv1265蛋白内插为pg/mL rRv1265蛋白成为可能。“MPC”表明样品的识别码；“涂片”表明涂片测试结果；“培养”表明培养测试结果；而“HIV”表明HIV状态。空心柱表明涂片阴性/培养测试阴性样品。实心柱表明涂片阳性/培养阳性样品。数据显示在涂片阳性/培养阳性样品中，无论受试者的HIV状态，Rv1265蛋白交叉反应性的水平显著更高。测定法的LOD＝～26pg/mL。
[0270] 图85是显示从根据其TB涂片测试结果、TB培养测试结果和HIV状态分类的患者获得的临床痰中Rv1265蛋白的表达的图示。痰是从4个TB阳性和TB阴性受试者中的每一个收集并如实施例中所述(方法4：18.0mL痰-M2，4x150μL替代扩增ELISA)处理的。简言之，将样品进行大小分级以去除小于100kDa分子量的污染物，用50mM Tris、pH 7.8、
5mM MgCl2平衡，浓缩并以4x150μL等分试样通过替代扩增ELISA进行分析。附图左侧系列的直方图显示校准标样中存在的Rv1265蛋白进行ELISA测定法的平均OD值，所述标样包括结核分枝杆菌菌株H37Rv全细胞裂解液的下述系列稀释：30μg/ml，柱1；10μg/ml，柱
2；3.33μg/ml，柱3；1.11μg/ml，柱4；0.37μg/ml，柱5；0.12μg/ml，柱6；0.04μg/ml，柱7；0μg/ml，柱8。附图右侧的系列直方图显示如实施例中所述制备的患者样品中存在的Rv1265蛋白进行ELISA测定法所得的平均OD值。“MPC”表明样品的识别码；“涂片”表明涂片测试结果；“培养”表明培养测试结果；而“HIV”表明HIV状态。空心柱表明涂片阴性/培养测试阴性样品。实心柱表明涂片阳性/培养阳性样品。
5mM MgCl2平衡，浓缩并以4x150μL等分试样通过替代扩增ELISA进行分析。附图左侧系列的直方图显示校准标样中存在的Rv1265蛋白进行ELISA测定法的平均OD值，所述标样包括结核分枝杆菌菌株H37Rv全细胞裂解液的下述系列稀释：30μg/ml，柱1；10μg/ml，柱
2；3.33μg/ml，柱3；1.11μg/ml，柱4；0.37μg/ml，柱5；0.12μg/ml，柱6；0.04μg/ml，柱7；0μg/ml，柱8。附图右侧的系列直方图显示如实施例中所述制备的患者样品中存在的Rv1265蛋白进行ELISA测定法所得的平均OD值。“MPC”表明样品的识别码；“涂片”表明涂片测试结果；“培养”表明培养测试结果；而“HIV”表明HIV状态。空心柱表明涂片阴性/培养测试阴性样品。实心柱表明涂片阳性/培养阳性样品。
[0271] 图86是显示从根据其TB涂片测试结果、TB培养测试结果和HIV状态分类的患者获得的临床痰中的表达的图示，表示为pg Rv1265蛋白/ml样品体积。将示于图63的数据基于其中的Rv1265蛋白校准值转换为pg抗原，这使得将结核分枝杆菌H37Rv的全细胞提取物的μg/ml Rv1265蛋白内插为pg/mL rRv1265蛋白成为可能。“MPC”表明样品的识别码；“涂片”表明涂片测试结果；“培养”表明培养测试结果；而“HIV”表明HIV状态。空心柱表明涂片阴性/培养测试阴性样品。实心柱表明涂片阳性/培养阳性样品。测定法的LOD＝～65pg/mL。
[0272] 图87是显示在来自罹患结核病的受试者或对照受试者的血清和血浆中检测抗EF-Tu抗体的图示。将重组EF-Tu以2μg/ml的浓度每孔50μl固定在ELISA板上。然后将用封闭缓冲液稀释100倍的血浆或血清样品与固定的蛋白在足以使得抗体：抗原复合物形成的条件下接触一段时间。洗涤ELISA板，然后通过结合稀释为1∶50000的绵羊抗人IgG辣根过氧化物酶(HRP)偶合物使用TMB检测结合的HRP活性来检测复合物。对每个样品确定吸光度(OD)(y轴)。黑柱形条表明来自罹患结核病的受试者的样品。灰柱形条表明来自对照受试者的样品。
[0273] 图88是显示针对融合于NUS的全长EF-Tu或针对SEQ ID NO：35的由浆细胞瘤产生的单克隆抗体的滴定的图示。将重组EF-Tu以17μg/ml的浓度固定于ELISA板上。将如标于x轴的命名为681E(◇)、683B(■)、682A(□)、685B(+)、684A(●)、524D(×)和521F(◆)的抗体稀释液与固定的重组EF-Tu在足以使得抗原：抗体复合物形成的条件下接触一段时间。洗涤ELISA板，然后通过结合稀释为1∶5000(v/v)的绵羊抗小鼠IgG辣根过氧化物酶(HRP)偶合物使用TMB检测结合的HRP活性来检测复合物。对每个样品确定吸光度(OD)(y轴)。
[0274] 图89是显示针对融合于NUS的全长EF-Tu或针对于SEQ ID NO：35的由浆细胞瘤产生的单克隆抗体的滴定的图示。将如标于x轴的重组EF-Tu的稀释液固定于ELISA板上。将命名为681E(◇)、683B(■)、682A(□)、680A(○)、685B(×)、684A(●)和521F(▲)的抗体以2.5μg/ml的浓度与固定的重组EF-Tu蛋白在足以使得抗原：抗体复合物形成的条件下接触一段时间。洗涤ELISA板，然后通过结合稀释为1∶5000(v/v)的绵羊抗小鼠IgG辣根过氧化物酶(HRP)偶合物使用TMB检测结合的HRP活性来检测复合物。对每个样品确定吸光度(OD)(y轴)。
[0275] 图90是显示使用鸡多克隆抗EF-Tu抗体作为捕捉抗体而单克隆抗体683B作为检测试剂使用夹心ELISA检测重组EF-Tu的图示。如该图图例所示使用每个抗体的多种浓度。将来自A280＝0.235的储液溶液的1∶2000至1∶2275328稀释的重组EF-Tu的滴定量
如标于X轴进行筛选。洗涤ELISA板，然后通过结合稀释为1∶5000(v/v)的绵羊抗小鼠IgG辣根过氧化物酶(HRP)偶合物使用TMB检测结合的HRP活性来检测复合物。对每个样品确定吸光度(OD)(y轴)。
如标于X轴进行筛选。洗涤ELISA板，然后通过结合稀释为1∶5000(v/v)的绵羊抗小鼠IgG辣根过氧化物酶(HRP)偶合物使用TMB检测结合的HRP活性来检测复合物。对每个样品确定吸光度(OD)(y轴)。
[0276] 图91是显示使用鸡多克隆抗EF-Tu抗体作为捕捉抗体而单克隆抗体683B(■)或524D(◆)或521F(▲)作为检测试剂使用夹心ELISA检测重组EF-Tu的图示。将多克隆抗体以5μg/ml的浓度固定于ELISA板上。将如标于x轴的滴定量的重组EF-Tu与固定的抗体在足以使得抗体：抗原复合物形成的条件下接触一段时间。然后将每个单克隆抗体以5μg/ml的浓度与所述固定的重组EF-Tu在足以使得抗体：抗原复合物形成的条件下接触一段时间。洗涤ELISA板，然后通过稀释为1∶5000(v/v)的绵羊抗小鼠IgG辣根过氧化物酶(HRP)偶合物使用TMB检测结合的HRP活性来检测复合物。对每个样品确定吸光度(OD)(y轴)。
[0277] 图92是显示使用来自鸡(hen)49(◆)或鸡50(■)的鸡多克隆抗EF-Tu抗体作为捕捉抗体和命名为683B的单克隆抗体使用夹心ELISA检测重组EF-Tu的图示。就命名而言，来自鸡49的多克隆抗体在本文中也命名为“Ch49”，而来自鸡50的多克隆抗体在本文中也命名为“Ch50”。将多克隆抗体以2.5μg/ml的浓度固定于ELISA板上。将如标于x轴的滴定量的重组EF-Tu与固定的抗体在足以使得抗体：抗原复合物形成的条件下接触一段时间。然后将单克隆抗体以2.5μg/ml的浓度与所述固定的重组EF-Tu在足以使得抗体：
抗原复合物形成的条件下接触一段时间。洗涤ELISA板，然后通过结合稀释为1∶5000(v/v)的绵羊抗小鼠IgG辣根过氧化物酶(HRP)偶合物使用TMB检测结合的HRP活性来检测复合物。对每个样品确定吸光度(OD)(y轴)。
抗原复合物形成的条件下接触一段时间。洗涤ELISA板，然后通过结合稀释为1∶5000(v/v)的绵羊抗小鼠IgG辣根过氧化物酶(HRP)偶合物使用TMB检测结合的HRP活性来检测复合物。对每个样品确定吸光度(OD)(y轴)。
[0278] 图93是将扩增的夹心ELISA与标准夹心ELISA就检测重组结核分枝杆菌EF-Tu蛋白作比较的图示。将ELISA板用浓度为2μg/ml的捕捉抗体Ch49包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体之后，将重组EF-Tu蛋白从100ng/ml的起始浓度稀释至约1.0pg/ml，并将每个稀释的50μl等分试样添加至经抗体包被的ELISA板的孔中(x轴)。在温育1小时之后，洗涤板去除未结合的抗原。对于标准和扩增ELISA，将单克隆抗体683B生物素化，然后将经生物素化的单克隆抗体(命名为“Mo683B-bi”)以2.0μg/ml的浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，并与50μl 1∶5000(v/v)稀释的由HRP偶合的绵羊抗小鼠IgG(标准夹心ELISA)或50μl 1∶2500(v/v)稀释的HRP80-链霉抗生物素蛋白(也称作“多聚80-HRP-链霉抗生物素蛋白”)组成的二抗温育。在室温再温育
1小时之后，如前所述洗涤板。最后，将所有样品用TMB温育30分钟(标准ELISA)或10分钟(扩增ELISA)。在450-620nm确定吸光度(y轴)。数据表明在这样的条件下使用扩增的夹心ELISA显著地增强检测：该扩增的夹心ELISA的检出限为约154pg/ml EF-Tu蛋白。
这与观察到的标准夹心ELISA的检出限(约2.172ng/ml EF-Tu蛋白)相比是有利的。
1小时之后，如前所述洗涤板。最后，将所有样品用TMB温育30分钟(标准ELISA)或10分钟(扩增ELISA)。在450-620nm确定吸光度(y轴)。数据表明在这样的条件下使用扩增的夹心ELISA显著地增强检测：该扩增的夹心ELISA的检出限为约154pg/ml EF-Tu蛋白。
这与观察到的标准夹心ELISA的检出限(约2.172ng/ml EF-Tu蛋白)相比是有利的。
[0279] 图94是显示在临床结核分枝杆菌分离株CSU93和HN878，以及在实验室菌株H37Rv的全细胞提取物中检测结核分枝杆菌EF-Tu蛋白的夹心ELISA结果的图示。扩增的夹心ELISA条件基本上如图73的图例所述，只不过下述方面有所不同：(i)细胞提取物如x轴所示进行测定；(ii)向全细胞提取物掺入重组EF-Tu蛋白至终浓度为50、16.7、5.6和
1.8μg/ml；和(iii)内源EF-Tu蛋白的浓度通过从EF-Tu浓度相对信号强度的标准曲线内插来确定，并就样品中掺入的重组EF-Tu蛋白的水平进行校正。数据表示为对于两个单独实验的每微克细胞提取物中的总蛋白的内源EF-Tu蛋白的皮克数(y轴)。还标出了平均蛋白水平。
1.8μg/ml；和(iii)内源EF-Tu蛋白的浓度通过从EF-Tu浓度相对信号强度的标准曲线内插来确定，并就样品中掺入的重组EF-Tu蛋白的水平进行校正。数据表示为对于两个单独实验的每微克细胞提取物中的总蛋白的内源EF-Tu蛋白的皮克数(y轴)。还标出了平均蛋白水平。
[0280] 图95是显示针对结核分枝杆菌EF-Tu蛋白的抗体与来自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或铜绿假单胞菌的全细胞裂解液缺乏显著的交叉反应性的夹心ELISA结果的图示。测定条件基本上如图74图例中所述。作为标样，还制备了从39.1pg/ml至2.5μg/ml范围的纯化的重组EF-Tu蛋白的系列稀释液以供与细胞提取物的信号强度进行比较，如标于x轴。还使用由封闭缓冲液组成的阴性对照，如标于x轴的“空白”。数据显示结核分枝杆菌与来自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或铜绿假单胞菌的全细胞裂解液之间的低交叉反应性或无交叉反应性。
[0281] 图96是显示未稀释的痰对在前述图7中所述的扩增的夹心ELISA测定法中检测重组EF-Tu蛋白的淬灭作用，以及通过稀释痰恢复丧失的信号的图示。将ELISA板用捕捉抗体Ch49以2.0μg/ml浓度包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体之后，以3.3ng/ml的浓度将重组EF-Tu蛋白掺入未稀释的封闭溶液(“封闭液”)，未稀释的痰(“痰”)，或用封闭溶液以从1∶1(v/v)封闭液∶痰至8∶1(v/v)封闭液∶痰的范围稀释的痰，如标于x轴。然后将50μl每个样品等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中(x轴)。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将生物素化的单克隆抗体Mo683B-bi以2.0μg/ml的浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，并与50μl1∶2500(v/v)稀释的HRP80-链霉抗生物素蛋白(也称作“多聚80-HRP-链霉抗生物素蛋白”)温育，温育并然后如前所述进行洗涤，最后用TMB温育10分钟。在450-620nm确定吸光度(y轴)。数据显示未稀释的痰对信号有淬灭作用，然而通过稀释痰实现了显著的信号恢复，即超过
70％的信号恢复。
70％的信号恢复。
[0282] 图97是显示未稀释的血浆对在前述图7中所述的扩增的夹心ELISA测定法中检测重组EF-Tu蛋白的淬灭作用，以及通过稀释血浆恢复丧失的信号的图示。将ELISA板用捕捉抗体Ch49以2.0μg/ml浓度包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体之后，以3.3ng/ml的浓度将重组EF-Tu蛋白掺入未稀释的封闭溶液(“封闭液”)，未稀释的血浆(“血浆”)，或用封闭溶液以从1∶1(v/v)封闭液∶血浆至8∶1(v/v)封闭液∶血浆的范围稀释的血浆，如标于x轴。然后将50μl每个样品等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中(x轴)。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将生物素化的单克隆抗体Mo683B-bi以2.0μg/ml的浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，并与50μl1∶2500(v/v)稀释的HRP80-链霉抗生物素蛋白(也称作“多聚80-HRP-链霉抗生物素蛋白”)温育，温育并然后如前所述进行洗涤，最后用TMB温育10分钟。在450-620nm确定吸光度(y轴)。数据显示未稀释的血浆对信号有淬灭作用，然而通过稀释血浆实现了显著的信号恢复，即超过70％的信号恢复。
[0283] 图98是显示结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌中EF-Tu蛋白表达(相对于总细胞蛋白)的图示，其通过夹心ELISA确定。在两个独立实验中重复两次测定来自结核分枝杆菌H35Rv(左边)，和鸟分枝杆菌(中间)和胞内分枝杆菌(右边)的全细胞裂解液。内源蛋白的浓度通过从标准曲线内插来计算，并就稀释因子加以校正。表示为pg/μg总细胞蛋白的内源蛋白水平对于三个测试的分枝杆菌中的每一个就平均值±SD进行作图。
[0284] 图99是显示在鸡中针对SEQ ID NO：36制备的多克隆抗体的滴定的图示。将重组P5CR(rP5CR)蛋白(SEQ ID NO：36)以5μg/ml的浓度固定于ELISA板上。将标于x轴上的命名为“粉红6”(■)和“粉红7”(×)的抗血清稀释液和标于x轴上的来自相同动物的免疫前血清(对于粉红6，◆；对于粉红7，▲)与固定的rP5CR蛋白在足以形成抗原：抗体复合物的条件下接触一段时间。洗涤ELISA板，并通过结合稀释为1∶5000(v/v)的绵羊抗鸡IgG辣根过氧化物酶(HRP)偶合物使用TMB检测结合的HRP活性来检测复合物。
对每个样品确定吸光度(OD)(y轴)。数据表明对于两个抗体制备物，抗体效价均为至少约
1∶32000(v/v)。命名为“粉红6”的抗体在本文中也称作“Ch6”，而命名为“粉红7”的抗体在本文中也称作“Ch7”。
对每个样品确定吸光度(OD)(y轴)。数据表明对于两个抗体制备物，抗体效价均为至少约
1∶32000(v/v)。命名为“粉红6”的抗体在本文中也称作“Ch6”，而命名为“粉红7”的抗体在本文中也称作“Ch7”。
[0285] 图100是显示在兔中针对SEQ ID NO：43制备的多克隆抗体的滴定的图示。将链霉抗生物素蛋白以5μg/ml固定于ELISA板上。将偶合于由SEQ IDNO：43所示的序列组成的肽的生物素(3μg/ml)与所述板在足以将所述肽通过生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用固定的条件下接触一段时间。在足以形成抗原-抗体复合物的条件下添加一段时间的兔抗血清或免疫前血清的稀释液，然后如图79图例所述检测结合的抗体，只不过二抗为绵羊抗兔IgG HRP偶合物。兔血清命名为Rb33(＝RCP33)(对于免疫血清，■；对于免疫前血清，◆)和Rb34(＝RCP34)(对于免疫血清，×；对于免疫前血清，▲)。血清稀释程度标于x轴。吸光度(OD)标于y轴。
[0286] 图101是显示兔抗P5CR抗体Rb37(＝RCP37)和Rb38(＝RCP38)检出限的图示。将包含SEQ ID NO：42所述的序列的生物素化的肽如图80的图例所述结合于ELISA板，只不过肽浓度从204.8ng/ml变为100pg/ml(x轴)。将抗体Rb37(◆，■)和Rb38(▲，×)
以及1∶500(v/v)(◆，▲)和1∶2000(v/v)(■，×)的稀释结合于肽，并使用绵羊抗兔IgG HRP偶合物如图80图例所述进行检测。数据表明Rb37的检出限在1∶500(v/v)稀
释为约0.8ng/ml，而在1∶2000(v/v)稀释为约1-3ng/ml；且Rb38的检出限在至少高至约
1∶2000(v/v)稀释为约1-5ng/ml。
以及1∶500(v/v)(◆，▲)和1∶2000(v/v)(■，×)的稀释结合于肽，并使用绵羊抗兔IgG HRP偶合物如图80图例所述进行检测。数据表明Rb37的检出限在1∶500(v/v)稀
释为约0.8ng/ml，而在1∶2000(v/v)稀释为约1-3ng/ml；且Rb38的检出限在至少高至约
1∶2000(v/v)稀释为约1-5ng/ml。
[0287] 图102是显示不同的抗体结合于重组结核分枝杆菌P5CR蛋白(SEQ IDNO：36)的图示，如通过ELISA确定。将重组P5CR蛋白从55.555ng/ml的起始浓度1∶3(v/v)系列稀释至228.62pg/ml，并使用每个稀释液的50μl等分试样包被ELISA板的孔(x轴)。在洗涤去除未结合的抗原之后，将通过对鸡(即，命名为Ch6/7的多克隆抗体汇集，通过结合本文中提及的多克隆抗体“粉红6”和“粉红7”产生)或小鼠(即，称为Mo1027D的单克隆抗体)进行免疫接种或通过用抗原的噬菌体展示(Ph4550.2)而制备的不同的抗体分别以5μg/ml的浓度与吸附的重组P5CR蛋白相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，用50μl1∶5000(v/v)稀释的偶合于辣根过氧化物酶(HRP)的二抗(例如，对于检测结合的Ch6/7抗体，绵羊抗鸡IgG；而对于检测结合的Mo1027D抗体，驴抗小鼠IgG)，洗涤，用TMB温育30分钟，并确定在450-620nm的吸光度(y轴)。数据显示Ch6/7多克隆抗体和重组噬菌体展示抗体Ph4550.2显著结合于重组P5CR。
[0288] 图103是显示使用抗体Ph4550.2作为捕捉抗体而多克隆抗体汇集Ch6/7作为检测抗体以测定重组结核分枝杆菌P5CR蛋白的夹心ELISA结果的优化的图示。将ELISA板用捕捉抗体以2μg/ml、5μg/ml和10μg/ml的浓度包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体之后，将重组P5CR蛋白从50ng/ml的起始浓度1∶3(v/v)系列稀释至22.86pg/ml，并将每个稀释液的50μl等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中(x轴)。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将检测抗体Ch6/7以5μg/ml或10μg/ml范围的浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，与50μl 1∶5000(v/v)稀释的偶合于辣根过氧化物酶(HRP)的二抗(即，绵羊抗鸡IgG)温育，洗涤，与TMB温育30分钟，并确定在450-620nm的吸光度(y轴)。虽不愿限定本发明，数据显示最优的信号是使用浓度为5μg/ml或10μg/ml的捕捉抗体与浓度为5μg/ml的检测抗体检测出的。
[0289] 图104是将辣根过氧化物酶(HRP)-偶合的二抗的检测与使用链霉抗生物素蛋白-HRP或链霉抗生物素蛋白多聚-40HRP进行的对生物素化二抗的检测进行比较的图示。将ELISA板用1-8pg/ml重组P5CR蛋白包被过夜，封闭，然后用生物素化的Ph4550.2或未标记的Ch6/7抗体在5μg/ml浓度进行温育。在洗涤去除未结合的抗体之后，将偶合于HRP的绵羊抗鸡IgG二抗或偶合于链霉抗生物素蛋白多聚-40HRP的驴抗鸡抗体添加至含有所述Ch6/7抗体的孔中。在平行反应中，将能够结合于生物素化的Ph4550.2的二抗和用链霉抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白多聚-40 HRP的二抗添加至含有Ph4550.2抗体的孔。在温育之后，洗涤板，用TMB温育30分钟，并确定450-620nm的吸光度(y轴)。数据显示与HRP比较使用链霉抗生物素蛋白多聚-40HRP作为检测试剂用于Ch6/7抗体显著的增强了信号。
[0290] 图105是显示就捕捉和检测抗体的量和链霉抗生物素蛋白多聚80HRP偶合物二抗的稀释对扩增的夹心ELISA进行优化以供测定低浓度的重组结核分枝杆菌P5CR蛋白的图示。将ELISA板用捕捉抗体Ph4550.2以5μg/ml或10μg/ml浓度包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体之后，将重组P5CR蛋白从500ng/ml的起始浓度1∶3(v/v)系列稀释至
22.86pg/ml，并将每个稀释的50μl等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中(x轴)。
在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将检测抗体Ch6/7以2.5μg/ml或5μg/ml范围的浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，与50μl
1∶200000(v/v)稀释的二抗(即，生物素化的驴抗鸡IgG)温育，如前所述洗涤，然后与HRP80-链霉抗生物素蛋白偶合物的50μl 1∶10000(v/v)稀释液或1∶20000(v/v)稀
释液温育。再次洗涤板，并与TMB温育30分钟，并确定在450-620nm的吸光度(y轴)。虽不愿限定本发明，数据显示在本文所使用的二抗浓度，夹心ELISA中P5CR蛋白的最优检出限是使用10μg/mlPh4550.2捕捉抗体和2.5μg/ml Ch6/7检测抗体，以及1∶10000稀释(v/v)的扩增的链霉抗生物素蛋白多聚-80HRP。
22.86pg/ml，并将每个稀释的50μl等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中(x轴)。
在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将检测抗体Ch6/7以2.5μg/ml或5μg/ml范围的浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，与50μl
1∶200000(v/v)稀释的二抗(即，生物素化的驴抗鸡IgG)温育，如前所述洗涤，然后与HRP80-链霉抗生物素蛋白偶合物的50μl 1∶10000(v/v)稀释液或1∶20000(v/v)稀
释液温育。再次洗涤板，并与TMB温育30分钟，并确定在450-620nm的吸光度(y轴)。虽不愿限定本发明，数据显示在本文所使用的二抗浓度，夹心ELISA中P5CR蛋白的最优检出限是使用10μg/mlPh4550.2捕捉抗体和2.5μg/ml Ch6/7检测抗体，以及1∶10000稀释(v/v)的扩增的链霉抗生物素蛋白多聚-80HRP。
[0291] 图106是将扩增的夹心ELISA与标准夹心ELISA就检测重组结核分枝杆菌P5CR蛋白作比较的图示。将ELISA板用浓度为5μg/ml的捕捉抗体Ph4550.2包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体之后，将重组P5CR蛋白从100ng/ml起始浓度1∶10(v/v)系列稀释至1.0pg/ml，并将每个稀释的50μl等分试样添加至经抗体包被的ELISA板的孔中(x轴)。
在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将抗体Ch6/7以2.0μg/ml的浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，并与50μl 1∶20000(v/v)稀释的由未标记的绵羊抗鸡IgG(标准夹心ELISA)或生物素化的驴抗鸡IgG(扩增的夹心ELISA)组成的二抗温育。在室温再温育1小时之后，如前所述洗涤板。然后将HRP(标准ELISA)或HRP80-链霉抗生物素蛋白(扩增ELISA)添加至板，并将其在室温再温育1小时，并如前所述洗涤板，最后，用TMB温育30分钟。在450-620nm确定吸光度(y轴)。数据表明在这样的条件下使用扩增的夹心ELISA显著地增强检测：该扩增的夹心ELISA的检出限为约48pg/ml P5CR蛋白，而半最大值检测为约1ng/ml P5CR蛋白。
在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将抗体Ch6/7以2.0μg/ml的浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，并与50μl 1∶20000(v/v)稀释的由未标记的绵羊抗鸡IgG(标准夹心ELISA)或生物素化的驴抗鸡IgG(扩增的夹心ELISA)组成的二抗温育。在室温再温育1小时之后，如前所述洗涤板。然后将HRP(标准ELISA)或HRP80-链霉抗生物素蛋白(扩增ELISA)添加至板，并将其在室温再温育1小时，并如前所述洗涤板，最后，用TMB温育30分钟。在450-620nm确定吸光度(y轴)。数据表明在这样的条件下使用扩增的夹心ELISA显著地增强检测：该扩增的夹心ELISA的检出限为约48pg/ml P5CR蛋白，而半最大值检测为约1ng/ml P5CR蛋白。
[0292] 图107是显示未稀释的血浆对在前述图8中所述的扩增的夹心ELISA测定法中检测重组P5CR蛋白的淬灭作用，以及通过稀释血浆恢复丧失的信号的图示。将ELISA板用捕捉抗体Ph4550.2以5μg/ml浓度包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体之后，以标于x轴的浓度将重组P5CR蛋白掺入未稀释的封闭溶液(“封闭”)，未稀释的血浆(“纯粹的血浆”)，或用封闭溶液以从1∶1(v/v)封闭液∶血浆至8∶1(v/v)封闭液∶血浆的范围的稀释的血浆，并将50μl每个样品等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中(x轴)。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将抗体Ch6/7以2.0μg/ml的浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，并与50μl 1∶20000(v/v)稀释的由生物素化的驴抗鸡IgG组成二抗(扩增的夹心ELISA)温育。在室温再温育1小时后，如前所述洗涤板。然后将HRP80-链霉抗生物素蛋白(扩增ELISA)添加至板，将其在室温再温育1小时，如前所述洗涤，并最后用TMB温育30分钟。在450-620nm确定吸光度(y轴)。数据显示，尽管血浆对信号有一些减弱/抑制，稀释临床样品基质确实使得信号强度的恢复超过约70％，并高至约88％。
[0293] 图108是显示未稀释的痰对在前述图8中所述的扩增的夹心ELISA测定法中检测重组P5CR蛋白的淬灭作用，以及通过稀释临床样品基质完全恢复丧失的信号的图示。将ELISA板用捕捉抗体Ph4550.2以5μg/ml浓度包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体之后，以标于x轴的浓度将重组P5CR蛋白掺入未稀释的封闭溶液(“封闭”)，未稀释的痰(“纯粹的痰”)，或用封闭溶液以从1∶1(v/v)封闭液∶痰至8∶1(v/v)封闭液∶痰的范围稀释的痰，并将50μl每个样品等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中(x轴)。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将抗体Ch6/7以2.0μg/ml的浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，并与50μl 1∶20000(v/v)稀释的由生物素化的驴抗鸡IgG组成二抗(扩增的夹心ELISA)温育。在室温再温育1小时后，如前所述洗涤板。然后将HRP80-链霉抗生物素蛋白(扩增ELISA)添加至板，将其在室温再温育1小时，如前所述洗涤，并最后用TMB温育30分钟。在450-620nm确定吸光度(y轴)。
数据显示，尽管痰对信号有一些减弱/抑制，稀释临床样品基质使得信号强度完全恢复，甚至有所增强。
数据显示，尽管痰对信号有一些减弱/抑制，稀释临床样品基质使得信号强度完全恢复，甚至有所增强。
[0294] 图109是显示针对结核分枝杆菌P5CR蛋白的抗体与来自酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或铜绿假单胞菌的全细胞裂解液缺乏显著的交叉反应性的夹心ELISA结果的图示。测定条件基本上如图86图例中所述，只不过测定的是0-10ng/ml纯化的重组P5CR蛋白或
100ng/ml或100μg/ml细胞提取物，如标于x轴。不含蛋白或细胞提取物的缓冲液用作阴性对照。数据显示在450-620nm吸光度变化，即，在对于每个样品减去背景吸光度之后。
100ng/ml或100μg/ml细胞提取物，如标于x轴。不含蛋白或细胞提取物的缓冲液用作阴性对照。数据显示在450-620nm吸光度变化，即，在对于每个样品减去背景吸光度之后。
[0295] 图110是显示在临床结核分枝杆菌分离株CSU93和HN878，以及在实验室菌株H37Rv的全细胞提取物中检测结核分枝杆菌P5CR蛋白的夹心ELISA结果的图示。测定条件基本上如图89的图例所述，只不过下述方面有所不同：(i)细胞提取物的来源如x轴所示；(ii)向全细胞提取物掺入重组P5CR蛋白至终浓度为50、16.7、5.6和1.8μg/ml；和(iii)内源P5CR蛋白的浓度通过从PC5R浓度相对信号强度的标准曲线内插来确定，并就样品中掺入的重组PC5R蛋白的水平进行校正。数据表示为对于两个单独实验的每微克细胞提取物总蛋白的内源PC5R蛋白的水平(y轴)。还标出了平均蛋白水平。
[0296] 图111是显示结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌中P5CR蛋白表达(相对于总细胞蛋白)的图示，其通过夹心ELISA确定。在两个独立实验中重复两次测定来自结核分枝杆菌菌株H37Rv(左边)，和鸟分枝杆菌(中间)和胞内分枝杆菌(右边)的全细胞裂解液。内源蛋白的浓度通过从标准曲线内插来计算，并就稀释因子加以校正。表示为pg/μg总细胞蛋白的内源蛋白水平对于三个测试的分枝杆菌中的每一个就平均值±SD进行作图。
[0297] 图112是显示在鸡中针对包含SEQ ID NO：44的重组蛋白制备的多克隆抗体的滴定的图示。将重组TetR(SEQ ID NO：44)以5μg/ml的浓度固定于ELISA板上。将标于x轴上的命名为“粉红4”(■)和“粉红5”(×)的抗血清稀释液和标于x轴上的来自相同动物的免疫前血清的稀释液(对于粉红4，◆；对于粉红5，▲)与固定的TetR在足以形成抗原：抗体复合物的条件下接触一段时间。洗涤ELISA板，并通过结合稀释为1∶5000(v/v)的绵羊抗鸡IgG辣根过氧化物酶(HRP)偶合物使用TMB来检测结合的HRP活性来检测复合物。对每个样品确定吸光度(OD)(y轴)。数据表明对于两个抗体制备物，对于粉红4，抗体效价为至少约1∶64000，而对于粉红5，抗体效价至少为约1∶128000。抗体“粉红4”也称作“Ch4”；而抗体“粉红5”也称作“Ch5”。
[0298] 图113是显示在兔中针对SEQ ID NO：55制备的多克隆抗体的检出限的图示。将链霉抗生物素蛋白以5μg/ml固定于ELISA板上。将浓度如x轴所示为204.8μg/ml至100pg/ml范围的偶合于由SEQ ID NO：55所示的序列组成的肽的生物素与所述板在足以将所述肽通过生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用固定的条件下接触一段时间。在足以形成抗原-抗体复合物的条件下添加一段时间的兔抗血清或免疫前血清的稀释液(1∶500(v/v)或1∶2000(v/v))，然后如图92图例所述检测结合的抗体，只不过二抗为绵羊抗兔IgG HRP偶合物。兔血清命名为RCP18(对于1∶500(v/v)稀释的免疫前血清，■；对于1∶500(v/v)稀释的免疫血清，◆；对于1∶2000(v/v)稀释的免疫前血清，×；对于1∶2000(v/v)稀释的免疫血清，▲)。吸光度(OD)标于y轴。数据表明RPC18的检出限为约0.1-0.5ng/ml。
[0299] 图114是使用多克隆抗血清RCP18(在图中＝Rb18)作为捕捉抗体，而包含多克隆抗体Ch4(＝本文中提及的抗体“粉红4”)和Ch5(＝本文中提及的抗体“粉红5”)的命名为“Ch4/5”的多克隆抗体汇集作为检测抗体进行的标准夹心ELISA的图示。该图显示在夹心ELISA中使用这两个抗体制备物的作用。用50μl RCP18抗体(Rb18)以5μg/ml或10μg/ml的浓度将ELISA板的孔包被过夜。在封闭并洗涤去除未结合的抗体之后，将重组TetR样蛋白从50ng/ml起始浓度稀释为80pg/ml，并将每个稀释的50μl等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中(x轴)。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将检测抗体(即，用于检测TetR-RCP18复合物的Ch4/5)以5μg/ml或10μg/ml或20μg/ml的浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，用50μl 1∶5000(v/v)稀释的偶合于辣根过氧化物酶(HRP)的二抗(即，对于检测Ch4/5，绵羊抗鸡IgG)温育，洗涤，用TMB温育30分钟，并在减去背景之后确定450-620nm处的吸光度(y轴)。虽不欲限定本发明，但数据表明在这种夹心ELISA格式中优选5μg/ml RCP18作为捕捉抗体而用5μg/mlCh4/5作为检测抗体的组合，其检测TetR至至少5ng/ml蛋白。
[0300] 图115是使用包含多克隆抗体Ch4(＝本文中提及的抗体“粉红4”)和Ch5(＝本文中提及的抗体“粉红5”)的命名为“Ch4/5”的多克隆抗体汇集作为捕捉抗体，而多克隆抗血清RCP18(在图中＝Rb18)作为检测抗体进行的标准夹心ELISA的图示。该图显示在夹心ELISA中使用这两个抗体制备物的作用。用50μl Ch4/5抗体以5μg/ml或10μg/ml的浓度将ELISA板的孔包被过夜。在封闭并洗涤去除未结合的抗体之后，将重组TetR样蛋白从50ng/ml起始浓度稀释为80pg/ml，并将每个稀释的50μl等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中(x轴)。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将检测抗体(即，用于检测TetR-Ch4/5复合物的RCP19)以5μg/ml或10μg/ml或20μg/ml的浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，用50μl 1∶5000(v/v)稀释的偶合于辣根过氧化物酶(HRP)的二抗(即，对于检测Ch4/5，绵羊抗兔IgG)温育，洗涤，用TMB温育30分钟，并在减去背景之后确定450-620nm处的吸光度(y轴)。虽不欲限定本发明，但数据表明在这种夹心ELISA格式中优选5μg/ml Ch4/5作为捕捉抗体而用5μg/mlRCP18作为检测抗体，其与示于图3的相反顺序的抗体相比，仅有略微改善。
[0301] 图116是使用包含多克隆抗体Ch4(＝本文中提及的抗体“粉红4”)和Ch5(＝本文中提及的抗体“粉红5”)的命名为“Ch4/5”的多克隆抗体汇集作为检测抗体，而命名为784F和Mo785E的单克隆抗体制备物作为作为检测抗体进行的标准夹心ELISA的图示。该图显示在夹心ELISA中使用这些抗体制备物的作用。用50μl Ch4/5抗体以500ng/ml或
1μg/ml或2μg/ml或4μg/ml或8μg/ml的浓度将ELISA板的孔包被过夜。在封闭并洗涤去除未结合的抗体之后，将重组TetR样蛋白从5ng/ml起始浓度稀释为2.29pg/ml，并将每个稀释的50μl等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中(x轴)。在温育1小时并
洗涤去除未结合的抗原之后，将检测抗体(即，用M784F或M Mo785E检测TetR-Ch4/5复合物)以2μg/ml的浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，用50μl 1∶5000(v/v)稀释的偶合于辣根过氧化物酶(HRP)的二抗(即，对于检测所述小鼠单克隆抗体，绵羊抗小鼠IgG)温育，洗涤，用TMB温育30分钟，并在减去背景之后确定450-620nm处的吸光度(y轴)。虽不欲限定本发明，但数据表明Mo785E单克隆抗体提供了最低的背景信号，并当与Ch4/5捕捉抗体组合时，提供了比兔多克隆RCP18更高的信号。
500ng/ml Ch4/5作为捕捉抗体而2μg/ml Mo785E作为检测抗体的组合提供了最低的背景信号，然而2μg/ml Ch4/5作为捕捉抗体而2μg/mlMo785E作为检测抗体的组合在该夹心ELISA形式中提供了最高的信号∶噪音比例。
1μg/ml或2μg/ml或4μg/ml或8μg/ml的浓度将ELISA板的孔包被过夜。在封闭并洗涤去除未结合的抗体之后，将重组TetR样蛋白从5ng/ml起始浓度稀释为2.29pg/ml，并将每个稀释的50μl等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中(x轴)。在温育1小时并
洗涤去除未结合的抗原之后，将检测抗体(即，用M784F或M Mo785E检测TetR-Ch4/5复合物)以2μg/ml的浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，用50μl 1∶5000(v/v)稀释的偶合于辣根过氧化物酶(HRP)的二抗(即，对于检测所述小鼠单克隆抗体，绵羊抗小鼠IgG)温育，洗涤，用TMB温育30分钟，并在减去背景之后确定450-620nm处的吸光度(y轴)。虽不欲限定本发明，但数据表明Mo785E单克隆抗体提供了最低的背景信号，并当与Ch4/5捕捉抗体组合时，提供了比兔多克隆RCP18更高的信号。
500ng/ml Ch4/5作为捕捉抗体而2μg/ml Mo785E作为检测抗体的组合提供了最低的背景信号，然而2μg/ml Ch4/5作为捕捉抗体而2μg/mlMo785E作为检测抗体的组合在该夹心ELISA形式中提供了最高的信号∶噪音比例。
[0302] 图117是将扩增的夹心ELISA与标准夹心ELISA就检测重组结核分枝杆菌TetR样蛋白作比较的图示。将ELISA板用浓度为2μg/ml的捕捉抗体Ch4/5包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体之后，将重组TetR样蛋白从100ng/ml的起始浓度稀释至490fg/ml，并将每个稀释的50μl等分试样添加至经抗体包被的ELISA板的孔中(x轴)。在温育1小时之后，洗涤板去除未结合的抗原。对于标准夹心ELISA，将未标记的单克隆抗体Mo785E以
2.5μg/ml的浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。对于扩增的夹心ELISA，将单克隆抗体Mo785E生物素化，并将生物素化的抗体以2.5μg/ml的浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，并用50μl1∶5000(v/v)稀释的由HRP-偶合的绵羊抗小鼠IgG(标准夹心ELISA)组成的二抗或50μl 1∶2500(v/v)稀释的HRP80-链
霉抗生物素蛋白温浴。然后将板在室温再温育1小时，并如前所述洗涤板。最后，将所有样品用TMB温育30分钟(标准ELISA)或10分钟(扩增ELISA)。在450-620nm确定吸光度
(y轴)。数据表明在这样的条件下使用扩增的夹心ELISA显著地增强检测：该扩增的夹心ELISA的检出限为约18pg/ml TetR样蛋白，而半最大值检测为约1ng/ml TetR样蛋白。这与标准夹心ELISA的观察到的检出限(约176pg/mlTetR样蛋白)相比是有利的。
2.5μg/ml的浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。对于扩增的夹心ELISA，将单克隆抗体Mo785E生物素化，并将生物素化的抗体以2.5μg/ml的浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，并用50μl1∶5000(v/v)稀释的由HRP-偶合的绵羊抗小鼠IgG(标准夹心ELISA)组成的二抗或50μl 1∶2500(v/v)稀释的HRP80-链
霉抗生物素蛋白温浴。然后将板在室温再温育1小时，并如前所述洗涤板。最后，将所有样品用TMB温育30分钟(标准ELISA)或10分钟(扩增ELISA)。在450-620nm确定吸光度
(y轴)。数据表明在这样的条件下使用扩增的夹心ELISA显著地增强检测：该扩增的夹心ELISA的检出限为约18pg/ml TetR样蛋白，而半最大值检测为约1ng/ml TetR样蛋白。这与标准夹心ELISA的观察到的检出限(约176pg/mlTetR样蛋白)相比是有利的。
[0303] 图118是显示在临床结核分枝杆菌分离株CSU93和HN878，以及在实验室菌株H37Rv的全细胞提取物中检测结核分枝杆菌TetR样蛋白的夹心ELISA结果的图示。扩增的夹心ELISA条件基本上如图97的图例所述，只不过下述方面有所不同：(i)细胞提取物如x轴所示进行测定；(ii)向全细胞提取物掺入重组TetR样蛋白至终浓度为50、16.7、5.6和1.8μg/ml；和(iii)内源TetR样蛋白的浓度通过从TetR浓度相对信号强度的标准曲线内插来确定，并就样品中掺入的重组TetR样蛋白的水平进行校正。数据表示为对于两个单独实验的每微克细胞提取物总蛋白的内源TetR样蛋白的皮克数(y轴)。还标出了平均蛋白水平。
[0304] 图119是显示针对结核分枝杆菌TetR样蛋白的抗体与来自酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或铜绿假单胞菌的全细胞裂解液缺乏显著的交叉反应性的夹心ELISA结果的图示。测定条件基本上如图98图例中所述，只不过以1∶2500(v/v)稀释使用HRP40-链霉抗生物素蛋白而非HRP80-链霉抗生物素蛋白，使用TMB进行15分钟的信号检测，并如标于x轴测定450fg/ml至1ng/ml纯化的重组TetR样蛋白或细胞提取物的1∶3(v/v)系列稀释(即11.1μg/ml或33.3μg/ml或100μg/ml)。不含蛋白或细胞提取物的缓冲液充当阴性对照。数据显示结核分枝杆菌与来自酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或铜绿假单胞菌的全细胞裂解液之间并无交叉反应性。
[0305] 图120是显示结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌中TetR样蛋白表达(相对于总细胞蛋白)的图示，其通过夹心ELISA确定。在两个独立实验中重复两次测定来自结核分枝杆菌菌株H37Rv(左边)，和鸟分枝杆菌(中间)和胞内分枝杆菌(右边)的全细胞裂解液。内源蛋白的浓度通过从标准曲线内插来计算，并就稀释因子加以校正。表示为pg/μg总细胞蛋白的内源蛋白水平对于三个测试的分枝杆菌中的每一个就平均值±SD进行作图。
[0306] 图121是显示从结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌的全细胞裂解液获得的滤过物中TetR蛋白的表达的图示，其通过夹心ELISA确定。将从结核分枝杆菌菌株H37Rv(左边)、鸟分枝杆菌(中间)和胞内分枝杆菌(右边)全细胞裂解液获得的滤过物重复进行两次测定。内源蛋白的浓度通过从标准曲线内插来计算，并就稀释因子(如果存在)加以校正。表示为pg/μL滤过物的内源蛋白水平对于三个分枝杆菌中的每一个就平均值±SD进行作图。
[0307] 图122提供了显示痰对抗体与重组BSX(上左)、Rv1265(上右)、S9(下左)和KARI(下右)蛋白的结合的抑制的图示。使用扩增ELISA系统分析在TB阴性痰中抗体与重组蛋白结合的抑制程度。用10ng/mL每种重组蛋白(每个小图的1-2列)、用封闭缓冲液
1∶3(v/v)稀释的混合物(每个小图的4-5列)、用封闭缓冲液1∶9(v/v)稀释的混合物(每个小图的7-8列)、和用封闭缓冲液1∶27(v/v)稀释的混合物(每个小图的10-11列)掺入痰。将样品在测定前在4℃温育过夜(每个小图的1、4、7、10列)或立即测定(每个小图的2、5、8、11)。阳性对照缺乏痰，并在测定之前温育过夜(每个小图的3、6、9、12列)。
样品在两个单独实验中的每一个在一式两份的孔中进行测定。在每个稀释中在痰中检测出的重组蛋白浓度通过从标准曲线内插来计算，并表示为重组蛋白掺入浓度的％(％信号恢复)。对于三种处理的四个稀释因子中的每一个将恢复的水平作为平均％信号恢复±SD进行作图。对每个示于x轴的稀释，数据表示为信号恢复百分比(Y轴)。
1∶3(v/v)稀释的混合物(每个小图的4-5列)、用封闭缓冲液1∶9(v/v)稀释的混合物(每个小图的7-8列)、和用封闭缓冲液1∶27(v/v)稀释的混合物(每个小图的10-11列)掺入痰。将样品在测定前在4℃温育过夜(每个小图的1、4、7、10列)或立即测定(每个小图的2、5、8、11)。阳性对照缺乏痰，并在测定之前温育过夜(每个小图的3、6、9、12列)。
样品在两个单独实验中的每一个在一式两份的孔中进行测定。在每个稀释中在痰中检测出的重组蛋白浓度通过从标准曲线内插来计算，并表示为重组蛋白掺入浓度的％(％信号恢复)。对于三种处理的四个稀释因子中的每一个将恢复的水平作为平均％信号恢复±SD进行作图。对每个示于x轴的稀释，数据表示为信号恢复百分比(Y轴)。
[0308] 图123提供了显示痰对抗体与内源结核分枝杆菌BSX(上左)、Rv1265(上右)、S9(下左)和KARI(下右)蛋白的结合的抑制的图示，其通过扩增的夹心ELISA确定。使用扩增ELISA系统分析在掺入TB阴性痰的结核分枝杆菌H37Rv全细胞裂解液中抗体与内源BSX、S9、Rv1265和KARI蛋白的结合的淬灭和遮掩的水平。用全细胞裂解液掺入痰以取得下述痰中的目标浓度：BSX＝9ng/mL、Rv1265＝2.8ng/mL、S9＝1.2ng/mL而KARI＝31ng/mL(每个小图的1-2列)、并用封闭缓冲液1∶3(v/v)稀释的混合物(每个小图的4-5列)、用封闭缓冲液1∶9(v/v)稀释的混合物(每个小图的7-8列)、和用封闭缓冲液1∶27(v/v)稀释的混合物(每个小图的10-11列)掺入痰。将样品在测定前在4℃温育过夜(每个小图的1、4、7、10列)或立即测定(每个小图的2、5、8、11)。阳性对照样品缺乏痰，并在测定之前温育过夜(每个小图的3、6、9、12列)。样品在两个单独实验中的每一个在一式两份的孔中进行测定。在每个稀释中在痰中检测出的内源蛋白浓度通过从标准曲线(用封闭缓冲液系列稀释的H37Rv-WCL)内插来计算，并表示为掺入浓度的％(％信号恢复)。对于三种处理的四个稀释因子中的每一个将恢复的水平作为平均％信号恢复±SD进行作图。
[0309] 图124是显示BSX(柱1-3)、EF-Tu(柱4-6)、KARI(柱7-9)、P5CR(柱10-12)、抗原A(柱13-15)、Rv1265(柱16-18)、抗原B(柱19-21)、抗原C(柱22-24)、S9(柱25-27)、抗原D(柱28-30)和抗原E(柱31-33)基于在结核分枝杆菌菌株H37Rv(每3列一组的第一列)、CSU939(每3列一组的第二列)和HN878(每3列一组的第三列)中总细胞蛋白表
达的相对表达的图示，其通过夹心ELISA来确定。内源蛋白的浓度通过从标准曲线内插来计算，并就稀释因子来加以校正。数据通过重复实验来获取，其中每个样品重复两次进行分析。内源蛋白的水平(表示为pg/μg总细胞蛋白)对于分析的11个TB抗原作为平均值
±SD进行作图。
达的相对表达的图示，其通过夹心ELISA来确定。内源蛋白的浓度通过从标准曲线内插来计算，并就稀释因子来加以校正。数据通过重复实验来获取，其中每个样品重复两次进行分析。内源蛋白的水平(表示为pg/μg总细胞蛋白)对于分析的11个TB抗原作为平均值
±SD进行作图。
[0310] 图125是图124所述的图示的扩展表示，显示一些低表达抗原的表达水平。
[0311] 图126是显示BSX(柱1-3)、EF-Tu(柱4-6)、KARI(柱7-9)、P5CR(柱10-12)、抗原A(柱13-15)、Rv1265(柱16-18)、抗原B(柱19-21)、抗原C(柱22-24)、S9(柱25-27)、6
抗原D(柱28-30)和抗原E(柱31-33)的相对表达的图示，所述表达表示为每1x10CFU结核分枝杆菌菌株H37Rv(每3列一组的第一列)、鸟分枝杆菌(每3列一组的第二列)和胞内分枝杆菌(每3列一组的第三列)的蛋白ng数，通过夹心ELISA来确定。内源蛋白的浓度通过从标准曲线内插来计算，并就稀释因子来加以校正。数据通过重复实验来获取，其中每个样品重复两次进行分析。内源蛋白的水平对于分析的11个TB抗原的每一个作为平均值±SD进行作图。数据表示结核分枝杆菌中BSX、EF-Tu、KARI、Rv1265和S9的特异性表达。
抗原D(柱28-30)和抗原E(柱31-33)的相对表达的图示，所述表达表示为每1x10CFU结核分枝杆菌菌株H37Rv(每3列一组的第一列)、鸟分枝杆菌(每3列一组的第二列)和胞内分枝杆菌(每3列一组的第三列)的蛋白ng数，通过夹心ELISA来确定。内源蛋白的浓度通过从标准曲线内插来计算，并就稀释因子来加以校正。数据通过重复实验来获取，其中每个样品重复两次进行分析。内源蛋白的水平对于分析的11个TB抗原的每一个作为平均值±SD进行作图。数据表示结核分枝杆菌中BSX、EF-Tu、KARI、Rv1265和S9的特异性表达。
[0312] 图127是图126所述的图示的扩展表示，显示一些低表达抗原的表达水平。数据表明在结核分枝杆菌中BSX、EF-Tu、P5CR、Rv1265和S9的特异性表达，以及KARI在胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌中在这些低检出限具有可检测出的表达。
[0313] 图128是显示BSX(柱1-3)、EF-Tu(柱4-6)、KARI(柱7-9)、P5CR(柱10-12)、抗原A(柱13-15)、Rv1265(柱16-18)、抗原B(柱19-21)、抗原C(柱22-24)、S9(柱25-27)、抗原D(柱28-30)和抗原E(柱31-33)的相对表达的图示，所述表达表示为每μg结核分枝杆菌菌株H37Rv(每3列一组的第一列)、鸟分枝杆菌(每3列一组的第二列)和胞内分枝杆菌(每3列一组的第三列)总细胞蛋白的抗原pg数，通过夹心ELISA来确定。内源蛋白的浓度通过从标准曲线内插来计算，并就稀释因子来加以校正。数据通过重复实验来获取，其中每个样品重复两次进行分析。内源蛋白的水平对于分析的11个TB抗原中的每一个作为平均值±SD进行作图。数据表示结核分枝杆菌中BSX、EF-Tu、Rv1265和S9的特异性表达。在这些条件下在胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌中明显可检出KARI。
[0314] 图129是图128所述的图示的扩展表示，显示一些低表达抗原的表达水平。数据表明Rv1265在结核分枝杆菌中的特定性表达，而大部分在胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌中的其他抗原在这些低检出限可检测出表达。
[0315] 图130是显示BSX(柱1-3)、EF-Tu(柱4-6)、KARI(柱7-9)、P5CR(柱10-12)、抗原A(柱13-15)、Rv1265(柱16-18)、抗原B(柱19-21)、抗原C(柱22-24)、S9(柱25-27)、抗原D(柱28-30)和抗原E(柱31-33)的相对表达的图示，所述表达表示为每μL结核分枝杆菌菌株H37Rv(每3列一组的第一列)、鸟分枝杆菌(每3列一组的第二列)和胞内分枝杆菌(每3列一组的第三列)全细胞裂解液的滤过物的抗原pg数，通过夹心ELISA来确定。内源蛋白的浓度通过从标准曲线内插来计算，并就稀释因子来加以校正。数据通过重复实验来获取，其中每个样品重复两次进行分析。内源蛋白的水平对于分析的11个TB抗原中的每一个作为平均值±SD进行作图。
[0316] 图131是图130所述的图示的扩展表示，显示一些低表达抗原的表达水平。
[0317] 图132提供了显示测定法工作范围和对重组结核分枝杆菌KARI、(IlvC)、BSX、Rv1265和S9蛋白(左边小图)和结核分枝杆菌菌株H37Rv全细胞裂解液(WCL)中的内源结核分枝杆菌KARI、(IlvC)、BSX、Rv1265和S9蛋白(右边小图)检出限的图示。重组蛋白和全细胞裂解液蛋白浓度示于x轴(μg/ml)而在标准条件下使用本文中所述的抗体对进行的扩增的夹心ELISA所得的吸光度示于y轴。数据表明所有四种抗原均能够在纳克浓度被显著地检测出来，而对于全细胞裂解液为微克浓度。
[0318] 优选实施例的详细描述
[0319] 分离的或重组的KARI蛋白及其免疫原性片段和表位
[0320] 本发明的一个方面提供了分离或重组的KARI蛋白或其免疫原性片段或表位。
[0321] 本发明的该方面涵盖了任何来源于本文中提及的KARI蛋白的合成或重组的肽，包括全长KARI蛋白、和/或KARI蛋白的衍生物或同源物，或其免疫原性片段或表位。
[0322] 优选的KARI蛋白是与SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列具有至少约80％氨基酸序列同一性的肽、多肽或蛋白。优选地，KARI蛋白与SEQ ID NO：1的同一性百分比为至少约85％，更优选至少约90％，甚至更优选至少约95％而还更优选至少约99％。本发明并不限定于使用例示的结核分枝杆菌KARI蛋白，因为本领域技术人员会知道，无需不必要的实验尝试即可界定与例示的结核分枝杆菌KARI蛋白具有序列同一性和免疫学等同性的蛋白片段。
[0323] 在确定两个氨基酸序列是否落在上文界定的百分比同一性限制范围内时，本领域技术人员会明白可以对氨基酸序列进行并排(side-by-side)比较。在上述比较或比对中，会根据用于进行所述比对的算法，在非相同残基的位置方面产生差异。在本文的语境中，提及两个或更多氨基酸序列的百分比同一性和相似性应认为是提及所述序列之间使用本领域技术人员已知的任何标准算法确定的各自相同和相似的残基数。具体而言，氨基酸同一性和相似性是使用Computer Genetics Group，Inc.，University Research Park，Madison，Wisconsin，United States of America的软件进行计算的，例如，使用Devereaux等，Nucl.Acids Res.12，387-395，1984的GAP程序，其使用Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48，443-453，1970的算法。或者，使用Thompson等，Nucl.Acids Res.22，4673-4680的CLUSTAL W算法以获得多重序列的比对，其中必需或需要最大化相同/相似残基的数量，而最小化比对中序列缺口的数量和/或长度。氨基酸序列比对还可使用多种其他商业上可得到的序列分析程序进行，例如，在NCBI可获得的BLAST程序。
[0324] 特别优选的片段包括那些包含表位，特别是B细胞表位或T细胞表位的。
[0325] B细胞表位方便地来源于免疫原性KARI蛋白的氨基酸序列。本发明具体涵盖了需要针对其进行免疫应答的独特型(idiotypic)和反独特型B细胞表位，以及经脂质修饰的B细胞表位或组B(Group B)蛋白。优选的B细胞表位当施用于哺乳动物时，能够引发抗体的产生，所述抗体优选针对结核分枝杆菌的中和抗体，且更优选地，高效价中和抗体。优选较短的B细胞表位，以便于肽合成。优选地，B细胞表位的长度不应超过30氨基酸的长度。更优选地，所述B细胞表位由约25或更少的氨基酸残基组成，且更优选少于20个氨基酸残基，且甚至更优选约5-20个氨基酸残基的长度，其来源于全长蛋白的序列。
[0326] CTL表位也方便地来源于KARI蛋白的全长氨基酸序列，且通常会由所述KARI蛋白至少9个连续的氨基酸组成，并具有使用供确定I类MHC结合表位的预测性算法确定的与I类MHC等位基因以显著的水平相互作用的氨基酸序列，所述算法例如University of Tuebingen，Germany的SYFPEITHI算法，或the National Institutes of Health of the Government of the United Statesof America的BioInformatics and Molecular Analysis Section(BIMAS)的HLAPeptide Binding Predictions程序的算法。更优选地，CTL表位会具有在抗原呈递细胞(APC)表面结合于和/或稳定I类MHC分子的氨基酸序列。甚至更优选地，所述CTL表位具有诱导记忆CTL应答或引发IFNγ的T细胞表达的序列(例如CD8+T细胞、细胞毒性T细胞(CTL))。还甚至更优选地，所述CTL具有在标准细胞毒性测定法中激发CTL活性的序列。KARI蛋白特别优选的CTL表位能够在人细胞或组织中引发细胞免疫应答，例如，通过识别并裂解结核分枝杆菌感染的人细胞，由此提供或增强针对结核分枝杆菌的细胞免疫。
[0327] 合适的片段为至少约5，例如10、12、15或20个氨基酸的长度。其还可以为少于200、100或50个氨基酸的长度。
[0328] KARI蛋白或其免疫原性片段或表位的氨基酸序列可就具体的目的根据本领域技术人员已知的方法进行修饰，而不负面影响其免疫功能。举例而言，特定的肽残基可经衍生化或化学修饰以增强所述免疫应答或允许所述肽偶联于其他试剂，特别是脂质。还可能改变肽内的特定氨基酸而不扰乱所述肽的整体结构或免疫原性。因此，上述变化称作“保守性”变化，并倾向于依赖于所述残基的亲水性或极性。侧链的大小和/或电荷在确定哪个取代是保守性的时候也是相关的因素。
[0329] 本发明明确地涵盖一种或多种免疫原性KARI肽之间的共价融合，包括肽的同二聚体、同三聚体、同四聚体或更高级的同多聚体，或包含两种或更多种不同免疫原性肽的异二聚体、异三聚体、异四聚体或更高级的异多聚体。
[0330] 本发明还涵盖一种或多种免疫原性KARI肽之间的非共价聚集体，例如，其通过离子的(ionic)、流体静力的(hydrostatic)或其他本领域已知的或本文中所述的相互作用保持在一起。
[0331] 本领域技术人员充分地知道，在定义生物学功能等同蛋白时，隐含着下述概念：对于在所述分子界定的部分内进行变化，但仍然得到具有可接受水平的等同生物学活性的分子所能进行的变化数是有限的。因此，本文中生物学功能等同蛋白界定为其中取代了特定氨基酸的蛋白。具体的实施例涵盖在所述肽的氨基酸序列中具有一个、两个、三个、四个、五个或更多个变化的变体。当然，可方便地制备多种具有不同取代的不同蛋白/肽，并依据本发明加以使用。
[0332] 本领域技术人员充分明白下述取代是可容许的保守取代：(i)涉及精氨酸、赖氨酸和组氨酸的取代；(ii)涉及丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸的取代；和(iii)涉及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的取代。并入上述保守取代的衍生物在本文中界定为生物学或免疫性的功能等同物。
[0333] 憎水性氨基酸指数(hydropathic amino acid index)对赋予蛋白相互作用的生物学功能的重要性在本领域通常是理解的(Kyte & Doolittle，J.Mol.Biol.157，105-132，1982)。已知一些氨基酸可取代另一些具有相似憎水性指数(hydropathic index)或得分(score)的氨基酸而仍旧保留类似的生物学活性。还可在确定产生功能性等同分子的保守取代中考虑氨基酸的憎水性指数。对每个氨基酸基于其疏水性和电荷特征指定如下所述的憎水性指数：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。在基于憎水性指数进行变化时，优选对憎水性指数在+/-0.2之内的氨基酸进行取代。更优选地，取代涉及憎水性指数在+/-0.1之内的氨基酸，且甚至更优选在约+/-0.05之内。
[0334] 在本领域还理解相似氨基酸的取代可基于亲水性来有效进行，特别是当所述生物学功能等同物蛋白或由此产生的肽意欲用于免疫学实施例，如本案中(例如，美国专利4554101号)。事实上，蛋白的最大局部平均亲水性(greatestlocal average hydrophilicity)，其由其邻接的氨基酸的亲水性决定，与其免疫原性和抗原性相关。如美国专利4554101号所详述，对氨基酸残基指定了下述亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0+/-0.1)；谷氨酸(+3.0+/-0.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5+/-0.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。在基于相似的亲水性值进行变化时，优选对彼此亲水性值在约+/-0.2之内的氨基酸进行取代，更优选在约+/-0.1之内，且甚至更优选在约+/-0.05之内。
[0335] 包含表位的KARI多肽或其肽片段可方便地使用标准技术，例如Merrifield的合成方法(Merrifield，J Am Chem Soc，85，：2149-2154，1963)和对该技术无数可用的改进(参见，例如Synthetic Peptides：A User′s Guide，Grant，编(1992)W.H.Freeman & Co.，New York，pp.382；Jones(1994)The ChemicalSynthesis of Peptides，Clarendon Press，Oxford，pp.230.)；Barany，G.和Merrifield，R.B.(1979)in The Peptides(Gross，E.and Meienhofer，J.eds.)，vol.2，pp.1-284，Academic Press，New York；Wünsch，E.， 编 (1974)Synthese vonPeptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie(Müler，E.，编)，vol.15，4th edn.，Parts 1 and 2，Thieme，Stuttgart；Bodanszky，M.(1984)Principles ofPeptide Synthesis，Springer-Verlag，Heidelberg；Bodanszky，M.& Bodanszky，A.(1984)The Practice of Peptide Synthesis，Springer-Verlag，Heidelberg；Bodanszky，M.(1985)Int.J.Peptide Protein Res.25，449-474.d来合成。
[0336] 如本领域所知，合成肽可产生为具有附加的亲水性N-端和/或C-端氨基酸添加至来源于全长KARI蛋白的片段或B细胞表位的序列，例如，为了便于合成或改善肽可溶性。就此目的，特别优选甘氨酸和/或丝氨酸残基。上述肽可经修饰以包括位于所述KARI片段两侧的附加的间隔物序列，所述间隔物包含杂聚物(hetero-polymer)(三聚体或四聚体)，所述杂聚物包含甘氨酸和丝氨酸。
[0337] 本发明的肽可方便地经修饰以供诊断目的，例如，通过添加天然或合成的半抗原、抗生素、激素、类固醇、核苷、核苷酸、核酸、酶、酶底物、酶抑制剂、生物素、亲和素、链霉抗生物素蛋白、多组氨酸标记、谷胱甘肽、GST、聚乙二醇、肽性多肽部分(peptidic polypeptide moiety)(例如，促吞噬肽(tuftsin)，多赖氨酸)、荧光标志物(例如，FITC、RITC、丹酰基、鲁米诺或香豆素)、生物发光标志物、自旋标记、生物碱、生物胺、维生素、毒素(例如，地高辛、鬼笔环肽、鹅膏菌素(amanitin)、河豚毒素(tetrodotoxin))或形成复合物的试剂。特别优选生物素化的肽。
[0338] 在另一个实施例中，将KARI蛋白或其免疫原性片段或表位作为重组蛋白产生。
[0339] 对于通过重组手段表达蛋白，将编码蛋白的核苷酸序列置于与启动子或其他能够在无细胞系统或细胞系统中调节表达的调节序列可操作的连接位置。在本发明的一个实施例中，包含KARI蛋白(例如，如SEQ ID NO：1所述)或其表位的编码序列可操作地连接于合适启动子序列的核酸，在足以发生表达的条件下在合适的细胞中表达一段时间。编码所述KARI蛋白的核酸，包括结核分枝杆菌的ilvC基因及其任何如本文中所述编码KARI蛋白的变体，可方便地从公众可以得到的氨基酸序列衍生。
[0340] 在另一个实施例中，将KARI蛋白作为重组融合蛋白产生，例如，以协助提取和纯化。为了产生融合多肽，将其开放阅读框以相同的阅读框共价连接，例如，使用标准的克隆方法，如由Ausubel等(Current Protocols inMolecular Biology，Wiley Interscience，ISBN 047150338，1992)描述的方法，并在启动子的调控下表达。融合蛋白配偶体的实施例包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、FLAG(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)、六组氨酸、GAL4(DNA结合和/或转录激活域)和β-半乳糖苷酶。还可方便地将蛋白水解剪切位点包含于融合蛋白配偶体和目标蛋白序列之间以使得去除融合蛋白序列成为可能。优选地，所述融合蛋白不会妨碍所述KARI蛋白的免疫功能。
[0341] 本文中提及的“启动子”应考虑其最广泛的含意，并包括经典基因组基因的转录调节序列，其包括精确转录起始(accurate transcription initiation)所需的TATA盒，其包含或不包含响应发育和/或外源刺激，或以组织特异性的形式改变基因表达的CCAAT盒序列和其他调节元件(即，上游激活序列、增强子和沉默子(silencer)。在本文语境中，术语“启动子”也用于描述下述的重组、合成或融合分子，或衍生物，所述分子或衍生物对其可操作地连接的下述核酸赋予、激活或增强其表达，所述核酸编码所述多肽或肽片段。优选的启动子可包含一种或多种特定调节元件的附加拷贝以进一步加强表达和/或改变该核酸分子的空间表达和/或时间表达。
[0342] 将核酸置于启动子的调节控制之下，即“可操作地连接于”该启动子，意指将所述核酸置于使得所述启动子序列控制其表达的位置。启动子通常位于其调控的编码序列的5’(上游)。
[0343] 在细菌(如大肠杆菌)中产生完整的多肽和肽的先决条件是使用具有有效核糖体结合位点的强启动子。通常适于在细菌细胞(如大肠杆菌)中表达的启动子包括但不仅限于，lacZ启动子、温度敏感的λL或λR启动子、T7启动子或可由IPTG诱导的tac启动子。多种其他供在大肠杆菌中表达本发明的核酸分子的载体系统在本领域是已知的，并描述于，例如，Ausubel等(In：CurrentProtocols in Molecular Biology.Wiley Interscience，ISBN 047150338，1987)或Sambrook等(In：Molecular cloning，A laboratory manual，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)。已描述了多种具有适于在细菌中表达的启动子和有效核糖体结合位点的质粒，例如，pKC30(λL：Shimakate and Rosenberg，Nature292，128，1981)；pKK173-3(tac：Amann andBrosius，Gene 40，183，1985)、pET-3(T7：Studier 和 Moffat，J.Mol.Biol.189，113，1986)；pBAD/TOPO 或 pBAD/Thio-TOPO系列的载体，其包含可由阿拉伯糖诱导的启动子(Invitrogen，Carlsbad，CA)，后者设计为还产生与硫氧还蛋白的融合蛋白以增强所表达的蛋白的可溶性；pFLEX系列的表达载体(Pfizer Inc.，CT，USA)；或pQE系列的表达载体(Qiagen，CA)，等等。
[0344] 通常适于在真核细胞的病毒和真核细胞中表达的启动子包括SV40晚期启动子、SV40早期启动子和巨细胞病毒(CMV)启动子、CMV IE(巨细胞病毒立即早期)启动子等。供在哺乳动物细胞(例如，293、COS、CHO、10T细胞、293T细胞)中表达的优选的载体包括但不仅限于，由Invitrogen提供的pcDNA载体组(vector suite)，特别是包含CMV启动子并编码C端6xHis和MYC标记的pcDNA3.1 myc-His-标记；以及逆转录病毒载体
pSRαtkneo(Muller等，Mol.Cell.Biol.，11，1785，1991)。对于在293T细胞中表达KARI蛋白或其衍生物的分泌形式，特别优选载体pcDNA 3.1 myc-His(Invitrogen)，其中表达的肽或蛋白可使用标准的利用镍柱以通过His标记结合所述蛋白的亲和技术纯化为不含同种蛋白。
pSRαtkneo(Muller等，Mol.Cell.Biol.，11，1785，1991)。对于在293T细胞中表达KARI蛋白或其衍生物的分泌形式，特别优选载体pcDNA 3.1 myc-His(Invitrogen)，其中表达的肽或蛋白可使用标准的利用镍柱以通过His标记结合所述蛋白的亲和技术纯化为不含同种蛋白。
[0345] 广泛范围的适于表达本发明的诊断蛋白或其免疫学衍生物(例如，表位或其他片段)的其他宿主/载体系统可公开获得，并描述于，例如，Sambrook等(In：Molecular cloning，A laboratory manual，第二版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)。
[0346] 将分离的核酸分子或包含该分子的基因构建体引入细胞以供表达的手段对于本领域技术人员是已知的。用于给定生物的技术依赖于已知的成功技术。将重组DNA引入动物细胞的手段包括微注射、通过DEAE-右旋糖酐介导的转染、通过脂质体介导的转染(如通过使用lipofectamine(Gibco，MD，USA)和/或cellfectin(Gibco，MD，USA))、PEG介导的DNA摄入、电穿孔和微粒轰击(microparticle bombardment)(如通过使用包被DNA的钨或金微粒(Agracetus Inc.，WI，USA))等。
[0347] 本发明的蛋白可以以分离的形式产生，优选实质上不含同种的蛋白。特别优选抗体和其他亲和配体以供产生分离的蛋白。优选地，在所述蛋白所在的制备物中，超过约90％(例如，95％，98％或99％)的制备物中的蛋白是KARI蛋白或其表位。
[0348] 分离或重组的次级分析物蛋白、肽及其表位。
[0349] 应理解本文中上述供产生分离和重组的KARI蛋白或其免疫原性片段的方法可根据情况作适当应用于产生次级分析物蛋白、肽和片段，其可用于免疫测定法形式，例如，为了对由结核分枝杆菌造成的感染或结核病的诊断或预后、抗体产生、分析物纯化、疫苗配制等的目的。本领域技术人员应理解，上述外推取决于用所述KARI蛋白免疫原取代所述次级分析物，例如，根据本文中的任何实施例结核分枝杆菌BSX蛋白或S9蛋白或GS蛋白或其免疫原性片段，或所述肽或表位或片段的组合或混合物。上述取代可根据本文的公开无需不必要的实验尝试即可方便地进行。
[0350] 为方便起见，优选的次级分析物(例如，供用于多分析物的基于抗原的测试的)，会包含选自SEQ ID NO：3-60所述的氨基酸序列，及其组合/混合物。
[0351] 举例而言，结核分枝杆菌BSX蛋白可通过标准手段进行表达，并自其获得片段，或者，合成肽可基于全长蛋白(例如，包含SwissProt Database登录号O53759所述的序列)的序列合成。来自全长BSX蛋白的示例性的免疫原性肽会包含选自下组的序列：MRQLAERSGVSNPYL(SEQ ID NO：3)、ERGLRKPSADVLSQI(SEQ ID NO：4)、LRKPSADVLSQIAKA(SEQ ID NO：5)、PSADVLSQIAKALRV(SEQ ID NO：6)、SQIAKALRVSAEVLY(SEQ IDNO：7)、
AKALRVSAEVLYVRA(SEQ ID NO：8)、VRAGILEPSETSQVR(SEQID NO：9)、TAITERQKQILLDIY(SEQ ID NO：10)、SQIAKALRVSAEVLYVRAC(SEQ ID NO：11)、MSSEEKLCDPTPTDD(SEQID NO：12)和VRAGILEPSETSQVRC(SEQ ID NO：13)。供产生上述片段的方法详细描述于本申请人于2005年8月19日提交的国际专利申请PCT/AU2005/001254号(WO 2006/01792)，其公开以全文提述的方式并入本文。
AKALRVSAEVLYVRA(SEQ ID NO：8)、VRAGILEPSETSQVR(SEQID NO：9)、TAITERQKQILLDIY(SEQ ID NO：10)、SQIAKALRVSAEVLYVRAC(SEQ ID NO：11)、MSSEEKLCDPTPTDD(SEQID NO：12)和VRAGILEPSETSQVRC(SEQ ID NO：13)。供产生上述片段的方法详细描述于本申请人于2005年8月19日提交的国际专利申请PCT/AU2005/001254号(WO 2006/01792)，其公开以全文提述的方式并入本文。
[0352] 作为替换或附加手段，结核分枝杆菌谷氨酰胺合成酶(GS)蛋白可通过标准手段进行表达，并自其获得片段，或者，合成肽可基于全长蛋白(例如，包含SwissProt Database登录号O33342所述的序列的)的序列合成。来自GS蛋白的示例性的免疫原性肽来源于GS蛋白的表面暴露区域，或包含序列RGTDGSAVFADSNGPHGMSSMFRSF(SEQ ID NO：57)或WASGYRGLTPASDYNIDYAI(SEQ ID NO：58)。供产生上述片段的方法详细描述于本申请人于2005年6月24日提交的国际专利申请PCT/AU2005/000930号(WO 2006/000045)，其公开以全文提述的方式并入本文。
[0353] 结合于KARI蛋白或其表位的抗体
[0354] 本发明的第二方面提供了特异性结合于KARI蛋白或其免疫原性片段或表位的抗体，例如，适用于本文中所述的测定法的单克隆或多克隆抗体制备物。
[0355] 本文中提及的抗体包含完整多克隆和单克隆抗体及其部分，其本身或与其他部分偶合。抗体部分包括Fab和F(ab)2片段和单链抗体。所述抗体可在合适的实验动物体内制备，或，在工程改造的抗体(单链抗体或SCABS等)的情况下，使用重组DNA技术在体外制备。
[0356] 按照本发明的该方面，可为了对受试者进行免疫接种的目的产生抗体，在此情况下，特别优选结合于B细胞表位的高效价或中和抗体。适用于免疫接种的受试者无疑取决于用于免疫接种的抗原或抗原性B细胞表位。考虑到本发明会广泛的应用于广泛范围的动物免疫接种，所述动物例如农场动物(farm animal)(例如，马、牛、绵羊、猪、山羊、鸡、鸭、火鸡等)，实验动物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠、兔)、家养动物(domestic animal)(猫、狗、鸟等)，野化(feral)或野生的外来动物(exotic animal)(例如，负鼠、猫、猪、水牛、野狗等)和人。
[0357] 或者，所述抗体可用于商业或诊断目的，在此情况下被施用KARI蛋白或其免疫原性片段或表位的受试者极有可能为实验动物或农场动物。广泛范围的动物用于产生抗血清。通常，用于产生抗血清的动物是兔、小鼠、兔、大鼠、仓鼠、豚鼠、山羊、绵羊、猪、狗、马或鸡。由于兔和绵羊的相对较大的血量，其为产生多克隆抗体的优选选择。然而，如本领域技术人员所知，与较小的动物(如小鼠)相比，需要更大量的免疫原以从大型动物获得抗体。在上述情况下，需要从经免疫接种的动物分离所述抗体。
[0358] 优选地，所述抗体是高效价抗体。“高效价”意指适用于诊断或治疗应用的足够高的效价。如本领域所知，对于何者可被视为“高效价”有所不同。对于大部分应用优选至少3 4 4 5 5
约10-10 的效价。更优选地，所述抗体效价会在10 至10 的范围，甚至更优选在约10 至
6
约10 的范围。
约10-10 的效价。更优选地，所述抗体效价会在10 至10 的范围，甚至更优选在约10 至
6
约10 的范围。
[0359] 更优选地，在来自病原体、病毒或细菌的B细胞的情况下，所述抗体是中和抗体(即，其能够中和所述B细胞表位来源于的生物的感染性)。
[0360] 为了产生抗体，所述KARI蛋白或其免疫原性片段或表位，任选地与任何合适的或需要的载体、佐剂、BRM或药学上可接受的赋形剂一同配制，可方便地以可注射的组合物的形式给药。注射可为鼻内、肌肉内、皮下、静脉内、皮内、腹膜内或其他已知途径。对于静脉内注射，需要包含一种或多种液体和营养补充剂(nutrient replenisher)。制备和表征抗体的手段在本领域是众所周知的(参见，例如，ANTIBODIES：A LABORATORY MANUAL，ColdSpring Harbor Laboratory，1988，以提述的方式并入本文)。
[0361] 将供生成多克隆抗体或单克隆抗体的优选的免疫原性肽使用几种本领域已知的偶合化学之一共价性偶联于免疫原性载体蛋白，如白喉类毒素(DT)、匙孔血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)、破伤风类毒素(TT)或流感病毒的核蛋白(NP)。其增强否则在动物(例如，小鼠、大鼠、鸡等)中不具有高免疫原性的肽的免疫原性。
[0362] 制备供上述偶联的载体蛋白的方法在本领域是众所周知的。举例而言，DT优选通过从白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)培养物纯化所述毒素并然后通过或化学去毒来产生，但也可通过纯化重组的或遗传上去毒的毒素类似物(例如，CRM197或如其他描述于美国专利4,709,017、5,843,711、5,601,827、和5,917,017号的突变体)来制备。优选地，所述类毒素(toxoid)是使用至多6个碳的桥联作为间隔物衍生的，如通过使用白喉类毒素(D-AH)的己二酸酰肼衍生物所提供的。
[0363] 对于偶联，可将来源于全长KARI蛋白的肽通过化学方法合成或通过重组表达手段产生，用羟胺处理以形成自由的巯基基团，并通过所述自由巯基基团交联于经马来酰亚胺修饰的白喉类毒素、破伤风类毒素或流感NP蛋白或其他载体分子。一种最具特异性并可靠的偶合化学使用肽中的半胱氨酸残基并将马来酰亚胺基团添加至所述载体蛋白，以形成稳定的硫醚键(Lee，A.C.等，Mol.Immune-l.17，749-756 1980)。举例而言，如果肽中不存在巯基基团，可先将所述KARI蛋白衍生肽通过添加C-端半胱氨酸残基进行修饰以辅助此方法。免疫原性KARI肽优选在非变性条件下用羟胺、硫醇还原剂或者通过酸或碱水解处理生成自由巯基基团，并将所述含巯基的肽通过藉由所述自由巯基基团进行化学键合偶合于载体来产生。上述偶合可为通过使用合适的二马来酰亚胺(bis-maleimide)化合物。或者，所述HA蛋白可偶合于经马来酰亚胺修饰的载体蛋白，如白喉类毒素、破伤风类毒素或流感(NP)蛋白或偶合于糖类，如藻酸(alginic acid)、右旋糖酐或聚乙二醇。上述经马来酰亚胺修饰的载体分子可通过将所述载体分子与马来酰亚胺-N-羟基琥珀酸酯类的异双功能(hetero-bifunctional)交联剂反应来形成。上述双功能酯的实施例包括马来酰亚胺-己酸-N-羟基琥珀酸酯(maleimido-caproic-N-hydroxysuccinimide ester，MCS)、马来酰亚胺-苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(maleimido-benzoyl-N-hydroxysuccinimide ester，MBS)、马来酰亚胺-苯甲酰硫代琥珀酰亚胺酯(maleimido-benzoylsul-fosuccinimideester，sulfo-MBS)、琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸(succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate，SMCC)、琥珀酰亚胺-4-(对马来酰亚胺苯基)丁酸(succinimidyl-4-(p-maleimido-phenyl)butyrate，SMPP)、硫代琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸(sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate，sulfo-SMCC)和硫代琥珀酰亚胺-4-(对马来酰亚胺苯基)丁酸(sulfosuccinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrate，sulfo-SMPP)。N-羟基琥珀酰亚胺酯部分与载体蛋白的氨基基团反应，从而使得马来酰亚胺部分可以自由的与抗原上的巯基基团反应以形成交联的物质。
[0364] 这样产生的偶合分子可经纯化，并用于免疫原性组合物以在施用于宿主时，引发对KARI肽的免疫应答，所述免疫应答比KARI肽单独引发的免疫应答更加强烈。
[0365] 白喉类毒素可商业获得，或通过标准方法从在浸没培养(submergedculture)中生长的白喉棒杆菌制备。白喉类毒素的产生分为五个阶段，即维持可用的种培养物(maintenance of working seed)、生长白喉棒杆菌、收获白喉毒素、将白喉毒素去毒以及浓缩白喉类毒素。在制备物中用作载体的纯化的白喉类毒素(DT)优选为通过使用水溶性碳二亚胺缩合方法附加间隔物分子(如己二酸酰肼(ADH))而修饰(衍生)的商业性的类毒素。然后从未反应的ADH分离经修饰的类毒素，其通常为己二酸酰肼衍生物D-AH。
[0366] KARI蛋白或其免疫原性片段或表位产生抗体的效力通过向动物(例如，小鼠、鸡、大鼠、兔、豚鼠、狗、马、牛、山羊或猪)注射包含KARI蛋白或其免疫原性片段或表位的配制剂，然后监测其针对B细胞表位的免疫应答来确立，如描述于实施例。初次和再次免疫应答均受监测。抗体效价使用任何常规免疫测定法确定，例如，ELISA或放射性免疫测定法。
[0367] 多克隆抗体的产生可通过对经免疫接种的动物在免疫接种后的多个时间点取血样来进行监测。如果要取得所需的抗体效价，可给予其二次的加强(booster)注射。反复进行加强和测定效价(tittering)的过程，直至取得合适的效价。当获得所需水平的免疫原性时，将经免疫接种的动物放血，分离其血清并储藏，和/或使用所述动物产生单克隆抗体(Mab)。
[0368] 特别优选单克隆抗体。对于产生单克隆抗体(Mab)，可使用多种众所周知的技术中任何一种，例如，例示于美国专利4,196,265号中的方法，其以提述的方式并入本文。
[0369] 举例而言，用有效量的KARI蛋白或其免疫原性片段或表位在足以刺激抗体产生细胞的条件下对合适的动物进行免疫接种。优选的动物是啮齿类如兔、小鼠和大鼠，然而亦可使用绵羊或蛙的细胞。使用大鼠可提供某些益处，但是优选小鼠或兔，其中BALB/c小鼠是最优选的，因为其为最常用的动物，且通常给出较高百分比的稳定融合物。已知兔提供高亲和性的单克隆抗体。
[0370] 在免疫接种后，将具有产生抗体潜力的体细胞，特别是B淋巴细胞(B细胞)，选用于Mab生成方法。这些细胞可通过脾脏、扁桃体或淋巴结的活检获得，或可自外周血样获得。优选脾细胞和外周血细胞，前者是因为其为分裂中的浆母细胞阶段的抗体产生细胞的丰富来源，而后者是因为外周血可方便地得到。通常，对一组动物进行免疫接种，并移除具有最高抗体效价的动物的脾。脾淋巴细胞是通过用注射器对脾进行匀浆来获得的。通常，7 8
来自经免疫接种的小鼠的脾包含大约5x10 至2x10 个淋巴细胞。
来自经免疫接种的小鼠的脾包含大约5x10 至2x10 个淋巴细胞。
[0371] 然后将来自经免疫接种的动物的B细胞与不死的骨髓瘤细胞的细胞融合，其通常来源于经KARI蛋白或其免疫原性片段或表位免疫接种的动物的相同物种。适用于杂交瘤-产生融合方法的骨髓瘤细胞系优选为非抗体产生的，具有高融合效率，并具有使其不能够在一些选择性培养基中生长的酶缺陷，所述选择性培养基仅支持所需的融合细胞，或杂交瘤的生长。可使用多种骨髓瘤细胞中的任一种，且其对于本领域技术人员是已知的(例如，鼠P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XX0；或大鼠R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和4B210；以及U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6)。优选的鼠骨髓瘤细胞是NS-1骨髓瘤细胞系(也称作P3-NS-1-Ag4-1)，其可容易地从NIGM Human Genetic Mutant Cell Repository以登录号GM3573获得。或者，使用鼠骨髓瘤SP2/0非生产者细胞(non-producer cell)，其具有8-氮杂鸟嘌呤抗性。
[0372] 为了生成抗体产生脾或淋巴结细胞和骨髓瘤细胞的杂合体，将体细胞与骨髓瘤细胞在促进细胞膜融合的试剂(化学的或电的)存在下分别以约20∶1至约1∶1的比例(v/v)混合。使用仙台病毒的融合方法已经由Kohler和Milstein，Nature 256，495-497，
1975；以及Kohler和Milstein，Eur.J.Immune-l.6，511-519，1976所描述。使用聚乙二醇(PEG)(如37％(v/v))PEG)的方法已经由Gefter等，Somatic Cell Genet.3，231-236，1977详细描述。使用电诱导的融合方法也是合适的。
1975；以及Kohler和Milstein，Eur.J.Immune-l.6，511-519，1976所描述。使用聚乙二醇(PEG)(如37％(v/v))PEG)的方法已经由Gefter等，Somatic Cell Genet.3，231-236，1977详细描述。使用电诱导的融合方法也是合适的。
[0373] 杂合体在包含阻断组织培养基中核苷酸的从头合成的试剂的选择性培养基中通过培养来增殖。示例性和优选的试剂是氨基蝶呤、氨甲喋呤和偶氮丝氨酸(azaserine)。氨基蝶呤和氨甲喋呤阻断嘌呤和嘧啶的从头合成，而偶氮丝氨酸仅阻断嘌呤合成。当使用氨基蝶呤和氨甲喋呤时，对培养基补充次黄嘌呤和胸腺嘧啶作为核苷酸的来源(HAT培养基)。当使用偶氮丝氨酸时，对培养基补充次黄嘌呤。
[0374] 优选的选择培养基是HAT，因为仅那些能够运行核苷酸补救途径的杂交瘤能够在HAT培养基中生存，而骨髓瘤细胞具有补救途径关键酶缺陷(例如，次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(hypoxanthine phosphoribosyl transferase)或称HPRT)，从而无法生存。B细胞可运行该补救途径，但其在培养物中具有有限的寿命，并通常在约两周内死亡。相应地，唯一能够在选择性培养基中生存的细胞是那些从骨髓瘤和B细胞形成的杂合体。
[0375] 对扩增的杂交瘤就抗体特异性和/或效价例如通过免疫测定法(例如，放射性免疫测定法、酶免疫测定法、细胞毒性测定法、噬菌斑测定法、斑点免疫测定法等)进行功能性选择。
[0376] 将选中的杂交瘤系列稀释并克隆入单独的抗体产生细胞系，然后可无限繁殖该克隆以提供MAb。可用两种基本方法利用所述细胞系以供MAb产生。将杂交瘤样品注射入用于提供初始融合体的体细胞和骨髓瘤细胞的类型的组织相容性动物(通常为其腹膜腔)。受注射的动物形成肿瘤，所述肿瘤分泌由所述融合细胞杂合体产生的特异性单克隆抗体。然后可将所述动物的体液(如血清或腹水)引流，以提供高浓度的MAb。也可将单独的细胞系在体外培养，其中MAb自然地分泌至培养基中，其可以以高浓度从所述培养基方便地获得。可进一步使用过滤、离心和多种层析方法(如HPLC或亲和层析)纯化(如需要)由任一手段产生的MAb。
[0377] 或者，使用ABL-MYC技术(NeoClone，Madison WI 53713，USA)产生分泌针对免疫原性KARI肽抗原的单克隆抗体(mAb)的细胞系。在此过程中，用一定量的该肽抗原对BALB/cByJ雌性小鼠进行免疫接种约2至约3个月。在此期间，以有规律性的间隔从经免疫接种的小鼠取测试血样以在标准ELISA中评价抗体应答。使用具有至少约1000抗体效价的小鼠脾以供后续使用包含癌基因v-abl和c-myc的无法复制(replication-incompetent)的逆转录病毒进行ABL-MYC感染。将脾细胞移植入首次接受测试的小鼠(naivemouse)，其便产生腹水，所述腹水包含产生针对KARI肽抗原的单克隆抗体(mAb)的细胞系。将mAb从腹水根据该mAb的同种型使用蛋白G或蛋白A纯化(例如，结合于固体基质)。由于不涉及杂交瘤融合，ABL-MYC方法具有更快、更划算，且比常规mAb产生方法产量更高的优点。此外，通过该方法产生的二倍体浆细胞瘤本质上比多倍体杂交瘤更加稳定，因为ABL-MYC逆转录病毒仅感染脾中被免疫接种的抗原刺激的细胞。然后ABL-MYC将这些激活的B-细胞转化为不死的mAb产生浆细胞，称作浆细胞瘤。“浆细胞瘤”为能够进行不受控制的细胞分裂的永生化的浆细胞。由于浆细胞瘤起初仅为一个细胞，所有从其产生的浆细胞瘤因此是同一的，而且，产生相同的所需“单克隆”抗体。其结果，无需分选不需要的细胞系。ABL-MYC技术一般地详细描述于下述公开：
[0378] 1.Largaespada等，Curr.Top.Microbiol.Immune-l.，166，91-96.1990；
[0379] 2.Weissinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，8735-8739，1991；
[0380] 3.Largaespada等，Oncogene，7，811-819，1992；
[0381] 4.Weissinger等，J.Immune-l.Methods 168，123-130，1994；
[0382] 5.Largaespada等，J.Immune-l.Methods.197(1-2)，85-95，1996；和
[0383] 6.Kumar等，Immune-.Letters 65，153-159，1999，
[0384] 其以提述的方式并入本文。
[0385] 本发明的单克隆抗体还包括由本领域众所周知的方法产生的抗独特型抗体。根据本发明的单克隆抗体还可为单克隆杂偶合体(heteroconjugate)，(即，两种或更多种抗体分子的杂合体)。在另一个实施例中，根据本发明的单克隆抗体是嵌合的单克隆抗体。在一个方法中，所述嵌合的单克隆抗体通过从小鼠抗KARI产生细胞克隆包含启动子、前导序列(leader)和可变区序列的重组DNA并从人抗体基因克隆恒定区外显子来进行工程改造。由上述重组基因编码的抗体是小鼠-人嵌合体。其抗体特异性由来源于小鼠序列的可变区确定。其同种型由恒定区确定，来源于人DNA。
[0386] 在另一个实施例中，根据本发明的单克隆抗体是“人源化的”单克隆抗体，其通过本领域众所周知的多种方法之任一而产生。即，将小鼠互补决定区(“CDR”)从小鼠Ig的重V链和轻V链转移至人的V域，然后用一些人残基在框架区替换其小鼠中对应残基。根据本发明的“人源化的”单克隆抗体特别适用于体内诊断和治疗方法。
[0387] 如上所述，根据本发明的单克隆抗体及其片段根据本领域众所周知的体外和体内方法进行增殖。体外增殖在合适的培养基(如Dulbecco氏改良Eagle培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium)或RPMI 1640培养基)中进行，任选地补充以哺乳动物血清(如胎牛血清)或痕量元素和维持生长的附加剂(supplement)(例如，饲养细胞(feeder cell)，如正常小鼠腹膜渗出物细胞，脾细胞，骨髓巨噬细胞等)。体外产生提供相对较纯的抗体制备物，并使得给出大量所需抗体的规模放大(scale-up)成为可能。供在组织培养条件下进行大规模杂交瘤培养的技术在本领域是已知的，且包括均一悬液培养(homogenous suspension culture)(例如，在气升式反应器或在持续搅拌反应器(continuous stirrer reactor)中或固定或截留的(entrapped)细胞培养)。
[0388] 大量本发明的单克隆抗体亦可通过在体内增殖杂交瘤细胞来获得。将细胞克隆注射入与亲细胞组织相容的哺乳动物(例如，同基因小鼠)，以引起抗体产生肿瘤的生长。任选地，在注射之前，用烃类，特别是油(如Pristane(四甲基十五烷))使所述动物预备(primed)。
[0389] 根据本发明，本发明的单克隆抗体的片段从上述产生的单克隆抗体获得，其方法包括用酶(如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化和/或通过化学还原来剪切二硫键。或者，本发明涵盖的单克隆抗体片段是使用自动肽合成仪合成的，或其可使用本领域已知技术手动产生。
[0390] 本发明的单克隆偶合物通过本领域已知方法制备，例如，通过将如上所述制备的单克隆抗体与例如酶，在偶联剂(如戊二醛或高碘酸)的存在下反应。与荧光素标志物的偶合物是在这些偶联剂的存在下，或通过与异硫氰酸酯反应制备的。与金属螯合物的偶合3 125 32 35 14 51
物是类似地产生的。其他抗体可偶合的部分包括放射性核素，例如，H、 I、P、S、C、Cr、
36 57 58 59 75 152
Cl、Co、Co、Fe、Se和 Eu。
物是类似地产生的。其他抗体可偶合的部分包括放射性核素，例如，H、 I、P、S、C、Cr、
36 57 58 59 75 152
Cl、Co、Co、Fe、Se和 Eu。
[0391] 本发明明确地包括偶联于任何可检测的配体或试剂的抗体，所述配体或试剂包括例如，酶(如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶)、或荧光团、放射性核素、有色染料、金微粒、胶体金等。
[0392] 本发明的放射性标记的单克隆抗体通过本领域已知方法产生。例如，将单克隆抗体通过与碘化钠或碘化钾以及化学氧化剂(如次氯酸盐)，或酶氧化剂(如乳过氧化物酶)99
相接触来碘化。根据本发明的单克隆抗体可用锝 通过配体交换方法来标记，例如，通过用亚锡溶液还原高锝酸盐(pertechnate)，将还原的锝螯合在Sephadex柱上，并将抗体施于该柱，或者，通过直接标记技术来标记(例如，通过将高锝酸盐，还原剂如SNCl2，缓冲溶液如酞酸钠-钾溶液和所述抗体一同温育)。
相接触来碘化。根据本发明的单克隆抗体可用锝 通过配体交换方法来标记，例如，通过用亚锡溶液还原高锝酸盐(pertechnate)，将还原的锝螯合在Sephadex柱上，并将抗体施于该柱，或者，通过直接标记技术来标记(例如，通过将高锝酸盐，还原剂如SNCl2，缓冲溶液如酞酸钠-钾溶液和所述抗体一同温育)。
[0393] 可使用任何免疫测定法以监测由KARI蛋白或其免疫原性片段或表位引起的抗体产生。免疫测定法就其最简单和直接的方面而言，是结合测定法。一些优选的免疫测定法是多种类型的本领域已知的酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射性免疫测定法(RIA)。使用组织切片的免疫-组织化学检测也是特别有用的。然而，应容易地理解，检测方法并不仅限于上述技术，且还可使用Western印迹、斑点印迹、FACS分析等。
[0394] 更优选地，所述测定法能够产生定量结果。
[0395] 举例而言，在简单的竞争测定法中对抗体进行测试。将结合于B细胞表位的已知抗体制备物和测试抗体与包含该B细胞表位(在此背景下其优选为天然抗原)的抗原组合物一同温育。本文中使用的“抗原组合物”指任何包含某些可接近的(accessible)形式的B细胞表位形式的任何组合物。特别优选抗原包被的ELISA板孔。在一个实施例中，将已知抗体在施于抗原组合物之前与多种量的测试抗体(例如，1∶1(v/v)、1∶10(v/v)和1∶100(v/v))预混合一段时间。如果已知抗体中的一种经标记，可直接检测结合于所述抗原的标记；将其与未混合的样品测定相比较将确定测试抗体的竞争程度，并因此确定相互反应性。或者，能够使用对已知或测试抗体具特异性的二抗确定竞争程度。
[0396] 结合于所述抗原组合物的抗体能够有效的与已知抗体竞争结合，因此会显著地减少后者的结合。用已知抗体在不存在任何测试抗体时的反应性作为对照。在测试抗体存在下反应性的显著减少表明测试抗体结合于B细胞表位(即，其与已知抗体交叉反应)。
[0397] 在一个示例性ELISA中，将结合于KARI蛋白或免疫原性片段或B细胞表位的抗体固定于显示蛋白亲和性的受选表面，如聚苯乙烯微滴定板中的孔。然后，将包含含B细胞表位的肽的组合物添加至孔。在结合并洗涤去除非特异性结合的免疫复合物之后，可检测出结合的表位。检测通常通过添加已知结合于所述B细胞表位并连接于可检测的标记的第二抗体来达成。该类型的ELISA是简单的“夹心ELISA”。检测也可通过添加所述第二抗体，然后添加对第二抗体具有结合亲和性的第三抗体来达成，其中所述第三抗体连接于可检测的标记。
[0398] 在一个替代性实施例(即，扩增ELISA)中，将结合于KARI蛋白或免疫原性片段或B细胞表位的抗体固定于显示蛋白亲和性的受选表面，如聚苯乙烯微滴定板中的孔。然后，将包含含B细胞表位的肽的组合物添加至孔。在结合并洗涤去除非特异性结合的免疫复合物之后，将结合于B细胞表位的抗体与结合的肽在足以形成复合物的条件下接触一段时间。然后使用二抗，和优选三抗进行扩增，所述抗体结合于识别B细胞表位的抗体。然后通过添加已知结合于所述二抗或三抗并连接于可检测标记的抗体来达成检测。
[0399] 在另一个示例性的，适用于流通(flow-through)和固相ELISA的免疫测定法形式，将结合于免疫原性KARI蛋白或免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或B细胞表位的抗体固定于显示蛋白亲和性的受选表面，如聚苯乙烯微滴定板的孔或者柱。将所述抗体结合的包含含所述B细胞表位的免疫原性KARI蛋白或免疫原性肽或免疫原性片段的样品在足以形成抗原-抗体复合物的条件下添加一段时间。在此情况下，添加的KARI蛋白、肽或片段与人Ig复合。举例而言，在患者血清的情况下，所述肽优选与人Ig依赖于患者针对结核分枝杆菌KARI蛋白的免疫应答而复合。在结合并洗涤去除非特异性结合的免疫复合物之后，通过添加已知在所述免疫复合物中结合于人Ig并连接于可检测标记的第二抗体来检测结合的表位。此为修饰的“夹心ELISA”。还可通过添加所述第二抗体，然后添加对于所述第二抗体具有结合亲和性的第三抗体来达成检测，其中所述第三抗体连接于可检测的标记。
[0400] 本发明的抗体可结合于固体支持物和/或在合适的容器中与合适的试剂、对照、说明书等一同包装于试剂盒。
[0401] 结合于次级分析物的抗体
[0402] 应理解本文中上述供产生针对KARI蛋白或其免疫原性片段产生抗体的方法可根据情况适当变动以适用于产生针对次级分析物的抗体，其用于免疫测定法形式，例如，为了对由结核分枝杆菌造成的感染或结核病进行诊断或预后的目的。如本领域技术人员应理解的，上述外推依赖于用KARI蛋白免疫原取代所述次级分析物，例如根据本文中任何实施例的结核分枝杆菌BSX蛋白或GS蛋白或S9蛋白或其免疫原性片段，或所述肽或表位或片段的组合或混合物。上述取代可根据本文的公开方便地无需任何不必要的实验尝试而进行。
[0403] 为方便起见，优选的供产生针对次级分析物(例如，用于多分析物基于抗原的测试)的抗体的免疫接种肽，包含选自下组的氨基酸序列：SEQ IDNO：3-60所述的氨基酸序列和其组合或混合物。
[0404] 举例而言，结合于结核分枝杆菌BSX蛋白的抗体可根据其全长蛋白(例如，包含SwissProt Database登录号O53759中所述的序列)或其肽片段来制备，所述肽片段包括例如选自下组的序列：MRQLAERSGVSNPYL(SEQ IDNO：3)、ERGLRKPSADVLSQI(SEQ ID NO：4)、LRKPSADVLSQIAKA(SEQID NO：5)、PSADVLSQIAKALRV(SEQ ID NO：6)、
SQIAKALRVSAEVLY(SEQ ID NO：7)、AKALRVSAEVLYVRA(SEQ ID NO：8)、VRAGILEPSETSQVR(SEQ ID NO：9)、TAITERQKQILLDIY(SEQ ID NO：10)、SQIAKALRVSAEVLYVRAC(SEQ ID NO：11)、MSSEEKLCDPTPTDD(SEQ ID NO：12)和VRAGILEPSETSQVRC(SEQ ID NO：13)及其组合。结合于免疫原性结核分枝杆菌BSX蛋白或肽以供检测由结核分枝杆菌造成的感染或结核病的抗体也详细描述于本申请人提交于2005年4月19日的国际专利申请PCT/AU2005/001254(WO
2006/01792)，其公开以提述的方式并入本文。
SQIAKALRVSAEVLY(SEQ ID NO：7)、AKALRVSAEVLYVRA(SEQ ID NO：8)、VRAGILEPSETSQVR(SEQ ID NO：9)、TAITERQKQILLDIY(SEQ ID NO：10)、SQIAKALRVSAEVLYVRAC(SEQ ID NO：11)、MSSEEKLCDPTPTDD(SEQ ID NO：12)和VRAGILEPSETSQVRC(SEQ ID NO：13)及其组合。结合于免疫原性结核分枝杆菌BSX蛋白或肽以供检测由结核分枝杆菌造成的感染或结核病的抗体也详细描述于本申请人提交于2005年4月19日的国际专利申请PCT/AU2005/001254(WO
2006/01792)，其公开以提述的方式并入本文。
[0405] 作为替代或附加手段，所述抗体结合于结核分枝杆菌谷氨酰胺合成酶(GS)蛋白(例如，包含SwissProt Database登录号O33342中所述的序列)或来源于
该蛋白的免疫原性肽，所述免疫原性肽例如包含GS蛋白表面暴露区，或包含序列
RGTDGSAVFADSNGPHGMSSMFRSF(SEQ ID NO：57)或WASGYRGLTPASDYNIDYAI(SEQ ID NO：58)或其组合。结合于免疫原性结核分枝杆菌GS或肽以供检测由结核分枝杆菌造成的感染或结核病的抗体也详细描述于本申请人提交于2005年6月24日的国际专利申请PCT/
AU2005/000930(WO 2006/000045)，其公开以提述的方式并入本文。
该蛋白的免疫原性肽，所述免疫原性肽例如包含GS蛋白表面暴露区，或包含序列
RGTDGSAVFADSNGPHGMSSMFRSF(SEQ ID NO：57)或WASGYRGLTPASDYNIDYAI(SEQ ID NO：58)或其组合。结合于免疫原性结核分枝杆菌GS或肽以供检测由结核分枝杆菌造成的感染或结核病的抗体也详细描述于本申请人提交于2005年6月24日的国际专利申请PCT/
AU2005/000930(WO 2006/000045)，其公开以提述的方式并入本文。
[0406] 本发明明确地考虑了针对除了BSX或GS或S9或其免疫原性片段之外的次级分析物的抗体，对其描述仅就例示的目的而提供。
[0407] 供检测结核病或结核分枝杆菌感染的诊断/预后方法
[0408] 1.基于抗原的测定法
[0409] 本发明提供了在受试者中诊断由结核分枝杆菌造成的感染或结核病的方法，包括在来自所述受试者的生物样品中检测KARI蛋白或其免疫原性片段或表位，其中样品中所述蛋白或免疫原性片段或表位的存在指示感染。
[0410] 检测结核分枝杆菌抗原，而非基于抗体的测定法的一个好处是，严重免疫妥协的患者可能并不产生可检测水平的抗体，且在任何患者中抗体的水平并不反应杆菌负载(bacilli burden)。在另一方面，抗原水平应反应杆菌负载，且作为所述杆菌的产物，为直接检测其存在的方法。
[0411] 在本发明的诊断测定法的一个实施例中，提供了在受试者中检测结核分枝杆菌感染的方法，所述方法包括将来源于所述受试者的生物样品与能够结合于KARI蛋白或其免疫原性片段或表位的抗体相接触，并检测抗原-抗体复合物的形成。
[0412] 优选地，怀疑所述受试者罹患由结核分枝杆菌造成的感染或结核病，和/或有形成结核病的风险，或有受结核分枝杆菌感染的风险。
[0413] 在另一个实施例中，本发明的诊断测定法可用于在受试者中确定由结核分枝杆菌造成的感染或结核病的进展。依照本发明的这些预后性应用，KARI蛋白或其免疫原性片段或表位在生物样品中的水平与感染状态正相关。举例而言，KARI蛋白或其免疫原性片段的水平低于罹患结核病或感染的症状的受试者中可检测出的KARI蛋白或片段的水平表明受试者正从感染恢复。类似地，所述蛋白或片段在来自受试者的样品中的水平比健康个体较高表明所述受试者并未完全摆脱所述疾病或感染。
[0414] 相应地，本发明的另一个实施例提供了确定具有由结核分枝杆菌造成的感染或结核病的受试者对使用治疗化合物对所述结核病或感染进行治疗的反应的方法，所述方法包括在来自所述受试者的生物样品中检测KARI蛋白或其免疫原性片段或表位，其中相比在正常或健康的受试者中可检测出的所述蛋白或片段或表位增强水平的所述蛋白或片段或表位表明所述受试者并未响应所述治疗，或尚未完全摆脱疾病或感染。
[0415] 在另一个实施例中，本发明提供了确定具有由结核分枝杆菌造成的感染或结核病的受试者对使用治疗化合物对所述结核病或感染进行治疗的反应的方法，所述方法包括在来自所述受试者的生物样品中检测KARI蛋白或其免疫原性片段或表位，其中所述蛋白或片段或表位的水平低于在罹患由结核分枝杆菌造成的感染或结核病中可检测出的蛋白或片段或表位的水平表明所述受试者响应所述治疗，或已经完全摆脱了疾病或感染。明确而言，如果KARI蛋白或其片段或表位的水平在受试者中无法检测出，则所述受试者对治疗有反应。
[0416] 在另一个实施例中，将来源于患者的生物样品中的KARI蛋白的量与在之前来源于相同患者的生物样品中检测的相同蛋白的量进行比较。如对于本领域技术人员显而易见，该方法可用于持续地监测具有潜在感染的患者或形成结核病的患者。以此方法，可就感染或疾病的发作或进展对患者进行监测，其目标为在感染确立之前就开始治疗，特别是对于HIV+的个体。
[0417] 作为替代或附加手段，可将在来源于罹患结核病的受试者的生物样品中检测的蛋白的量与参照样品比较，其中所述参照样品来源于一个或多个不再罹患感染或疾病的结核病患者，或一个或多个最近接受了成功的对感染治疗的结核病患者，和/或一个或多个不再具有结核病并不再罹患感染或疾病的受试者。
[0418] 在一个实施例中，未在参照样品中检测出KARI蛋白或其免疫原性片段，然而，在患者样品中检测出了所述KARI蛋白或其免疫原性片段，表明所述样品来源的患者正罹患由结核分枝杆菌造成的感染或结核病，或将发生急性感染。
[0419] 或者，KARI蛋白或其免疫原性片段的量与参照样品中检测出的水平相比可以是增强的。同样，这表明所述生物样品所分离自的患者正罹患由结核分枝杆菌造成的感染或结核病，或会发生急性感染。
[0420] 在本文中描述的诊断/预后方法的一个实施例中，所述生物样品是之前从所述受试者获得的。依照上述实施例，所述预后或诊断方法是离体进行的。
[0421] 还在另一个实施例中，本主题诊断/预后方法还包括加工来自受试者的样品以产生包括所述分析物的衍生物或提取物(例如，胸膜液或痰或血清)。
[0422] 合适的样品包括来自下述组织的提取物：如脑、乳房、卵巢、肺、结肠、胰、睾丸、肝、肌肉和骨组织，或体液，如痰、血清、血浆、全血、血清或胸膜液。
[0423] 优选地，所述生物样品是选自下组的体液或组织样品：唾液、血浆、血、血清、痰、尿液和肺。并不排除其他样品。
[0424] 从本文的描述，显而易见优选的样品可包含下述循环的免疫复合物，所述免疫复合物包含与人免疫球蛋白复合的KARI蛋白或其片段。检测上述免疫复合物明确地落入本发明的保护范围内。依照该实施例，捕捉试剂例如用于捕捉KARI抗原(KARI蛋白、多肽或其免疫活性的片段或表位)的捕捉抗体除了与受试者循环中的分离的抗原复合之外，还与所述受试者的免疫球蛋白复合。抗Ig抗体，任选地偶合于可检测的标记，用于特异性的结合被捕获的CIC，由此检测CIC患者样品。在本发明的保护范围内，所述抗Ig抗体优先结合于样品中的IgM、IgA或IgG。在特别优选的实施例中，所述抗Ig抗体结合于人Ig，例如人IgA、人IgG或人IgM。所述抗Ig抗体可偶合于本领域已知的任何标准的可检测标记。这对于检测由病原体(例如，细菌或病毒)造成的感染，或对于诊断任何与CIC相关的疾病或病症是特别有用的。相应地，可对根据本文中任何实施例描述的诊断方法进行修饰，其中来源于所述受试者的样品包含一种或多种下述循环免疫复合物，所述免疫复合物包含结合于结核分枝杆菌KARI蛋白或其一种或多种免疫原性KARI肽、片段或表位的免疫球蛋白(Ig)，且其中检测抗原-抗体复合物的形成包括将抗-Ig抗体与所述循环免疫复合物免疫球蛋白部分在足以形成复合物的条件下相接触一段时间，然后检测结合的抗-Ig抗体。
[0425] 本发明明确地涵盖供诊断由结核分枝杆菌造成的感染的多分析物测试。举例而言，供检测结合于结核分枝杆菌KARI蛋白的抗体的测定法可与供检测结核分枝杆菌BSX或谷氨酰胺合成酶(GS)蛋白的测定法组合。在此方面，本发明人还产生了下述浆细胞瘤，所述浆细胞瘤产生结合于BSX或GS的免疫原性片段或肽或表位的单克隆抗体。
[0426] 2.基于抗体的测定法
[0427] 本发明提供了在受试者中诊断由结核分枝杆菌造成的感染或结核病的方法，包括在来自所述受试者的生物样品中检测结合于KARI蛋白或其免疫原性片段或表位的抗体，其中所述抗体在样品中的存在指示感染。所述感染可为过去的或现在的感染，或潜在感染。
[0428] 优选地，怀疑所述受试者罹患由结核分枝杆菌造成的感染或结核病，和/或有形成结核病的风险，和/或有受结核分枝杆菌感染的风险。
[0429] 基于抗体的测定法主要用于检测由结核分枝杆菌造成的活动感染(activeinfection)。优选地，考虑受试者的临床史，因为在由结核分枝杆菌造成的最近过去的感染或慢性感染中可能存留残余的抗体水平。
[0430] 该形式是廉价并高度敏感的，然而，对于在免疫妥协的个体中检测感染并不像基-于抗原的测定法形式一样有用。然而，基于抗体的测定法显然可用于在HIV 或非免疫妥协+
的HIV 个体中检测结核分枝杆菌感染。
的HIV 个体中检测结核分枝杆菌感染。
[0431] 在另一个实施例中，本发明提供了在受试者中检测结核分枝杆菌感染的方法，所述方法包括将来源于受试者的生物样品与KARI蛋白或其免疫原性片段或表位相接触并检测抗原-抗体复合物的形成。
[0432] 在本文中所述的基于抗体的测定法中，优选用于检测所述抗体的KARI蛋白或其免疫原性片段或表位与来自未受感染的受试者并无高度交叉反应性。相应地，分离的或重组的KARI优选用于本文中所述的基于抗体的平台。
[0433] 在另一个实施例中，本发明的诊断测定法可用于确定受试者中由结核分枝杆菌造成的感染或结核病的进展。依照本发明的这些预后性应用，在来自受试者的血液或血清、血浆或免疫球蛋白级分中结合于KARI蛋白或片段或表位的抗体的量与感染状态正相关。举例而言，针对其的抗KARI蛋白的水平低于在罹患结核病或感染的症状的受试者中可检测出的抗KARI蛋白抗体的水平表明所述受试者正从感染恢复。类似地，所述抗体在来自受试者的样品中比健康个体高的水平表明所述受试者并未完全摆脱所述疾病或感染。
[0434] 在本发明的另一个实施例中，提供了确定具有由结核分枝杆菌造成的感染或结核病的受试者对使用治疗化合物对所述结核病或感染进行治疗的反应的方法，所述方法包括在来自所述受试者的生物样品中检测结合于KARI蛋白或其免疫原性片段或表位的抗体，其中相比在正常或健康的受试者中可检测出的抗体水平增强的抗体的水平表明所述受试者并未响应所述治疗或并未完全摆脱疾病或感染。同样，优选分离的或重组的KARI蛋白。
[0435] 在另一个实施例中，本发明提供了确定具有由结核分枝杆菌造成的感染或结核病的受试者对使用治疗化合物对所述结核病或感染进行治疗的反应的方法，所述方法包括在来自所述受试者的生物样品中检测结合于KARI蛋白或其免疫原性片段或表位的抗体，其中所述抗体的水平低于在罹患由结核分枝杆菌造成的感染或结核病的受试者中可检测出的抗体的水平表明所述受试者对所述治疗有反应或已经完全摆脱了疾病或感染。
[0436] 在来自罹患结核病的受试者的生物样品中检测出的针对KARI蛋白或片段的抗体的量可与参照样品相比较，其中所述参照样品来源于一个或多个之前并未感染结核分枝杆菌或最近并未感染结核分枝杆菌的健康受试者。上述阴性对照受试者会具有低的循环抗体效价，这使其成为基于抗体的测定法形式中合适的标样。举例而言，结合于KARI蛋白或其免疫原性片段的抗体无法在所述参照样品中检测出，且仅在患者样品中检测出，表明所述样品来源的患者正罹患由结核分枝杆菌造成的感染或结核病，或会发生急性感染。分离的或重组的KARI蛋白优选用于上述实施例。
[0437] 在本文中所述的诊断/预后方法的一个实施例中，所述生物样品是之前从所述受试者获得的。依照上述实施例，所述预后或诊断方法是离体进行的。
[0438] 还在另一个实施例中，本主题的诊断/预后方法还包括加工来自所述受试者的样品以产生包含所述分析物的衍生物或提取物(例如，血、血清、血浆或任何含免疫球蛋白的样品)。
[0439] 合适的样品包括，例如，来自包含免疫球蛋白的组织(如血、骨)的提取物，或体液如血清、血浆、全血、血清的含免疫球蛋白的级分、血浆的含免疫球蛋白的级分、血的含免疫球蛋白的级分。
[0440] 3.检测系统
[0441] 本文中考虑到的优选的检测系统包括任何已知用于在从人受试者分离的生物样品中检测蛋白或抗体的测定法，例如，SDS/PAGE，等电聚焦，二维凝胶电泳包括SDS/PAGE和等电聚焦，免疫测定法，使用抗体或蛋白的非抗体配体的基于检测的系统，所述配体例如小分子(例如，化合物、蛋白的激动剂、拮抗剂、变构调节剂(allosteric modulator)、竞争性抑制剂或非竞争性抑制剂)。依照这些实施例，所述抗体或小分子可用于任何适用于检测蛋白的标准的固相或溶液相测定法形式。本发明明确地涵盖光学或荧光检测，例如，使用质谱法、MALDI-TOF、生物传感技术(biosensor technology)、瞬时的光纤(evanescent fiber optics)、或荧光共振能量转移。特别涵盖了适用于高通量筛选大量样品的测定系统，特别是高通量光谱共振方法(例如，MALDI-TOF、电喷射MS或纳米电喷射(nano-electrospray)MS)。
[0442] 特别优选免疫测定法形式，例如，选自下组的免疫测定法：免疫印迹、Western印迹、斑点印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定法(RIA)酶免疫测定法。使用荧光共振能量转移(FRET)、同位素编码亲和标记(ICAT)、质谱(例如基质辅助激光解吸/电离飞行时间(matrix-assisted laserdesorption/ionization time of flight，MALDI-TOF)、电喷射电离(ESI)、生物传感技术、瞬时的光纤技术或蛋白芯片技术的修饰的免疫测定法也是有用的。
[0443] 优选地，所述测定法是半定量测定法或定量测定法。
[0444] 标准的固相ELISA形式对确定来自多个患者样品的蛋白或抗体的浓度是特别有用的。
[0445] 在一种形式，如一种测定法中，涉及将包含抗KARI蛋白抗体的生物样品，或者KARI蛋白或其免疫原性片段固定于固体基质上，例如，聚苯乙烯或聚碳酸酯微孔或浸渍片、膜或玻璃支持物(例如，玻璃载玻片)上。
[0446] 在基于抗原的测定法的情况下，将特异性结合KARI蛋白的固定的抗体与所述生物样品直接接触，并与其在所述样品中的任何靶蛋白形成直接键合。对于基于抗体的测定法，将固定的分离的或重组的KARI蛋白或其免疫原性片段或表位与所述生物样品接触。在溶液中添加的抗体或蛋白通常用可检测的报道分子标记，例如，胶体金、荧光标记(例如FITC或Texas Red)或酶(例如，辣根过氧化物酶(HRP))，碱性磷酸酶(AP)或β-半乳糖苷酶)。作为替代或附加手段，可使用结合于第一抗体或所述分离的/重组的KARI抗原的第二标记抗体。在洗涤去除任何未结合的抗体或KARI抗原之后，所述标记可直接检测(在荧光标记的情况下)，或通过添加底物来检测，所述底物例如过氧化氢、TMB或甲苯胺，或5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖吡喃糖苷(x-gal)。
[0447] 上述基于ELISA的系统特别适用于对样品中蛋白或抗体的量进行定量，例如，通过将检测系统针对已知量的标样进行校准。
[0448] 在另一种形式中，ELISA由将特异性结合KARI蛋白的抗体固定于固体基质(例如，膜、聚苯乙烯或聚碳酸酯微孔、聚苯乙烯或聚碳酸酯浸渍片或玻璃支持物)上组成。然后使患者样品与所述抗体产生物理联系，样品中的抗原被结合或“被捕获(captured)”。然后可使用标记的抗体检测结合的蛋白。举例而言，如果所述蛋白是从人样品中捕获的，则使用抗人Ig抗体来检测被捕获的蛋白。
[0449] 本发明的该实施例的一个实施例包括：
[0450] (i)将特异性结合免疫原性KARI肽或KARI蛋白的抗体固定于固体基质或支持物上；
[0451] (ii)将结合的抗体与从受试者获得的样品在足以使得被固定的抗体结合于样品中的KARI蛋白或其片段并由此形成抗原-抗体复合物的条件下相接触一段时间，优选所述样品为含抗体的样品，如血、血清或其含Ig的级分；和
[0452] (iii)在下述方法中检测形成的抗原-抗体复合物，所述方法包括将所述复合物与识别人Ig的抗体相接触，其中所述人Ig的存在表明结核分枝杆菌在患者样品中的存在。
[0453] 依据该实施例，固定的抗体的特异性保证分离的或经免疫复合的KARI蛋白或包含所述抗体识别的表位的片段实际上结合，而抗人Ig的特异性保证仅检测经免疫复合的KARI蛋白或片段。在此语境下，术语“经免疫复合的(immune-complexed)”应指患者样品中KARI蛋白或其片段与人Ig(如人IgA或人IgM或人IgG等)复合。相应地，该实施例对检测在受试者中产生了免疫应答的结核分枝杆菌的存在或由结核分枝杆菌造成的感染的存在是特别有用的。通过适当地选取检测抗体，例如，抗人IgA或抗人IgG或者抗人IgM，还可以确定所述受试者免疫应答涉及的同种型。上述结合于人IgA、IgM或IgG的抗体检测对于本领域而言是公众可获得的。
[0454] 作为前述实施例的替代或附加手段，可使用结合第二(检测)抗体的第三标记抗体。
[0455] 对于本领域技术人员显而易见本文中所述的测定法形式可适用于高通量形式，例如筛选方法的自动化，或适用于微点阵形式，如描述于Mendoza等，Biotechniques 27(4)：778-788，1999的。此外，上述测定法的变化(例如，竞争性ELISA)对于本领域技术人员而言是显而易见的。
[0456] 或者，抗-KARI蛋白抗体，或者KARI蛋白或其免疫原性片段的存在，是使用放射性免疫测定法(RIA)检测的。该测定法的基本原理是使用放射性标记的抗体或抗原以检测抗体抗原相互作用。举例而言，特异性结合于KARI蛋白的抗体可结合于固体支持物，且将生物样品与所述抗体直接接触。为了检测结合的抗原，将经放射性标记的分离和/或重组形式的抗原与相同的抗体相接触。在洗涤之后，检测结合的放射性强度的量。因为生物样品中的任何抗原抑制经放射性标记的抗原的结合，检测出的放射性强度的量与样品中抗原的量成反比。上述测定法可通过使用利用递增的已知浓度的分离抗原的标准曲线来量化。
[0457] 对于本领域技术人员显而易见，上述测定法可经修饰以使用任何报道分子替换放射性标记，所述报道分子，例如，酶或荧光分子。
[0458] Western印迹也可用于检测KARI蛋白或其免疫原性片段。在上述测定法中，来自生物样品的蛋白使用十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)使用本领域众所周知的技术来分离，所述技术描述于，例如Scopes(In：Protein Purification：Principles and Practice，Third Edition，SpringerVerlag，1994)。然后将分离的蛋白使用本领域众所周知的方法(例如电转移)转移至固体支持物，例如，膜，或更具体地，硝酸纤维素膜、尼龙膜或PVDF膜。然后将该膜封闭，并用特异性结合KARI蛋白的标记的抗体或配体探测。或者，可使用标记的第二或甚至第三抗体或配体以检测特异性一抗的结合。
[0459] 特别优选供检测抗-KARI蛋白抗体，或者KARI蛋白或其免疫原性片段存在与否的高通量方法。
[0460] 在一个实施例中，使用质谱法(例如MALDI-TOF)以供快速鉴定经一维或二维凝胶电泳分离的蛋白。相应地，无需使用特异性结合于目标蛋白的抗体或配体以检测目标蛋白。相反，使用凝胶电泳使用本领域已知方法分离来自生物样品的蛋白，并使用MALDI-TOF分析在大约正确分子量和/或等电点的那些蛋白以确定目标蛋白的存在与否。
[0461] 或者，使用质谱法(例如，MALDI或ESI，或方法的组合)以确定特定蛋白在生物样品(例如痰)中的浓度。上述蛋白优选之前就其参数(如分子量和等电点)已经被良好地表征。
[0462] 生物传感装置通常将电极表面与整合入装置的电流或阻抗测定元件的组合与测定底物组合使用(如描述于美国专利号5,567,301中的)。优选将特异性结合于目标蛋白的抗体掺入生物传感装置的表面，并将从患者分离的生物样品(例如，使用本文中所述的方法溶解的痰)与所述装置相接触。由所述生物传感装置检测到的电流或阻抗的变化表明蛋白结合于所述抗体或配体。本领域中已知的一些形式的生物传感器亦依赖于质子表面共振(surfaceplasmon resonance)以检测蛋白相互作用，其中质子表面共振表面反射的变化指示蛋白结合于配体或抗体(美国专利号5,485,277和5,492,840号)。
[0463] 由于将上述系统应用于微米或纳米尺度的便利性，生物传感器特别适用于高通量分析。此外，上述系统可方便地应用于合并几种检测试剂，使得在单一生物传感器单元中并行处理多个诊断试剂成为可能。这使得同时检测少量体液中的几种表位成为可能。
[0464] 还优选瞬时的生物传感器(evanescent biosensor)，因其无需在检测目标蛋白之前预处理生物样品。瞬时的生物传感器通常依赖于具预决波长的光与荧光分子(例如，附加于探针表面附近的荧光抗体)的相互作用，以在诊断性蛋白结合于抗体或配体时发射不同波长的荧光。
[0465] 为了产生蛋白芯片，将能够结合特定抗体或目标蛋白的蛋白、肽、多肽、抗体或配体结合于固体支持物(例如玻璃、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、聚苯乙烯、二氧化硅、金属或氮化硅)。该固定过程是直接的(例如，通过共价连接，例如，Schiff碱形成、二硫键连接或酰胺或尿键形成)或间接的。生成蛋白芯片的方法在本领域是已知的，并描述于，例如美国专利申请号20020136821、20020192654、20020102617和美国专利号6,391,625。为了将蛋白结合于固体支持物，常常需要处理所述固体支持物从而在其表面形成化学反应性基团，例如，用含醛的硅烷试剂处理。或者，可将抗体或配体捕获在微加工的(microfabricated)聚丙烯酰胺凝胶垫上，并使用如描述于Arenkov等Anal.Biochem.278：123-131，2000的微电泳加速进入凝胶中。
[0466] 优选如此生成蛋白芯片，从而使得几种蛋白、配体或抗体排列在所述芯片上。该形式使得同时在样品中筛选几种蛋白的存在成为可能。
[0467] 或者，蛋白芯片可仅包含一种蛋白、配体或抗体，并用于就一种目标多肽的存在筛选一个或多个患者样品。上述芯片还可用于就目标多肽同时筛选一个阵列的患者样品。
[0468] 优选地，将待使用蛋白芯片分析的样品附于报道分子，例如可使用本领域众所周知的方法检测出的荧光分子、放射性分子、酶或抗体。相应地，通过将蛋白芯片与标记样品相接触，并随后洗涤去除任何未结合的蛋白，可使用本领域众所周知的方法(例如，使用DNA微点阵读数器(DNA microarrayreader)检测结合的蛋白的存在。
[0469] 或 者，使 用 生 物 分 子 相 互 作 用 分 析 -质 谱 法 (biomolecular interactionanalysis-mass spectrometry，BIA-MS)以快速地检测并表征以低至亚飞摩尔(fmol)水平存在于复杂生物样品中的蛋白(Nelson等Electrophoresis 21：
1155-1163，2000)。一种在分析蛋白芯片中有用的技术是用表面增强的激光解吸/电离飞行时间质谱法(surface enhanced laser desorption/ionization-time offlight-mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)技术以表征结合于所述蛋白芯片的蛋白。或者，所述蛋白芯片是使用ESI如描述于美国专利申请20020139751来进行分析的。
1155-1163，2000)。一种在分析蛋白芯片中有用的技术是用表面增强的激光解吸/电离飞行时间质谱法(surface enhanced laser desorption/ionization-time offlight-mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)技术以表征结合于所述蛋白芯片的蛋白。或者，所述蛋白芯片是使用ESI如描述于美国专利申请20020139751来进行分析的。
[0470] 如本领域技术人员显而易见，蛋白芯片特别适用于并行处理多种检测试剂。相应地，可将分别能够特异性结合于不同肽或蛋白的几种抗体或配体结合于所述蛋白芯片的不同区域。使用所述芯片分析生物样品便使得检测多种目标蛋白，或KARI蛋白的多个B细胞表位成为可能。本发明特别地考虑了并行处理多种诊断和预后标志物。
[0471] 在另一个实施例中，使用ICAT或ITRAC分析样品，基本上如美国专利申请20020076739所述。该系统依赖于用试剂标记来自一个来源(即，健康个体)的蛋白样品，并用第二试剂标记来自另一个来源(即，结核病患者)的蛋白样品，第二试剂与第一试剂在化学上是同一的，但由于同位素组成在分子量上有所不同。优选第一和第二样品还包含生物素分子。然后将等浓度两种样品混合，并通过亲和素亲和层析回收肽。然后使用质谱法分析样品。重和轻肽离子之间峰高度的任何差异与生物样品中蛋白丰度的差异直接相关。
然后，上述蛋白的身份可使用本领域众所周知的方法确定，例如MALDI-TOF或ESI。
然后，上述蛋白的身份可使用本领域众所周知的方法确定，例如MALDI-TOF或ESI。
[0472] 在一个特别优选的实施例中，对包含抗-KARI蛋白抗体，或者KARI蛋白或其免疫原性片段的生物样品进行二维凝胶电泳。依照该实施例，优选在电泳之前例如通过离心、过滤或离心和过滤的组合去除某些颗粒状物质。然后分离生物样品中的蛋白。举例而言，所述蛋白可根据其电荷使用等电聚焦和/或根据其分子量进行分离。二维分离使得鉴定蛋白的多种同种型成为可能，因为具有相似分子量的蛋白还通过其电荷分离。使用质谱法，可以确定目标蛋白是否存在于患者样品中。
[0473] 如对本领域技术人员显而易见，本文中所述的诊断或预后测定法可为多路并行处理的(multiplexed)测定法。本文中使用的术语“多路并行处理”)应理解为不仅指在单一样品中同时检测两种或更多种诊断或预后标志物，但还涵盖在单一样品中连续检测两种或更多种诊断或预后标志物、在不同但匹配的样品中同时检测两种或更多种诊断或预后标志物，以及在不同但匹配的样品中连续检测两种或更多种诊断或预后标志物。本文中使用的术语“匹配的样品”应理解为指来源于相同的初始生物样品的两个或更多个样品，或在相同时间点分离的两个或更多个生物样品。
[0474] 相应地，多路并行处理的测定法可包括在相同反应中同时检测几个抗-KARI蛋白抗体和/或KARI表位的测定法，或者，其可检测除了一种或多种抗-KARI蛋白抗体和/或KARI表位之外的其他一种或多种抗原/抗体。
[0475] 本发明明确地涵盖供检测除了通过细胞表面的一种或多种受体检测CD4+T辅助细胞和/或一种或多种HIV-1和/或HIV-2抗原之外检测KARI蛋白抗体和KARI表位的多路并行处理方法。上述测定法对同时获得针对结核分枝杆菌和HIV-1和/或HIV-2的共感染的信息，和/或确定具有结核分枝杆菌的受试者是否免疫妥协是特别有用的。显然，上述多路并行处理的测定法形式可用于监测HIV+/TB+个体的健康。
[0476] 如本领域技术人员显而易见，如果上述测定法是基于抗体或配体的，则这些抗体均必需在相同条件下起作用。
[0477] 4.生物样品和参照样品
[0478] 优选地，对其中KARI蛋白或抗-KARI蛋白抗体进行检测的生物样品是选自下组的样品：肺、肺相关的淋巴样组织、鼻旁窦、支气管、细支气管、肺泡、呼吸道具纤毛的粘膜上皮、呼吸道的粘膜上皮、支气管肺泡灌洗液(BAL)、肺泡衬液(alveolar lining fluid)、痰、粘液、唾液、血液、血清、血浆、尿液、腹膜液、心包液、胸膜液、呼吸道的鳞状上皮细胞、肥大细胞、杯形细胞、肺细胞(1型或2型)、内上皮树突状细胞(intra epithelial dendritic cell)、PBMC、嗜中性粒细胞、单核细胞或所述组织、液体或细胞中任意一种或多种的任何含免疫球蛋白的级分。
[0479] 在一个实施例中，生物样品是之前从受试者获得的。
[0480] 优选地，怀疑所述样品所获得自的受试者罹患结核病或受结核分枝杆菌感染和/或具有形成结核病的风险和/或具有受结核分枝杆菌感染的风险。
[0481] 在一个实施例中，生物样品从受试者通过选自下组的方法获得：手术或其他切出方法、吸取(aspiration)体液(如高张生理盐水或丙二醇)、支气管肺泡灌洗、支气管镜检查、用玻璃试管、唾液小杯(salivette)(Sarstedt AG，Sevelen，Switzerland)、Ora-sure(Epitope Technologies Pty Ltd，Melbourne，Victoria，Australia)、omni-sal(Saliva Diagnostic Systems，Brooklyn，NY，USA)搜集唾液和使用本领域众所周知的任何方法收集血，例如，使用注射器。
[0482] 特别优选的生物样品是痰，其使用例如描述于Gershman，N.H.等，JAllergy Clin Immune-l，10(4)：322-328，1999的方法从患者肺分离。优选地，所述痰是咳出的(expectorated)，即天然咳出来的。
[0483] 在另一个优选的实施例中，生物样品是从患者使用本领域众所周知的方法收集的血中分离出的血浆。
[0484] 在一个实施例中，处理生物样品以裂解所述样品中的细胞。上述方法包括使用洗涤剂、酶、反复冻融所述细胞、声处理(sonication)或在玻璃珠的存在下涡旋振荡所述细胞，等等。
[0485] 在另一个实施例中，处理生物样品以使得存在于所述样品的蛋白变性。蛋白变性的方法包括加热样品，用2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、N-乙酰基半胱氨酸、洗涤剂或其他化合物(例如，胍或尿素)处理样品。举例而言，优选使用DTT以供液化痰。
[0486] 还在另一个实施例中，处理生物样品以浓缩所述样品中的蛋白。浓缩蛋白的方法包括沉淀、冻干、使用漏斗管凝胶(funnel tube gel)(TerBush andNovick，Journal of Biomolecular Techniques，10(3)；1999)、超滤或透析。
[0487] 如显而易见的，本发明提供的诊断和预后方法需要一定程度的定量以确定对感染或疾病进展诊断或预后的蛋白的量。上述定量可通过在本文中所述的测定法中包括合适的参照样品来确定，其中所述参照样品来源于健康的或正常的个体。
[0488] 在一个实施例中，所述参照样品包含例如来自之前或最近未经感染并未罹患感染或疾病的健康受试者的细胞、液体或组织。方便地，上述参照样品是来自液体或无需手术切除或介入来获取的组织。相应地，优选体液及其衍生物。高度优选的参照样品包括痰、粘液、唾液、血液、血清、血浆、尿、BAL液、腹膜液、心包液、胸膜液、PBMC、嗜中性粒细胞、单核细胞或所述组织、液体或细胞中任意一种或多种的任何含免疫球蛋白的级分。
[0489] 对参照样品和测试(或患者)样品进行加工、分析或测定，并比较自参照样品和测试样品获得的数据。在一个实施例中，对参照样品和测试样品同时进行加工、分析或测定。在另一个实施例中，对参照样品和测试样品在不同时间进行加工、分析或测定。
[0490] 在另一个实施例中，测定法中并不包括参照样品。作为替代，可从之前生成的确立的数据组中推出参照样品。相应地，在一个实施例中，参照样品包括来自健康个体样本群体研究(sample popular study of healthy individuals)的数据，例如，对于经测试的实体中健康范围的统计学显著数据。然后将从测试样品的加工、分析或测定推出的数据与对于样品群体获得的数据比较。
[0491] 从足够大量以致代表群体的参照样品获得的数据使得生成供确定具体参数的平均水平的数据组成为可能。相应地，可对于个体的任何群体和对于来源于所述个体的任何样品确定对感染或疾病为诊断性或预后性的蛋白的量，以供随后与针对待测定的样品确定的表达产物的水平相比较。当依赖于上述经标准化的数据组时，优选在每个进行的测定法中包括内部对照以就变动进行对照。
[0492] 诊断性测定法试剂盒
[0493] 本发明提供了供在生物样品中检测结核分枝杆菌感染的试剂盒。在一个实施例中，所述试剂盒包含：
[0494] (i)一种或多种结合于KARI蛋白或其免疫原性片段或表位的抗体；和
[0495] (ii)供检测抗原-抗体复合物形成的手段。
[0496] 在另一个实施例中，所述试剂盒包括：
[0497] (i)分离的或重组的KARI蛋白或其免疫原性片段或表位；和
[0498] (ii)供检测抗原-抗体复合物形成的手段。
[0499] 本主题试剂盒的抗体、免疫原性KARI肽和检测手段优选选自本文中上述的抗体和免疫原性KARI肽，且该实施例应自其描述以提述的方式并入本文。对于任何测定法形式选取相容的试剂盒组分对于本领域技术人员容易地根据描述显而易见。
[0500] 在一个特别优选的实施例中，本主题试剂盒包括：
[0501] (i)结合于分离的或重组的KARI蛋白或其免疫原性片段或表位的抗体；和
[0502] (ii)抗人Ig。
[0503] 优选地，所述试剂盒还包括一定量的全长KARI蛋白的一种或多种免疫原性肽片段或任何两种或更多种所述肽的融合物。
[0504] 任选地，所述试剂盒还包括供检测抗体、其片段或配体对KARI蛋白结合的手段。上述手段包括报道分子，例如酶(如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、底物、辅因子、抑制剂、染料、放射性核素、发光基团(luminescent group)、荧光基团(fluorescent group)、生物素或胶体颗粒(如胶体金或硒)。优选上述报道分子直接连接于所述抗体或配体。
[0505] 还在另一个实施例中，试剂盒还可包括参照样品。上述参照样品可例如，为来源于从一个或多个结核病受试者分离的生物样品的蛋白样品。或者，参照样品可包括从一个或多个正常健康个体分离的生物样品。上述参照样品任选地包含于供诊断或预后测定法的试剂盒中。
[0506] 在另一个实施例中，参照样品包含由抗体或配体检测的肽。优选地，所述肽是已知浓度的。上述肽特别地用作标样。相应地，多种已知浓度的上述肽可使用本文中所述的预后或诊断测定法进行检测。
[0507] 还在另一个实施例中，试剂盒任选地包含供样品制备的手段，例如，细胞裂解的手段。优选地，上述手段为溶解痰的手段，例如洗涤剂(例如，三丁基膦、C7BZO、硫酸右旋糖酐、DTT、N-乙酰基半胱氨酸或聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯(polyoxyethylenesorbitan monolaurate))。
[0508] 还在另一个实施例中，试剂盒包含供蛋白分离的手段(Scopes(In：ProteinPurification：Principles and Practice，Third Edition，Springer Verlag，
1994)。
1994)。
[0509] 预防和治疗方法
[0510] KARI蛋白或其免疫原性片段或表位，当施于动物受试者时，可诱导特异性产生高效价抗体。
[0511] 相应地，本发明提供了引发针对结核分枝杆菌的抗体产生的方法，包括将分离的KARI蛋白或其免疫原性片段或表位在足以引发抗体(例如，结合于结核分枝杆菌的中和抗体)产生的条件下施于所述受试者一段时间。
[0512] 还在足以引发抗体(例如，结合于结核分枝杆菌的中和抗体)产生的条件下施用一种或多种第二抗原(例如结核分枝杆菌BSX或S9或GS或其免疫原性片段)一段时间是落在本发明的保护范围内的。上述施用可为与施用KARI蛋白或片段同时进行(即，共施用)，或者，在将KARI蛋白或片段施于受试者之前或之后进行。
[0513] 优选地，根据前述任何实施例的中和抗体为高效价的中和抗体。
[0514] 用于产生抗体的KARI蛋白或其他蛋白或其表位的有效量根据所述免疫原性B细胞表位的特性、给药途径、用于免疫接种的动物和寻求的抗体的特性变动。所有上述变量可通过本领域已知手段凭经验确定。
[0515] 在一个优选的实施例中，本发明提供了在受试者中诱导针对结核分枝杆菌的免疫性的方法，包括将分离的或重组的KARI蛋白或其免疫原性片段或表位在足以引发针对所述分离的或重组的KARI蛋白或其免疫原性片段或表位的体液免疫应答的条件下施于所述受试者一段时间。
[0516] 还在足以引发针对该抗原的体液免疫应答的条件下施用一种或多种第二抗原(例如结核分枝杆菌BSX或S9或GS或其免疫原性片段)一段时间也落在本发明的保护范围内。上述施用可为与施用KARI蛋白或片段同时进行(即，共施用)，或者，在将KARI蛋白或片段施于受试者之前或之后进行。
[0517] 免疫接种的抗原可如本文中所述以任何方便的配制剂的形式施用。
[0518] “体液免疫应答”指针对免疫接种的抗原生成足以阻止由结核分枝杆菌造成的感染的次级免疫应答。
[0519] 优选地，生成的体液免疫性包括在受试者中引发持续水平的结合于免疫接种抗原中B细胞表位的抗体。“持续水平的抗体”指足以结合于B细胞表位以阻止由结核分枝杆菌造成的感染的循环抗体的水平。
[0520] 优选地，抗体水平持续至少约六个月或9个月或12个月或2年。
[0521] 在另一个实施例中，本发明提供了增强受试者免疫系统的方法，包括在足以在所述受试者中赋予或增强针对结核分枝杆菌的抗性的条件下施用具免疫活性的KARI蛋白或其表位或包含所述KARI蛋白或表位的疫苗组合物一段时间。
[0522] 还在足以在所述受试者中赋予或增强针对结核分枝杆菌的抗性的条件下施用一种或多种第二抗原(例如结核分枝杆菌BSX或S9或GS或其免疫原性片段)一段时间也落在本发明的保护范围内。上述施用可为与施用KARI蛋白或片段同时进行(即，共施用)，或者，在将KARI蛋白或片段施于受试者之前或之后进行。
[0523] “赋予或增强抗性”指发生在所述受试者中的结核分枝杆菌特异性免疫应答，所述应答选自下组：
[0524] (i)在所述受试者中产生针对结核分枝杆菌的KARI蛋白或所述蛋白的表位的抗体；
[0525] (ii)在所述受试者中产生结合于结核分枝杆菌的中和抗体；
[0526] (iii)在受试者中激活对结核分枝杆菌的KARI蛋白具有特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和/或CTL前体；和
[0527] (iv)受试者具有针对后续结核分枝杆菌感染或潜在结核分枝杆菌感染的再激活的增强免疫性。
[0528] 本发明应理解为涵盖在未受感染的人受试者中提供或增强针对结核分枝杆菌免疫性的方法，包括在足以提供针对由结核分枝杆菌造成的将来感染的免疫记忆的条件下将具免疫活性的KARI蛋白或其表位，或包含所述KARI蛋白或表位的疫苗组合物施于所述受试者一段时间。
[0529] 还在足以提供针对由结核分枝杆菌造成的将来感染的免疫记忆的条件下施用一种或多种第二抗原(例如结核分枝杆菌BSX或GS或其免疫原性片段)一段时间也落在本发明的保护范围内。上述施用可为与施用KARI蛋白或片段同时进行(即，共施用)，或者，在将KARI蛋白或片段施于受试者之前或之后进行。
[0530] 本发明提供了在受试者中治疗结核病的方法，包括进行本文中所述的诊断方法或预后方法。
[0531] 在一个实施例中，本发明提供了预防方法，包括：
[0532] (i)在来自受试者的生物样品中检测结核分枝杆菌感染的存在：和
[0533] (ii)施用治疗上有效量的本文中所述的药物组合物以减少受试者的肺、血液或淋巴系统中病原性杆菌数。
[0534] 如从本文的公开显而易见，根据该实施例的合适的组合物包括KARI蛋白或其免疫原性片段，任选地与一种或多种其他免疫原结核分枝杆菌蛋白或肽片段一起，与药学上可接受的载体或赋形剂组合。包含根据本发明任何实施例的KARI蛋白或其片段，或肽或表位或片段的组合或混合物，以及一种或多种第二抗原(例如结核分枝杆菌BSX和/或S9和/或Rv1265和/或EF-Tu和/或P5CR和/或TetR和/或GS或其免疫原性片段，例如SEQID NO：3-60中任一所述的或其组合/混合物)的上述组合物也落在本发明的保护范围内。
[0535] 优选地，将所述组合物施用于携带潜在的或活动的结核分枝杆菌感染的受试者。
[0536] 虽不愿拘于任何理论或作用模式，但所述治疗方法增强T细胞识别并裂解携带结核分枝杆菌的细胞的能力，或瞬时地或以持续方式增强T细胞识别结核分枝杆菌抗原的T细胞表位的能力。类似地，可在激活潜在的结核分枝杆菌感染之后，或在重新感染结核分枝杆菌之后，或者用本发明的KARI蛋白或表位或疫苗组合物对之前经感染的受试者进行免疫接种之后重新激活T细胞群体。可使用标准方法来确定CTL激活是否发生于受试者中(例如，使用细胞毒性测定法、ELISPOT)或在受试者的PBMC中确定IFN-γ的产生。
[0537] 优选地，将所述肽或衍生物或变体或疫苗组合物在足以引发或增强CD8+T细胞的扩展的条件下施用一段时间。还更优选地，将所述肽或衍生物或变体或疫苗组合物在足以在受试者中增强结核分枝杆菌特异性细胞介导免疫(CMI)的条件下施用一段时间。
[0538] “结核分枝杆菌特异性CMI”指激活的和克隆扩展的CTL是MHC限制性的(MHC-resctricted)，并对本发明的CTL表位具有特异性。CTL是基于抗原特异性和MHC限制性来进行分类的(即，非特异性CTL和抗原特异性、MHC限制性CTL)。非特异性CTL由多种细胞类型组成，包括NK细胞和抗体依赖性细胞毒性，且可在免疫应答中非常早地起作用以减少病原体负载，此时抗原特异性应答仍在确立之中。与之相对，MHC限制性的CTL在与非特异性CTL相比较晚时取得最优的活性，通常是在抗体产生之前。抗原特异性CTL抑制或减少结核分枝杆菌的传播，并优选地结束感染。
[0539] CTL激活、克隆扩展或CMI可为系统性诱导的或区域性局限的(compartmentally localized)。在区域性局限的作用的情况下，优选使用适当地配制为供施用于该区域的疫苗组合物。在另一方面，对在受试者中系统性诱导CTL激活、扩展或CMI并无上述严格的限制。
[0540] KARI蛋白或其表位，任选地与一种或多种其他蛋白或表位组合(例如，来源于结核分枝杆菌的BSX或GS或S9蛋白)单独施用或在疫苗组合物中施用以引发CTL激活、克隆扩展或CMI的有效量，根据免疫原性表位的特性，给药途径，进行免疫接种的受试者的体重、年龄、性别和一般健康情况，以及所寻求的CTL应答的特性而变动。所有上述变量是通过本领域已知手段凭经验确定的。
[0541] 将KARI蛋白或其表位，任选地与一种或多种其他蛋白或表位组合(例如，来源于结核分枝杆菌的BSX或GS或S9蛋白)，并任选地与任何合适的或需要的载体、佐剂、BRM或药学上可接受的赋形剂配制，以可注射的组合物形式方便地进行给药。注射可为鼻内、肌肉内、皮下、静脉内、皮内、腹膜内或其他已知的途径。对于静脉内注射，包含一种或多种液体和营养补充剂是理想的。
[0542] 待施用的最优剂量和优选的给药途径是使用动物模型确立的，例如，通过用包含所述肽的配制剂注射小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、马、牛、山羊或猪，并然后使用任何常规测定法监测针对所述表位的CTL免疫应答。
[0543] 也可使用过继转移(adoptive transfer)以赋予或增强针对结核分枝杆菌感染的抗性或阻止或减少重新激活的潜在感染的严重性。相应地，在相关的实施例中，提供了在未感染的人类受试者中增强或赋予针对结核分枝杆菌的免疫性的方法，包括在离体情况下将从人受试者获得的T细胞与具免疫活性的KARI蛋白或其表位或包含所述蛋白或表位的疫苗组合物在足以赋予所述T细胞针对结核分枝杆菌的活性的条件下接触一段时间。
[0544] 在一个优选的实施例中，本发明提供了增强人受试者的结核分枝杆菌特异性细胞介导免疫的方法，所述方法包括：
[0545] (i)在离体情况下将从人受试者得到的T细胞与具免疫活性的KARI蛋白或其CTL表位或包含所述蛋白或表位的疫苗组合物在足以赋予所述T细胞针对结核分枝杆菌的活性的条件下接触一段时间；和
[0546] (ii)将激活的T细胞自体引入所述受试者，或同种异体引入另一个人受试者。
[0547] 如本文中所述的其他实施例，本发明涵盖施用附加的免疫原性蛋白或表位，例如，来源于结核分枝杆菌BSX或S9或GS蛋白的。
[0548] 所述T细胞可为CTL或CTL前体细胞。
[0549] 所述T细胞所获得自的人受试者可为与受治疗的受试者相同或不同的受试者。受治疗的受试者可为任何携带潜在或活动结核分枝杆菌感染或有结核分枝杆菌感染或结核分枝杆菌感染重新激活风险的人受试者，或者其他情况下需要获得针对结核分枝杆菌疫苗接种或渴望获得针对结核分枝杆菌疫苗接种的人。
[0550] 上述过继转移方法的进行优选如Einsele等，Blood 99，3916-3922，2002所述进行，而结核分枝杆菌反应性的测定基本上也根据该文献所述进行，该方法以提述的方式并入本文。
[0551] “结核分枝杆菌活性”意指使得T细胞能够如本文中上述定义一般被激活(即，所述T细胞会识别并裂解携带结核分枝杆菌的细胞，或能够识别结核分枝杆菌抗原的T细胞表位，无论是瞬时地还是以持续的方式)。相应地，特别优选所述T细胞为CTL前体，其通过本发明的方法使其能够识别和裂解携带结核分枝杆菌的细胞或能够识别结核分枝杆菌抗原的T细胞表位，无论是瞬时地还是以持续的方式。
[0552] 对于上述离体应用，所述T细胞优选包含于从人受试者获得的生物样品中，例如包含初级或中枢淋巴样器官(例如，骨髓或胸腺)或次级或外周淋巴样器官(例如，血、PBMC或由其来源的暗黄覆盖层级分(buffy coat fraction))的活检样本。
[0553] 优选地，所述T细胞或包含T细胞的样本是之前从人受试者获得的，例如，通过与将所述样本委托病理学实验室进行分析的医师进行磋商。
[0554] 优选地，本主题方法还包括获得包含所述受试者的T细胞的样品，且更优选地，从所述受试者获得所述样品。
[0555] 配制剂
[0556] 本发明明确地涵盖了KARI蛋白或其免疫原性片段或表位在制备针对人或其他动物受试者中结核分枝杆菌感染的治疗性或预防性亚单位疫苗中的用途。
[0557] 相应地，本发明提供了包含KARI蛋白或其免疫原性片段或表位与药学上可接受的稀释剂组合的药物组合物或疫苗。
[0558] 在一个优选的实施例中，根据该实施例的组合物包含KARI蛋白或其免疫原性片段，任选地还包括一种或多种其他免疫原性结核分枝杆菌蛋白或肽片段，与药学上可接受的载体或赋形剂的组合。包含根据本发明任何实施例的KARI蛋白或其片段，或肽或表位或片段的组合或混合物，以及一种或多种第二抗原(例如结核分枝杆菌BSX和/或S9和/或Rv1265和/或EF-Tu和/或P5CR和/或TetR和/或GS或其免疫原性片段，例如SEQ IDNO：3-60中任一所述的或其组合/混合物)的上述组合物显然落在本发明的保护范围内。
[0559] 方便地将所述KARI蛋白，以及任选地其他蛋白，或其免疫原性片段或表位配制于药学上可接受的赋形剂或稀释剂中，例如，水性溶剂、非水性溶剂、无毒赋形剂(如盐)、防腐剂、缓冲液等。非水性溶剂的实施例为丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射的有机酯，如油酸乙酯。水性溶剂包括水、醇/水溶液、生理盐水溶液、非消化道溶剂载体(parenteral vehicle)(如氯化钠)、Ringer’s葡萄糖(Ringer’s dextrose)等。防腐剂包括抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。所述药物组合物多种组分的pH和准确浓度根据本领域一般技术进行调整。
[0560] 在某些情况下，亦可能想要将所述KARI蛋白以及任选地，其他蛋白或其免疫原性片段或表位，与佐剂一同配制以增强对B细胞表位的免疫应答。同样，严格意义上这并非必需的。上述佐剂包括任何可接受的免疫刺激性化合物(immune-stimulatory compound)，例如，细胞因子、毒素或合成组合物。示例性的佐剂包括IL-1、IL-2、BCG、氢氧化铝、N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thur-MDP)、N-乙酰基-去甲-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11637，称作去甲-MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1’，2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酸基氧)-乙醇胺(CGP)1983A，称作MTP-PE)、脂质A、MPL和RIBI，其包含三种从细菌提取的组分：单磷酸脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)在2％鲨烯/Tween 80中的乳液。
[0561] 特别优选用于针对结核分枝杆菌的疫苗的佐剂，例如，描述于Elhay和Andersen Immune-l.Cell Biol.75，595-603，1997；or Lindblad et al.，Infect.Immun.65，1997。
[0562] 可能想要将生物应答调节剂(BRM)与所述KARI蛋白或其免疫原性片段或表位共同给药，以下调抑制性T细胞的活性。示例性的BRM包括但不仅限于，西咪替丁(CIM；1200mg/d)(Smith/Kline，PA，USA)；吲哚美辛(IND；150mg/d)(Lederle，NJ，USA)；或低剂量的环磷酰胺(CYP；75、150或300mg/m.sup.2)(Johnson/Mead，NJ，USA)。
[0563] 供施用所述KARI蛋白或任选的其他蛋白或其免疫原性片段或表位的优选载体(vehicle)包括脂质体。脂质体是由一种或多种围绕水性区室的脂质双层组成的微观囊 泡 (microscopic vesicle)(Bakker-Woudenberg 等，Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.12(Suppl.1)，S61(1993)；and Kim，Drugs 46，618(1993))。脂质体在组成上与细胞膜相似，因此脂质体通常可安全的给药，并为生物可降解的。
[0564] 供制备脂质体和与脂质体配制(例如，包埋)多种分子(包括肽和寡核苷酸)的技术对本领域技术人员是众所周知的。
[0565] 取决于制备方法，脂质体可为单层的或多层的，且其大小可从0.02μm至大于10μm的范围内变动。多种试剂可包埋于脂质体中。疏水物质(hydrophobic agent)分配于双层中，而亲水物质(hydrophilic agent)分配在内部水性空间内(Machy等，LIPOSOMES IN CELL BIOLOGY ANDPHARMACOLOGY(John Libbey 1987)，和Ostro等，American J.Hosp.Pharm.46，1576(1989))。
[0566] 脂质体还可吸附于几乎任何类型的细胞，然后释放其包埋的试剂。或者，所述脂质体与靶细胞融合，从而将脂质体的内含物排空至靶细胞。或者，吸附的脂质体可被吞噬性的细胞胞吞(endocytose)。在胞吞作用(endocytosis)之后发生脂质体脂质的溶酶体内降解，并释放出包埋的物质(Scherphof等，Ann.N.Y.Acad.Sci.446，368(1985))。在本文的语境下，KARI蛋白或其免疫原性片段或表位可位于脂质体的表面，以便于抗原呈递，而无需对所述脂质体进行破坏或胞吞作用。然而，无论机理或递送为如何，结果是相关的KARI蛋白或其免疫原性片段或表位布置于胞内。
[0567] 脂质体载体可为阴离子的或阳离子的。阴离子脂质体载体包括在胞吞作用或内体酸化之后破坏内体膜或与内体膜融合的pH敏感性脂质体。阳离子脂质体优选用于在体外介导哺乳动物细胞转染或核酸的一般性递送，但可用于递送其他治疗剂，如肽或脂肽。
[0568] 阳离子脂质体制备物是通过常规方法制备的(Feigner等，Proc.Nat′l Acad.Sci USA 84，7413(1987)；Schreier，Liposome Res.2，145(1992))。商业性制备物，如Lipofectin(Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，Md.USA)，可容易地获得。待给药的脂质体量基于剂量响应曲线来进行优化，Feigner等，见上。
[0569] 其他用于本发明方法中的合适的脂质体包括多层囊泡(multilamellarvesicles，MLV)、寡层囊泡(oligolamellar vesicles，OLV)、单层囊泡(unilamellarvesicles，UV)、小型单层囊泡(small unilamellar vesicles，SUV)、中等大小单层囊泡(medium-sized unilamellar vesicles，MUV)、大型单层囊泡(largeunilamellar vesicles，LUV)、巨大型单层囊泡(giant unilamellar vesicles，GUV)、多泡囊泡(multivesicular vesicles，MVV)、通过反相蒸发方法制备的单层或寡层囊泡(single or oligolamellar vesicles made by reverse-phase evaporationmethod，REV)、通过反相蒸发方法制备的多层囊 泡 (multilamellar vesiclesmade by the reverse-phase evaporation method，MLV-REV)、稳定多层囊泡(stable plurilamellar vesicles，SPLV)、冻融MLV(frozen and thawed MLV，FATMLV)、通过挤出方法制备的囊泡(vesicles prepared by extrusion methods，VET)、通过弗氏压碎器制备的囊泡(vesicles prepared by French press，FPV)、通过融合制备的囊泡(vesicles prepared by fusion，FUV)、脱水-再水合囊泡(dehydration-rehydration vesicles，DRV)、以及水泡体(bubblesomes，BSV)。本领域技术人员会知道供制备这些脂质体的技术在本领域是众所周知的。(参见COLLOIDAL DRUG DELIVERY SYSTEMS，vol.66，J.Kreuter，编，Marcel Dekker，Inc.1994)。
[0570] 也考虑了其他形式的递送颗粒，例如，微球等，以供递送KARI蛋白和任选的其他蛋白，或其免疫原性片段或表位。
[0571] 制备合适的配制剂和药学上有效的溶剂载体的方法，例如，见于REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第 83-92章，第1519-1714页 (Mack Publishing Company1990)，其以提述的方式并入本文。
[0572] 或者，所述肽或衍生物或变体是作为细胞疫苗通过施用自体或同种异体的抗原呈递细胞(APC)或树突状细胞来配制的，所述细胞在体外经处理使得其在其表面呈递所述肽。
[0573] 还考虑了基于核酸的疫苗，其包含编码具免疫活性的KARI蛋白和任选的其他蛋白，或其表位的核酸(例如，DNA或RNA)，并克隆入合适的载体(例如，牛痘、金丝雀痘、腺病毒或其他真核病毒载体)。优选地，将编码KARI蛋白和任选的其他蛋白的DNA配制为DNA疫苗，例如，与现存的卡介苗(BCG)或免疫佐剂如牛痘病毒、弗氏佐剂或另一免疫刺激剂组合配制。
[0574] 本发明进一步参照下述非限定性实施例进行描述。
[0575] 实施例1
[0576] 样品收集和加工，抗体产生和免疫测定法
[0577] 使用下述一般方法进行样品收集和加工，抗体产生和衡量，其服从于后续实施例(即，实施例2及其后续)中的公开。使用在该实施例中提及的方法，除非在后续实施例(即，实施例2及其后续)中特别记载了另一种方法。在后续实施例中提及的方法应视为就该特定实施例而言。
[0578] 1.患者痰样品的收集
[0579] 使用TB阴性和TB阳性痰以衡量用于如后续实施例中所述的TB诊断的抗体对Becton，Dickinson & CO.，Research Triangle Park，Durham，NorthCarolina，USA获得了类似地未经加工的痰，并在本文中称作“痰-BD”。其他样品从在Johannesburg，South Africa的另一位置和从Health ConceptsInternational Limited，Thailand获得。
[0580] 2.痰的预处理
[0581] a)“痰-M1”
[0582] 在一个实施例中，本文中称作“痰-M1”的痰级分是通过将收集的痰1∶1(v/v)稀释至终浓度为在50mM磷酸盐缓冲液pH7.4中10mM新鲜制备的二硫苏糖醇(DTT)来制备的。适当地根据生产商或供应商的说明添加不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合(cocktail)片剂(Roche Molecular Biochemicals，Cat#1873580)以提供最终的1∶4(v/v)稀释的痰。将样品通过涡旋振荡搅拌约30秒，然后在4℃使用定轨振荡器(orbital shaker)或轻柔涡旋振荡混合30秒，小心避免大量的细胞裂解。然后将液化的痰以2000xg在4℃离心约10分钟以沉淀细胞并去除不溶物质。将上清在4℃以14000xg离心约10分钟，以沉淀细微的颗粒状物质。移除上清，并使用0.2μm孔径GD/X PVDF无菌过滤器过滤，并将滤过物保留并在-20℃冷冻储藏。
[0583] b)“痰-C1”
[0584] 在另一个实施例中，本文中称作“痰-C1”的痰级分是通过将收集的痰1∶1(v/v)稀释至终浓度为在50mM磷酸盐缓冲液pH7.4中10mM新鲜制备的二硫苏糖醇(DTT)来制备的。适当地根据生产商或供应商的说明添加不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合(cocktail)片剂(Roche Molecular Biochemicals，Cat#1873580)以提供最终的1∶2(v/v)稀释的痰。将样品通过涡旋振荡搅拌约30秒，然后在4℃使用定轨振荡器或轻柔涡旋振荡混合30秒，小心避免大量的细胞裂解。然后将液化的痰以2000xg在4℃离心约10分钟以沉淀细胞并去除不溶物质。将上清在4℃以14000xg离心约10分钟，以沉淀细微的颗粒状物质。移除上清，并不经过滤在-20℃冷冻储藏。
[0585] 3.加工冷冻的痰以供测定
[0586] 使用了四种不同的方法以供进一步加工如上所述制备的冷冻的经预处理的痰。
[0587] a)方法1
[0588] 如上所述制备的痰-M1(2.5mL)等同于约0.6mL未稀释的(“纯粹的”)痰。在此示例性的方法中，未对痰-M1进行进一步加工，将其用于使用17x150μL替代的替代ELISA测定中。
[0589] b)方法2
[0590] 如上所述制备的痰-C1(1.8mL)等同于0.9mL未稀释的(“纯粹的”)痰。在此示例性的方法中，将痰-C1通过丙酮沉淀减少至0.6mL的体积，用于使用4x150μL替代的替代ELISA测定中。具体而言，将痰-C1离心以去除不溶物质，将上清转移至未经使用的(fresh)试管中，并添加四倍(4)体积的冷丙酮，并将样品在-80℃温育30分钟，然后将其在4℃以4000xg离心30分钟以收集沉淀的蛋白级分。保留蛋白沉淀，并将其风干约30分钟，轻柔地重新溶解于0.6mL的50mM Tris pH 7.8，5mM MgCl2中。
[0591] c)方法3
[0592] 如上所述制备的痰-C1(9mL)等同于4.5mL未稀释的(“纯粹的”)痰。在此示例性的方法中，对痰-C1进行大小分级、脱盐并配为约0.6mL的体积，用于使用4x150μL替代的替代ELISA测定中。简言之，融解冷冻的痰-C1，调整为终浓度0.3mM EDTA，并添加4mL的50mM Tris7.8，5mM MgCl2。将样品在环境温度以4000xg离心20分钟以沉淀不溶物质。保留上清，转移至未经使用的试管，稀释于等体积的50mM Tris7.8，5mM MgCl2，上样于100kDa MW截取值的大小排阻旋转柱(size exclusion spin column)，并以4000xg在环境温度离心25分钟。保留洗脱物，并转移至5kDa MW截取值的大小排阻旋转柱，并以4000xg(环境温度)离心至少约60分钟或直至收集了～0.6mL的洗脱物。将样品体积用50mM Tris pH
7.8，5mM MgCl2调整为约0.62mL，以用于如上所述的替代ELISA测定法。
7.8，5mM MgCl2调整为约0.62mL，以用于如上所述的替代ELISA测定法。
[0593] d)方法4
[0594] 如上所述制备的痰-M1(18mL)等同于4.5mL未稀释的(“纯粹的”)痰。在此示例性的方法中，对痰-M1进行大小分级、脱盐并配为0.6mL的体积，用于使用4x150μL替代的替代ELISA测定中。简言之，融解冷冻的痰-M1，调整为终浓度0.3mM EDTA，并添加4mL的50mM Tris7.8，5mM MgCl2。将样品在环境温度以4000xg离心20分钟以沉淀不溶物质。保留上清，转移至未经使用的试管，稀释于等体积的50mM Tris7.8，5mM MgCl2，上样于100kDa MW截取值的大小排阻旋转柱，并以4000xg在环境温度离心25分钟。保留洗脱物，并转移至
5kDa MW截取值的大小排阻旋转柱，并以4000xg(环境温度)离心至少约60分钟或直至收集了～0.6mL的洗脱物。将样品体积用50mM Tris pH 7.8，5mM MgCl2调整为约0.62mL，以用于如上所述的替代ELISA测定法。
5kDa MW截取值的大小排阻旋转柱，并以4000xg(环境温度)离心至少约60分钟或直至收集了～0.6mL的洗脱物。将样品体积用50mM Tris pH 7.8，5mM MgCl2调整为约0.62mL，以用于如上所述的替代ELISA测定法。
[0595] 4.从痰、血清或血浆制备IgG级分
[0596] 将患者痰、血清或血浆在8.2ml免疫纯的IgG结合缓冲液(Pierce)中稀释，然后通过0.22μm过滤器进行过滤，然后上样于 Explorer(AmershamBiosciences)所附的蛋白A柱。用免疫纯Ag/Ab温和洗脱缓冲液(Pierce)洗脱结合的抗体。汇集洗脱的级分(结合于抗原的IgG)并置于冰上3小时以使得免疫复合物能够解离。然后将IgG级分通过经100000分子量截断值的柱(Millipore)过滤来从抗原级分分离。将两个级分和蛋白A柱的流过物用苯甲酰化的透析膜(Sigma)相对于4升的磷酸盐缓冲盐水pH 7.2在4℃透析过夜，然后再用4升缓冲液透析3小时。将所有的级分(流过物和来自所述100000截取值的柱的渗余物和蛋白A柱的流过物)以10份丙酮对1份样品的比例在-20℃用丙酮
沉淀1小时，然后以4000g旋转20分钟。将沉淀的样品溶解于包含5M尿素，2M硫脲，2％CHAPS，2％ SB3-10和40mM Tris的样品缓冲液中至约2mg/ml的终浓度，然后用5mM三丁基膦还原并用10mM丙烯酰胺烷化1.5小时。通过添加DTT至10mM的终浓度来淬灭烷化反应。将样品分为200μl的等分试样并储藏于-20℃。
沉淀1小时，然后以4000g旋转20分钟。将沉淀的样品溶解于包含5M尿素，2M硫脲，2％CHAPS，2％ SB3-10和40mM Tris的样品缓冲液中至约2mg/ml的终浓度，然后用5mM三丁基膦还原并用10mM丙烯酰胺烷化1.5小时。通过添加DTT至10mM的终浓度来淬灭烷化反应。将样品分为200μl的等分试样并储藏于-20℃。
[0597] 5.选择用于诊断测定法的结核分枝杆菌抗原
[0598] 选择用于基于抗原的诊断测定法的结核分枝杆菌抗原的主要标准是其存在于TB阳性的痰中，以及其免疫原性，以提供简单的诊断测试。在TB阳性痰中如下述段落所描述鉴定候选抗原。
[0599] a)确定蛋白含量
[0600] 样品的蛋白含量使用Bradford测定法进行估计。在重新水合IPG条之前，将样品以21000xg离心10分钟。收集上清并每毫升添加10μl 1％ Orange G(Sigma)作为指示剂染料(indicator dye)。
[0601] b)二维凝胶电泳
[0602] 第一维
[0603] 将干燥的11cm IPG条(Amersham-Biosciences)用180μl蛋白样品重新水合16-24小时。将经重新水合的条在Protean IEF Cell(Bio-Rad，Hercules，CA)或Proteome System’s IsoElectrIQ电泳装置上聚焦大约140kVhr，最大值为10kV。然后将经聚焦的条平衡于尿素/SDS/Tris-HCl/溴酚蓝缓冲液中。
[0604] c)第二维
[0605] 将 经 平 衡 的 条 插 入 6-15 ％ (w/v)Tris- 乙 酸 SDS-PAGE 预 浇 的10cmx15cmGelChips(Tyrian Diagnostics，Sydney Australia)的上样孔中。以每个凝胶50mA进行1.5小时的电泳，或直至示踪染料(tracking dye)到达凝胶的底部。使用SyproRuby(Molecular Probes)对来自渗余物级分或流过物级分的蛋白进行染色。用银对来自洗脱物级分的蛋白根据Shevchenko等(Anal Chem.68(5)：850-8，1996)的方法进行染色。在脱色之后使用AlphaImager System(AlphaInnotech Corp.)扫描凝胶图像。然后用Coomassie G-250对凝胶进行染色以帮助使后续分析中蛋白斑点(protein spot)可视化。
[0606] d)质谱法
[0607] 在进行质谱分析之前，通过胶内(in-gel)胰蛋白酶消化来制备蛋白样品。使TM用Xcise ，一种与Montage In-Gel Digestion Kit(由Tyrian Diagnostics开发，并由Millipore，Billerica，Ma，01821，USA发售(distribute))相结合的切出/液体处理机器人(Tyrian Diagnostics，Sydney，Australia和Shimadzu-Biotech，Kyoto，Japan)将蛋白凝胶块切出、脱色、消化并脱盐。在切割斑点之前，将2-D凝胶在水中温育以保持恒定的尺寸并防止干燥。然后，将2-D凝胶置于Xcise上，拍摄数字图像，并选取待切割的斑点。在自动切出斑点之后，对凝胶块进行自动液体处理和胶内消化。简言之，用100μl的50％(v/v)乙腈/100mM碳酸氢铵对每个斑点进行脱色。通过添加100％乙腈对凝胶块进行干燥，5秒钟后去除乙腈，并通过在37℃蒸发剩余的乙腈将所述凝胶完全干燥。蛋白分解消化是通过用30μl包含5μg/mL经修饰的猪胰蛋白酶的50mM碳酸氢铵(pH 7.8)将干燥的凝胶块重新水合，并在37℃温育过夜来进行的。
[0608] 如果需要进行附加的液相层析(LC)-电喷射电离(ESI)MS分析，将十微升(10μl)经胰蛋白酶消化的肽混合物移除至干净微滴定板上。
[0609] 在MALDI MS之前的自动脱盐和浓缩经胰蛋白酶消化的肽是使用基于R2的层析进行的。将吸附的肽使用2μl的90％(v/v)乙腈和0.085％(v/v)TFA中的2mg/ml α-氰基4-羟基肉桂酸从尖部洗脱至384-位MALDI-TOF样品靶板(sample target plate)上
(Kratos，Manchester，UK or Bruker Daltronics，Germany)。
(Kratos，Manchester，UK or Bruker Daltronics，Germany)。
[0610] 使用Axima-CFR MALDI MS质谱仪(Kratos，Manchester，UK)以阳离子反射模式(positive ion reflectron mode)分析消化产物(digest)。使用具有337nm波长的氮气激光器(nitrogen laser)照射样品。只保存超过特定标准的谱。谱以自动模式在600Da至4000Da的分子量范围对每个样品点施以64-点光栅来获取。对所有的光谱使用自体消化的胰蛋白酶峰分子量，m/z 842.51Da以及掺入的促肾上腺皮质激素(ACTH)肽，m/z 2465.117Da进行内部两点校准(internal two point calibration)。使用如包含于TM
基于网络的蛋白组学数据管理系统BioinformatIQ (Tyrian Diagnostics)中的由Tyrian Diagnostics设计的软件来从MS谱提取同位素峰。
基于网络的蛋白组学数据管理系统BioinformatIQ (Tyrian Diagnostics)中的由Tyrian Diagnostics设计的软件来从MS谱提取同位素峰。
[0611] 蛋白鉴定是通过将经胰蛋白酶消化的肽的单同位素分子量(即，肽分子量指纹)与来自蛋白数据库的理论分子量使用IonIQ或MASCOT数据库搜索软件(Proteome System Limited，North Ryde，Sydney，Australia)进行匹配来进行的。查询(query)是针对非冗余的SwissProt(Release 40)和TrEMBL(Release20)数据库(2002年6月版本)进行的，并通过MOWSE评分系统的修饰来对蛋白身份进行分类(rank)。考虑到了丙酰胺-半胱氨酸(cys-PAM)或羧酰胺基甲基-半胱氨酸(cys-CAM)和氧化的甲硫氨酸修饰，并允许100ppm的分子量容限(tolerance)。
[0612] 仅在初始不考虑错切(miscleavage)的搜索进行之后考虑错切位点。使用下述标准来衡量搜索结果：MOWSE评分，与候选蛋白匹配的肽的数量和强度，匹配的肽对候选蛋白序列的覆盖，以及凝胶上的位置。
[0613] 作为附加或替代手段，使用LC-ESI-MS分析蛋白。将经胰蛋白酶消化的蛋白溶液(10μl)通过纳米流(nanoflow)LC/MS使用配备了由自动采样器和泵组成的Surveyor LC系统的LCQ Deca Ion Trap质谱仪(ThermoFinnigan，SanJose，CA)来进行分析。将肽使用偶联于C18 PicoFrit柱(New Objective)的PepFinder试剂盒(Thermo-Finnigan)进行分离。在30-60分钟的期间进行从含0.1％(v/v)甲酸(流动相A)至含0.1％(v/v)甲酸(流动相B)的90％(v/v)乙腈的梯度洗脱。将质谱仪设定为获得三个扫描事件：一次全扫描(从400-2000amu)，继以两次数据依存性MS/MS扫描。
[0614] e)生物信息学分析
[0615] 在自动收集了质谱峰之后，如下所述处理数据。对所有的谱首先检查肽分子量的正确校准。然后对谱进行处理以去除背景噪音，包括对应于胰蛋白酶峰和基质的分子量。然后将数据针对公众可获得的SwissProt和TrEMBL数据库使用Tyrian Diagnostics搜索引擎IonIQ v69和/或MASCOT。将PSD数据针对相同数据库使用内部的搜索引擎FragmentastIQ进行搜索。还将LCMS-MS数据使用SEQUEST搜索引擎软件针对该数据库进行搜索。
[0616] 6.对于诊断测定法验证结核分枝杆菌抗原和抗体
[0617] 对候选诊断标志物和抗体的验证是通过在来源于命名为H37Rv的结核分枝杆菌实验室菌株的培养物的全细胞裂解液(WCL)中，和来源于命名为CSU93、HN898和CDC1551的两个结核分枝杆菌临床菌株的培养物的全细胞裂解液(WCL)中，使用根据本发明任何实施例所述的扩增ELISA系统来确定相应的内源抗原的存在来进行的。亦使用了细胞的胞质溶胶级分、细胞膜、细胞壁、和全细胞裂解液的滤过物。选取在所有菌株中可检测出的抗原和抗体以供进一步验证。
[0618] 候选诊断标志物和抗体的验证还通过在来源于非分枝杆菌生物(例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和酿酒酵母)的培养物的全细胞裂解液(WCL)中使用根据本发明下文所述的扩增ELISA系统来确定相应的内源抗原的特异性表达来进行的。还使用了全细胞裂解液的滤过物。优选在结核分枝杆菌中特异性检出的抗原和抗体。
[0619] 候选诊断标志物和抗体的验证还通过在来源于命名为H37Rv的结核分枝杆菌实验室菌株的培养物的全细胞裂解液(WCL)中使用根据本发明下文所述的扩增ELISA系统来确定相应的内源抗原的特异性表达，并将其与在其他分枝杆菌菌种例如鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌中的表达相对比(opposeto)来进行的。亦使用了全细胞裂解液的滤过物。优选由特定抗体特异性在结核分枝杆菌中特异性检测出的抗原，然而并不舍弃亦表达于鸟分枝杆菌和/或胞内分枝杆菌中的那些。这是因为测试样品中任何分枝杆菌的诊断性测试作为预先的一般性测定(generic assay)是有用的，且可与针对结核分枝杆菌的菌种特异性测试一同使用，例如，使用本文中公开的特异性诊断标志物和/或培养测试以确定结核分枝杆菌的存在与否。
[0620] 7.全细胞裂解液的制备
[0621] 从冻干的结核分枝杆菌细胞中提取蛋白。将细胞重悬于提取缓冲液，并在砂磨机(bead mill)中加工以使细胞破裂并释放蛋白。通过离心沉淀细胞碎片，并使用上清作为全细胞裂解液(WCL)。进行Bradford比色测定法以估计蛋白浓度。在一些情况下，使用来自Colorado State University的胞质溶胶提取物。
[0622] 8.抗体产生方法
[0623] 抗体通过用来源于如后续实施例中所述鉴定的结核分枝杆菌的特异性免疫原性蛋白的合成的免疫原性肽进行免疫接种来制备，或者，通过用使用标准方法通过重组手段产生的结核分枝杆菌全长免疫原性蛋白或结核分枝杆菌免疫原性蛋白的免疫原性片段来制备。对于重组蛋白或片段的产生，将编码所述免疫原的结核分枝杆菌菌株H37Rv的DNA序列分离并克隆入合适的载体以供在大肠杆菌中表达，并通过标准的层析技术纯化表达的蛋白或片段。
[0624] b)单克隆抗体
[0625] 使用全长重组蛋白，或来源于全长序列的肽片段作为抗原根据标准方法进行抗体产生。将大约5mg肽/蛋白提供给NeoClone，Madison，Wisconsin以供根据其标准实验方案进行单克隆抗体的生成。提供了约1mg肽/蛋白作为生物素化产物以供质量控制(quality control)。
[0626] 用蛋白根据Neoclone的标准免疫接种方法对BALB/cByJ雌性小鼠进行接种。以规则的间隔进行经免疫接种的小鼠的测试放血以用于使用生物素化的肽的质量控制血清ELISA。使用ELISA确定具有最高效价的多克隆血清。将具有至少1000多克隆抗体效价的小鼠用于ABL-MYC感染方法。将具有与肽抗原交叉反应的多克隆抗体的最高效价的约3-5只小鼠的脾根据NeoClone的标准感染方法用于ABL-MYC感染。将经ABL-MYC感染的小鼠的脾细胞移植入约20只未经实验的(naive)小鼠。分离在经移植的小鼠中形成的腹水，并就产生结合于靶肽抗原的单克隆抗体(mAb)的细胞进行筛选。
[0627] 分离了产生mAb的细胞系(即，浆细胞瘤)。使用ELISA确证了结合亲和性和同种型特异性。将mAb以1ml等分试样(大约)的腹水与相关的细胞系一同提供。对当使用标准方法测定时具有高效价的那些单克隆抗体制备物，如本文中所述进行进一步的诊断测试，使用所述单克隆血清作为捕捉和/或检测试剂。所述mAb是从腹水使用蛋白G或蛋白A柱纯化的。
[0628] c)多克隆抗体
[0629] 多克隆抗体制备物是针对全长重组结核分枝杆菌蛋白通过使用标准方法对鸡或兔进行免疫接种来制备的。就命名而言，命名为“ChX/Y”的多克隆抗血清指包含在鸡中制备的单独批次“ChX”和“ChY”的汇集制备物。针对重组结核分枝杆菌蛋白的多克隆抗体制备物是就其使用标准方法(例如，ELISA)测定时的高效价而选取的，并对其如本文中所述进行进一步的诊断测试，使用所述多克隆血清作为捕捉和/或检测试剂。
[0630] 8.抗体选择标准
[0631] 抗体是基于其在ELISA中对于免疫原的敏感性和特异性进行选择的，其优选检出限(LOD)为，例如在单位点ELISA中少于约100ng/mL重组抗原，和/或在扩增的双位点ELISA中少于约500pg/mL抗原。还选择在结核分枝杆菌培养物中检测结核分枝杆菌抗原而对其他分枝杆菌菌种或非分枝杆菌病原体具有很少或不具有交叉反应性的抗体。
[0632] 首先通过使用单位点ELISA在每个情况下针对免疫原的反应性来筛选抗体。本领域技术人员会明白，单位点ELISA需要结合于固体底物的表面的未标记的重组免疫原和标记的检测抗体，例如，偶合于可检测标志物(如胶体金或生物素)的抗体，其中所述检测抗体特异性结合于包含于固定的免疫原中的靶抗原上的表位。检测抗体结合于所述固定的免疫原，从而使得其固定于所述固体底物，并通过结合所述检测抗体上的标记间接地被标记。
[0633] 作为替代或附加手段，进行双位点ELISA，这受制于能否获得与测试抗体在双位点测试中配对的抗体。双位点ELISA需要结合于固体底物表面的未标记的捕捉抗体和标记的检测抗体，例如，偶合于可检测标志物(如胶体金或生物素)的抗体，其中捕捉抗体和检测抗体均特异性结合于靶抗原，但分别结合于靶抗原上不同的或不相互干扰的表位。当抗原存在于测试样品中时，检测抗体和捕捉抗体将抗原夹在中间(“sandwich“)，从而使得其固定于所述固体底物，并通过结合所述检测抗体上的标记间接地被标记。
[0634] 一般而言，对于在双位点ELISA中具有少于约500pg/mL的LOD的抗体，进行Western印迹(WB)免疫电泳以确证所述抗体对于重组蛋白的特异性，以及存在于全细胞裂解液中的具有预期分子量的内源结核分枝杆菌蛋白。简言之，将重组蛋白和全细胞裂解液在一维SDS/聚丙烯酰胺凝胶(10％聚丙烯酰胺Nu-PAGE凝胶)上使用MOPS或MES缓
冲液系统根据生产商的说明通过电泳进行分离。将经分辨的蛋白使用半干燥电印迹系统(semi-dryelectroblotting system)从凝胶转移至PVDF膜上。然后根据标准方法用针对对应抗原的一抗探测所述膜，接着用能够结合所述抗体探针的HRP偶合的二抗进行探测。然后通过化学发光检测系统将特异性信号显影，并使用X射线胶片继以扫描或使用Fuji-LAS-3000成像仪获取图像，以直接地从经处理的印迹获取图像。对于每个经测试的抗原，对Western印迹条件就所需的一抗和二抗的稀释程度进行优化以提供最优的信噪比(数据未显示)。将复制印迹(replica blot)用一抗和二抗(阳性对照)或者仅用二抗
(阴性对照)进行探测。
冲液系统根据生产商的说明通过电泳进行分离。将经分辨的蛋白使用半干燥电印迹系统(semi-dryelectroblotting system)从凝胶转移至PVDF膜上。然后根据标准方法用针对对应抗原的一抗探测所述膜，接着用能够结合所述抗体探针的HRP偶合的二抗进行探测。然后通过化学发光检测系统将特异性信号显影，并使用X射线胶片继以扫描或使用Fuji-LAS-3000成像仪获取图像，以直接地从经处理的印迹获取图像。对于每个经测试的抗原，对Western印迹条件就所需的一抗和二抗的稀释程度进行优化以提供最优的信噪比(数据未显示)。将复制印迹(replica blot)用一抗和二抗(阳性对照)或者仅用二抗
(阴性对照)进行探测。
[0635] 这些Western数据通过竞争实验得以确证，在所述实验中，在进行Western印迹之前，将一抗用摩尔过量的重组免疫原在溶液中预温育以由此竞争在经分辨的蛋白上的表位。因此，在Western印迹中信号的丧失确证了起初对抗体特异性的结论。简言之，如前文所述进行Western印迹，只不过将一抗用100至200摩尔过量的相应重组蛋白进行预温育。用通常方法探测印迹。
[0636] 9.抗体对的选择
[0637] 对于抗体对的选择，使用符合前述部分中所述的抗体选择标准可获得的最敏感的抗体进行双位点ELISA。在选择抗体对的语境下，进行双位点ELISA时，本发明人将候选抗体在两种配置中分别用于检测抗体和捕捉抗体，以由此确定捕捉抗体和检测抗体的最优配置。一般而言，对于每个测试的捕捉抗体浓度针对重组免疫原的滴定以不同稀释程度使用检测抗体。用于此目的的优选检测抗体为生物素化的抗体，其可使用多HRP偶合的链霉抗生物素蛋白进行检测。当无法获得生物素化的检测抗体时，优选的检测抗体包括下述未标记的检测抗体，所述抗体可通过顺序结合(i)针对所述检测抗体的生物素化的二抗(例如，抗兔Ig或抗鸡Ig或抗小鼠Ig)和(ii)针对结合的生物素化二抗的多HRP偶合的链霉抗生物素蛋白来进行检测。
[0638] 10.ELISA形式
[0639] a)单位点ELISA
[0640] 将NUNC板用重组蛋白的系列稀释进行包被，并在4℃温育过夜。在封闭之后，将板用测试抗体的多种稀释继以HRP偶合的二抗和TMB进行温育。每个反应的体积是50μl。在每次添加之间洗涤板。免疫反应通过基于视觉检查显色所得的合适时间(通常约30分钟)之后通过添加0.5M H2SO4中止，并在微板读数器中在450nm和620nm的波长读取OD。
[0641] 将所得的数据输出到Microsoft Excel，其中记录DeltaOD(OD450-620)(称作OD)以供数据分析。所述测定法的敏感性如下所述进行确定，并表示为LODAbT。对具有少于约100ng/mL的LODAbT的抗体就其在夹心ELISA中作为捕捉抗体或检测抗体适合性进行进一步测试。
[0642] b)标准双位点或“夹心”ELISA
[0643] 标准夹心ELISA是使用所选的抗体对进行的，例如，以确定其作为捕捉抗体或检测抗体的适合性。用多种稀释程度的捕捉抗体包被NUNC免疫板，然后将其顺序用相关的重组蛋白或包含测试免疫原的全细胞裂解液滤过物，以及多种稀释程度的检测抗体、HRP偶合的二抗和SIGMA TMB进行温育。每个反应的体积为50μl。在每次添加之间洗涤板。免疫反应通过基于视觉检查显色所得的合适时间(通常约30分钟)之后通过添加0.5M H2SO4中止，并在微板读数器中在450nm和620nm的波长读取OD。
[0644] 将所得的数据输出至Microsoft Excel以供分析。测定法的敏感性如下所述进行确定，并称作LOD；选择产生最低LOD得分(例如，少于约3ng/mL)的抗体对以供在扩增的夹心ELISA中进行进一步优化。
[0645] c)扩增的夹心ELISA
[0646] 扩增的夹心ELISA如本文中上述的标准夹心ELISA来进行，并通过相同方法进行分析，只不过将板用生物素化的检测抗体或检测抗体继以生物素化的二抗进行温育。扩增是通过添加50μl多种稀释程度的多聚80-HRP-链霉抗生物素蛋白继以50μl的Pierce TMB来达成的。选择产生最低LOD得分(例如，少于约500pg/mL)的抗体对。
[0647] d)ELISA数据分析
[0648] 将ELISA数据输出至Microsoft Excel进行分析。使用X-Y图对标准曲线进行作图，使得平均OD+SD(OD＝OD450nm-OD620nm)置于Y轴，而重组蛋白/肽浓度(例如，pg/mL)置于X轴(对数尺度)。使用变异系数(计算为标准偏差除以平均值，并表示为百分比CV％)作为测定法内和测定法间变异性的量度。
[0649] 使用GraphPad Prism软件用标准曲线数据点拟合4-参数的对数曲线。未知样品的抗原浓度是通过将OD值在生成的曲线上内插来确定的。
[0650] e)检出限(LOD值)的确定
[0651] 当可获得合适的校准曲线时，在双位点“夹心”ELISA中抗体对的检出限(LOD)定义为使用GraphPad Prism软件中可获得的功能，产生等同于平均基线指加3xSD的OD值的免疫原浓度。对于单位点ELISA，或对于无法获得校准曲线的夹心ELISA，使用Microsoft Excel估计抗体或抗体对的LOD。对于每个分析的免疫原性蛋白，使用来自ELISA剂量响应曲线的吸光度数据来计算LOD值。
[0652] 对于单位点ELISA：对于单位点ELISA数据或双位点ELISA数据，当数据点不足以使软件应用非线性回归曲线拟合功能时，在Excel中获得LOD的估计。如下所述确定剂量响应曲线的基线和基线平均OD+3xSD：确定吸光度的增值，其计算为对于给定免疫原浓度的吸光度和下一个更高免疫原浓度的吸光度之间的差值。当吸光度的增值低于约0.05OD单位时，该时间点视为基线的起点。使用重复样品在视为的基线起点处以及下两个增值点处的的吸光度平均值和SD来计算该系列的平均值+3xSD。产生大于平均基线OD+3xSD的吸光度的免疫原浓度视为LOD值。
[0653] 对于夹心ELISA：在一个方法中，将重组蛋白/肽免疫原的浓度，即“log10[免疫原]”值和从夹心ELISA获得的重复的吸光度值转移至为了从原始ELISA数据自动计算所2
需值而生成的Excel工作表模板。生成R 值作为对标准曲线拟合良好程度的估计，且大于约0.99的值被接受为良好的拟合。还计算了99％置信区间(CI)值的范围。在拟合曲线的底部渐近线范围中从拟合的标准曲线中内插得到最大值。所述内插值，当取反对数时，表示具有等于平均基线值加3xSD的OD值的重组蛋白浓度。该值，称作LOD值，视为表明所述ELISA的敏感性。
需值而生成的Excel工作表模板。生成R 值作为对标准曲线拟合良好程度的估计，且大于约0.99的值被接受为良好的拟合。还计算了99％置信区间(CI)值的范围。在拟合曲线的底部渐近线范围中从拟合的标准曲线中内插得到最大值。所述内插值，当取反对数时，表示具有等于平均基线值加3xSD的OD值的重组蛋白浓度。该值，称作LOD值，视为表明所述ELISA的敏感性。
[0654] 或者，将log10[免疫原]和相应的重复吸光度值输出至GraphPad Prism，其中使用非线性回归曲线拟合功能来将数据点拟合至4-参数对数曲线。使用非线性回归曲线拟2
合功能将数据拟合至S形曲线(sigmoid curve)。生成R 值作为对标准曲线拟合良好程度的估计，且大于约0.99的值被接受为良好的拟合。对应于基线平均值吸光度(OD)加3xSD的重组蛋白/肽免疫原浓度是从标准曲线内插得到的。
合功能将数据拟合至S形曲线(sigmoid curve)。生成R 值作为对标准曲线拟合良好程度的估计，且大于约0.99的值被接受为良好的拟合。对应于基线平均值吸光度(OD)加3xSD的重组蛋白/肽免疫原浓度是从标准曲线内插得到的。
[0655] 实施例2
[0656] 使用结合于乙酮醇酸结核分枝杆菌还原异构酶(KARI)的对由结核分枝杆菌造成的感染或结核病的基于抗原的诊断
[0657] 1.在TB阳性受试者中鉴定KARI蛋白
[0658] 在TB+样品中识别出具有约36kDa分子量的蛋白。来自MALDI-TOF数据的十个肽的序列与SEQ ID NO：1所述的结核分枝杆菌ilvC基因编码的序列匹配。该10个肽对SEQ ID NO：1的覆盖百分比为约37％，表明所述肽片段来源于该同一个蛋白标志物。
[0659] 具有SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列的鉴定的蛋白为推定的乙酮醇酸还原异构酶，并命名为“KARI”。
[0660] 2.抗体
[0661] 多克隆抗体是使用标准方法针对由结核分枝杆菌的ilvC基因编码的重组KARI蛋白制备的。单克隆抗体是使用ABL-MYC技术(NeoClone，MadisonWI 53713，USA)以产生分泌针对由结核分枝杆菌的ilvC基因编码的全长重组KARI蛋白的单克隆抗体(mAb)，以及针对所述全长蛋白的肽片段的单克隆抗体(mAb)的细胞系来制备的。用于制备单克隆抗体的肽片段包含全长蛋白的下述氨基酸区域：
[0662] a)SEQ ID NO：1的残基40-56，任选地添加C-端半胱氨酸残基；
[0663] b)SEQ ID NO：1的残基290-300，任选地添加C-端半胱氨酸残基；和
[0664] c)SEQ ID NO：1的残基298-310，任选地添加C-端半胱氨酸残基。
[0665] 产生了超过十个抗体，包括多克隆和单克隆抗体制备物，并就其适合性如实施例1所述进行筛选。具体而言，产生了命名为“Ch34/35”的多克隆抗体制备物，以及几种单克隆抗体制备物，例如，命名为Mo1283F、Mo1E7、Mo2C7、Mo3A2、Mo2B1、Mo4F7、Mo3C3、Mo1C10、Mo4C10、Mo1F6、Mo2D6、Mo3H3和Mo4D11的。
[0666] 命名为Ch34/35、Mo1283F、Mo1F6和Mo2B1的抗体是针对重组KARI蛋白制备的。
[0667] 命名为Mo4F7和Mo4C10的抗体是针对包含SEQ ID NO：1的残基40-56的合成肽产生的。命名为Mo2D6的抗体是针对包含SEQ ID NO：1的残基290-300的合成肽制备的。命名为Mo1A4、Mo1H2、Mo2E5、Mo2G2、Mo3H3、Mo4C3、Mo4D2和Mo4D11的单克隆抗体是针对包含SEQ ID NO：1的残基298-310的合成肽来制备的，且在这些制备物中，Mo3H3和Mo4D11在ELISA中具有最高的效价。
[0668] 将抗体如实施例1所述进行筛选以确定最优的抗体对和在双位点ELISA中优选的取向。在一个实施例中，使用来源于小鼠的单克隆抗体Mo1283F作为捕捉抗体而来源于鸡的多克隆抗体Ch34/35作为检测载体，例如，参见图1-14。在另一个实施例中，使用来源于小鼠的单克隆抗体Mo2B1(或简称为“2B1”)作为捕捉抗体，并配以来源于鸡的抗体Ch34/35作为检测抗体，例如，参见图15-23e。在另一个实施例中，使用来源于小鼠的单克隆抗体Mo1F6(或简称为“1F6”)作为捕捉抗体，并配以来源于小鼠的单克隆抗体Mo2B1作为检测抗体，例如，参见图24和28。在另一个实施例中，使用来源于小鼠的单克隆抗体Mo2D6(或简称为“2D6”)作为捕捉抗体，并配以来源于小鼠的单克隆抗体Mo2B1作为检测抗体，例如，参见图28。在另一个实施例中，使用来源于鸡的抗体Ch34/35作为捕捉抗体，并配以单克隆抗体Mo2B1作为检测抗体，例如，参见图29。
[0669] 还在另一个实施例中，使用单克隆抗体2B1作为捕捉抗体，并配以单克隆抗体1F6作为检测抗体。在另一个实施例中，使用单克隆抗体2B1作为捕捉抗体，并配以单克隆抗体2D6作为检测抗体。在另一个实施例中，使用单克隆抗体2D6作为捕捉抗体，并配以单克隆抗体1F6作为检测抗体。在另一个实施例中，使用单克隆抗体1F6作为捕捉抗体，并配以单克隆抗体2D6作为检测抗体。
[0670] 并未排除其他的取向和抗体的组合。
[0671] 3.KARI蛋白的线性表位定位
[0672] 将针对KARI蛋白和肽制备的抗体针对一组(a pepset of)来源于SEQ IDNO：1中所述的全长KARI蛋白的序列的合成肽来进行筛选，以在全长蛋白上定位线性B-细胞表位。
[0673] 数据(未显示)表明结核分枝杆菌的全长KARI蛋白包含下述线性B-细胞表位，其可用作诊断性肽基试剂，并用于制备诊断抗体：
[0674] a)SEQ ID NO：1的残基1-23；
[0675] b)SEQ ID NO：1的残基40-71，且优选SEQ ID NO：1的残基57-71；
[0676] c)SEQ ID NO：1的残基97-111；
[0677] d)SEQ ID NO：1的残基169-199；
[0678] e)SEQ ID NO：1的残基265-279；
[0679] f)SEQ ID NO：1的残基290-300；优选SEQ ID NO：1的残基298-300；和
[0680] g)SEQ ID NO：1的残基313-333。
[0681] 举例而言，单克隆抗体Mo1283F结合于SEQ ID NO：1的残基97-111之内；单克隆抗体Mo4F7和Mo4C10结合于SEQ ID NO：1的残基40-56之内；而单克隆抗体Mo2D6结合于SEQ ID NO：1的残基290-300之内，并优选与SEQ ID NO：1的298-300结合。参见，例如，图24-28。
[0682] 对这些线性B-细胞表位区域(a)至(g)的精细定位是通过测试针对KARI蛋白的抗体结合于在这些区域内或与这些区域重叠的5聚体肽的能力，和/或这些抗体结合于相对于基础序列(即，SEQ ID NO：1)包含氨基酸取代的突变体肽的能力来进行的。作为替代或附加手段，对这些线性B-细胞表位区域(a)至(g)的精细定位是通过测试在这些区域内或与这些区域重叠的5聚体肽，和/或相对于基础序列(即，SEQ ID NO：1)包含氨基酸取代的突变体肽，引发结合于KARI蛋白的抗体的产生的能力来进行的。
[0683] 4.验证KARI及针对其的抗体作为诊断试剂
[0684] 将来自结核分枝杆菌菌株H37Rv的KARI蛋白的氨基酸序列表示为SEQ ID NO：1。其翻译产物具有约36kDa的预期分子量。基本上如实施例1所述进行的对经六组氨酸标记的rKARI蛋白的一维SDS/PAGE分析显示所述KARI蛋白作为大约37kDa的单一条带迁移
(数据未显示)，其为基于翻译产物和六组氨酸标记部分理论分子量的融合蛋白预期分子量。
(数据未显示)，其为基于翻译产物和六组氨酸标记部分理论分子量的融合蛋白预期分子量。
[0685] 使用ELISA捕捉抗体(Mo1283F)和检测抗体(Ch34/35)分别进行Western印迹分析，以检测结核分枝杆菌H37Rv、结核分枝杆菌CSU93和结核分枝杆菌HN878的全细胞裂解液中的重组KARI蛋白和内源KARI蛋白。两个抗体均在来源于所有三个结核分枝杆菌菌株的全细胞裂解液中识别具有天然KARI蛋白预期分子量(即，约36kDa)的条带，并检测出略微较大的重组KARI蛋白(图13)。结合为高度特异性的，几乎无背景。因此，可获得的数据确证了抗体Mo1283F和Ch34/35对于检测结核分枝杆菌KARI蛋白的特异性。
[0686] 基本上如实施例1所述进行的竞争性Western印迹分析也表明多克隆抗体Ch34/35与重组的KARI蛋白和内源KARI蛋白的结合可通过将抗体与过量浓度的未标记的重组KARI蛋白预温育来消除(图13)。总之，可获得的数据表明抗体Mo1283F和Ch34/35抗体特异性结合于结核分枝杆菌KARI蛋白。
[0687] 在类似的实验中，显示命名为Mo2B1、Mo1E7、Mo2C7和Mo3A2的单克隆抗体特异性结合于培养的结核分枝杆菌H37Rv的全细胞裂解液(WCL)(泳道3)，且命名为Mo2B1和Mo3A2的抗体亦在Western印迹中结合于重组KARI蛋白(图14)。
[0688] 5.供检测结核分枝杆菌KARI蛋白的扩增的夹心ELISA
[0689] 扩增ELISA基本上如本实施例和实施例1中所述进行，使用5μg/mL的Mo1283F抗体作为捕捉试剂，而2.5μg/mL的Ch34/35多克隆抗体作为检测抗体，以及用生物素化的二抗与HRP偶合的链霉抗生物素蛋白以检测结合的检测抗体。
[0690] 在图1中表示的数据表明在测试的测定条件下，并使用这种虽然并非必需的，但为优选的抗体取向，具有低背景噪音和约1690pg/mL的LOD。本发明人认为在夹心ELISA中上述检测的敏感性连同低背景落在有用的限制范围内。
[0691] 6.抗-KARI抗体与不同结核分枝杆菌分离株之间的交叉反应性
[0692] 为了进一步评价KARI作为生物样品中结核分枝杆菌存在的诊断标志物的适合性，并评价针对KARI蛋白制备的抗体的特异性，本发明人比较了结核分枝杆菌临床菌株CSU93和HN878与结核分枝杆菌实验室菌株H93Rv的细胞提取物之间，抗体在如上所述进行的扩增的夹心ELISA中的反应性。
[0693] 简言之，将ELISA板用捕捉抗体Mo1283F包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体后，将来自每个分离株的细胞提取物添加至经抗体包被的ELISA板孔中。作为每个测定法的阴性对照，使用不含细胞提取物的缓冲液。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将检测抗体Ch34/35与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，用50μl稀释的二抗(例如，生物素化的驴抗鸡IgG和多聚-40链霉抗生物素蛋白-HRP偶合物)温育1小时，再次洗涤，用TMB温育10分钟，并确定450-620nm的吸光度。将样品在全细胞提取物的三个稀释中重复进行两次测定。基于KARI蛋白的标准化水平产生校准标准曲线。
[0694] 在图2中表示的数据显示结核分枝杆菌KARI蛋白以可比较的水平存在于临床结核分枝杆菌分离株CSU93和实验室菌株H37Rv中。在结核分枝杆菌H878中可检测出较低水平的KARI蛋白，表明针对KARI蛋白的抗体可能无法分辨具体的结核分枝杆菌临床菌株。
[0695] 还在使用单克隆抗体Mo2B1作为捕捉抗体而Ch34/35作为检测抗体在扩增的夹心ELISA中进行的一组类似实验中验证了这些数据(图15)。图15中的数据还表明H37Rv和另一种临床分离株CDC1551之间具有可比较的水平。
[0696] 在图2和15中表示的数据并未否认(abrogate)针对KARI蛋白的抗体在一般的单分析物诊断测试中，或者作为多分析物测试一部分与如本文所述或本领域已知的针对结核分枝杆菌的特定菌株的抗体一同使用时的有用性。举例而言，若需要，可将针对KARI蛋白的抗体与来自KARI阳性临床样本的结核分枝杆菌的后续培养物一同使用以产生关于样品中存在的临床相关菌株的信息。
[0697] 为了确定KARI表达是否限于特定的亚细胞级分，或是否所述蛋白在HN878中的较低水平是由于在特定亚细胞级分中的抑制蛋白，对H37Rv、HN878和CDC1551的胞质溶胶级分、细胞膜级分和细胞壁级分进行扩增ELISA，使用Mo2B1作为捕捉抗体，而Ch34/35作为检测抗体。在图16-19中表示的数据表明KARI蛋白可在每个级分中检测出，而在每个级分中KARI蛋白的相对水平与细胞裂解液中的水平一致。
[0698] 7.不同分枝杆菌菌种之间的交叉反应性
[0699] 为了进一步评价KARI作为生物样品中结核分枝杆菌存在的诊断标志物的适合性，并评价针对KARI蛋白制备的抗体的特异性，本发明人比较了在分枝杆菌菌种结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的细胞提取物之间，抗体在如上所述进行的扩增的夹心ELISA中的反应性。
[0700] 简言之，将ELISA板用捕捉抗体Mo1283F包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体后，将来自每个分枝杆菌菌种的细胞提取物添加至经抗体包被的ELISA板孔中。作为每个测定法的阴性对照，使用不含细胞提取物的缓冲液。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将检测抗体Ch34/35与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，用50μl稀释的二抗(例如，生物素化的驴抗鸡IgG和多聚-40链霉抗生物素蛋白-HRP偶合物)温育1小时，再次洗涤，用TMB温育10分钟，并确定450-620nm的吸光度。将样品在全细胞提取物的三个稀释中重复进行两次测定。基于KARI蛋白的标准化水平产生校准标准曲线。
[0701] 类似的实验是使用单克隆抗体Mo2B1作为捕捉试剂而Ch34/35多克隆抗体用作检测试剂来进行的。
[0702] 在图3、4和21中表示的数据显示在三个分枝杆菌菌种之间具有可检测出但是低的交叉反应性，表明结核分枝杆菌KARI蛋白可能更适于在这些测定条件下使用Mo2B1作为捕捉试剂进行物种特异性的结核分枝杆菌检测。这并不否认Mo1283F或Mo2B1，或其他针对KARI蛋白的抗体在一般的单分析物诊断测试，或者作为多分析物测试一部分与如本文所述或本领域已知的针对结核分枝杆菌的菌种特异性标志物的抗体一同使用时的有用性。举例而言，可将针对KARI蛋白的抗体与来自KARI阳性临床样本的结核分枝杆菌的后续培养物一同使用。
[0703] 作为替代或附加手段，可将针对KARI蛋白的抗体与具有与其他测试的分枝杆菌的低交叉反应性的一种或多种针对结核分枝杆菌Rv1265和/或结核分枝杆菌BSX蛋白和/或结核分枝杆菌EF-Tu和/或结核分枝杆菌S9蛋白的抗体如本文中所述同时使用。在解释上述多分析物测试时，针对KARI蛋白的抗体的结合表明临床样品中分枝杆菌的存在，而附加的针对结核分枝杆菌Rv1265和/或结核分枝杆菌BSX蛋白和/或结核分枝杆菌EF-Tu和/或结核分枝杆菌S9蛋白的抗体结合表明更高可能性的结核分枝杆菌感染。对于上述应用，特别优选针对结核分枝杆菌KARI蛋白的抗体和一种或多种针对结核分枝杆菌Rv1265蛋白的抗体以及针对结核分枝杆菌BSX蛋白的组合，基于针对Rv1265和BSX的抗体与鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的低交叉反应性。
[0704] 8.结核分枝杆菌与非分枝杆菌病原体之间的低交叉反应性
[0705] 为了进一步评价KARI作为在生物样品中的结核分枝杆菌存在的诊断标志物的适合性，本发明人比较了在结核分枝杆菌菌株H37Rv(实验室菌株)、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和酿酒酵母的细胞提取物之间进行的扩增的夹心ELISA中的抗体交叉反应性。
[0706] 简言之，将ELISA板用捕捉抗体Mo1283F或Mo2B1包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体后，将来自每个微生物的细胞提取物添加至经抗体包被的ELISA板孔中。作为每个测定法的阴性对照，使用不含细胞提取物的缓冲液。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将检测抗体Ch34/35与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，用50μl二抗(即，生物素化的驴抗鸡IgG和多聚-40链霉抗生物素蛋白-HRP偶合物)温育1小时，再次洗涤，用TMB温育10分钟，并确定450-620nm的吸光度。
[0707] 在图5、20和21中表示的数据未显示针对结核分枝杆菌KARI蛋白的抗体与大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、或酿酒酵母细胞提取物在测试条件下有显著的交叉反应性，表明所述抗体形成了结核分枝杆菌特异性测试的基础。
[0708] 9.在临床样品中检测KARI蛋白
[0709] 为了进一步评价KARI作为生物样品中结核分枝杆菌存在的诊断标志物的适合性，本发明人确定了抗体在从TB阳性受试者获得的临床样品中检测内源KARI蛋白的能力，所述受试者是之前根据涂片测试和结核分枝杆菌培养测定法的结果诊断的。将患者根据涂片测试和培养测试的结果，和HIV状态分类。所有测试的受试者均为涂片阴性且培养阴性，或者，涂片阳性且培养阳性。
[0710] 简言之，如本文中如上所述对痰样品进行夹心ELISA，所述痰是通过方法3制备的，并作为17x150微升等分试样在替代扩增实验方法(见下)下进行测定。将ELISA板用捕捉抗体Mo1283F或Mo2B1包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体之后，将经处理的痰添加至经抗体包被的ELISA板的孔中。作为对于每个测定法的阴性对照，使用缓冲液。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原后，将检测抗体Ch34/35与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，用50μl二抗温育(即，生物素化的驴抗鸡IgG和多聚-40链霉抗生物素蛋白-HRP偶合物)一小时，再次洗涤，用TMB温育10分钟并确定450-620nm的吸光度。
[0711] 在图6、7和10-12中表示的数据(Mo1283F:Ch34/35抗体对)和在图23a-e中表示的数据(Mo2B1:Ch34/35抗体对)显示在所有测试的TB阳性样品中检测出显著较高水平的KARI蛋白，所述阳性样品之前显示为涂片阳性和/或培养阳性。在绝大多数TB涂片阴性样品中检测出背景信号。然而，少数涂片阴性样品针对结核分枝杆菌KARI蛋白使用两种抗体组合均测试为阳性(图11、12和图23a-c)，表明替代测定法(例如，涂片测试)和/或如根据本文任何实施例所述的其他使用针对BSX和/或Rv1265和/或S9的抗体基于抗原的测试在增强所述测定法的特异性或确证针对KARI蛋白结果方面的有用性。
[0712] 举例而言，如本文表1所示，本文中例示的6/7的涂片阴性，针对KARI蛋白测试为阳性的样品显示为针对其他本文中例示的抗原(例如，S9蛋白和/或BSX蛋白和/或Rv1265蛋白)为阴性的。还对针对KARI蛋白测试为阳性的涂片阴性样品就本文中所述的其他蛋白标志物进行了筛选，如果平均信号大于测定缓冲液空白以上三个标准偏差，则将其记录为阳性。
[0713] 表1
[0714] 涂片阴性临床样品的检测
[0715]涂片测试 样品ID KARI(ilvC) Rv1265 BSX S9
0 MPC364 阳性 阴性 阴性 阴性
0 MPC363 阳性 阳性 阳性 阴性
0 MPC375 阳性 有疑问
0 MPC388 阳性 阴性
0 MPC339 阳性 阴性 阴性
0 MPC311 阳性 阳性 阴性 阴性
0 MPC313 阳性 阴性 阴性 阴性
0 MPC364 阳性 阴性 阴性 阴性
0 MPC363 阳性 阳性 阳性 阴性
0 MPC375 阳性 有疑问
0 MPC388 阳性 阴性
0 MPC339 阳性 阴性 阴性
0 MPC311 阳性 阳性 阴性 阴性
0 MPC313 阳性 阴性 阴性 阴性
[0716] 10.评估样品对信号的抑制
[0717] 为了评价是否在痰中存在可能不利地影响测定敏感性(例如，在ELISA或护理位置(point-of-care)或现场试验(field test)形式中)的抑制性或信号抑制性
(signal-suppressing)因子，将痰样品掺以10ng/mL重组结核分枝杆菌KARI蛋白，并将所得的样品分三步1∶27(v/v)系列稀释。将样品温育过夜，并如上所述通过扩增ELISA分析，或立即测定。
(signal-suppressing)因子，将痰样品掺以10ng/mL重组结核分枝杆菌KARI蛋白，并将所得的样品分三步1∶27(v/v)系列稀释。将样品温育过夜，并如上所述通过扩增ELISA分析，或立即测定。
[0718] 在图8和9中表示的数据(右下小图，标为“ilvC”)表明痰包含一些抑制KARI蛋白信号检测的因子，因为信号强度在添加未稀释的痰之后减少，无论所述测定法是否立即进行或在温育过夜之后进行。然而，该信号强度的丧失可通过稀释痰进行性地抑制，且将痰稀释至少约1∶9(v/v)时很大程度上阻止了信号强度的丧失。信号强度还在过夜温育痰中的重组蛋白之后减少，且该信号强度的丧失也可部分地通过稀释痰样品来阻止。这些数据表明推荐将痰1∶9(v/v)稀释至封闭缓冲液中并快速分析样品来增强在这些条件下测定KARI蛋白的信号强度。
[0719] 11.在分枝杆菌中细胞可检测出的KARI蛋白的相对水平
[0720] 为了进一步评价KARI作为分枝杆菌感染的诊断性标志物的适合性，确定在结核分枝杆菌菌株H37Rv、CSU93和HN878以及结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌全细胞裂解液中相对于本文中所述的其他10个结核分枝杆菌抗原(包括BSX、EF-Tu、P5CR、Rv1265、S9和TetR样蛋白)的KARI蛋白的水平。
[0721] 基本上如该实施例和实施例1中所述进行扩增的夹心ELISA，以根据标准实验方法鉴定每种抗原的相对水平，并包括了校准标准以使得量化成为可能。
[0722] 示于图122-125的数据表明KARI在所有三种测试的结核分枝杆菌菌株中当基于总细胞蛋白表示时，是相对丰富的蛋白。据此，在测试的11个免疫原性蛋白中，结核分枝杆菌Rv1265、BSX和S9也是相对丰富的。示于图126-132的数据表明KARI蛋白一般地在分枝杆菌菌种中也是相对丰富的蛋白，而其他测试的主要免疫原性蛋白，即BSX、Rv1265和S9，当基于细胞表示时(图104-105)或基于全细胞裂解液蛋白的微克数时(图128-129)或基于全细胞裂解液滤过物的微升数时(图130-131)，似较之KARI具有对结核分枝杆菌更强的特异性。这些数据表明了KARI作为结核分枝杆菌感染类别性的(generic)单分析物标志物，或作为针对分枝杆菌感染或结核分枝杆菌感染的多分析物测试的一部分与BSX和/或Rv1265和/或S9蛋白组合时的有用性。并未排除其他用于对结核分枝杆菌感染进行多分析物测试的组合和/或将对KARI蛋白的测定与涂片测试组合。
[0723] 12.优化检出限
[0724] 为了进一步增强夹心ELISA的敏感性，使用替代性扩增方法以在用捕捉抗体包被所述ELISA板之后进行反复的抗原结合。基本上，这会导致结合于捕捉抗体的抗原量增加，尽管96-孔ELISA板的50μl体积限制。简言之，该反复的抗原加载涉及在夹心ELISA中在洗涤并添加检测抗体之前重复几次抗原结合步骤，例如，2或3或4或5次等。自然而然，每个等分试样的抗原样品是在标准的温育期间之后，下一等分试样添加之前去除的。可修改重复数以优化测定法(例如，参数如信噪比、检出限和在半最大信号处检测出的抗原量)，这取决于测试的样品的特性(例如，样品类型)，而无需不必要的实验。举例而言，可使用多至约20次重复样品加载(即，多至20x替代性扩增)以提供结核分枝杆菌KARI蛋白的低背景信号和降低的检出限。
[0725] 实施例3
[0726] 使用结合于命名为BSX的推定的结核分枝杆菌转录调节子的抗体进行的由结核分枝杆菌造成的感染或结核病的基于抗原的诊断
[0727] 1.在TB阳性受试者中鉴定BSX蛋白
[0728] 在TB+样品中识别出具有约15kDa分子量的蛋白。来自MALDI-TOF数据的十二个肽的序列与SEQ ID NO：2所述的结核分枝杆菌pbsX基因编码的序列匹配。该12个肽对SEQ ID NO：2的覆盖百分比为约70％，表明所述肽片段来源于该同一个蛋白标志物。
[0729] 具有SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列的蛋白鉴定为结核分枝杆菌推定的转录调节蛋白，并命名为“BSX”。
[0730] 2.抗体
[0731] 针对重组BSX蛋白制备了四十六(46)个抗体，并针对通过对合成肽的PEPSET进行线性B-细胞表位筛选衍生的免疫原性BSX肽制备了几种抗体，所述筛选扫描BSX蛋白的氨基酸序列。获得了多克隆和单克隆抗体，并就其适合性如本文中或实施例1中所述进行筛选。该方法导致鉴定了如该实施例所述供诊断结核分枝杆菌的几个抗体对。除了那些具体描述于该实施例中的抗体组合和抗体取向之外，本发明还涵盖多种抗体组合和抗体取向，包括例示的抗体以任何取向(例如，作为捕捉或检测抗体)的任何组合。
[0732] 3.使用抗体Mo639F和Ch12/13验证作为诊断标志物的BSX
[0733] 针对结核分枝杆菌制备的抗体包括命名为“Mo639F”的来源于小鼠的抗体和命名为“Ch12/13”的来源于鸡的多克隆抗体。这些抗体与其他抗体一同用于验证BSX作为针对结核分枝杆菌的诊断标志物。在一个实施例中，如下所述，将所述抗体用于说明在结核分枝杆菌全细胞提取物中对BSX的特异性检测。
[0734] 将来自结核分枝杆菌菌株H37Rv的BSX蛋白的氨基酸序列表示为SEQID NO：2。其翻译产物具有约16kDa的预期分子量。基本上如实施例1所述进行的对经六组氨酸标记的rBSX蛋白的一维SDS/PAGE分析显示所述BSX蛋白作为大约17kDa的单一条带迁移(数据未显示)，其为基于翻译产物和六组氨酸标记部分理论分子量预期的融合蛋白的分子量。
[0735] 使用ELISA捕捉抗体(Mo639F)和检测抗体(Ch12/13)分别进行Western印迹分析，以检测结核分枝杆菌H37Rv、结核分枝杆菌CSU93和结核分枝杆菌HN878的全细胞裂解液中的重组BSX蛋白和内源BSX蛋白。两个抗体均在来源于所有三个结核分枝杆菌菌株的全细胞裂解液中识别具有天然BSX蛋白预期分子量(即，约16kDa)的条带，并检测出略微较大的重组BSX蛋白(数据未显示)。可检测出极低的背景或无背景。因此，可获得的数据确证了抗体Mo639F和Ch12/13对于检测结核分枝杆菌BSX蛋白的特异性。
[0736] 基本上如实施例1所述进行的竞争性Western印迹分析表明多克隆抗体Ch12/13与重组的BSX蛋白和内源BSX蛋白的结合可通过将抗体与过量浓度的未标记的重组BSX蛋白预温育来消除(数据未显示)。
[0737] 总之，可获得的数据表明抗体Mo639F和Ch12/13可用于在实验室和临床结核分枝杆菌菌株的全细胞裂解液中特异性地检测BSX。
[0738] 4.针对结核分枝杆菌BSX的抗体R16、C44和Mo403B的滴定
[0739] 针对结核分枝杆菌制备的抗体还包括命名为R16的兔多克隆抗BSX抗体(针对BSX肽培育)、命名为C44的鸡抗BSX多克隆抗体(针对重组蛋白培育)和命名为Mo403B的小鼠抗-BSX单克隆抗体(针对BSX C-端培育)。
[0740] 使用这些抗BSX抗体之一(即R16或C44或Mo403B)作为捕捉抗体而用这些抗体中的另一个作为检测抗体进行ELISA测定法。用多种抗BSX抗体，包括鸡(Ch)抗BSX pAb C44、兔(Ra)抗BSX pAb R16和小鼠(Mo)抗BSX mAbMo403B，均以20μg/ml使用每孔
50μl包被ELISA板。以从50ng/ml减至3pg/ml的浓度添加滴定量的重组BSX。抗原检测使用10μg/ml的兔抗BSX(用重组BSX蛋白进行预温育，或不进行预温育)继以通过使用以1∶5000(v/v)稀释的绵羊抗兔Ig HRP偶合物(对于鸡捕捉系统)的检测，或者20μg/ml的鸡抗BSX pAb C44继以以1∶5000(v/v)稀释的绵羊抗鸡IgG HRP偶合物(对于小鼠和兔捕捉系统)来进行。数据表示于图30。
50μl包被ELISA板。以从50ng/ml减至3pg/ml的浓度添加滴定量的重组BSX。抗原检测使用10μg/ml的兔抗BSX(用重组BSX蛋白进行预温育，或不进行预温育)继以通过使用以1∶5000(v/v)稀释的绵羊抗兔Ig HRP偶合物(对于鸡捕捉系统)的检测，或者20μg/ml的鸡抗BSX pAb C44继以以1∶5000(v/v)稀释的绵羊抗鸡IgG HRP偶合物(对于小鼠和兔捕捉系统)来进行。数据表示于图30。
[0741] 5.抗体C44和Mo403B在夹心ELISA中的检出限(LOD)
[0742] 在确定对于检测纯化的重组BSX而言抗BSX mAb Mo403B和pAb C44的检出限之后，我们的初始研究着眼于优化使用mAb Mo403B作为捕捉抗体而pAb C44作为检测抗体的夹心ELISA。简言之，将抗BSX mAb Mo403B以从10-40μg/ml范围的浓度如上所述固定于ELISA平板上作为捕捉抗体。然后使用纯化的鸡抗BSX pAb，C44，以10或20μg/ml的浓度如上所述作为检测抗体，继以用以1∶5000(v/v)稀释的绵羊抗鸡IgG HRP和供信号检测的TMB温育以筛选从50ng/ml减至0.39ng/ml的重组BSX的滴定量。数据示于图31。
[0743] 在这些条件下，重组BSX的检出限为～2-3ng/ml。
[0744] 6.使用抗体R16和C44在患者样品中检测BSX
[0745] 将来自南非的TB患者和来自南非(前缀“M”)和来自澳大利亚(前缀“CGS”)的罹患非TB呼吸道疾病的对照患者的痰样品(50μl+50μl封闭缓冲液)分别通过夹心ELISA就BSX抗原的存在进行筛选。将纯化的兔抗BSX(肽28)pAb，R16作为捕捉抗体以20μg/ml的浓度固定于ELISA板上。使用纯化的鸡抗BSX pAb，C44以5μg/ml的浓度用作检测抗体。使用以1∶5000(v/v)稀释的绵羊抗鸡IgG HR和TMB进行信号检测。向来自对照患者CGS25的痰掺入5ng/ml重组BSX作为阳性对照(红色)。数据显示于图32。
[0746] 7.使用抗体对Mo403B和C44或R16和C44供检测结核分枝杆菌BSX蛋白的扩增的夹心ELISA
[0747] 将ELISA板用纯化的抗BSX mAb Mo403B以40μg/ml的浓度或纯化的鸡抗BSX pAb C44以5μg/ml的浓度使用每孔50μl进行包被。将纯化的重组BSX的滴定量以50ng/ml减至0.39ng/ml的浓度添加。使用10μg/ml的浓度的鸡抗BSX，继以以多种稀释的驴抗鸡IgG生物素偶合物，并最终以1∶5000(v/v)稀释的链霉抗生物素蛋白-HRP，或者使用多种浓度的抗BSXmAb Mo403B，继以以1∶30000(v/v)稀释的山羊抗小鼠IgG，和以1∶5000(v/v)的驴抗山羊IgG HRP偶合物进行两个扩增系统。所述扩增系统是用于与基础抗原检测系统进行比较，在后者中，以10μg/ml的浓度使用鸡抗BSX，接着以1∶5000(v/v)的稀释使用绵羊抗鸡IgG HRP偶合物。
[0748] 如图33所示，扩增ELISA比标准ELISA敏感大约10倍。当在所述扩增系统中使用兔pAb作为捕捉抗体，而鸡pAb作为第一检测Ab时，信号强度略微较高(图34)。
[0749] 本发明人还调查了扩增ELISA系统，其如图33和35所示，使用纯化的兔抗BSX pAb R16作为捕捉抗体，而纯化的鸡抗BSX pAb C44作为检测抗体，然后用生物素化的第二检测Ab进行扩增。该系统与之前描述的扩增系统(图35；图36)相比使得敏感性进一步增加2倍(图35；图36)。
[0750] 本发明人还进行下述研究：使用扩增的基于生物素的ELISA以筛选来自TB和非TB呼吸道疾病对照患者的临床痰样品，永远应注意由于涂片显微术和培养测定法的低敏感性，在非TB呼吸道疾病组中可能有多至30-40％的患者具有TB共感染(图37)。
[0751] 为了调查抗体位点是否被内源BSX所饱和，本发明人还用来自相同的对应患者的痰样品的新鲜等分试样比较了(i)温育时间；和(ii)顺序温育的作用。将温育从1小时增加至2小时对信号强度并无任何作用。与之相对，预先数据表明用痰的两个不同的样品加载进行的顺序温育增加了信号强度(图38)。虽然所述增加并不大，这些预先观察表明有必要进一步调查。有趣的是，信号强度的增加对于检测作为阳性对照的重组蛋白而言是最显著的。
[0752] 8.使用命名为Mo639F和Ch12/13的抗体进行的扩增的夹心ELISA
[0753] 另一个供诊断结核分枝杆菌的抗体对由命名为“Mo639F”的来源于小鼠的抗体作为优选的捕捉抗体和命名为“Ch12/13”的来源于鸡的多克隆抗体作为优选的检测抗体组成。并未排除其他的取向和抗体组合。
[0754] 扩增ELISA基本上是如本实施例和实施例1中所述进行的，使用2μg/mL的Mo639F抗体作为捕捉试剂，而5μg/mL的Ch12/13多克隆抗体作为检测抗体，以及用生物素化的驴抗鸡IgG二抗与HRP-偶合的多聚-40链霉抗生物素蛋白以检测结合的检测抗体。
[0755] 在图39中表示的数据表明在测试的测定条件下，以及这种虽然并非必需的，但为优选的抗体取向下，具有低背景噪音和约89pg/mL的LOD。本发明人认为在夹心ELISA中上述检测的敏感性以及低背景落在有用的限制范围内。
[0756] 9.抗-BSX抗体与不同结核分枝杆菌分离株的交叉反应性
[0757] 为了进一步评价BSX作为生物样品中结核分枝杆菌存在的诊断标志物的适合性，并评价针对BSX蛋白制备的抗体的特异性，本发明人比较了结核分枝杆菌临床菌株CSU93和HN878与结核分枝杆菌实验室菌株H93Rv的细胞提取物之间，Mo639F和Ch12/13抗体在如上所述进行的扩增的夹心ELISA中的反应性。
[0758] 简言之，将ELISA板用捕捉抗体Mo639F包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体后，将来自每个分离株的细胞提取物添加至经抗体包被的ELISA板孔中。作为每个测定法的阴性对照，使用不含细胞提取物的缓冲液。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将检测抗体Ch12/13与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，用50μl稀释的二抗(例如，生物素化的驴抗鸡IgG和多聚-40链霉抗生物素蛋白-HRP偶合物)温育1小时，再次洗涤，用TMB温育10分钟，并确定450-620nm的吸光度。将样品在全细胞提取物的三个稀释中重复进行两次测定。基于BSX蛋白的标准化水平产生校准标准曲线。
[0759] 在图40中表示的数据显示结核分枝杆菌BSX蛋白在临床菌株中以与实验室菌株H37Rv中相比高的水平存在。在结核分枝杆菌H878中可检测出比CSU93中低的BSX蛋白水平，然而，这些数据表明针对BSX蛋白的抗体在检测结核分枝杆菌的临床分离株中具有一般性用途。
[0760] 在图40中表示的数据支持针对BSX蛋白的抗体在一般的单分析物诊断测试中，或者作为多分析物测试一部分与如本文所述或本领域已知的针对特定菌株的结核分枝杆菌的抗体一同使用时的有用性。
[0761] 若需要，还可将针对BSX蛋白的抗体与来自BSX阳性临床样本的结核分枝杆菌的后续培养物一同使用以产生关于样品中存在的临床相关菌株的信息。
[0762] 10.不同分枝杆菌菌种之间的交叉反应性
[0763] 为了进一步评价BSX作为生物样品中结核分枝杆菌存在的诊断标志物的适合性，并评价针对BSX蛋白制备的抗体的特异性，本发明人比较了在分枝杆菌菌种结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的细胞提取物之间，抗体在如上所述进行的扩增的夹心ELISA中的反应性。
[0764] 简言之，将ELISA板用捕捉抗体Mo639F包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体后，将来自每个分枝杆菌菌种的细胞提取物添加至经抗体包被的ELISA板孔中。作为每个测定法的阴性对照，使用不含细胞提取物的缓冲液。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将检测抗体Ch12/13与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，用50μl稀释的二抗(例如，生物素化的驴抗鸡IgG和多聚-40链霉抗生物素蛋白-HRP偶合物)温育1小时，再次洗涤，用TMB温育10分钟，并确定450-620nm的吸光度。将样品在全细胞提取物的三个稀释中重复进行两次测定。基于BSX蛋白的标准化水平产生校准标准曲线。
[0765] 在图41a和41b中表示的数据显示三种分枝杆菌菌种之间几乎无可检测出的交叉反应性，表明结核分枝杆菌BSX蛋白对于在这些测定条件下或使用所选的抗体对检测结核分枝杆菌具有菌种特异性。这支持针对BSX蛋白的抗体在一般的或菌种特异性的单分析物诊断测试，或者作为多分析物测试一部分与如本文所述或本领域已知的针对结核分枝杆菌的其它标志物的抗体一同使用时的有用性。举例而言，可将针对BSX蛋白的抗体与一种或多种针对针对结核分枝杆菌Rv1265和/或结核分枝杆菌KARI蛋白和/或结核分枝杆菌EF-Tu和/或结核分枝杆菌S9蛋白的抗体如本文中所述同时使用。
[0766] 还可将针对BSX蛋白的抗体与来自BSX阳性临床样本的结核分枝杆菌的后续培养物一同使用。
[0767] 11.结核分枝杆菌与非分枝杆菌病原体之间的低交叉反应性
[0768] 为了进一步评价BSX作为生物样品中结核分枝杆菌存在的诊断标志物的适合性，本发明人比较了在结核分枝杆菌菌株H37Rv(实验室菌株)、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或铜绿假单胞菌的细胞提取物之间，进行的扩增的夹心ELISA中的抗体交叉反应性。
[0769] 简言之，将ELISA板用捕捉抗体Mo639F包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体后，将来自每个微生物的细胞提取物添加至经抗体包被的ELISA板孔中。作为每个测定法的阴性对照，使用不含细胞提取物的缓冲液。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将检测抗体Ch12/13与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，用50μl二抗(即，生物素化的驴抗鸡IgG和多聚-40链霉抗生物素蛋白-HRP偶合物)温育
1小时，再次洗涤，用TMB温育10分钟，并确定450-620nm的吸光度。
1小时，再次洗涤，用TMB温育10分钟，并确定450-620nm的吸光度。
[0770] 在图42中表示的数据未显示针对结核分枝杆菌BSX蛋白的抗体与大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或铜绿假单胞菌的细胞提取物在测试条件下有显著的交叉反应性，表明所述抗体形成了结核分枝杆菌特异性测试的基础。
[0771] 12.在临床样品中检测BSX蛋白
[0772] 为了进一步评价BSX作为生物样品中结核分枝杆菌存在的诊断标志物的适合性，本发明人确定了抗体在从TB阳性受试者获得的临床样品检测内源BSX蛋白的能力，所述受试者是之前根据涂片测试和结核分枝杆菌培养测定法的结果诊断的。将患者根据涂片测试和培养测试的结果，和HIV状态分类。所有测试的受试者均为涂片阴性且培养测试阴性，或者，涂片阳性且培养阳性。
[0773] 在一个实施例中，如图43的图例所述进行免疫磁珠测定法，其使用包被以抗BSX Ch8多克隆抗体的磁珠以从之前诊断出的受试者的经处理的痰捕捉BSX，而Mo639F单克隆抗体作为检测抗体，并对所述检测抗体进行使用偶合于HRP的抗小鼠Ig的扩增。如图43所示，在TB涂片阳性和培养阳性受试者中，与TB阴性受试者相比较，鉴定出统计学上显著较高水平的BSC蛋白。
[0774] 在另一个实施例中，如上所述对患者痰样品进行扩增的夹心ELISA，所述痰是通过方法3制备的，并作为4x150微升等分试样在替代扩增实验方法(见下)下进行测定。将ELISA板用捕捉抗体Mo639F或其他合适的抗BSX抗体包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体之后，将经处理的痰添加至经抗体包被的ELISA板的孔中。作为对于每个测定法的阴性对照，使用缓冲液。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原后，将检测抗体Ch12/13或其他合适的抗体与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，用50μl二抗(即，生物素化的驴抗鸡IgG和多聚-40链霉抗生物素蛋白-HRP偶合物)温育一小时，再次洗涤，用TMB温育10分钟并确定450-620nm的吸光度。
[0775] 在图44和45中表示的数据显示在之前显示为培养阳性和涂片阳性的4个测试的TB阳性样品中至少3个中检测出显著较高水平的BSX蛋白。与之相对在TB阴性样品中检测出背景信号。
[0776] 13.评估样品对信号的抑制
[0777] 为了评价是否在痰中存在可能不利地影响敏感性(例如，在ELISA或护理位置或现场试验形式中)的抑制性或信号抑制性因子，将痰样品掺以10ng/mL重组结核分枝杆菌BSX蛋白，并将所得的样品分三步1∶27(v/v)系列稀释。将样品温育过夜，并如上所述通过扩增ELISA分析，或立即测定。
[0778] 在图87和88中表示的数据(左上小图，标为“BSX”)表明痰包含一些抑制BSX蛋白信号检测的因子，因为信号强度在添加未稀释的痰之后减少，无论所述测定法是否立即进行或在温育过夜之后进行。然而，该信号强度的丧失可通过稀释痰进行性地抑制，且将痰稀释至少约1∶9(v/v)时很大程度上阻止了信号强度的丧失。信号强度还在过夜温育痰中的重组蛋白之后减少，且该信号强度的丧失也可通过稀释痰样品来部分阻止。这些数据表明推荐将痰至少1∶9(v/v)稀释至封闭缓冲液和快速分析样品来增强在这些条件下测定BSX蛋白的信号强度。
[0779] 14.在分枝杆菌细胞中可检测出的BSX蛋白的相对水平
[0780] 为了进一步评价BSX作为分枝杆菌感染的诊断性标志物的适合性，在结核分枝杆菌菌株H37Rv、CSU93和HN878以及结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌全细胞裂解液中相对于本文中所述的其他10个结核分枝杆菌抗原(包括KARI、EF-Tu、P5CR、Rv1265、S9和TetR样蛋白)确定BSX蛋白的水平。
[0781] 基本上如本实施例和实施例1中所述进行扩增的夹心ELISA，以根据标准实验方法鉴定每种抗原的相对水平，并包括了校准标准以使得量化成为可能。
[0782] 示于图124-125的数据表明BSX在所有三种测试的结核分枝杆菌菌株中当基于总细胞蛋白表示时，是相对丰富的蛋白。据此，在测试的11个免疫原性蛋白中，结核分枝杆菌Rv1265、BSX和S9蛋白也是相对丰富的。示于图126-127的数据表明BSX蛋白一般地在分枝杆菌菌种中也是相对丰富的蛋白，而其他测试的主要免疫原性蛋白，即BSX、Rv1265和S9，当基于细胞表示时(图126-127)或基于全细胞裂解液蛋白的微克数时(图128-129)或基于全细胞裂解液滤过物的微升数时(图130-131)，似较之BSX具有对结核分枝杆菌更强的特异性。这些数据表明了BSX作为结核分枝杆菌感染类别性的单分析物标志物，或作为针对分枝杆菌感染或结核分枝杆菌感染的多分析物测试的一部分与BSX和/或Rv1265和/或S9蛋白组合时的有用性。并未排除其他供对结核分枝杆菌感染进行多分析物测试的组合。
[0783] 11.优化检出限
[0784] 为了进一步增强夹心ELISA的敏感性，使用替代性扩增方法以在用捕捉抗体包被所述ELISA板之后进行反复的抗原结合。基本上，这会导致结合于捕捉抗体的抗原量增加，尽管96-孔ELISA板的50μl体积限制。简言之，该反复的抗原加载涉及在夹心ELISA中在洗涤并添加检测抗体之前重复几次抗原结合步骤，例如，2或3或4或5次等。自然而然，每个等分试样的抗原样品是在标准的温育期间之后，下一等分试样添加之前去除的。可修饰重复的次数以优化测定法(例如，参数如信噪比、检出限和在半最大信号处检测出的抗原量)，这取决于测试的样品的特性(例如，样品类型)，而无需不必要的实验尝试。举例而言，可使用多至约20次重复样品加载(即，多至20x替代性扩增)以提供结核分枝杆菌BSX蛋白的低背景信号和降低的检出限。
[0785] 实施例4
[0786] 使用结合于命名为S9的推定的结核分枝杆菌核糖体蛋白的抗体进行的由结核分枝杆菌造成的感染或结核病的基于抗原的诊断
[0787] 1.在TB阳性受试者中鉴定S9蛋白
[0788] 在来自TB+样品的血清免疫球蛋白级分中识别出具有约30.2kDa分子量的蛋白(图46)。来自MALDI-TOF数据的四个肽的序列(SEQ ID NO：15-18，含15和18)与具有SwissProt登录号P66638的蛋白(SEQ ID NO：14)匹配。该4个肽(SEQ ID NO：15-18)对P66638的覆盖百分比为约14-15％，表明所述肽片段来源于该同一个蛋白标志物。该结论受下述支持：仅有六个具有零错切的理论的经胰蛋白酶消化的肽，和十四个具有一个错切的理论的经胰蛋白酶消化的肽。
[0789] 鉴定的具有SEQ ID NO：14中所述的氨基酸序列的蛋白命名为“S9”。有趣的是，S9蛋白的估计分子量仅为约16.4kDa，而S9的估计等电点为约10.7。由于S9蛋白观察到的分子量比估计值高约14kDa，所述蛋白非常可能是经翻译后修饰的(例如，通过糖基化)，或与其他影响分子类型(如核酸)一同迁移。
[0790] 2.抗体
[0791] 抗体是针对结核分枝杆菌的重组S9蛋白(rS9)和针对从全长S9蛋白序列衍生的合成肽使用本文中所述方法制备的。针对rS9大约产生了八个(8)抗体，并如实施例1中所述就其适合性进行筛选。
[0792] a)针对合成S9肽的抗体
[0793] 合成来自30S核糖体蛋白S9，包含序列H-MTETT PAPQT PAAPAGPAQS FC-NH2的合成肽至78％纯度，所述纯度是通过藉由模拟表位(Mimotopes)的液相层析使用固相肽合成技术确定的。该肽通过马来酰亚胺己酰基-N-羟基琥珀酰亚胺接头偶联于匙孔血蓝蛋白(KHL)。
[0794] 为了便于检测针对该表位培育的抗体，还将肽与GSGL间隔物一同合成，并附于生物素(PAPQT PAAPA GPAQS FGSGL-生物素)，其纯度根据液相层析为93％。
[0795] 对兔根据下述注射实验方案注射每剂量600μg的合成肽，所述合成肽包含连接于KHL的氨基酸序列H-MTETT PAPQT PAAPA GPAQS FC-NH2：
[0796]预放血 第0周
初次接种 第0周
第一次加强 第3周
第二次加强 第6周
测试放血 第7.5周
第三次加强 第9周
完全放血(bleedout) 第10.5周
初次接种 第0周
第一次加强 第3周
第二次加强 第6周
测试放血 第7.5周
第三次加强 第9周
完全放血(bleedout) 第10.5周
[0797] 在10.5周之后，对兔进行完全放血。将所有血收集于无菌容器中，并在37℃温育以加速凝固(clotting)。将容器离心，去除血清，并重新离心以去除剩余的红细胞。血清命名为“R9”。
[0798] 将链霉抗生物素蛋白(Sigma Aldrich)用ddH2O稀释至5μg/ml，并在Nunc板中在4℃温育过夜。然后轻拍去除溶液，并将250μL封闭缓冲液(在PBS中1％(w/v)酪蛋白、0.1％(v/v)Tween 20，0.1％(w/v)叠氮化钠)添加至每个孔，并在室温温育1小时。将封闭缓冲液轻拍去除，并将生物素化的肽(对应于注射入兔的免疫原)以3μg/ml(50μl/孔)添加在封闭缓冲液中，并在室温在振荡器上温育1小时。将板在Elx405Auto Plate Washer(Bio-Tek Instruments Inc.，Winooski，VT)中用0.5x PBS/0.05％(v/v)Tween 20溶液洗涤，将过量溶液轻拍到纸巾上。将兔血清用封闭缓冲液从1∶5002倍稀释至1∶1024000，并在室温以50μl/孔在振荡器上温育1小时。用板洗涤器使用0.5x PBS/0.05％(v/v)Tween 20溶液洗涤板，并将过量溶液轻拍到纸巾上。兔抗体与其相应的表位的结合是使用在偶合物稀释缓冲液中稀释为10000分之一的HRP-偶合的绵羊抗兔(Chemicon)来检测的。将五十毫升添加至每个孔，并在室温在振荡器上温育一小时。用板洗涤器使用0.5x PBS洗涤板，并将过量溶液轻拍到纸巾上。将五十毫升TMB(3，3’，5’，5-四甲基联苯胺；Sigma)添加至每个孔，并在暗处将板温育30分钟。用50μL/孔的0.5M硫酸终止显色。每个孔的吸光度用微滴定板读数器读取(PowerWaveX 340板读数器，Bio-Tek InstrumentsInc.，Winooski，VT))，使用450nm的波长和620nm的消光波长(extinction)。滴定结果示于图47。
[0799] 为了滴定所述肽，使用基本上如上文所述的实验方法。然而，生物素化的肽是从20480pg/ml滴定至10pg/ml，并首先通过亲和肽柱纯化兔血清，并将其以10μg/ml、20μg/ml和40μg/ml添加至ELISA。该分析的结果示于图48。
[0800] 本发明涵盖除了具体描述于本实施例中的抗体组合和抗体取向之外的多种抗体组合和抗体取向，包括任何例示的抗体以任何取向的组合(例如，作为捕捉抗体或检测抗体)。
[0801] b)针对全长重组S9蛋白的抗体
[0802] 针对全长重组结核分枝杆菌蛋白(SEQ ID NO：14)通过使用标准方法对鸡和小鼠进行免疫接种制备的两个抗体(Ch27和Mo1025F)，与其他产生的抗体(包括通过S9肽的噬菌体展示产生的二价F(ab)2片段和针对纯化的S9肽培育的另一个多克隆抗体(R9))相比较，显示具有在ELISA测定法中检测S9蛋白的最高的敏感性(数据未显示)。在本文中，鸡抗S9单克隆血清命名为“Ch27”，而小鼠抗S9抗体命名为“Mo1025F”。供诊断结核分枝杆菌的优选的抗体对由命名为“Mo1025F”的来源于小鼠的抗体作为优选的检测抗体而命名为“Ch27”的来源于鸡的多克隆抗体作为优选的捕捉抗体组成。
[0803] 在图51中表示的数据显示针对重组结核分枝杆菌核糖体蛋白S9制备的抗体Ch27和Mo1025F能够通过标准ELISA检测重组S9蛋白，并表明小鼠抗体Mo1025F由于其相对于抗体Ch27(在使用的条件下大于125ng/ml S9蛋白的半最大检测和约32ng/ml的检出限)较高的效价(即，在使用的条件下约93ng/ml S9蛋白的半最大检测，和约8ng/ml的检出限)可能作为诊断试剂具有特别的有用性。
[0804] 供进行本发明的其他抗体和抗体对描述于本实施例，包括命名为“R9”的针对合成肽制备的兔多克隆抗体(见下)。并未排除其他抗体组合和抗体取向。
[0805] 3.使用抗体R9、Mo1025F和Ch27验证作为诊断标志物的S9
[0806] 将来自结核分枝杆菌菌株H37Rv的S9蛋白的氨基酸序列表示为SEQ IDNO：15。其翻译产物具有约16.4kDa的预期分子量。基本上如实施例1所述进行的对经六组氨酸标记的rS9蛋白的一维SDS/PAGE分析显示所述S9蛋白作为大约17kDa的单一条带迁移(数据未显示)，其为基于翻译产物和六组氨酸标记部分理论分子量预期的融合蛋白分子量。
[0807] 为了确证多克隆抗体R9能够检测结核分枝杆菌表达的蛋白，使用来自结核分枝杆菌实验室菌株H37Rv提取的蛋白进行Western印迹。提取胞质溶胶和细胞膜蛋白，并使用基本上如实施例1所述的Western印迹进行分析。抗体R9在经还原的胞质溶胶样品、经还原的膜样品和未经还原的胞质溶胶/膜样品中检测出具有正确分子量的蛋白。相应地，结核分枝杆菌(例如，菌株H37Rv)表达核糖体蛋白R9，之前本领域中并不知道该事实。
[0808] 使用ELISA捕捉抗体(Ch27)和检测抗体(Mo1025F)分别进行Western印迹分析(数据未显示)，以检测结核分枝杆菌H37Rv、结核分枝杆菌CSU93和结核分枝杆菌HN878的全细胞裂解液中的重组S9蛋白和内源S9蛋白。两个抗体均在全细胞裂解液中识别具有天然S9蛋白预期分子量(即，约16.4kDa)的条带，并检测出略微较大的重组S9蛋白(数据未显示)。可检测出极小的背景或无背景。
[0809] 多克隆抗体Ch27在实验室菌株H37Rv的提取物中检测出高水平的内源S9蛋白，其具有预期的分子量，并在临床菌株CSU93中检测出水平远较之为低但仍可检测出的内源S9蛋白。与之相对，单克隆抗体Mo1025F在H37Rv和CSU93中均与具有预期分子量的蛋白强烈反应，并还在临床菌株HN878中产生出可检测的强信号。如Ch27抗体制备物，从Mo1027对S9蛋白在H37Rv提取物中的结合获得的信号强度显著地强于从CSU93细胞提取物中获得的。这些数据表明使用这两种抗体制备物获得的信号强度的差异可为其不同抗体效价的结果，而非其在不同培养物中检测S9蛋白能力的本质差异的结果，因为其趋势对于两个制备物均为相同的，即HN878信号＜CSU93信号＜H37Rv信号。
[0810] 因此，可得到的数据确证了抗体Mo1025F和Ch27对于检测结核分枝杆菌S9蛋白的特异性。
[0811] 基本上如实施例1所述的竞争性Western印迹分析表明两种抗体与重组的S9蛋白和内源S9蛋白的结合可通过将抗体与过量浓度的未标记的重组S9蛋白预温育来消除(数据未显示)。
[0812] 总之，可获得的数据表明ELISA捕捉抗体(Ch27)和检测抗体(Mo1025F)特异性结合于结核分枝杆菌S9蛋白。
[0813] 4.在来自TB受试者的痰中使用多克隆抗体R9检测S9
[0814] 本文中所述的R9抗体用于在来自20个TB受试者和20个罹患非TB的受试者的样品中检测S9蛋白。简言之，将来自TB或非TB患者的痰(12μl)加载于4-12％1D梯度SDS聚丙烯酰胺凝胶上，并通过电泳分离。然后将蛋白电转移至PVDF膜上。然后将膜在
1XPBS，0.1％ Tween-20(PBS-T)中含1％酪蛋白的溶液中在室温(RT)封闭2小时。然后将膜用15μg/ml纯化的兔抗S9多克隆抗体溶液(即R9)在RT温育2小时，接着用PBST洗
涤3x10分钟。然后将膜用1∶10000稀释的绵羊抗兔IgG-HRP偶合抗体溶液在RT温育1
小时，接着用PBST洗涤5x10分钟。最终将膜用“Femto”化学发光试剂(Pierce)处理5分钟，之后暴露于x射线胶片。
1XPBS，0.1％ Tween-20(PBS-T)中含1％酪蛋白的溶液中在室温(RT)封闭2小时。然后将膜用15μg/ml纯化的兔抗S9多克隆抗体溶液(即R9)在RT温育2小时，接着用PBST洗
涤3x10分钟。然后将膜用1∶10000稀释的绵羊抗兔IgG-HRP偶合抗体溶液在RT温育1
小时，接着用PBST洗涤5x10分钟。最终将膜用“Femto”化学发光试剂(Pierce)处理5分钟，之后暴露于x射线胶片。
[0815] 使用兔R9多克隆抗体，在20/20南非TB患者(敏感性＝100％)和5/20澳大利亚非TB呼吸道疾病患者(特异性＝75％)中检测出核糖体蛋白S9。
[0816] 5.使用抗体Ch27和Mo1025F的夹心ELISA
[0817] 在第一组实验中，进行夹心ELISA以确定最优的捕捉和检测抗体，以及所用的合适抗体浓度。简言之，将两个ELISA板用Ch27或Mo1025F抗体以在封闭缓冲液中2.5μg/ml和5μg/ml的浓度包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体后，将50μl重组S9蛋白的等分试样(用封闭缓冲液中从500ng/ml起始浓度1∶2(v/v)系列稀释至7.8ng/ml)，添加至经抗体包被的ELISA板孔中。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将交替的检测抗体(即，Mo1025F用于检测Ch27-S9复合物，而Ch27用于检测Mo1025F-S9复合物)与板以1.25μg/ml至5μg/ml的范围的浓度相接触。在室温温育1小时之后，如前所述洗涤板，用
50μl的1∶5000(v/v)稀释的偶合于辣根过氧化物酶(HR)的驴抗小鼠IgG温育，如前所述洗涤，用TMB温育30分钟，并确定450-620nm的吸光度。
50μl的1∶5000(v/v)稀释的偶合于辣根过氧化物酶(HR)的驴抗小鼠IgG温育，如前所述洗涤，用TMB温育30分钟，并确定450-620nm的吸光度。
[0818] 在图52和53中表示的数据表明在使用Ch27作为捕捉抗体而Mo1025F作为检测抗体时，获得了在夹心ELISA中取得每单位重组S9蛋白较高信号的优选(虽然不是必需的)抗体取向。用该抗体取向还观察到了抗体之间的最低相互反应性，如图52中S9不存在于样品中时的基线值所示。
[0819] 为了确定所述夹心ELISA对重组结核分枝杆菌S9蛋白的检出限，还使用从18.31pg/ml至150ng/ml的浓度范围的S9蛋白的系列稀释进行了该测定法。在图54中表示的数据表明，在测试的测定条件下，用该抗体组合并无背景信号，且可检出低至约996pg/ml浓度的结核分枝杆菌核糖体蛋白S9，其半最大检测为约28ng/ml结核分枝杆菌核糖体蛋白S9。本发明人认为在夹心ELISA中的这种检测敏感性连同低背景是落在有用的限制范围内的。
[0820] 6.供检测结核分枝杆菌S9蛋白的扩增的夹心ELISA
[0821] 扩增ELISA基本如本实施例和实施例1中所述进行，使用Ch27多克隆抗体作为捕捉试剂而Mo1025F单克隆抗体作为检测抗体，并使用生物素化的驴抗小鼠IgG二抗与多聚-40链霉抗生物素蛋白-HRP偶合物以检测结合的检测抗体。作为生物素化的二抗的替代手段，将单克隆抗体Mo1025直接生物素化以产生本文中命名为“Mo1025F-Bio”的物种，其可使用HRP-偶合的链霉抗生物素蛋白直接检测出。
[0822] 如示于图55，使用生物素化的二抗和链霉抗生物素蛋白多聚40辣根过氧化物酶(HRP)偶合物提供了检测敏感性的部分提高，其统计学上显著的检出限低至约150pg/ml重组的结核分枝杆菌核糖体蛋白S9。在这些条件下，所述夹心ELISA还能够在半最大信号处检测约6ng/ml结核分枝杆菌核糖体蛋白S9。
[0823] 使用生物素化的Mo1025F-Bio抗体作为检测抗体试剂获得了类似的结果。如图59所示，直接使用Mo1025F-Bio检测抗体进行的扩增ELISA还将LOD从1470pg/mL降低约4倍至约348pg/mL，然而在这些实验中，标准ELISA的LOD高于如上文中所述的实验中的LOD，即1470pg/mL对996pg/mL，表明两种扩增ELISA系统的实际结果可能是相当的。为了补偿实验间的变动对数据的调整支持该结论。
[0824] 7.替代扩增ELISA
[0825] 为了进一步增强夹心ELISA的敏感性，本发明人进一步修饰了该基础测定法，即在用捕捉抗体包被ELISA板之后使用反复的抗原结合。基本上，这导致结合于捕捉抗体的抗原量增加，尽管96-孔ELISA板的50μl体积限制。简言之，该反复的抗原加载涉及在夹心ELISA中在洗涤并添加检测抗体之前重复几次抗原结合步骤，例如，2或3或4或5次等。自然而然，每个等分试样的抗原样品是在标准的温育期间之后，下一等分试样添加之前去除的。可修饰重复的次数以优化测定法(例如，参数如信噪比、检出限和在半最大信号处检测出的抗原量)，这取决于测试的样品的特性(例如，样品类型)，而无需不必要的实验尝试。
[0826] 如示于图56，五次重复样品加载(即，5x替代扩增)提供了低背景信号，和约84pg/ml结核分枝杆菌核糖体蛋白S9的检出限。因为示于图56的测定法并非在达到信号饱和的条件下进行，无法估计在半最大信号检测出的抗原量。尽管如此，通过反复的抗原加载获得了重组结核分枝杆菌核糖体蛋白S9检测敏感性约2倍的增加。
[0827] 7.结核分枝杆菌与非分枝杆菌病原体之间的低交叉反应性
[0828] 为了进一步评价S9作为生物样品中结核分枝杆菌存在的诊断标志物的适合性，本发明人比较了在结核分枝杆菌菌株H37Rv(实验室菌株)、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或铜绿假单胞菌的细胞提取物之间，进行的扩增的夹心ELISA中的抗体交叉反应性。
[0829] 简言之，将ELISA板用捕捉抗体Ch27以5μg/ml的浓度包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体后，将来自每个微生物的500ng/ml或50μg/ml的细胞提取物添加至经抗体包被的ELISA板孔中。作为每个测定法的阴性对照，使用不含细胞提取物的缓冲液。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将检测抗体Mo1025F以2.5μg/ml浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，用50μl 1∶5000(v/v)稀释的二抗(即，生物素化的驴抗小鼠IgG和多聚-40链霉抗生物素蛋白-HRP偶合物)温育1小时，再次洗涤，用TMB温育10分钟，并确定450-620nm的吸光度。在该实验中未进行重复的样品加载。
[0830] 在图57中表示的数据显示在测试条件下，针对结核分枝杆菌核糖体蛋白S9的抗体与大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或铜绿假单胞菌的细胞提取物具有低交叉反应性。
[0831] 8.抗S9抗体与不同结核分枝杆菌分离株之间的交叉反应性
[0832] 为了进一步评价S9作为生物样品中结核分枝杆菌存在的诊断标志物的适合性，并评价针对S9蛋白制备的抗体的特异性，本发明人比较了在临床结核分枝杆菌菌株CSU93和H878以及实验室结核分枝杆菌菌株H37Rv的细胞提取物之间，抗体在如上所述进行的扩增的夹心ELISA中的反应性。
[0833] 简言之，将ELISA板用捕捉抗体Ch27包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体后，将来自每个分离株的细胞提取物添加至经抗体包被的ELISA板孔中。作为每个测定法的阴性对照，使用不含细胞提取物的缓冲液。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将检测抗体Mo1025F或Mo1025F-Bio与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，用50μl稀释的二抗(例如，当使用Mo1025作为检测抗体时，为生物素化的驴抗小鼠IgG)温育1小时，然后用多聚-40链霉抗生物素蛋白-HRP偶合物温育1小时，再次洗涤，用TMB温育10分钟，并确定450-620nm的吸光度。将样品在全细胞提取物的三个稀释中重复进行两次测定。基于S9蛋白的标准化水平产生校准标准曲线。
[0834] 在图58和60中表示的数据显示结核分枝杆菌S9蛋白以相当的水平存在于临床结核分枝杆菌分离株CSU93和实验室菌株H37Rv中。图61中的数据也显示S9蛋白在H37Rv、CSU93和HN878中具有相当的水平。
[0835] 在图60中表示的数据支持针对S9蛋白的抗体在一般的单分析物诊断测试，或者作为多分析物测试一部分与检测结核分枝杆菌其他抗原或甚至检测如本文所述或本领域已知的特定菌株的结核分枝杆菌的抗体一同使用时的有用性。
[0836] 若需要，可将针对S9蛋白的抗体与来自S9阳性临床样本的结核分枝杆菌的后续培养物一同使用以产生关于样品中存在的临床相关菌株的信息。
[0837] 9.不同分枝杆菌菌种之间的交叉反应性
[0838] 为了进一步评价S9作为生物样品中结核分枝杆菌存在的诊断标志物的适合性，并评价针对S9蛋白制备的抗体的特异性，本发明人比较了在分枝杆菌菌种结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的细胞提取物之间，抗体在如上所述进行的扩增的夹心ELISA中的反应性。
[0839] 简言之，将ELISA板用捕捉抗体Ch27包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体后，将来自每种分枝杆菌的细胞提取物添加至经抗体包被的ELISA板孔中。作为每个测定法的阴性对照，使用不含细胞提取物的缓冲液。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将检测抗体Mo1025F或Mo1025-Bio与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，如果需要用50μl稀释的二抗(例如，如果使用Mo1025F作为检测试剂，生物素化的驴抗小鼠IgG)温育1小时，然后用多聚-40链霉抗生物素蛋白-HRP偶合物温育1小时，再次洗涤，用TMB温育10分钟，并确定450-620nm的吸光度。将样品在全细胞提取物的三个稀释中重复进行两次测定。基于S9蛋白的标准化水平产生校准标准曲线。
[0840] 在图61中表示的数据显示三种分枝杆菌菌种之间几乎无可检测出的交叉反应性，表明结核分枝杆菌S9蛋白对于在这些测定条件下和/或使用所选的抗体对检测结核分枝杆菌具有菌种特异性。这支持针对S9蛋白的抗体在对结核分枝杆菌的单分析物诊断测试，或者作为多分析物测试一部分与如本文所述或本领域已知的针对结核分枝杆菌感染的其它抗原性标志物的抗体一同使用时的有用性。
[0841] 还可将针对S9蛋白的抗体与来自S9阳性临床样本的结核分枝杆菌的后续培养物一同使用。
[0842] 作为替代或附加手段，可将针对S9蛋白的抗体与一种或多种针对结核分枝杆菌Rv1265和/或结核分枝杆菌BSX和/或结核分枝杆菌EF-Tu和/或结核分枝杆菌KARI蛋白的抗体如本文中所述同时使用。
[0843] 10.在临床样品中检测S9蛋白
[0844] 为了进一步评价S9作为生物样品中结核分枝杆菌存在的诊断标志物的适合性，本发明人确定了抗体在从TB阳性受试者获得的临床样品检测内源S9蛋白的能力，所述受试者是之前根据涂片测试和结核分枝杆菌培养测定法的结果诊断的。将患者根据涂片测试和培养测试的结果，和HIV状态分类。所有测试的受试者均为涂片阴性且培养测试阴性，或者，涂片阳性且培养阳性。
[0845] 简言之，如本文中如上所述对痰样品进行夹心ELISA，所述痰是通过方法2或方法3制备的，并作为4x150微升等分试样或17x150微升等分试样在替代扩增实验方法(见上)下进行测定。将ELISA板用捕捉抗体Ch27包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体之后，将经处理的痰添加至经抗体包被的ELISA板的孔中。作为对于每个测定法的阴性对照，使用不含细胞提取物的缓冲液。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原后，将检测抗体Mo1025F或Mo1025F-Bio与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，如果需要，用50μl稀释的二抗温育(例如，如果Mo1025F用作检测试剂，为生物素化的驴抗小鼠IgG)一小时，然后用多聚-40链霉抗生物素蛋白-HRP偶合物温育1小时，再次洗涤，用TMB温育10分钟并确定450-620nm的吸光度。将样品在全细胞提取物的三个稀释中重复进行两次测定。基于S9蛋白的标准化水平产生校准标准曲线。
[0846] 在图62至67中表示的数据显示在之前显示为培养阳性和涂片阳性的TB阳性样品中显著地检测出S9蛋白。当表示为pg S9蛋白每mL痰时，对于TB阳性样品的信号稳定的保持在TB阴性样品背景之上。优选的测定结果可使用供制备临床痰样品的方法3与替代扩增来获得。
[0847] 11.评估样品对信号的抑制
[0848] 为了评价是否在痰中存在可能不利地影响测定敏感性(例如，在ELISA或护理位置或现场试验形式中)的抑制性或信号抑制性因子，将痰样品掺以10ng/mL重组结核分枝杆菌S9蛋白，并将所得的样品分三步1∶27(v/v)系列稀释。将样品温育过夜，并如上所述通过扩增ELISA分析，或立即测定。
[0849] 在图87和88中表示的数据(左下小图，标为“S9”)表明痰包含一些抑制S9蛋白信号检测的因子，因为信号强度在添加未稀释的痰之后减少，无论所述测定法是否立即进行或在温育过夜之后进行。然而，该信号强度的丧失可通过稀释痰进行性地抑制，且将痰稀释至少约1∶9(v/v)时很大程度上阻止了信号强度的丧失。信号强度还在痰中过夜温育重组蛋白之后减少。这些数据表明将痰至少1∶9(v/v)稀释至封闭缓冲液和快速分析样品可以增强在这些条件下测定S9蛋白的信号强度。
[0850] 在一组单独的评价因子是否存在于血浆中的实验中，将不同浓度的重组结核分枝杆菌核糖体蛋白S9(即，0.8-16ng/ml)与系列稀释的血浆混合，并在如上文所述使用生物素化的二抗和链霉抗生物素蛋白多聚-40辣根过氧化物酶(HRP)偶合物的测定法形式中进行测试。
[0851] 在测试的条件下，未观察到信号的显著抑制，且可通过进行至少一轮的反复的样品加载来补偿信号强度至最小限度的丧失(图58)。
[0852] 12.在分枝杆菌细胞中可检测出的S9蛋白的相对水平
[0853] 为了进一步评价S9作为分枝杆菌感染的诊断性标志物的适合性，在结核分枝杆菌菌株H37Rv、CSU93和HN878以及结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌全细胞裂解液中相对于本文中所述的其他10个结核分枝杆菌抗原(包括BSX、KARI、EF-Tu、P5CR、Rv1265和TetR样蛋白)确定S9蛋白的水平。
[0854] 基本上如本实施例和实施例1中所述进行扩增的夹心ELISA，以根据标准实验方法鉴定每种抗原的相对水平，并包括了校准标准以使得量化成为可能。
[0855] 示于图130-131的数据表明S9在所有三种测试的结核分枝杆菌菌株中当基于总细胞蛋白表示时，是适度地丰富的蛋白。据此，结核分枝杆菌BSX、Rv1265和S9蛋白以相似水平表达，且相对于以显著更高水平表达的KARI，它们是以中间水平表达的，而EF-Tu在较低水平表达。示于图126-131的数据确证了S9在结核分枝杆菌中相对鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌中的特异性表达，当表达是基于细胞(图126-127)或基于全细胞裂解液蛋白的微克数(图128-129)或基于全细胞裂解液滤过物的微升数(图130-131)进行计算时，在后两种细菌中，所述蛋白在这些条件下无法容易地通过夹心ELISA检测出。这些数据表明了S9作为结核分枝杆菌感染的单分析物标志物，或作为针对分枝杆菌感染或结核分枝杆菌感染的多分析物测试的一部分与KARI和/或Rv1265和/或BSX蛋白组合时的有用性。并未排除其他用于对结核分枝杆菌感染进行多分析物测试的组合。
[0856] 实施例5
[0857] 使用结合于结核分枝杆菌蛋白Rv1265/MT1303的抗体进行的由结核分枝杆菌造成的感染或结核病的基于抗原的诊断
[0858] 1.在TB阳性受试者中鉴定Rv1265蛋白
[0859] 在来自TB+样品的血浆免疫球蛋白级分中识别出蛋白片段。来自MALDI MS数据的四个肽的序列(SEQ ID NO：22-25，含15和18)与具有SwissProt登录号P64789的假说蛋白(SEQ ID NO：21)匹配。该4个肽(SEQ IDNO：22-25)对P64789的覆盖百分比为约19％，表明所述肽片段来源于该同一个蛋白标志物。
[0860] 鉴定出的具有SEQ ID NO：21中所述的氨基酸序列的假说蛋白命名为“蛋白Rv1265/MT1303”。蛋白Rv1265/MT1303的估计分子量为约25.2kDa，而估计等电点为约7.11。
[0861] 2.抗体
[0862] a)针对结核分枝杆菌Rv1265/MT1303的肽片段制备的抗体
[0863] 包含全长蛋白Rv1265/MT1303氨基酸残基13-25的合成肽(SEQ IDNO：26)和包含SEQ ID NO：21氨基酸残基90-100的合成肽(即，SEQ ID NO：27)是通过标准方法合成的。这些肽可分别通过马来酰亚胺己酰基-N-羟基琥珀酸接头偶联于钥孔血蓝蛋白(KHL)。
[0864] 为了便于检测针对该表位培育的抗体，还将肽分别合成，每个均与GSGL间隔物一同合成，并与生物素附接。
[0865] 将鸡和兔用包含SEQ ID NO：26所述的氨基酸序列的合成肽根据标准方法进行免疫接种。对动物进行放血。将所有血收集于无菌容器中，并在去除血块之后收集血清。
[0866] 为了滴定在鸡中产生的抗血清，将重组蛋白Rv1265/MT1303以5μg/ml的浓度固定于Nunc免疫板上。去除溶液，并使用封闭缓冲液(在PBS中1％(w/v)酪蛋白、0.1％(v/v)Tween 20，0.1％(w/v)叠氮化钠)封闭孔。去除封闭缓冲液并添加稀释于PBS的血清，并温育足够时间使得抗体与结合的重组的蛋白Rv1265/MT1303复合，通常为在室温约1小时。洗涤板，而抗体对重组蛋白Rv1265/MT1303的结合是使用1∶5000(v/v)稀释于偶合物稀释缓冲液中的HRP偶合的绵羊抗鸡IgG来检测的。将五十毫升(50ml)TMB(3，3’，5’，5-四甲基联苯胺；Sigma)添加至每个孔，并在暗处将板温育30分钟。用50μL/孔的0.5M硫酸终止显色。每个孔的吸光度用微滴定板读数器读取(PowerWaveX 340板读数器，Bio-Tek Instruments Inc.，Winooski，VT)，使用450nm的波长和620nm的消光波长。滴定结果示于图68。
[0867] 为了测试兔抗血清，将链霉抗生物素蛋白(Sigma Aldrich)用双蒸水(ddH2O)稀释至5μg/ml，并在Nunc板中在4℃温育过夜。然后轻拍去除溶液，并将250μL封闭缓冲液(在PBS中1％(w/v)酪蛋白、0.1％(v/v)Tween 20，0.1％(w/v)叠氮化钠)添加至每个孔，并在室温温育1小时。将封闭缓冲液轻拍去除，并将生物素化的肽(SEQ ID NO：26)以3μg/ml(50μl/孔)添加在封闭缓冲液中，并在室温在振荡器上温育1小时。将板在Elx405 Auto Plate Washer(Bio-Tek Instruments Inc.，Winooski，VT)中用0.5x PBS/0.05％(v/v)Tween 20溶液洗涤，将过量溶液轻拍到纸巾上。将兔血清用封闭缓冲液从1∶500(v/v)稀释至1∶1024000(v/v)，并在室温以50μl/孔在振荡器上温育1小时。用板洗涤器使用0.5x PBS/0.05％(v/v)Tween 20溶液洗涤板，并将过量溶液轻拍到纸巾上。兔抗体与SEQ ID NO：26的结合是使用1∶5000(v/v)稀释于偶合物稀释缓冲液中的HRP-偶合的绵羊抗兔IgG(Chemicon)来检测的。将五十毫升(50ml)添加至每个孔，并在室温在振荡器上温育一小时。用板洗涤器使用0.5x PBS洗涤板，并将过量溶液轻拍到纸巾上。将五十毫升TMB(3，3’，5’，5-四甲基联苯胺；Sigma)添加至每个孔，并在暗处将板温育30分钟。用
50μL/孔的0.5M硫酸终止显色。每个孔的吸光度用微滴定板读数器读取(PowerWaveX 340板读数器，Bio-Tek Instruments Inc.，Winooski，VT)，使用450nm的波长和620nm的消光波长(extinction)。滴定结果示于图69。
50μL/孔的0.5M硫酸终止显色。每个孔的吸光度用微滴定板读数器读取(PowerWaveX 340板读数器，Bio-Tek Instruments Inc.，Winooski，VT)，使用450nm的波长和620nm的消光波长(extinction)。滴定结果示于图69。
[0868] 血清检出限是通过将固定于ELISA板上的重组的Rv1265/MT1303蛋白以19.6ng/ml至200pg/ml的浓度滴定来确定的。将纯化的兔抗体以1.25μg/ml、2.5μg/ml或5μg/ml的浓度添加。将绵羊抗兔Ig HRP偶合物(1∶5000(v/v)稀释)和TMB用于在标准ELISA中检测结合的兔抗体。数据示于图70。
[0869] 为了滴定所述肽，使用基本上如上文所述的实验方法。然而，包含SEQID NO：26的生物素化的肽是从20480pg/ml滴定至100pg/ml，而所述兔血清是以1∶500(v/v)和1∶2000(v/v)的稀释程度添加至ELISA的。
[0870] b)针对重组的结核分枝杆菌Rv1265蛋白制备的单克隆抗体
[0871] 将全长的重组Rv1265蛋白(SEQ ID NO：21)根据标准方法用作供抗体产生的抗原。将大约6mg的蛋白提供给NeoClone，Madison，Wisconsin，USA以供根据其标准实验方法产生单克隆抗体。提供约1mg作为生物素化的肽的所述蛋白用于质量控制。
[0872] 对五只BALB/cByJ雌性小鼠用蛋白根据Neoclone的标准免疫接种方法进行免疫接种。以规则的间隔进行经免疫接种的小鼠的测试放血以用于使用生物素化的肽的质量控制血清ELISA。使用ELISA确定具有最高效价的多克隆血清。将具有至少1000多克隆抗体效价的小鼠用于ABL-MYC感染方法。将具有与肽抗原的交叉反应的多克隆抗体的最高效价的3只小鼠的脾根据NeoClone的标准感染方法用于ABL-MYC感染。将经ABL-MYC感染的小鼠的脾细胞移植入约20只未经实验的小鼠。分离在经移植的小鼠中形成的腹水，并就产生结合于靶肽抗原的单克隆抗体(mAb)的细胞进行筛选。
[0873] 分离了产生命名为788C的mAb的细胞系(即，浆细胞瘤)。使用ELISA确证了mAb788C结合亲和性和同种型特异性。将命名为788C的mAb以1ml等分试样(大约)的腹水
与相关的细胞系一同提供。当使用标准方法测定时，这种单克隆抗体针对Rv1265具有高效价(数据未显示)，并使用所述单克隆血清作为捕捉和检测试剂进行进一步的诊断测试，但由于所述抗体在作为捕捉抗体时的较低背景，优选使用该抗体取向。命名为788C的mAb是从腹水使用蛋白G或蛋白A柱进一步纯化的。
与相关的细胞系一同提供。当使用标准方法测定时，这种单克隆抗体针对Rv1265具有高效价(数据未显示)，并使用所述单克隆血清作为捕捉和检测试剂进行进一步的诊断测试，但由于所述抗体在作为捕捉抗体时的较低背景，优选使用该抗体取向。命名为788C的mAb是从腹水使用蛋白G或蛋白A柱进一步纯化的。
[0874] c)针对重组结核分枝杆菌Rv1265蛋白制备的多克隆抗体
[0875] 针对全长的重组结核分枝杆菌蛋白Rv1265(SEQ ID NO：21)通过使用标准方法对鸡进行免疫接种制备了另外两个抗体制备物。两个不同批次的鸡多克隆抗血清，命名为“Ch10”和“Ch11”是针对Rv1265蛋白培育的，然后将其汇集产生本文中命名为“Ch10/11”的抗体。所述多克隆抗体制备物在使用标准方法测定时针对Rv1265具有高效价(数据未显示)，而本文中的进一步的诊断测试是使用命名为Ch10/11的多克隆血清进行的。
[0876] 3.验证Rv1265和针对其的抗体为诊断试剂
[0877] 为了进一步评价Rv1265作为当使用命名为Ch10/11和Mo788C进行检测时，生物样品中结核分枝杆菌存在的诊断标志物的适合性，本发明人通过western印迹和免疫沉淀比较了在实验室分离株H37Rv和临床结核分枝杆菌菌株CSU93和HN878以及实验室结核分枝杆菌菌株H37Rv之间的抗体反应性。
[0878] a)Western印迹
[0879] 简言之，Western印迹是针对通过在10％(w/v)Bis-Tri Nu-PAGE(Invitrogen，Carlsbad CA，USA)上电泳分离，并转移至PVDF激活的膜(Immobilon-P，Millipore Inc，USA)上的蛋白进行的。在转移之后，将膜在0.008％ DB-71(Sigma Chemical Co.USA)中在40％(v/v)乙醇/10％(v/v)乙酸中温育7分钟，在40％(v/v)乙醇/10％(v/v)乙酸中迅速漂洗，对其进行扫描以可视地确证蛋白转移，并在含Trition-X100的Tris缓冲生理盐水(TBS-T)中漂洗。将干燥的膜在甲醇中重新激活，并转移至封闭缓冲液(含1％(w/v)牛血清白蛋白的TBS-T)在4℃过夜。将一抗Ch10/11在封闭缓冲液中稀释至0.5μg/ml的浓度，并与膜在室温温育90分钟，在此时间之后将膜在TBS-T中洗涤，用HRP-偶合的二抗(即，1∶100000(v/v)稀释的绵羊抗鸡IgG-HRP偶合物)在室温温育60分钟，并如前所述进行洗涤。将抗体Mo788c在封闭缓冲液中稀释至5μg/ml的浓度并与膜在室温温育90分钟，在此时间之后将膜在TBS-T中洗涤，用HRP-偶合的二抗(即，1∶50000(v/v)稀释的驴抗小鼠IgG-HRP偶合物)在室温温育60分钟，并如前所述进行洗涤。HRP-二抗偶合物的结TM
合是通过将膜在SuperSignal West″Femto″Maximum SensitivitySubstrate(Pierce，Inc.USA)中温育，并使用LAS-3000多重成像仪(multi-imager)(FujiFilm Inc.，Japan)使化学发光可见来检测的。该实验方案一般地适用于其他本文中所述的抗原的Western印迹。
合是通过将膜在SuperSignal West″Femto″Maximum SensitivitySubstrate(Pierce，Inc.USA)中温育，并使用LAS-3000多重成像仪(multi-imager)(FujiFilm Inc.，Japan)使化学发光可见来检测的。该实验方案一般地适用于其他本文中所述的抗原的Western印迹。
[0880] 在临床结核分枝杆菌分离株CSU93和HN878，以及在实验室菌株H37Rv中使用Ch10/11多克隆血清检测出了约25kDa的免疫反应性条带(数据未显示)，与结核分枝杆菌Rv1265蛋白的预期的分子量一致。在对照中，也在正确的位置检测出了具有约28kDa的估计分子量的包含六组氨酸标记的重组Rv1265蛋白(数据未显示)。仅有几乎无法检测出或无法检测出的背景。
[0881] 基本上如实施例1中所述进行的竞争性Western印迹分析表明多克隆血清Ch10/11对重组Rv1265蛋白和内源Rv1265蛋白的结合可通过将抗体与过量浓度的未标记的重组Rv1265蛋白预温育来消除(数据未显示)。
[0882] 可获得的数据表明了多克隆血清Ch10/11在全细胞裂解液中对于检测Rv1265蛋白的特异性。
[0883] b)免疫沉淀
[0884] 对抗体特异性的进一步验证是通过从菌株H37RV的全细胞裂解液使用Ch10/11多克隆抗体进行的免疫沉淀，并通过LC-MS确定免疫沉淀的蛋白的氨基酸序列而获得的。
[0885] 4.使用针对结核分枝杆菌Rv1265制备的抗体的夹心ELISA
[0886] 本实施例说明了对Rv1265蛋白的有效检测是通过使用单克隆抗体Mo788C作为捕捉试剂而命名为Ch10/11的多克隆抗体汇集作为检测试剂进行的夹心ELISA进行的。该抗体对的选择是因为，例如，对于汇集的抗体制备物Ch10/11和单克隆抗体Mo788C的滴定表明Ch10/11和Mo788C能够检测更少的在5μg/ml抗体浓度的蛋白。
[0887] a)优选的抗体取向
[0888] 在第一组诊断测试中，进行表准夹心ELISA以确定最优的捕捉和检测抗体，以及所用的合适抗体浓度。简言之，将ELISA板的孔用50μl 5μg/ml浓度或10μg/ml浓度的Mo788C抗体，或2.5μg/ml浓度或5μg/ml浓度的Ch10/11抗体包被过夜。在封闭并洗涤去除未结合的抗体后，将重组Rv1265蛋白从500ng/ml起始浓度1∶3(v/v)系列稀释至22.86pg/ml，并将每个稀释的50μl等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中。在温育
1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将50μl交替的检测抗体(即，2.5μg/ml或5μg/ml或10μg/ml的Ch10/11用于检测Rv1265-Mo788C复合物，或5μg/ml或10μg/ml或
20μg/ml的Mo788C用于检测Rv1265-Ch10/11复合物)与结合的抗原-抗体复合物相接
触。在室温温育1小时之后，洗涤板，用50μl的1∶5000(v/v)稀释的偶合于辣根过氧化物酶(HRP)的二抗(即，对于检测Ch10/11，绵羊抗鸡IgG，或对于检测Mo788C，绵羊抗小鼠IgG)温育，洗涤，用TMB温育30分钟，并在减去背景之后确定450-620nm的吸光度。
1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将50μl交替的检测抗体(即，2.5μg/ml或5μg/ml或10μg/ml的Ch10/11用于检测Rv1265-Mo788C复合物，或5μg/ml或10μg/ml或
20μg/ml的Mo788C用于检测Rv1265-Ch10/11复合物)与结合的抗原-抗体复合物相接
触。在室温温育1小时之后，洗涤板，用50μl的1∶5000(v/v)稀释的偶合于辣根过氧化物酶(HRP)的二抗(即，对于检测Ch10/11，绵羊抗鸡IgG，或对于检测Mo788C，绵羊抗小鼠IgG)温育，洗涤，用TMB温育30分钟，并在减去背景之后确定450-620nm的吸光度。
[0889] 这些滴定实验(数据未显示)表明，无论捕捉试剂为何，信号并不取决于检测抗体的浓度。用Mo788C作为捕捉试剂和用Ch10/11作为捕捉试剂的系统无论其测试的浓度均显示相似的敏感性，即9ng/ml。以此为基础，我们在夹心ELISA中使用5μg/ml的Mo788C作为捕捉试剂而用2μg/ml的Ch10/11作为检测试剂。
[0890] 在进一步的实验中(图71)，将ELISA板的孔用50μl 5μg/ml浓度的Ch10/11或Mo788C抗体包被过夜。在封闭并洗涤去除未结合的抗体后，将重组Rv1265蛋白从500ng/ml起始浓度1∶3(v/v)系列稀释至22.86pg/ml，并将每个稀释的50μl等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中(x轴)。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将交替的检测抗体(即，Ch10/11用于检测Rv1265-Mo788C复合物，而Mo788C用于检测Rv1265-Ch10/11复合物)以2μg/ml的浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，用50μl的1∶5000(v/v)稀释的偶合于辣根过氧化物酶(HRP)的二抗(即，对于检测Ch10/11，绵羊抗鸡IgG，或对于检测Mo788C，绵羊抗小鼠IgG)温育，洗涤，用TMB温育30分钟，并在减去背景之后确定450-620nm的吸光度(y轴)。
[0891] 不限定本发明，表示于图71的数据表明，当在夹心ELISA中使用单克隆抗体Mo788C作为捕捉试剂而使用多克隆抗体汇集Ch10/11作为检测试剂时观察到较低的背景。标准ELISA中的LOD为约522pg/mL。
[0892] 5.供检测结核分枝杆菌Rv1265蛋白的扩增的夹心ELISA
[0893] 扩增ELISA基本上如本实施例和实施例1中所述进行，使用Mo788C抗体作为捕捉试剂而多克隆Ch10/11抗体作为检测抗体，并使用生物素化的二抗与HRP偶合的链霉抗生物素蛋白检测结合的检测抗体。
[0894] 将ELISA板的孔用捕捉抗体Mo788C以5μg/ml的浓度包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体后，将重组Rv1265蛋白从10μg/ml起始浓度1∶10(v/v)系列稀释至1.0pg/ml，并将每个稀释的50μl等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中(x轴)。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将抗体Ch10/11以2.0μg/ml的浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，并用50μl的由HRP偶合的绵羊抗鸡IgG组成的1∶5000(v/v)稀释的二抗(标准夹心ELISA)或用50μl 1∶50000(v/v)稀释的生物素化的驴抗鸡IgG(扩增的夹心ELISA)温育。在室温再温育一小时之后，如前所述洗涤板。对于进行扩增ELISA的样品，然后将HRP80-链霉抗生物素蛋白添加至板，将其在室温再温育一小时，并如前所述洗涤。最后，将所有样品用TMB温育30分钟。在450-620nm确定吸光度。
[0895] 如示于图72，在ELISA中使用链霉抗生物素蛋白多聚80辣根过氧化物酶(HRP)与生物素化的驴抗鸡IgG检测结合的Ch10/11抗体，与本文中如上所述进行的标准夹心ELISA相比，获得了较佳的结果。更具体而言，数据表明使用扩增的夹心ELISA检测显著增强。该扩增的夹心ELISA的检出限为约60pg/ml Rv1265蛋白，其半最大值检测为约5ng/ml Rv1265蛋白。这与在标准夹心ELISA中观察到的约2.6ng/ml Rv1265蛋白的检出限，与约100ng/ml Rv1265蛋白的半最大值检测相比是有利的。这些数据也表明在扩增的夹心ELISA形式中，Ch10/11抗体与Mo788C相比作为检测抗体是较佳的。
[0896] 因此，在测试的测定条件下，以及该虽然并非必需的，但为优选的抗体取向下，具有低背景噪音和约60pg/mL的LOD。本发明人认为在夹心ELISA中上述检测的敏感性以及低背景落在有用的限制范围内。
[0897] 7.结核分枝杆菌与非分枝杆菌病原体之间的低交叉反应性
[0898] 为了进一步评价Rv1265作为生物样品中结核分枝杆菌存在的诊断标志物的适合性，本发明人比较了在结核分枝杆菌菌株H37Rv(实验室菌株)、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或铜绿假单胞菌的细胞提取物之间，进行的夹心ELISA中的抗体交叉反应性。
[0899] 扩增的夹心ELISA基本上如本文中所述在不同浓度的重组Rv1265蛋白和100ng/ml和100μg/ml酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或铜绿假单胞菌的细胞提取物之间进行。
[0900] 在图74中表示的数据显示在测试条件下，针对结核分枝杆菌Rv1265的抗体与酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或铜绿假单胞菌的细胞提取物具有低交叉反应性。具体而言，在测试的细胞提取物浓度之间几乎无或无信号差异，且获得的信号并不显著高于背景。与之相对，所述测定法检测少于1ng/ml的重组Rv1265蛋白。
[0901] 8.评估样品对信号的抑制
[0902] 为了评价是否在生物样品中存在待使用本发明的夹心ELISA(例如，在护理位置或在现场试验形式中)测试的因子，将不同浓度的重组结核分枝杆菌Rv1265蛋白(即，0-8ng/ml)与血浆(图75)或痰(图76)的系列稀释混合，并在上述无替代扩增的扩增的夹心ELISA测定法形式中进行测试，即，使用Mo788C作为捕捉抗体，Ch10/11作为检测抗体，以及包含生物素化的驴抗鸡IgG和链霉抗生物素蛋白多聚80HRP(“HRP80-链霉抗生物素蛋白”)的检测系统。
[0903] 在测试的条件下，对未稀释的或稀释的含血浆样品观察到显著的信号抑制(图78)。
[0904] 与之相对，在该组实验中未在未稀释的含痰样品中观察到信号抑制(图79)。然而，在另一种实验中，将10ng/mL重组结核分枝杆菌Rv1265蛋白掺入痰样品，并将所得的样品分三步1∶27(v/v)系列稀释。将样品温育过夜，并如上所述通过扩增ELISA分析，或立即测定。在图87和88中表示的数据(右上小图，标为“Rv1265”)表明一些痰包含抑制Rv1265蛋白信号检测的因子，因为在这种情况下信号强度在添加未稀释的痰之后减少，无论所述测定法是否立即进行或在温育过夜之后进行。然而，这种情况下信号强度的丧失可通过约1∶3(v/v)稀释痰加以抑制，且如果进一步稀释，可增强信号超过预计的值。上述稀释还消除了任何由于延长温育痰造成的信号强度的损失。
[0905] 总而言之，这些数据表明来源于痰的因子并不对痰中Rv1265的检测具有实质性的不利影响。
[0906] 9.不同分枝杆菌菌种之间的交叉反应性
[0907] 为了进一步评价Rv1265作为生物样品中结核分枝杆菌存在的诊断标志物的适合性，并评价针对Rv1265蛋白制备的抗体的特异性，本发明人比较了在分枝杆菌菌种结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的细胞提取物之间，抗体在如上所述进行的扩增的夹心ELISA中的反应性。
[0908] 简言之，将ELISA板用捕捉抗体Mo788C包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体后，将来自每种分枝杆菌菌种的细胞提取物添加至经抗体包被的ELISA板孔中。作为每个测定法的阴性对照，使用不含细胞提取物的缓冲液。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将检测抗体Ch10/11与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，用50μl稀释的二抗(例如，生物素化的驴抗鸡IgG)温育1小时，再次洗涤，用TMB温育10分钟，并确定450-620nm的吸光度。将样品在全细胞提取物的三个稀释中重复进行两次测定。基于Rv1265蛋白的标准化水平产生校准标准曲线。
[0909] 在图77和78中表示的数据显示三种分枝杆菌菌种之间无可检测出的交叉反应性，表明结核分枝杆菌Rv1265蛋白在这些测定条件下和/或使用所选的抗体对结核分枝杆菌具有特异性。这支持针对Rv1265蛋白的抗体在菌种特异性单分析物诊断测试，或者作为多分析物测试一部分与如本文所述或本领域已知的一般性针对分枝杆菌或针对结核分枝杆菌的其他标志物的抗体一同使用时的有用性。举例而言，可将针对Rv1265蛋白的抗体与一种或多种针对结核分枝杆菌KARI蛋白和/或结核分枝杆菌BSX蛋白和/或结核分枝杆菌EF-Tu和/或结核分枝杆菌S9蛋白的抗体如本文中所述同时使用。
[0910] 还可将针对Rv1265蛋白的抗体与来自Rv1265阳性临床样本的结核分枝杆菌的后续培养物一同使用。
[0911] 10.在分枝杆菌细胞中可检测出的Rv1265蛋白的相对水平
[0912] 为了进一步评价Rv1265作为分枝杆菌感染的诊断性标志物的适合性，在结核分枝杆菌菌株H37Rv、CSU93和HN878以及结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌全细胞裂解液中相对于本文中所述的其他10个结核分枝杆菌抗原(包括BSX、EF-Tu、P5CR、S9、KARI和TetR样蛋白)确定Rv1265蛋白的水平。
[0913] 基本上如本实施例和实施例1中所述进行扩增的夹心ELISA，以根据标准实验方法鉴定每种抗原的相对水平，并包括了校准标准以使得量化成为可能。
[0914] 示于图130-131的数据表明Rv1265在所有三种测试的结核分枝杆菌菌株中当基于总细胞蛋白表示时，是适度地丰富的蛋白。据此，结核分枝杆菌BSX、Rv1265和S9蛋白以相似水平表达，且相对于以显著更高水平表达的KARI，它们是以中间水平表达的，而EF-Tu在较低水平表达。示于图126-131的数据确证了Rv1265在结核分枝杆菌中相对鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌中的高特异性表达，当表达是基于细胞(图126-127)或基于全细胞裂解液蛋白的微克数(图128-129)或基于全细胞裂解液滤过物的微升数(图130-131)进行计算时，在后两种细菌中，所述蛋白在这些条件下无法容易地通过夹心ELISA检测出。
[0915] 这些数据表明了Rv1265作为分枝杆菌感染的单分析物标志物，或作为针对分枝杆菌感染或结核分枝杆菌感染的多分析物测试的一部分与KARI和/或S9和/或BSX蛋白组合时的有用性。并未排除其他供对结核分枝杆菌感染进行多分析物测试的组合。
[0916] 11.替代扩增
[0917] 为了进一步增强夹心ELISA的敏感性，本发明进一步修饰了该基础测定法，即在用捕捉抗体包被ELISA板之后使用反复的抗原结合。基本上，这导致结合于捕捉抗体的抗原量增加，尽管96-孔ELISA板的50μl体积限制。简言之，该反复的抗原加载涉及在夹心ELISA中在洗涤并添加检测抗体之前重复几次抗原结合步骤，例如，2或3或4或5次等。自然而然，每个等分试样的抗原样品是在标准的温育期间之后，下一等分试样添加之前去除的。可修饰重复的次数以优化测定法(例如，参数如信噪比、检出限和在半最大信号处检测出的抗原量)，这取决于测试的样品的特性(例如，样品类型)，而无需不必要的实验尝试。
[0918] 举例而言，多至约20次重复样品加载(即，多至20x替代扩增)提供了低背景信号，并降低了Rv1265蛋白的检出限。
[0919] 实施例6
[0920] 使用结合于结核分枝杆菌延伸因子-Tu(EF-Tu)蛋白的抗体进行的由结核分枝杆菌造成的感染或结核病的基于抗原的诊断
[0921] 1.在TB阳性受试者中鉴定EF-Tu蛋白
[0922] 在来自TB+样品的血浆免疫球蛋白级分中识别出蛋白片段。来自MALDI MS数据的一个肽的序列与具有SwissProt登录号P64789的蛋白(SEQ ID NO：29)匹配。
[0923] 鉴定出的具有SEQ ID NO：29中所述的氨基酸序列的假说蛋白命名为“延伸因子-Tu”或“EF-Tu”。EF-Tu蛋白的估计分子量为约43.59kDa，而估计等电点为约5.28。
[0924] 2.验证EF-Tu和针对其的抗体为诊断试剂
[0925] a)通过在患者血清中检测针对EF-Tu的抗体来验证EF-Tu
[0926] 为了验证EF-Tu是结核分枝杆菌感染的诊断标志物，通过单位点ELISA就针对TB+和TB-受试者的血清的免疫反应性筛选全长重组蛋白。简言之，将重组EF-Tu以每孔50μl以20μg/ml的浓度固定于ELISA板上。然后将1∶100(v/v)稀释的来自TB和非TB受试者的血浆添加至每个ELISA板的孔中。结合的人IgG是通过结合1∶50000(v/v)稀释的绵羊抗人IgG HRP偶合物，然后用TMB底物以每孔50μl进行显色来检测的。如示于图89，多个罹患TB的受试者(HIV+和HIV-)在其血清中携带针对EF-Tu蛋白的抗体。这些数据表明受结核分枝杆菌感染的受试者产生针对EF-Tu的抗体，无论其是否还受HIV感染。这些数据表明EF-Tu作为供诊断结核分枝杆菌感染或结核病的生物标志物的有用性。
[0927] b)通过对EF-Tu蛋白的线性B细胞表位定位来验证EF-Tu
[0928] 为了进一步验证EF-Tu是结核分枝杆菌感染的标志物，对该蛋白进行了线性B细胞表位定位来鉴定EF-Tu蛋白的免疫原性表位。从示于SEQ IDNO：29的原始氨基酸序列产生一组82个合成肽(PEPSET)。每个合成肽通过由氨基酸残基Ser-Gly-Ser-Gly组成的间隔物附于生物素以便于其用于ELISA测定法。
[0929] 通过单位点ELISA用所述PEPSET的肽筛选从诊断罹患TB的受试者分离的血清和从对照受试者分离的对照血清以鉴定受结核分枝杆菌感染的受试者对其产生免疫应答的那些肽。测试的血清是来自南非(S.A.)Zulu TB阳性个体，S.A.Zulu TB阴性个体，中国TB阳性个体，中国TB阴性个体，未知种族的世界卫生组织(World Health Organization，WHO)TB阳性个体，未知种族的WHO TB阴性个体，以及澳大利亚白人TB阴性对照个体。简言之，将Nunc-Immune-module maxisorp孔用100μl/孔的5μg/ml稀释于milli-Q水的链霉抗生物素蛋白在室温包被过夜或在4℃包被一个周末。轻拍去除孔中的抗链霉生物素蛋白，并用每孔400μl含1.0％(w/v)酪蛋白、0.1％(v/v)Tween 20和0.1％(w/v)叠氮化物(封闭物)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)封闭每个孔。在1小时之后，去除封闭物，并将每个孔用100μl封闭物中的生物素化的肽包被1小时，同时搅动板。随后，每个孔使用Elx405 Auto Plate Washer(Bio-TekInstruments Inc.，Winooski，VT)用0.5x PBS/0.05％Tween20溶液洗涤，使其在吸水纸上干燥，并与干燥剂储藏于4℃，或立即使用。接着，在50μl的1∶50(v/v)稀释于封闭物的患者血清中搅拌温育1小时。在该温育之后，将所有孔使用Elx405 Auto Plate Washer(Bio-Tek Instruments Inc.，Winooski，VT)用0.5x PBS/0.05％Tween 20溶液以层流洗涤，并轻拍干燥。然后将80μl绵羊抗人IgG马辣根过氧化物酶(HRP)偶合物添加至每个孔。将偶合物在PBS/0.1％(w/v)、酪蛋白/0.1％(v/v)、Tween 20/0.1％(w/v)硫柳汞中1∶10000(v/v)稀释，并搅拌温育1小时。然后将每个孔使用Elx405Auto Plate Washer(Bio-Tek Instruments Inc.，Winooski，VT)使用PBS洗涤。最后，将80μl基于液体TMB底物的系统(Sigma)添加至每个孔，然后将所述孔在室温在黑暗中温育20分钟。反应通过添加80μl 0.5M硫酸来终止。每个肽以两次重复进行测定，并如果两次重复显得不可复制，则继续重复。
[0930] 免疫原性肽表现为肽吸光度分布中的异常值(outlier)，并遵循对数转化标准化通过计算正态分数统计(normal score statistic)检测，其中平均值和标准偏差通过鲁棒的(robust)M-Estimator来估计。通过该手段鉴定的EF-Tu的免疫原性肽的氨基酸序列示于下面的表2。
[0931] 表2
[0932]
[0933] c)通过Western印迹验证EF-Tu和针对EF-Tu的抗体
[0934] 将来自结核分枝杆菌菌株H37Rv的EF-Tu蛋白的氨基酸序列表示为SEQ ID NO：29。其翻译产物具有约43.6kDa的预期分子量。基本上如实施例1所述进行的对经六组氨酸标记的重组EF-Tu蛋白的一维SDS/PAGE分析显示所述EF-Tu蛋白作为大约45kDa的单一条带迁移(数据未显示)，其为基于翻译产物和六组氨酸标记部分理论分子量的融合蛋白预期分子量。
[0935] 来自结核分枝杆菌菌株H37Rv、CSU93和HN878的全细胞提取物的Western印迹分析是使用由命名为“Ch49”的多克隆抗体组成的抗体探针进行或用命名为“Mo683B”的单克隆抗体进行的，前者是在鸡中针对EF-Tu/NusA融合蛋白制备的，而后者是在小鼠中使用来源于EF-Tu氨基酸序列(SEQ IDNO：35)的免疫原性肽制备的。这些抗体的制备如下所述。在每种情况下，抗体的结合是使用HRP偶合的二抗来检测的。
[0936] 两个抗体均在来源于所有三个结核分枝杆菌菌株的全细胞裂解液中识别具有天然EF-Tu蛋白预期分子量(即，约43.6kDa)的条带，并检测出略微较大的重组EF-Tu蛋白(约45kDa)(数据未显示)。几乎无或无可检测出的背景。
[0937] 基本上如实施例1中所述进行了对Mo683B的竞争性Western印迹分析。简言之，在探测含重组EF-Tu蛋白的Western印迹之前，将100倍摩尔数过量的重组EF-Tu与Mo683B预温育。数据表明所述单克隆抗体对重组EF-Tu蛋白的结合可通过将抗体与过量浓度的未标记的重组EF-Tu蛋白预温育来消除(数据未显示)。
[0938] 总之，可得到的数据表明抗体Mo683B和Ch49特异性结合于全细胞提取物中的结核分枝杆菌EF-Tu蛋白。
[0939] 3.抗体
[0940] 针对重组EF-Tu蛋白和EF-Tu的免疫原性肽(见下)使用本文中所述的方法制备抗体，并就其作为供诊断结核分枝杆菌感染的试剂的适合性进行筛选。
[0941] a)分离结合于结核分枝杆菌EF-Tu的单克隆抗体
[0942] 选用于单克隆抗体产生的抗原如下所述：
[0943] (i)融合于NUS蛋白的重组全长EF-Tu蛋白；和
[0944] (ii)包含氨基酸序列VINVNEEVEIVGIRPSTTKC(SEQ ID NO：35)的肽。
[0945] 将每种抗原提供给NeoClone，Madison，Wisconsin，USA以供根据其标准实验方法产生单克隆抗体。简言之，用偶合于载体的肽根据Neoclone的标准免疫接种方法对BALB/cByJ雌性小鼠进行免疫接种。以规则的间隔进行经免疫接种的小鼠的测试放血以用于使用生物素化的肽的质量控制血清ELISA。使用ELISA确定具有最高效价的多克隆血清。将具有至少1000多克隆抗体效价的小鼠用于ABL-MYC感染方法。将具有与肽抗原交叉反应的多克隆抗体的最高效价的小鼠的脾根据NeoClone的标准感染方法用于ABL-MYC感染。将经ABL-MYC感染的小鼠的脾细胞移植入未经实验的小鼠。分离在经移植的小鼠中形成的腹水，并就产生结合于靶肽抗原的单克隆抗体(mAb)的细胞进行筛选。
[0946] 使用所述合成肽(SEQ ID NO：35)获得了十五个不同的产生单克隆抗体的浆细胞瘤，且其命名为″Mo524A、″Mo524B″、″Mo524C″、″Mo524D″、″Mo524E″、″Mo524F″、″Mo525B″、″Mo525D″、″Mo525F″、″Mo680A″、″Mo681E″、″Mo682A″、″Mo683B″、″Mo684A″和″Mo685B″)。使用融合于NusA的重组EF-Tu蛋白产生了另外六个产生单克隆抗体的浆细胞瘤，且其命名为″Mo520C、″Mo521C″、″Mo521D″、″Mo521F″、″Mo522A″和″Mo522E″。命名为Mo683B、Mo682A、Mo685B和Mo684A的细胞系是从细胞系542D分出的。命名为Mo681E的细胞系是从细胞系Mo552E分出的。细胞系Mo680A是从细胞系Mo521F分出的。
[0947] 在一个实施例中，显示产生单克隆抗体Mo521F、Mo524D和Mo522E的浆细胞瘤能够结合全长的重组EF-Tu。
[0948] 在另一个实施例中，命名为Mo524D、Mo521F、Mo683B、Mo682A、Mo685B、Mo684A、Mo681E和Mo680A的mAb是从腹水使用蛋白G或蛋白A柱纯化的。
[0949] 单克隆抗体制备物如下所述通过单位点ELISA进行滴定。将重组EF-Tu蛋白以约17μg/ml的浓度包被于ELISA板底部。将命名为Mo524D、Mo521F、Mo683B、Mo682A、Mo685B、Mo684A、Mo681E和Mo680A的单克隆抗体中的每一个的等分试样以不同的终浓度添加至
5pg/ml。然后使用绵羊抗小鼠HRP抗体偶合物在标准条件下检测抗体的结合。确定450nm和620nm的吸光度，并确定450nm和620nm的吸光度的差值。获得平均数据。该测定法的结果显示于图90。
5pg/ml。然后使用绵羊抗小鼠HRP抗体偶合物在标准条件下检测抗体的结合。确定450nm和620nm的吸光度，并确定450nm和620nm的吸光度的差值。获得平均数据。该测定法的结果显示于图90。
[0950] 在滴定所述单克隆抗体的进一步测定法中，将重组EF-Tu以约81.4ng/ml至约79.5ng/ml范围的浓度包被于ELISA板底部。命名为Mo524D、Mo521F、Mo683B、Mo682A、Mo685B、Mo684A、Mo681E和Mo680A的单克隆抗体中的每一个的等分试样以2.5μg/ml添加。
然后使用绵羊抗小鼠HRP抗体偶合物在标准条件下检测抗体的结合。获得平均数据。该测定法的结果显示于图91。
然后使用绵羊抗小鼠HRP抗体偶合物在标准条件下检测抗体的结合。获得平均数据。该测定法的结果显示于图91。
[0951] b)制备结合于结核分枝杆菌EF-Tu的多克隆抗体
[0952] 通过用全长重组EF-Tu蛋白对鸡进行免疫接种产生了两个不同批次的多克隆抗体，所述重组蛋白为仅为其本身，或为使用标准方法产生的融合于NUS蛋白的重组蛋白。通过硫酸铵沉淀从由经免疫接种的鸡产生的蛋纯化免疫球蛋白级分。或者，抗体是从经免疫接种的母鸡的血清纯化的。两个不同批次的鸡多克隆抗血清是针对全长重组蛋白制备的，且其命名为“Ch49”(针对EF-Tu-NusA制备的)和“Ch50”(针对重组EF-Tu制备的)。
[0953] 还根据标准方法用SEQ ID NO：35所述的免疫原性EF-Tu肽通过免疫接种鸡或兔来制备多克隆抗体，任选地在C端融合于半胱氨酸残基。产生了五个不同的多克隆抗血清，且其命名为“Ch36”、“Ch37”、“Ch38”(在鸡中使用SEQ ID NO：35与C端半胱氨酸残基制备)、“Rb29”(在兔中使用SEQ ID NO：35与C端半胱氨酸制备)和“Rb8”(在兔中使用SEQ ID NO：35制备)。
[0954] 针对全长的重组EF-Tu的多克隆抗体制备物当使用标准方法测定时具有高效价(数据未显示)，且本文中的进一步的诊断性测试是使用命名为Ch49和Ch50的多克隆血清来进行的。
[0955] 4.供检测结核分枝杆菌EF-Tu蛋白的标准ELISA
[0956] 使用来自两只经免疫接种的母鸡之一的鸡抗EF-Tu多克隆抗体作为捕捉抗体而三种不同的单克隆抗体(即命名为Mo683B、Mo524D和Mo512F的抗体)之一作为检测抗体进行夹心ELISA测定法。简言之，ELISA是使用下述三种标准ELISA实验方案来进行的：
[0957] a)抗体滴定
[0958] 1.将ELISA板用来自母鸡编号49的鸡多克隆抗体(“Ch49”)以10μg/ml或5μg/ml的浓度包被。添加从A280＝0.235的储液以1∶2000至1∶2275328稀释的滴定量的重组EF-Tu。抗原检测是使用单克隆抗体Mo683B以5μg/ml或2.5μg/ml的浓度继以使用
1∶5000(v/v)稀释的绵羊抗小鼠Ig HRP偶合物进行的。数据表示于图92。
1∶5000(v/v)稀释的绵羊抗小鼠Ig HRP偶合物进行的。数据表示于图92。
[0959] 2.将ELISA板用来自母鸡编号50的鸡多克隆抗体(“Ch50”)以5μg/ml浓度包被。添加浓度范围为约75.7ng/ml至约73.9pg/ml的滴定量的重组EF-Tu。抗原检测是使用命名为Mo683B、Mo524D或Mo521F的单克隆抗体以5μg/ml的浓度继以使用1∶5000(v/v)稀释的绵羊抗小鼠Ig HRP偶合物进行的。数据表示于图93。
[0960] 3.将ELISA板用来自母鸡编号49或母鸡编号50的鸡多克隆抗体(“Ch50”)以2.5μg/ml的浓度包被。添加浓度范围为约122.9ng/ml至约120pg/ml的滴定量的重组EF-Tu。抗原检测是使用命名为Mo683B的单克隆抗体以2.5μg/ml的浓度继以使用
1∶5000(v/v)稀释的绵羊抗小鼠Ig HRP偶合物进行的。数据表示于图94。
1∶5000(v/v)稀释的绵羊抗小鼠Ig HRP偶合物进行的。数据表示于图94。
[0961] b)优选的抗体取向
[0962] 本试验方案提供了本发明人如何确定最优的捕捉和检测抗体，以及所用的合适抗体浓度的实施例。简言之，将ELISA板的孔用50μl 5μg/ml浓度或10μg/ml浓度的Mo683B抗体，或2.5μg/ml浓度或5μg/ml浓度的Ch49抗体包被过夜。在封闭并洗涤去除未结合的抗体后，将重组EF-Tu蛋白从500ng/ml起始浓度1∶3(v/v)系列稀释至22.86pg/ml，并将每个稀释的50μl等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将50μl交替的检测抗体(即，2.5μg/ml或5μg/ml或10μg/ml的Ch49用于检测Rv1265-Mo683B复合物，或5μg/ml或10μg/ml或20μg/ml的Mo683B用于检测Rv1265-Ch49复合物)与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，用50μl的1∶5000(v/v)稀释的偶合于辣根过氧化物酶(HRP)的二抗(即，对于检测Ch49，绵羊抗鸡IgG，对于检测Mo683B，绵羊抗小鼠IgG)温育，洗涤，用TMB温育30分钟，并在减去背景之后确定450-620nm的吸光度。
[0963] 在进一步的实验中，将ELISA板的孔用50μl 5μg/ml浓度的Ch49或Mo683B抗体包被过夜。在封闭并洗涤去除未结合的抗体后，将重组EF-Tu蛋白从500ng/ml起始浓度1∶3(v/v)系列稀释至22.86pg/ml，并将每个稀释的50μl等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中(x轴)。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将交替的检测抗体(即，Ch49用于检测EF-Tu-Mo683B复合物，而Mo683B用于检测EF-Tu-Ch49复合物)以2μg/ml的浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，用
50μl的1∶5000(v/v)稀释的偶合于辣根过氧化物酶(HRP)的二抗(即，对于检测Ch49，绵羊抗鸡IgG，对于检测Mo683B，绵羊抗小鼠IgG)温育，洗涤，用TMB温育30分钟，并在减去背景之后确定450-620nm的吸光度(y轴)。
50μl的1∶5000(v/v)稀释的偶合于辣根过氧化物酶(HRP)的二抗(即，对于检测Ch49，绵羊抗鸡IgG，对于检测Mo683B，绵羊抗小鼠IgG)温育，洗涤，用TMB温育30分钟，并在减去背景之后确定450-620nm的吸光度(y轴)。
[0964] 5.供检测结核分枝杆菌EF-Tu蛋白的扩增的夹心ELISA
[0965] 本实施例说明了对于通过使用多克隆抗体Ch49作为捕捉试剂而命名为Mo683B的单克隆抗体作为检测试剂的夹心ELISA检测EF-Tu蛋白而优化的因素。之所以选择该抗体对，是因为，例如，在前述实施例中的滴定数据表明该抗体组合与其他本文中所述的抗体组合相比可检测出更少的EF-Tu蛋白。应理解为这些实验方案仅就例示的目的提供，并可容易地适用于其他未具体描述的抗体组合。
[0966] 在本实施例中，扩增ELISA基本上如本实施例和实施例1中所述进行，使用多克隆血清Ch49作为捕捉试剂而生物素化的单克隆抗体Mo683B(即，“Mo683B-Bio”)作为检测试剂。将ELISA板的孔用捕捉抗体Ch49以2μg/ml的浓度包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体后，将重组EF-Tu蛋白从100ng/ml起始浓度1∶10(v/v)系列稀释至1.0pg/ml，并将每个稀释的50μl等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中(x轴)。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将生物素化的抗体Mo683B-Bio以2.0μg/ml的浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，并用50μl的由HRP偶合的绵羊抗小鼠IgG组成的1∶5000(v/v)稀释的二抗(标准夹心ELISA)或用50μl 1∶2500(v/v)稀释的HRP80-链霉抗生物素蛋白温育。也可使用多聚40链霉抗生物素蛋白-HRP偶合物替代HRP80-链霉抗生物素蛋白。在室温再温育一小时之后，如前所述洗涤板。最后，将所有样品用TMB温育30分钟(标准ELISA)或10分钟(扩增ELISA)。在450-620nm确定
吸光度。
吸光度。
[0967] 如示于图95，使用链霉抗生物素蛋白多聚-80辣根过氧化物酶(HRP)与生物素化的Mo683B，与本文中所述进行的标准夹心ELISA相比，获得了较佳的结果。更具体而言，数据表明使用扩增的夹心ELISA检测显著增强。该扩增的夹心ELISA的检出限为约154pg/ml EF-Tu蛋白。这与在标准夹心ELISA中观察到的约2.172ng/ml EF-Tu蛋白的检出限相比是有利的。
[0968] 在类似条件下的另一个实验中，这些条件下扩增的夹心ELISA的LOD仅为46pg/mL，与之相比标准ELISA的LOD是296pg/mL(数据未显示)。本发明人认为在夹心ELISA中上述检测的敏感性以及低背景落在有用的限制范围内。
[0969] 6.抗EF-Tu抗体与不同结核分枝杆菌分离株之间的交叉反应性
[0970] 为了进一步评价EF-Tu作为生物样品中结核分枝杆菌存在的诊断标志物的适合性，并评价针对EF-Tu蛋白制备的抗体的特异性，本发明人比较了在临床结核分枝杆菌菌株CSU93和H878和实验室结核分枝杆菌菌株H37Rv的细胞提取物之间，抗体在如上所述进行的扩增的夹心ELISA中的反应性。
[0971] 本文中所述的扩增ELISA还用于在实验室菌株H37Rv和临床分离株CSU93和HN878的全细胞提取物中检测重组EF-Tu蛋白。将重组蛋白(以1.8μg/ml、5.6μg/ml、
16.7μg/ml和50μg/ml稀释于封闭缓冲液中)添加至全细胞裂解液，并将样品基本上如本文中所述通过扩增的夹心ELISA重复两次测定。全细胞裂解液中内源EF-Tu蛋白的浓度是通过从标准曲线内插来计算，并减去对应掺入的重组EF-Tu蛋白的信号。
16.7μg/ml和50μg/ml稀释于封闭缓冲液中)添加至全细胞裂解液，并将样品基本上如本文中所述通过扩增的夹心ELISA重复两次测定。全细胞裂解液中内源EF-Tu蛋白的浓度是通过从标准曲线内插来计算，并减去对应掺入的重组EF-Tu蛋白的信号。
[0972] 在这些菌株中存在的内源结核分枝杆菌EF-Tu蛋白的水平，如从两个独立实验所确定，表示于图96。数据表明对于H37Rv，平均EF-Tu水平为约65pg/μg细胞提取物，而在临床分离株的全细胞提取物中仅为约10pg/μg。
[0973] 总之，迄今为止获得的数据表明Ch49/Mo683B抗体对能够在结核分枝杆菌临床相关的菌株和实验室菌株全细胞提取物中检测内源EF-Tu蛋白。
[0974] 7.结核分枝杆菌与非分枝杆菌病原体之间的低交叉反应性
[0975] 为了进一步评价EF-Tu作为生物样品中结核分枝杆菌存在的诊断标志物的适合性，本发明人比较了在结核分枝杆菌菌株H37Rv(实验室菌株)、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或铜绿假单胞菌的细胞提取物之间，进行的扩增的夹心ELISA中抗体的交叉反应性。
[0976] 简言之，扩增的夹心ELISA基本上如本文中所述使用不同浓度的重组EF-Tu蛋白和2mg/ml和500μg/ml大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或铜绿假单胞菌的细胞提取物之间进行。
[0977] 在图97中表示的数据显示在测试条件下，针对结核分枝杆菌EF-Tu的抗体与大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或铜绿假单胞菌的细胞提取物具有低交叉反应性。具体而言，在测试的细胞提取物浓度之间几乎无或无信号差异，且获得的信号并不显著高于背景。与之相对，所述测定法检测少于1ng/ml的重组EF-Tu蛋白。
[0978] 8.不同分枝杆菌菌种之间的交叉反应性
[0979] 为了进一步评价EF-Tu作为生物样品中结核分枝杆菌存在的诊断标志物的适合性，并评价针对EF-Tu蛋白制备的抗体的特异性，本发明人比较了在分枝杆菌菌种结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的细胞提取物之间，抗体在如上所述进行的扩增的夹心ELISA中的反应性。
[0980] 简言之，将ELISA板用捕捉抗体Ch49包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体后，将来自每种分枝杆菌的细胞提取物添加至经抗体包被的ELISA板孔中。作为每个测定法的阴性对照，使用不含细胞提取物的缓冲液。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将检测抗体Mo683B-Bio与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，用50μl 1∶2500(v/v)稀释的HRP80-链霉抗生物素蛋白温育。也可用多聚40链霉抗生物素蛋白-HRP偶合物替代HRP80-链霉抗生物素蛋白。再次洗涤板，用TMB温育10分钟，并确定450-620nm的吸光度。将样品在全细胞提取物的三个稀释中重复进行两次测定。基于EF-Tu蛋白的标准化水平产生校准标准曲线。
[0981] 在图100中表示的数据显示对鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌低水平的交叉反应性，然而显而易见对结核分枝杆菌更强的反应性。例如，可将针对EF-Tu的抗体与来自EF-Tu阳性临床样本的结核分枝杆菌的后续培养物一同使用。
[0982] 数据表明取决于使用的测定条件的敏感性，EF-Tu是适用于一般性检测分枝杆菌或适用于特异性检测结核分枝杆菌的合适标志物。针对EF-Tu的抗体可单独使用或与一种或多种针对结核分枝杆菌Rv1265和/或结核分枝杆菌BSX蛋白和/或结核分枝杆菌KARI和/或结核分枝杆菌S9蛋白的抗体如本文中所述同时使用，且优选地与选自下组的抗体一同使用：针对Rv1265的抗体、针对BSX的抗体和针对S9的抗体，其对其他测试的分枝杆菌具有低交叉反应性。
[0983] 9.在临床样品中检测EF-Tu蛋白
[0984] 为了进一步评价EF-Tu作为生物样品中结核分枝杆菌存在的诊断标志物的适合性，本发明人确定了抗体在从TB阳性受试者获得的临床样品检测内源EF-Tu蛋白的能力，所述受试者是之前根据涂片测试和结核分枝杆菌培养测定法的结果诊断的。
[0985] 在一个实施例中，将重组结核分枝杆菌EF-Tu蛋白(3.3ng/ml)与痰(图96)或血浆(图97)的系列稀释混合，并在如上所述无替代扩增的扩增的夹心ELISA测定法形式中测试，即，使用作为捕捉抗体的Ch49和包含生物素化的Mo683B-Bi单克隆抗体继以链霉抗生物素蛋白多聚-80HRP的检测系统(“HRP80-链霉抗生物素蛋白”)。
[0986] 在测试的条件下，可在稀释的样品中检测出重组的EF-Tu，说明其可行性(图98和99)。
[0987] 在另一个实施例中，抗体在从之前基于涂片测试和结核分枝杆菌培养测试结果而诊断为TB阳性的受试者获得的临床样品中检测内源EF-Tu蛋白的能力基本上是如本文所述针对其他标志物的方法来确定的。将患者根据涂片测试和培养测试的结果，和HIV状态分类。受试者为涂片阴性且培养测试阴性，或者，涂片阳性且培养阳性。
[0988] 简言之，如本文中如上所述对痰样品进行标准或扩增ELISA，所述痰是通过本文中所述的方法制备的，优选是作为多至约20x150微升等分试样在替代扩增实验方法(见下)下进行测定。将ELISA板用捕捉抗体Ch49包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体之后，将经处理的痰添加至经抗体包被的ELISA板的孔中。作为对于每个测定法的阴性对照，使用缓冲液。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原后，将检测抗体Mo683B或Mo683B-Bio与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，用50μl针对Mo683B的二抗温育(即，生物素化的驴抗小鼠IgG)。在适当地与Mo683B-Bio检测抗体或生物素化的驴抗小鼠IgG温育之后，添加多聚-40链霉抗生物素蛋白-HRP偶合物，并将样品温育一小时，再次洗涤，用TMB温育10分钟并确定450-620nm的吸光度。
[0989] 10.评估样品对信号的抑制
[0990] 为了评价是否在生物样品中存在待使用本发明的夹心ELISA(例如，在护理位置或在现场试验形式中)测试的因子，将重组结核分枝杆菌EF-Tu蛋白(3.3ng/ml)与痰(图96)或血浆(图97)的系列稀释混合，并在上述扩增的夹心ELISA测定法形式中进行测试，即，使用作为捕捉抗体的Ch49和包含生物素化的Mo683B单克隆抗体继以链霉抗生物素蛋白多聚-80HRP的检测系统(“HRP80-链霉抗生物素蛋白”)。
[0991] 在测试的条件下，对未稀释的或稀释的含痰或含血浆样品观察到显著的信号抑制(图98和99)。在两种情况下，对于信号的抑制或淬灭均可通过将痰或血浆在封闭缓冲液中稀释来消除。
[0992] 11.在分枝杆菌细胞中可检测出的EF-Tu蛋白的相对水平
[0993] 为了进一步评价EF-Tu作为分枝杆菌感染的诊断性标志物的适合性，在结核分枝杆菌菌株H37Rv、CSU93和HN878以及结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌全细胞裂解液中相对于本文中所述的其他10个结核分枝杆菌抗原(包括BSX、KARI、S9、Rv1265、P5CR和TetR样蛋白)确定EF-Tu蛋白的水平。
[0994] 基本上如本实施例和实施例1中所述进行扩增的夹心ELISA，以根据标准实验方法鉴定每种抗原的相对水平，并包括了校准标准以使得量化成为可能。
[0995] 示于图124-125的数据表明EF-Tu在结核分枝杆菌细胞中以与BSX、KARI、Rv1265和S9蛋白相比较低的水平表达。EF-Tu蛋白也在H37Rv中以远高于测试的临床分离株的水平表达。
[0996] 另一方面，示于图126-131的数据表明EF-Tu蛋白在结核分枝杆菌中以远高于其他测试的分枝杆菌的水平表达。
[0997] 总体而言，这些数据表明了EF-Tu作为结核分枝杆菌感染类别性的单分析物标志物，或作为针对分枝杆菌感染或结核分枝杆菌感染的多分析物测试的一部分与BSX和/或KARI和/或S9和/或Rv1265蛋白组合时的有用性。并未排除其他供对结核分枝杆菌感染进行多分析物测试的组合。
[0998] 11.优化检出限
[0999] 为了进一步增强夹心ELISA的敏感性，使用替代的扩增方法以在用捕捉抗体包被ELISA板之后使用反复的抗原结合。基本上，这导致结合于捕捉抗体的抗原量增加，尽管96-孔ELISA板的50μl体积限制。简言之，该反复的抗原加载涉及在夹心ELISA中在洗涤并添加检测抗体之前重复几次抗原结合步骤，例如，2或3或4或5次等。自然而然，每个等分试样的抗原样品是在标准的温育期间之后，下一等分试样添加之前去除的。可修饰重复的次数以优化测定法(例如，参数如信噪比、检出限和在半最大信号处检测出的抗原量)，这取决于测试的样品的特性(例如，样品类型)，而无需不必要的实验尝试。
[1000] 在一个实施例中，可使用五次重复样品加载(即，5x替代扩增)以提供低背景信号，并降低结核分枝杆菌EF-Tu蛋白的检出限。
[1001] 在另一个实施例中，多至约20次重复样品加载(即，多至20x替代扩增)可提供低背景信号，并降低EF-Tu蛋白的检出限。
[1002] 实施例7
[1003] 使用结合于结核分枝杆菌P5CR蛋白的抗体进行的由结核分枝杆菌造成的感染或结核病的基于抗原的诊断
[1004] 1.在TB阳性受试者中鉴定P5CR蛋白
[1005] 在来自TB+样品的血清免疫球蛋白级分中识别出具有约15kDa分子量的蛋白。来自MALDI-TOF数据的五个肽的序列(SEQ ID NO：37-41，含37和41)与具有SwissProt登录号Q11141的蛋白(SEQ ID NO：36)匹配。该5个肽(SEQ ID NO：37-41)对Q11141的覆盖百分比为约19％，表明所述肽片段来源于该同一个蛋白标志物。
[1006] 鉴定出的具有SEQ ID NO：36中所述的氨基酸序列的蛋白命名为“P5CR”。P5CR蛋白的估计分子量仅为约30.2kDa，而估计等电点为约4.7。
[1007] 2.抗体
[1008] a)针对结核分枝杆菌P5CR蛋白的肽片段制备的抗体
[1009] 包含全长蛋白P5CR氨基酸残基43-61的合成肽(SEQ ID NO：42)或氨基酸残基238-255的合成肽(SEQ ID NO：43)是通过标准方法合成的。这些肽可分别通过马来酰亚胺己酰基-N-羟基琥珀酸接头偶联于钥孔血蓝蛋白(KHL)。为了便于检测针对这些表位培育的抗体，还将它们与GSGL间隔物一起合成并与生物素附接。将兔用包含SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：43所述的氨基酸序列的合成肽根据标准方法进行免疫接种。对动物进行放血。将所有血收集于无菌的容器中，并在去除血块之后收集血清。
[1010] 获得了四种兔抗体制备物：具有针对SEQ ID NO：43的特异性的抗体Rb33和Rb34；和具有针对SEQ ID NO：42的特异性的抗体Rb37和Rb38。
[1011] 还在鸡中使用包含SEQ ID NO：42所述的序列的合成肽产生了多克隆抗体。
[1012] 为了滴定在鸡中产生的抗血清，将rP5CR蛋白以5μg/ml的浓度固定于Nunc免疫板上。去除溶液，并使用封闭缓冲液(在PBS中1％(w/v)酪蛋白、0.1％(v/v)Tween 20，0.1％(w/v)叠氮化钠)封闭孔。去除封闭缓冲液并添加稀释于PBS的血清，并温育足够时间使得抗体与结合的P5CR蛋白复合，通常为在室温约1小时。洗涤板，而抗体对P5CR蛋白的结合是使用1∶5000(v/v)稀释于偶合物稀释缓冲液中的HRP偶合的绵羊抗鸡IgG来检测的。将五十毫升(50ml)TMB(3，3’，5’，5-四甲基联苯胺；Sigma)添加至每个孔，并在暗处将板温育30分钟。通过添加50μL/孔的0.5M硫酸终止显色。每个孔的吸光度用微滴定板读数器读取(PowerWaveX 340板读数器，Bio-Tek Instruments Inc.，Winooski，VT))，使用450nm的波长和620nm的消光波长。滴定结果示于图101。
[1013] 为了测试兔抗血清，将链霉抗生物素蛋白(Sigma Aldrich)用双蒸水(ddH2O)稀释至5μg/ml，并在Nunc板中在4℃温育过夜。然后轻拍去除溶液，并将250μL封闭缓冲液(在PBS中1％(w/v)酪蛋白、0.1％(v/v)Tween 20，0.1％(w/v)叠氮化钠)添加至每个孔，并在室温温育1小时。将封闭缓冲液轻拍去除，并将生物素化的肽(SEQ ID NO：
42)以3μg/ml(50μl/孔)在封闭缓冲液中添加，并在室温在振荡器上温育1小时。将板在Elx405 Auto Plate Washer(Bio-Tek Instruments Inc.，Winooski，VT)中用0.5x PBS/0.05％(v/v)Tween 20溶液洗涤，将板中的过量溶液轻拍到纸巾上。将兔血清用封闭缓冲液从1∶500(v/v)2倍稀释至1∶1024000(v/v)，并在室温以50μl/孔在振荡器上温育1小时。用板洗涤器使用0.5x PBS/0.05％(v/v)Tween 20溶液洗涤板，并将过量溶液轻拍到纸巾上。兔抗体与SEQ ID NO：42的结合是使用1∶5000(v/v)稀释于偶合物稀释缓冲液中的HRP-偶合的绵羊抗兔IgG(Chemicon)来检测的。将五十毫升(50ml)添加至每个孔，并在室温在振荡器上温育一小时。用板洗涤器使用0.5x PBS洗涤板，并将过量溶液从板轻拍到纸巾上。将五十毫升(50ml)TMB(3，3’，5’，5-四甲基联苯胺；Sigma)添加至每个孔，并在暗处将板温育30分钟。用50μL/孔的0.5M硫酸终止显色。每个孔的吸光度用微滴定板读数器读取(PowerWaveX 340板读数器，Bio-Tek Instruments Inc.，Winooski，VT))，使用450nm的波长和620nm的消光波长(extinction)。SEQ ID NO：42的血清滴定数据示于图102。
42)以3μg/ml(50μl/孔)在封闭缓冲液中添加，并在室温在振荡器上温育1小时。将板在Elx405 Auto Plate Washer(Bio-Tek Instruments Inc.，Winooski，VT)中用0.5x PBS/0.05％(v/v)Tween 20溶液洗涤，将板中的过量溶液轻拍到纸巾上。将兔血清用封闭缓冲液从1∶500(v/v)2倍稀释至1∶1024000(v/v)，并在室温以50μl/孔在振荡器上温育1小时。用板洗涤器使用0.5x PBS/0.05％(v/v)Tween 20溶液洗涤板，并将过量溶液轻拍到纸巾上。兔抗体与SEQ ID NO：42的结合是使用1∶5000(v/v)稀释于偶合物稀释缓冲液中的HRP-偶合的绵羊抗兔IgG(Chemicon)来检测的。将五十毫升(50ml)添加至每个孔，并在室温在振荡器上温育一小时。用板洗涤器使用0.5x PBS洗涤板，并将过量溶液从板轻拍到纸巾上。将五十毫升(50ml)TMB(3，3’，5’，5-四甲基联苯胺；Sigma)添加至每个孔，并在暗处将板温育30分钟。用50μL/孔的0.5M硫酸终止显色。每个孔的吸光度用微滴定板读数器读取(PowerWaveX 340板读数器，Bio-Tek Instruments Inc.，Winooski，VT))，使用450nm的波长和620nm的消光波长(extinction)。SEQ ID NO：42的血清滴定数据示于图102。
[1014] 尽管未显示对于抗体Rb33和/或Rb34的滴定数据，使用类似的实验方案以针对包含SEQ ID NO：43的序列的肽滴定这些多克隆抗体。
[1015] 为了滴定肽(即，SEQ ID NO：42)，使用基本上如上文所述的实验方案。然而，生物素化的肽是从20480pg/ml滴定至100pg/ml，而兔血清是以1∶500(v/v)和1∶2000(v/v)的稀释添加至ELISA。该分析的结果示于图103。尽管未显示针对包含SEQ ID NO：43的序列的肽的滴定数据，但使用了类似的实验方案以针对抗体Rb33和/或Rb34滴定该肽。
[1016] c)针对结核分枝杆菌P5CR制备的重组抗体
[1017] 针对P5CR的重组抗体是从AbD Serotec(MorphoSys AG，Germany的一个部门)获得的，该部门根据与申请人/受让人的合同使用本文中所述的对于重组抗体产生的标准方法产生所述抗体。
[1018] 从AbD Serotec获得了几种重组抗体制备物，命名为Ph4549、Ph4464-4470和Ph4550.2。在标准ELISA中，命名为P4550.2的抗体被视为高效价抗体，因此本文中进一步的诊断测试是使用所述Ph4550.2抗体进行的。
[1019] d)针对重组结核分枝杆菌P5CR蛋白制备的抗体
[1020] 针对全长重组结核分枝杆菌蛋白(SEQ ID NO：36)通过使用标准方法对鸡进行免疫接种制备了另外两个抗体制备物。针对所述P5CR蛋白培育了两个不同批次的鸡多克隆抗血清，命名为“Ch6”和“Ch7”，然后将其汇集以产生本文中命名为“Ch6/7”的抗体。
[1021] 还针对重组P5CR蛋白使用标准方法产生了三种单克隆抗体，且其命名为Mo1027D、Mo1028C和Mo1028D。
[1022] 当使用标准方法测定时，针对P5CR的多克隆抗体制备物具有最高效价的(数据未显示)，且本文中进一步的诊断测试是使用命名为Ch6/7的多克隆血清进行的。
[1023] 3.验证P5CR和抗体
[1024] 为了进一步评价P5CR作为生物样品中结核分枝杆菌存在的诊断标志物的适合性，本发明人通过使用Ch6/7多克隆血清，或在另一组实验中，使用重组抗体Ph4550.2的western印迹比较了在临床结核分枝杆菌菌株CSU93和HN878以及实验室结核分枝杆菌菌株H37Rv之间的抗体反应性。
[1025] 简言之，Western印迹是针对通过在10％(w/v)Bis-Tri Nu-PAGE(Invitrogen，Carlsbad CA，USA)上电泳分离，并转移至PVDF激活的膜(Immobilon-P，Millipore Inc，USA)上的蛋白进行的。在转移之后，将膜在0.008％DB-71(Sigma Chemical Co.USA)中在40％(v/v)乙醇/10％(v/v)乙酸中温育7分钟，在40％(v/v)乙醇/10％(v/v)乙酸中迅速漂洗，对其进行扫描以可视地确证蛋白转移，并在含Trition-X100的Tris缓冲盐水(TBS-T)中漂洗。将干燥的膜在甲醇中重新激活，并转移至封闭缓冲液(含1％(w/v)牛血清白蛋白的TBS-T)在4℃过夜。将多克隆血清Ch6/7或重组抗体P4550.2在封闭缓冲液中稀释至0.5μg/ml的浓度，并分别与膜在室温温育90分钟，在此时间之后将膜在TBS-T中洗涤，用HRP-偶合的二抗(即，1∶100000(v/v)稀释的绵羊抗鸡IgG-HRP偶合物)在室温温育60分钟，并如前所述进行洗涤。HRP-二抗偶合物的结合是通过将膜在TM
SuperSignal West″Femto″MaximumSensitivity Substrate(Pierce，Inc.USA)中温育，并使用LAS-3000多重成像仪(multi-imager)(FujiFilm Inc.，Japan)显影来检测的。
SuperSignal West″Femto″MaximumSensitivity Substrate(Pierce，Inc.USA)中温育，并使用LAS-3000多重成像仪(multi-imager)(FujiFilm Inc.，Japan)显影来检测的。
[1026] 在临床结核分枝杆菌分离株CSU93和HN878，以及在实验室菌株H37Rv中使用多克隆血清检测出了约31kDa的免疫反应性条带(数据未显示)，与结核分枝杆菌P5CR蛋白的预期的分子量一致。重组抗体也在临床结核分枝杆菌分离株CSU93和在实验室菌株H37Rv中检测出了结核分枝杆菌P5CR蛋白，然而在HN878中与P5CR蛋白的结合弱得多。在对照实验中，也在正确的位置检测出了具有约35kDa的估计分子量的包含六组氨酸标记的重组P5CR蛋白(数据未显示)。
[1027] 基本上如实施例1中所述进行的竞争性Western印迹分析表明两种抗体对重组P5CR蛋白和内源EF-Tu蛋白的结合可通过将抗体与过量浓度的未标记的重组P5CR蛋白预温育来消除(数据未显示)。
[1028] 总之，可获得的数据表明了重组抗体Ph4550.2和多克隆血清Ch6/7特异性结合于结核分枝杆菌P5CR蛋白。
[1029] 4.使用重组Ph4550.2抗体和多克隆Ch6/7血清的夹心ELISA
[1030] 本实施例说明了对P5CR蛋白的有效检测是通过使用重组抗体Ph4550.2作为捕捉试剂而命名为Ch6/7的多克隆抗体汇集作为检测试剂进行的夹心ELISA进行的。该抗体对的选择是因为，例如，对于汇集的抗体制备物Ch6/7、重组抗体Ph4550.2和单克隆抗体Mo1027D针对P5CR蛋白的滴定表明Ch6/7和Ph4550.2能够在5μg/ml抗体浓度相对于Mo1027D检测更少的蛋白(图104)。
[1031] a)优选的抗体取向
[1032] 在第一组诊断测试中，进行标准夹心ELISA以确定最优的捕捉和检测抗体，以及所用的合适抗体浓度。简言之，将两个ELISA板用Ch6/7或Ph4550.2抗体以2.5μg/ml和5μg/ml在封闭缓冲液中的浓度包被。在封闭并洗涤去除未结合的抗体后，将重组P5CR蛋白的50μl等分试样，从500ng/ml起始浓度1∶2(v/v)系列稀释至7.8ng/ml，添加至经抗体包被的ELISA板孔中。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将交替的检测抗体(即，Ph4550.2用于检测Ch6/7-P5CR复合物，或Ch6/7用于检测Ph4550.2-P5CR复合物)以1.25μg/ml至5μg/ml范围的浓度与板相接触。在室温温育1小时之后，如前所述洗涤板，用50μl的1∶5000(v/v)稀释的偶合于辣根过氧化物酶(HRP)的驴抗小鼠IgG温育，如前所述洗涤，用TMB温育30分钟，并确定450-620nm的吸光度。
[1033] 选择虽然并非必需的，但为优选的抗体取向以在夹心ELISA中取得每单位更高的信号。还优选选择提供抗体间最低交叉反应性的抗体取向，如在测定中不存在重组蛋白时低基线值所示。
[1034] b)检出限
[1035] 为了确定针对重组结核分枝杆菌P5CR蛋白的夹心ELISA的检出限，使用P5CR蛋白的系列稀释进行测定，其浓度范围为22.86pg/ml至50ng/ml。还对抗体浓度进行变动，从而使用2μg/ml、5μg/ml和10μg/ml浓度的Ph4550.2捕捉抗体，并使用5μg/ml或10μg/ml的Ch6/7检测抗体。
[1036] 表示于图105的数据表明，在测试的测定条件下，低至约360pg/ml的结核分枝杆菌P5CR蛋白可使用5μg/ml Ph4550.2捕捉抗体和5μg/ml Ch6/7检测抗体来检测。还在这些条件下观察到与在更高捕捉抗体浓度进行的测定相比较低的背景信号，为22.86pg/ml蛋白。然而，使用10μg/ml Ph4550.2捕捉抗体和5μg/ml Ch6/7检测抗体也在宽范围的蛋白浓度观察到可接受的信噪比。
[1037] 5.供检测结核分枝杆菌P5CR蛋白的扩增的夹心ELISA
[1038] 本发明人还调查了生物素化的抗体和链霉抗生物素蛋白多聚HRP偶合物是否可以与常规生物素-链霉抗生物素蛋白-HRP系统或HRP-偶合二抗相比改善ELISA敏感性。
[1039] 如示于图106，使用链霉抗生物素蛋白多聚-40辣根过氧化物酶(HRP)与生物素化的驴抗鸡IgG在ELISA中检测结合的Ch6/7与下述其他系统相比，获得了较佳的结果，所述系统包括HRP-偶合的绵羊抗鸡IgG用于检测多克隆检测抗体。类似地，这些数据优于任何能够在用作检测抗体时检测重组Ph4550.2抗体的偶合物。这些数据表明Ch6/7抗体在扩增的夹心ELISA形式中作为检测抗体优于Ph4550.2。
[1040] 相应地，通过在扩增的夹心ELISA中在图107中所示的限制之内变化捕捉抗体Ph4550.2、检测抗体Ch6/7和扩增的链霉抗生物素蛋白多聚80HRP的浓度进行了进一步优化。
[1041] 示于图107的结果表明了在使用10μg/ml Ph4550.2捕捉抗体和2.5μg/mlCh6/7检测抗体与1∶10000(v/v)稀释的扩增的链霉抗生物素蛋白多聚80HRP的扩增的夹心ELISA中对P5CR蛋白的最优检出限。
[1042] 在前述实验中所述的测试的合成中，产生了针对P5CR的扩增的夹心ELISA。简言之，将ELISA板的孔用Ph4550.2抗体以在封闭缓冲液中5μg/ml的浓度包被。在洗涤去除未结合的抗体后，将50μl重组P5CR蛋白的等分试样，从100ng/ml起始浓度1∶2(v/v)在封闭缓冲液中系列稀释至1pg/ml，添加至经抗体包被的ELISA板孔中。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将抗体Ch6/7以在封闭缓冲液中2.0μg/ml的浓度与板相接触。在室温温育1小时之后，如前所述洗涤板，并用50μl的1∶200000(v/v)稀释的生物素化的驴抗鸡IgG和1∶20000(v/v)稀释的链霉抗生物素蛋白多聚80HRP温育，如前所述洗涤，用TMB温育30分钟。在450-620nm确定吸光度。
[1043] 表示于图108的数据将该扩增的夹心ELISA的检出限与使用HRP偶合的绵羊抗鸡IgG作为针对Ch6/7抗体的检测试剂的标准ELISA的检出限相比较。该扩增的夹心ELISA的检出限为约48pg/ml P5CR蛋白，半最大检测为约1ng/ml P5CR蛋白。这与标准的测定法的敏感性相比是有利的。
[1044] 6.评估样品对信号的抑制
[1045] 为了评价是否在生物样品中存在待使用本发明的夹心ELISA(例如，在护理位置或在现场试验形式中)测试的因子，将不同浓度的重组结核分枝杆菌P5CR蛋白(即，0-30pg/ml)与血浆(图109)或痰(图110)的系列稀释混合，并在上述无替代扩增的扩增的夹心ELISA测定法形式中进行测试，即，使用Ph4550.2作为捕捉抗体，Ch6/7作为检测抗体，以及包含生物素化的驴抗鸡IgG和链霉抗生物素蛋白多聚80HRP(“HRP80-链霉抗生物素蛋白”)的检测系统。
[1046] 在测试的条件下，对未稀释的含血浆样品观察到显著的信号抑制(图110)，然而，将血浆样品至少约1∶1(v/v)稀释减少了信号的丧失。血浆样品在封闭缓冲液中的1∶8(v/v)稀释导致与使用仅与封闭溶液混合(即，无血浆)的肽获得的信号相比约88％的信号恢复。
[1047] 还对于未稀释的含痰样品观察到了对信号的抑制(图111)，然而这成比例地远低于血浆，且痰在封闭缓冲液中的1∶1(v/v)稀释导致与使用仅与封闭溶液混合(即，无痰)的肽获得的信号相比信号增强。
[1048] 总之，可获得的数据表明扩增的夹心ELISA可在生物样品(包括稀释的血浆或痰)中检测少于约3.3pg/ml P5CR蛋白。
[1049] 7.结核分枝杆菌与非分枝杆菌病原体之间的低交叉反应性
[1050] 为了进一步评价P5CR作为生物样品中结核分枝杆菌存在的诊断标志物的适合性，本发明人比较了在不同浓度的重组P5CR蛋白和酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或铜绿假单胞菌的100ng/ml和100μg/ml细胞提取物之间，在如本实施例中所述进行的扩增的夹心ELISA中的抗体交叉反应性。
[1051] 表示于图112的数据显示针对结核分枝杆菌P5CR的抗体在测试的条件下与酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或铜绿假单胞菌细胞提取物的低交叉反应性。具体而言，在测试的细胞提取物浓度之间几乎无或无信号差异，且获得的信号并不显著高于背景。与之相对，该测定检测少于1ng/ml的重组P5CR蛋白。
[1052] 8.抗EF-Tu抗体与不同结核分枝杆菌分离株之间的交叉反应性
[1053] 本文中所述的扩增ELISA还用于在实验室菌株H37RV和临床分离株CSU93和HN878的全细胞提取物中检测重组P5CR蛋白。将重组蛋白(以1.8μg/ml、5.6μg/ml、
16.7μg/ml和50μg/ml稀释于封闭缓冲液)添加至全细胞裂解液，并通过扩增的夹心ELISA对样品基本上如本文中所述重复进行两次测定。在全细胞裂解液中内源P5CR蛋白的浓度是通过从标准曲线内插并减去对应掺入的重组P5CR蛋白的信号来计算的。
16.7μg/ml和50μg/ml稀释于封闭缓冲液)添加至全细胞裂解液，并通过扩增的夹心ELISA对样品基本上如本文中所述重复进行两次测定。在全细胞裂解液中内源P5CR蛋白的浓度是通过从标准曲线内插并减去对应掺入的重组P5CR蛋白的信号来计算的。
[1054] 如通过两个独立实验而确定的存在于这些菌株中的内源结核分枝杆菌P5CR蛋白的水平示于图113。数据表明平均P5CR水平是在约5-9pg/ml总细胞提取物范围内。
[1055] 总之，迄今获得的数据表明Ch6/7多克隆血清和重组抗体Ph4550.2能够在结核分枝杆菌的临床相关和实验室菌株的全细胞提取物中检测内源P5CR蛋白。
[1056] 9.不同分枝杆菌菌种之间的低交叉反应性
[1057] 为了进一步评价P5CR作为生物样品中结核分枝杆菌存在的诊断标志物的适合性，并评价针对P5CR蛋白制备的抗体的特异性，本发明人比较了在分枝杆菌菌种结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的细胞提取物之间，抗体在如上所述进行的扩增的夹心ELISA中的反应性。
[1058] 简言之，将ELISA板用捕捉抗体Ph4550.2包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体后，将来自每种分枝杆菌菌种的细胞提取物添加至经抗体包被的ELISA板孔中。作为每个测定法的阴性对照，使用不含细胞提取物的缓冲液。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将检测抗体Ch6/7与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，用50μl稀释的二抗(例如，生物素化的驴抗鸡IgG)温育1小时，然后再用1∶2500(v/v)稀释的HRP80-链霉抗生物素蛋白(也可用多聚40链霉抗生物素蛋白-HRP偶合物替代HRP80-链霉抗生物素蛋白)温育，然后再次洗涤板，用TMB温育10分钟，并确定450-620nm的吸光度。将样品在全细胞提取物的三个稀释中重复进行两次测定。基于P5CR蛋白的标准化水平产生校准标准曲线。
[1059] 在图113中表示的数据显示两个分枝杆菌菌种，结核分枝杆菌和胞内分枝杆菌之间的交叉反应性，但未检测出鸟分枝杆菌。这些数据表明结核分枝杆菌P5CR蛋白在这些测定条件下或使用所选的抗体对较不适于进行结核分枝杆菌的菌种特异性检测。这并未消除针对P5CR蛋白的抗体在一般性单分析物诊断测试中，或者作为多分析物测试的一部分与针对KARI蛋白的抗体，和/或本文中所述或本领域已知的结核分枝杆菌菌种特异性标志物一同使用的有用性。
[1060] 举例而言，针对P5CR蛋白的抗体可与来自P5CR阳性临床样本的结核分枝杆菌的后续培养一同使用。
[1061] 或者，针对KARI的抗体和针对P5CR的抗体可用作类别性的分枝杆菌属测试，其中KARI交叉反应性的存在和P5CR交叉反应性的不存在表明除了结核分枝杆菌或胞内分枝杆菌之外的分枝杆菌(例如，因为其表明鸟分枝杆菌)，或其中针对KARI和P5CR两者的交叉反应性表明结核分枝杆菌或胞内分枝杆菌。
[1062] 作为替代或附加手段，可将针对KARI蛋白和/或P5CR蛋白的抗体与一种或多种如本文中所述的，与其他测试的分枝杆菌具有低交叉反应性的针对结核分枝杆菌BSX和/或结核分枝杆菌S9蛋白和/或结核分枝杆菌Rv1265蛋白的抗体一同使用。在诠释上述多分析物测试时，针对KARI和P5CR蛋白两者的抗体的结合表明在临床样品中结核分枝杆菌或胞内分枝杆菌的存在，而针对结核分枝杆菌BSX和/或结核分枝杆菌S9蛋白和/或结核分枝杆菌Rv1265蛋白的抗体的另外结合表明更高可能性的结核分枝杆菌感染。
[1063] 10.在分枝杆菌细胞中可检测出的P5CR蛋白的相对水平
[1064] 为了进一步评价P5CR作为分枝杆菌感染的诊断性标志物的适合性，在结核分枝杆菌菌株H37Rv、CSU93和HN878以及结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌全细胞裂解液中相对于本文中所述的其他10个结核分枝杆菌抗原(包括BSX、EF-Tu、KARI、Rv1265、S9和TetR样蛋白)确定P5CR蛋白的水平。
[1065] 基本上如本实施例和实施例1中所述进行扩增的夹心ELISA，以根据标准实验方法鉴定每种抗原的相对水平，并包括了校准标准以使得量化成为可能。
[1066] 示于图124-125的数据表明P5CR当与BSX、KARI、Rv1265和S9相比时，甚至当与EF-Tu相比时，以较低的水平在所有三种测试的结核分枝杆菌菌株中表达，然而仍表达于实验室和临床相关菌株中。
[1067] 示于图126-131的数据表明P5CR蛋白在分枝杆菌中一般而言也是以低水平表达，如其与例如BSX、KARI、Rv1265和S9相比在结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌中的低表达所示。尽管P5CR的低表达，在示于图127的实验中，在结核分枝杆菌和胞内分枝杆菌中的表达的差异比图113中观察到的差异更大。
[1068] 总体而言，这些数据表明了P5CR作为结核分枝杆菌感染类别性的单分析物标志物，或作为针对分枝杆菌感染的多分析物测试的一部分，例如在与KARI组合时，或作为针对结核分枝杆菌感染的多分析物测试的一部分，例如与BSX和/或S9和/或Rv1265蛋白组合时的有用性。并未排除其他供对结核分枝杆菌感染进行多分析物测试的组合。
[1069] 11.优化检出限
[1070] 为了进一步增强夹心ELISA的敏感性，使用替代的扩增方法以在用捕捉抗体包被ELISA板之后使用反复的抗原结合。基本上，这导致结合于捕捉抗体的抗原量增加，尽管96-孔ELISA板的50μl体积限制。简言之，该反复的抗原加载涉及在夹心ELISA中在洗涤并添加检测抗体之前重复几次抗原结合步骤，例如，2或3或4或5次等。自然而然，每个等分试样的抗原样品是在标准的温育期间之后，下一等分试样添加之前去除的。可修饰重复的次数以优化测定法(例如，参数如信噪比、检出限和在半最大信号处检测出的抗原量)，这取决于测试的样品的特性(例如，样品类型)，而无需不必要的实验尝试。
[1071] 例如，多至约20次重复样品加载(即，多至20x替代扩增)可提供低背景信号，并降低P5CR蛋白的检出限。
[1072] 实施例8
[1073] 使用结合于结核分枝杆菌TetR样蛋白的抗体进行的由结核分枝杆菌造成的感染或结核病的基于抗原的诊断
[1074] 1.鉴定TetR样蛋白为结核分枝杆菌感染的诊断标志物
[1075] 在来自TB+样品的血浆和痰的免疫球蛋白级分中识别出蛋白片段。来自血浆样品MALDI MS数据的六个肽的序列(SEQ ID NO：45-56，含45和56)和另外四个来自痰的MALDI MS数据的肽(SEQ ID NO：51-54)与具有SwissProt登录号O53310的蛋白(SEQ ID NO：44)匹配。该6个血浆来源的肽(SEQ ID NO：45-56)对Q53310的覆盖百分比为约22％，而4个痰来源的肽(SEQ ID NO：51-54)对Q53310的覆盖百分比为约33％，表明在两种情况下肽片段均来源于该同一个蛋白标志物。
[1076] 鉴定出的具有SEQ ID NO：44中所述的氨基酸序列的蛋白命名为“TetR”或简单的“TetR”。TetR的估计分子量为约23.1kDa，而估计等电点为约4.9。
[1077] 2.结合于结核分枝杆菌TetR样蛋白或TetR来源的肽的抗体
[1078] a)针对合成肽制备的多克隆抗体
[1079] 包含全长TetR氨基酸残基147-174的合成肽(SEQ ID NO：55)或氨基酸残基113-127的合成肽(SEQ ID NO：56)是根据标准方法合成的。这些肽可分别通过马来酰亚胺己酰基-N-羟基琥珀酸接头偶联于钥孔血蓝蛋白(KHL)。
[1080] 为了便于检测针对SEQ ID NO：44的表位培育的抗体，还将肽分别合成，每个均与GSGL间隔物一同合成，并附于生物素。
[1081] 将鸡和兔用包含SEQ ID NO：44所述的序列的重组蛋白，和用包含SEQID NO：55所述的氨基酸序列的合成肽根据标准方法进行免疫接种。对动物进行放血。将所有血收集于灭菌的容器中，并在去除血块之后收集血清。
[1082] 为了滴定在鸡中产生的针对重组蛋白(SEQ ID NO：44)的抗血清，将重组蛋白免疫原以5μg/ml的浓度固定于Nunc免疫板上。去除溶液，并使用封闭缓冲液(在PBS中1％(w/v)酪蛋白、0.1％(v/v)Tween 20，0.1％(w/v)叠氮化钠)封闭孔。去除封闭缓冲液并添加以1∶500(v/v)至1∶1024000(v/v)的范围稀释于PBS的血清，并温育足够时间使得抗体与结合的推定的转录调节蛋白TetR，或TetR来源的肽复合，通常为在室温进行约1小时。洗涤板，而抗体对TetR蛋白的结合是使用1∶5000(v/v)稀释于偶合物稀释缓冲液中的HRP偶合的绵羊抗鸡IgG来检测的。将五十毫升(50ml)TMB(3，3’，5’，5-四甲基联苯胺；Sigma)添加至每个孔，并在暗处将板温育30分钟。通过添加50μL/孔的0.5M硫酸终止显色。每个孔的吸光度用微滴定板读数器读取(PowerWaveX340板读数器，Bio-Tek Instruments Inc.，Winooski，VT)，使用450nm的波长和620nm的消光波长。滴定结果示于图114。
[1083] 为了测试针对包含SEQ ID NO：55的合成肽的兔抗血清，将链霉抗生物素蛋白(Sigma Aldrich)用双蒸水(ddH2O)稀释至5μg/ml，并在Nunc板中在4℃温育过夜。然后轻拍去除板中的溶液，并将250μL封闭缓冲液(在PBS中1％(w/v)酪蛋白、0.1％(v/v)Tween 20，0.1％(w/v)叠氮化钠)添加至每个孔，并在室温温育1小时。将封闭缓冲液轻拍去除，并将稀释至204.8ng/ml至100pg/ml的浓度范围的生物素化的肽(SEQ ID NO：55)以3μg/ml(50μl/孔)在封闭缓冲液中添加，并在室温在振荡器上温育1小时。将板在Elx405Auto PlateWasher(Bio-Tek Instruments Inc.，Winooski，VT)中 用0.5x PBS/0.05％(v/v)Tween 20溶液洗涤，将过量溶液从板轻拍到纸巾上。将兔血清和免疫前血清用封闭缓冲液稀释至1∶500(v/v)或1∶2000(v/v)，并在室温以50μl/孔在振荡器上温育1小时。用板洗涤器使用0.5x PBS/0.05％(v/v)Tween 20溶液洗涤板，并将过量溶液轻拍到纸巾上。兔抗体与SEQ ID NO：55的结合是使用1∶5000(v/v)稀释于偶合物稀释缓冲液中的HRP-偶合的绵羊抗兔IgG(Chemicon)来检测的。将五十毫升(50ml)添加至每个孔，并在室温在振荡器上温育一小时。用板洗涤器使用0.5x PBS洗涤板，并将过量溶液轻拍到纸巾上。将五十毫升TMB(3，3’，5’，5-四甲基联苯胺；Sigma)添加至每个孔，并在暗处将板温育30分钟。通过添加50μL/孔的0.5M硫酸终止显色。每个孔的吸光度用微滴定板读数器读取(PowerWaveX 340板读数器，Bio-TekInstruments Inc.，Winooski，VT)，使用450nm的波长和620nm的消光波长(extinction)。数据示于图115。
[1084] b)针对重组蛋白制备的单克隆抗体
[1085] 用全长重组TetR-样蛋白(SEQ ID NO：44)作为抗原根据标准方法进行单克隆抗体产生。将大约2mg蛋白提供给NeoClone，Madison，Wisconsin根据其标准实验方案进行单克隆抗体的生成。提供了约1mg肽/蛋白作为生物素化肽以供质量控制(quality control)。用蛋白根据Neoclone的标准免疫接种方法对五只BALB/cByJ雌性小鼠进行免疫接种。以规则的间隔进行经免疫接种的小鼠的测试放血以用于使用生物素化的肽的质量控制血清ELISA。使用ELISA确定具有最高效价的多克隆血清。将具有至少1000多克隆抗体效价的小鼠用于ABL-MYC感染方法。对于每个待产生的单克隆抗体，将具有与肽抗原交叉反应的多克隆抗体的最高效价的3只小鼠的脾根据NeoClone的标准感染方法用于ABL-MYC感染。对于每个待产生的单克隆抗体，将经ABL-MYC感染的小鼠的脾细胞移植入约20只未经实验的小鼠。分离在经移植的小鼠中形成的腹水，并就产生结合于靶肽抗原的单克隆抗体(mAb)的细胞进行筛选。
[1086] 分离了六个产生分别命名为Mo784A、Mo784D、Mo784F、Mo785E、Mo785F和Mo785C的不同mAb的细胞系(即，浆细胞瘤)。使用ELISA确证了结合亲和性和同种型特异性。将mAb以1ml等分试样(大约)的腹水与相关的细胞系一同提供。
[1087] 3.标准夹心ELISA
[1088] 本实施例说明了通过夹心ELISA使用实施例4中所述的多克隆和单克隆抗体有效检测TetR样蛋白，以及使用鸡多克隆抗体Ch4(＝粉红4)和Ch5(＝粉红5)的汇集对标准ELISA进行优化，即将Ch4/5用作捕捉试剂而单克隆抗体784F和Mo785E作为检测试剂。抗体对Ch4/5和Mo785E最终是根据，例如，其与其他本文中所述的抗体组合相比在夹心ELISA中其较高的信噪比选取的。
[1089] a)优选的抗体取向
[1090] 在第一组诊断测试中，进行标准夹心ELISA以确定最优的捕捉和检测抗体，以及所用的合适抗体浓度。
[1091] 在一个实施例中，使用多克隆血清RCP18(＝Rb18)作为捕捉抗体而命名为“Ch4/5”，包含多克隆抗体Ch4(＝本文中提及的“粉红4”)和Ch5(＝本文中提及的“粉红
5”)的多克隆抗体的汇集作为检测抗体。简言之，将ELISA板的孔用50μl 5μg/ml浓度或10μg/ml浓度的RCP18(Rb18)抗体包被过夜。在封闭并洗涤去除未结合的抗体后，将重组TetR样蛋白从50ng/ml起始浓度稀释至80pg/ml，并将每个稀释的50μl等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将检测抗体(即，Ch4/5用于检测TetR-RCP18复合物)以5μg/ml或10μg/ml或20μg/ml的浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，用50μl的1∶5000(v/v)稀释的偶合于辣根过氧化物酶(HRP)的二抗(即，对于检测Ch4/5，绵羊抗鸡IgG)温育，洗涤，用TMB温育30分钟，并在减去背景之后确定450-620nm的吸光度。
5”)的多克隆抗体的汇集作为检测抗体。简言之，将ELISA板的孔用50μl 5μg/ml浓度或10μg/ml浓度的RCP18(Rb18)抗体包被过夜。在封闭并洗涤去除未结合的抗体后，将重组TetR样蛋白从50ng/ml起始浓度稀释至80pg/ml，并将每个稀释的50μl等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将检测抗体(即，Ch4/5用于检测TetR-RCP18复合物)以5μg/ml或10μg/ml或20μg/ml的浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，用50μl的1∶5000(v/v)稀释的偶合于辣根过氧化物酶(HRP)的二抗(即，对于检测Ch4/5，绵羊抗鸡IgG)温育，洗涤，用TMB温育30分钟，并在减去背景之后确定450-620nm的吸光度。
[1092] 表示于图116的数据表明在该夹心ELISA形式中优选5μg/ml RCP18作为捕捉抗体而5μg/ml Ch4/5作为检测抗体的组合。
[1093] 在第二个实施例中，使用命名为“Ch4/5”，包含多克隆抗体Ch4(＝本文中提及的“粉红4”)和Ch5(＝本文中提及的“粉红5”)的多克隆抗体的汇集作为捕捉抗体，而多克隆抗血清RCP18(＝Rb18)作为检测抗体进行标准夹心ELISA。简言之，将ELISA板的孔用50μl 5μg/ml浓度或10μg/ml浓度的Ch4/5抗体包被过夜。在封闭并洗涤去除未结合的抗体后，将重组TetR样蛋白从50ng/ml起始浓度稀释至80pg/ml，并将每个稀释的50μl等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将检测抗体(即，RCP18用于检测TetR-Ch4/5复合物)以5μg/ml或10μg/ml或20μg/
ml的浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，用50μl的
1∶5000(v/v)稀释的偶合于辣根过氧化物酶(HRP)的二抗(即，对于检测Ch4/5，绵羊抗鸡IgG)温育，洗涤，用TMB温育30分钟，并在减去背景之后确定450-620nm的吸光度。
ml的浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，用50μl的
1∶5000(v/v)稀释的偶合于辣根过氧化物酶(HRP)的二抗(即，对于检测Ch4/5，绵羊抗鸡IgG)温育，洗涤，用TMB温育30分钟，并在减去背景之后确定450-620nm的吸光度。
[1094] 表示于图117的数据表明在该夹心ELISA形式中优选5μg/ml Ch4/5作为捕捉抗体而5μg/ml RCP18作为检测抗体的组合，且其与示于图116中的抗体的相反取向相比略微改善。
[1095] 在进一步的诊断测试中，使用命名为为“Ch4/5”，包含多克隆抗体Ch4(＝本文中提及的“粉红4”)和Ch5(＝本文中提及的“粉红5”)的多克隆抗体的汇集作为捕捉抗体，而两种命名为784F和Mo785E的单克隆抗体制备物之一作为检测抗体进行标准夹心ELISA。将ELISA板的孔用50μl 500ng/ml或1μg/ml或2μg/ml或4μg/ml或8μg/ml浓度的
Ch4/5抗体包被过夜。在封闭并洗涤去除未结合的抗体后，将重组TetR样蛋白从5ng/ml起始浓度稀释至2.29pg/ml，并将每个稀释的50μl等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将检测抗体(即，784F或Mo785E用于检测TetR-Ch4/5复合物)以2μg/ml的浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，用50μl的1∶5000(v/v)稀释的偶合于辣根过氧化物酶(HRP)的二抗(即，对于检测小鼠单克隆抗体，绵羊抗小鼠IgG)温育，洗涤，用TMB温育30分钟，并在减去背景之后确定450-620nm的吸光度。
Ch4/5抗体包被过夜。在封闭并洗涤去除未结合的抗体后，将重组TetR样蛋白从5ng/ml起始浓度稀释至2.29pg/ml，并将每个稀释的50μl等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将检测抗体(即，784F或Mo785E用于检测TetR-Ch4/5复合物)以2μg/ml的浓度与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，用50μl的1∶5000(v/v)稀释的偶合于辣根过氧化物酶(HRP)的二抗(即，对于检测小鼠单克隆抗体，绵羊抗小鼠IgG)温育，洗涤，用TMB温育30分钟，并在减去背景之后确定450-620nm的吸光度。
[1096] 表示于图118的数据表明Mo785E单克隆抗体提供了最低的背景信号，且当与Ch4/5捕捉抗体组合时，提供了比兔多克隆RCP18更高的信号。500ng/ml Ch4/5作为捕捉抗体而2μg/ml Mo785E作为检测抗体的组合提供了最低的背景信号，然而2μg/ml Ch4/5作为捕捉抗体而2μg/ml Mo785E作为检测抗体的组合在该夹心ELISA形式中提供了最高的信噪比。
[1097] 3.验证TetR样蛋白和抗体
[1098] 简言之，Western印迹是针对通过在10％(w/v)Bis-Tri Nu-PAGE(Invitrogen，Carlsbad CA，USA)上电泳分离，并转移至PVDF激活的膜(Immobilon-P，Millipore Inc，USA)上的蛋白，并分别用单克隆抗体Mo785E或多克隆抗体Ch4/5进行的。在转移之后，将膜在0.008％DB-71(SigmaChemical Co.USA)中在40％(v/v)乙醇/10％(v/v)乙酸中温育7分钟，在40％(v/v)乙醇/10％(v/v)乙酸中迅速漂洗，对其进行扫描以可视地确证蛋白转移，并在含Trition-X100的Tris缓冲盐水(TBS-T)中漂洗。将干燥的膜在甲醇中重新激活，并转移至封闭缓冲液(含1％(w/v)牛血清白蛋白的TBS-T)在4℃过夜。将单克隆抗体Mo785E或多克隆抗体Ch4/5在封闭缓冲液中稀释至0.5μg/ml的浓度，并分别与膜在室温温育90分钟，在此时间之后将膜在TBS-T中洗涤，用HRP-偶合的二抗(即，1∶100000(v/v)稀释的用于Mo785E的绵羊抗小鼠IgG-HRP偶合物或用于Ch4/5的驴抗鸡IgG-HRP偶合物)在室温温育60分钟，并如前所述进行洗涤。HRP-二抗偶合物的结合是通TM
过将膜在SuperSignal West″Femto″Maximum Sensitivity Substrate(Pierce，Inc.USA)中温育，并使用LAS-3000多重成像仪(multi-imager)(FujiFilm Inc.，Japan)使化学发光可见来检测的。
过将膜在SuperSignal West″Femto″Maximum Sensitivity Substrate(Pierce，Inc.USA)中温育，并使用LAS-3000多重成像仪(multi-imager)(FujiFilm Inc.，Japan)使化学发光可见来检测的。
[1099] 在两种临床结核分枝杆菌分离株CSU93和HN878，以及在实验室菌株H37Rv中通过两种抗体检测出了约24kDa的免疫反应性条带(数据未显示)，与结核分枝杆菌TetR样蛋白的预期的分子量一致。在对照中，也在正确的位置检测出了具有约25kDa的估计分子量的包含六组氨酸标记的重组TetR样蛋白(未显示)。在另一个实验中，Mo785E对这些条带的检测由将一抗在1000倍摩尔过量的未标记的重组TetR样蛋白中预温育来阻止(数据未显示)。
[1100] 5.使用多克隆Ch4/5抗体和mAb Mo785E的扩增的夹心ELISA
[1101] 本发明人还调查了生物素化的抗体和链霉抗生物素蛋白多聚HRP偶合物是否可以与常规生物素-链霉抗生物素蛋白-HRP系统或HRP-偶合二抗相比改善ELISA敏感性。
[1102] 将ELISA板用捕捉抗体Ch4/5以2μg/ml浓度包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体之后，将重组TetR样蛋白从100ng/ml的起始浓度稀释至490fg/ml，并将每个稀释的50μl等分试样添加至经抗体包被的ELISA板孔中。在温育1小时之后，洗涤板以去除未结合的抗原。对于标准夹心ELISA，将未标记的单克隆抗体Mo785E与结合的抗原-抗体复合物以2.5μg/ml的浓度相接触。
[1103] 对于扩增的夹心ELISA，将单克隆抗体Mo785E生物素化，并将生物素化的抗体与结合的抗原-抗体复合物以2.5μg/ml的浓度相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，并用50μl 1∶5000(v/v)稀释的由HRP偶合的绵羊抗小鼠IgG(标准夹心ELISA)或50μl1∶2500(v/v)稀释的HRP80-链霉抗生物素蛋白组成的二抗温育。然后将板在室温再温育一个小时，并如前所述洗涤。最后，将所有样品用TMB温育30分钟(标准ELISA)或10分钟(扩增ELISA)。在450-620nm确定吸光度。
[1104] 如示于图119，在下述条件下使用扩增的夹心ELISA对检测有显著的增强：该扩增的夹心ELISA的检出限为约18pg/ml TetR样蛋白，半最大检测为约1ng/ml TetR样蛋白。这与在标准夹心ELISA中观察到的约79-176pg/mlTetR样蛋白的检出限相比是有利的。本发明人认为在夹心ELISA中上述检测的敏感性以及低背景落在有用的限制范围内。
[1105] 6.针对不同结核分枝杆菌分离株的TetR样蛋白的抗体之间的交叉反应性
[1106] 为了进一步评价TetR作为生物样品中结核分枝杆菌存在的诊断标志物的适合性，本发明人通过扩增的夹心ELISA比较了在临床结核分枝杆菌菌株CSU93和HN878以及实验室结核分枝杆菌菌株H37Rv的细胞提取物之间的抗体反应性。
[1107] 本文中所述的扩增ELISA还用于在实验室菌株H37RV和临床分离株CSU93和HN878的全细胞提取物中检测重组TetR样蛋白。将重组蛋白(以1.8μg/ml、5.6μg/ml、
16.7μg/ml和50μg/ml稀释于封闭缓冲液)添加至全细胞裂解液，且样品通过扩增的夹心ELISA基本上如本文中所述进行重复两次测定。内源TetR样蛋白在全细胞裂解液中的浓度是从标准曲线内插并减去对应掺入的重组TetR样蛋白的信号来计算的。存在于这些菌株中的内源结核分枝杆菌TetR样蛋白水平，如从两次独立实验所确定，表示于图120中。
数据表明对于H37Rv和CSU93，平均TetR水平为约3-5pg/μg细胞提取物，而在临床分离株HN878的全细胞提取物中为约9pg/μg。
16.7μg/ml和50μg/ml稀释于封闭缓冲液)添加至全细胞裂解液，且样品通过扩增的夹心ELISA基本上如本文中所述进行重复两次测定。内源TetR样蛋白在全细胞裂解液中的浓度是从标准曲线内插并减去对应掺入的重组TetR样蛋白的信号来计算的。存在于这些菌株中的内源结核分枝杆菌TetR样蛋白水平，如从两次独立实验所确定，表示于图120中。
数据表明对于H37Rv和CSU93，平均TetR水平为约3-5pg/μg细胞提取物，而在临床分离株HN878的全细胞提取物中为约9pg/μg。
[1108] 总之，迄今获得的数据表明扩增的夹心ELISA测定法形式能够在结核分枝杆菌临床相关和实验室菌株的全细胞提取物中检测内源TetR样蛋白。
[1109] 7.结核分枝杆菌与非分枝杆菌病原体之间的低交叉反应性
[1110] 为了进一步评价TetR作为生物样品中结核分枝杆菌存在的诊断标志物的适合性，本发明人比较了在不同浓度的重组TetR样蛋白和酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或铜绿假单胞菌的细胞提取物之间，在基本上如本文中所述进行的扩增的夹心ELISA中的抗体交叉反应性。测定条件略微有所变动，使用1∶2500(v/v)稀释的HRP40-链霉抗生物素蛋白而非HRP80-链霉抗生物素蛋白，并用TMB显色15分钟以供信号检测。不含蛋白或细胞提取物的缓冲液用作阴性对照。在该诊断测试中未进行替代扩增或反复的样品加载。
[1111] 表示于图121的数据未显示针对结核分枝杆菌TetR的抗体在测试的条件下与酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或铜绿假单胞菌细胞提取物具有可检测的交叉反应性。具体而言，在测试的细胞提取物浓度之间几乎无或无信号差异，且获得的信号并不显著高于背景。与之相对，该测定检测少至约10pg/ml的重组TetR样蛋白。
[1112] 8.不同分枝杆菌菌种之间的交叉反应性
[1113] 为了进一步评价TetR样作为生物样品中结核分枝杆菌存在的诊断标志物的适合性，并评价针对TetR样蛋白制备的抗体的特异性，本发明人比较了在分枝杆菌菌种结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的细胞提取物之间，抗体在如上所述进行的扩增的夹心ELISA中的反应性。
[1114] 简言之，将ELISA板用捕捉抗体Ch4/5包被过夜。在洗涤去除未结合的抗体后，将来自每种分枝杆菌菌种的细胞提取物添加至经抗体包被的ELISA板孔中。作为每个测定法的阴性对照，使用不含细胞提取物的缓冲液。在温育1小时并洗涤去除未结合的抗原之后，将生物素化的检测抗体Mo785E-Bio与结合的抗原-抗体复合物相接触。在室温温育1小时之后，洗涤板，用1∶2500(v/v)稀释的HRP80-链霉抗生物素蛋白(也可用多聚40链霉抗生物素蛋白-HRP偶合物替代HRP80-链霉抗生物素蛋白)温育，然后再次洗涤，用TMB温育10分钟，并确定450-620nm的吸光度。将样品在全细胞提取物的三个稀释中重复进行两次测定。基于TetR样蛋白的标准化水平产生校准标准曲线。
[1115] 在图122中表示的数据显示抗TetR抗体与来自结核分枝杆菌的全细胞提取物之间的强交叉反应性，而几乎未在鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的全细胞提取物中检测出交叉反应性。与之相对，全细胞提取物的滤过物在结核分枝杆菌和胞内分枝杆菌中均导致显著和可相互比较的交叉反应性，表明与P5CR类似，结核分枝杆菌TetR样蛋白在这些测定条件或使用所选的抗体对时可能较不适于对结核分枝杆菌进行菌种特异性检测。这并未消除针对TetR样蛋白的抗体在一般性单分析物诊断测试中，或者作为多分析物测试的一部分与针对KARI蛋白的抗体，和/或本文中所述或本领域已知的结核分枝杆菌菌种特异性标志物一同使用的有用性。
[1116] 举例而言，针对TetR样蛋白的抗体可与来自P5CR阳性临床样本的结核分枝杆菌的后续培养一同使用。
[1117] 或者，针对KARI的抗体和针对TetR样的抗体可用作类别性的分枝杆菌测试，其中KARI交叉反应性的存在和TetR样交叉反应性的不存在表明除了结核分枝杆菌或胞内分枝杆菌之外的分枝杆菌(例如，因为其表明鸟分枝杆菌)，或其中针对KARI和TetR样两者的交叉反应性表明结核分枝杆菌或胞内分枝杆菌。
[1118] 作为替代或附加手段，可将针对KARI蛋白和/或TetR样蛋白的抗体与一种或多种如本文中所述的，与其他测试的分枝杆菌具有低交叉反应性的针对结核分枝杆菌BSX和/或结核分枝杆菌S9蛋白和/或结核分枝杆菌Rv1265蛋白的抗体一同使用。在诠释上述多分析物测试时，针对KARI和TetR样蛋白两者的抗体的结合表明在临床样品中结核分枝杆菌或胞内分枝杆菌的存在，而针对结核分枝杆菌BSX和/或结核分枝杆菌S9蛋白和/或结核分枝杆菌Rv1265蛋白的抗体的另外结合表明更高可能性的结核分枝杆菌感染。
[1119] 9.在分枝杆菌细胞中可检测出的TetR样蛋白的相对水平
[1120] 为了进一步评价TetR样作为分枝杆菌感染的诊断性标志物的适合性，在结核分枝杆菌菌株H37Rv、CSU93和HN878以及结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌全细胞裂解液中相对于本文中所述的其他10个结核分枝杆菌抗原(包括TetR样、TetR样、P5CR、TetR样、TetR样和TetR样蛋白)确定TetR样蛋白的水平。
[1121] 基本上如本实施例和实施例1中所述进行扩增的夹心ELISA，以根据标准实验方法鉴定每种抗原的相对水平，并包括了校准标准以使得量化成为可能。
[1122] 示于图124-131的数据表明TetR样以低水平在所有三种测试的结核分枝杆菌菌株中表达，与P5CR蛋白的表达相当。
[1123] 另一方面，示于图126-131的数据表明TetR样蛋白还对结核分枝杆菌相对较具特异性，且在用于鸟分枝杆菌或胞内分枝杆菌的测定条件下无法检测出。
[1124] 这些数据表明了TetR样作为分枝杆菌或结核分枝杆菌感染的类别性的单分析物标志物，或作为针对分枝杆菌感染或结核分枝杆菌感染的多分析物测试的一部分，与BSX和/或KARIT和/或S9和/或Rv1265蛋白组合时的有用性。并未排除其他供对结核分枝杆菌感染进行多分析物测试的组合。
[1125] 11.优化检出限
[1126] 为了进一步增强夹心ELISA的敏感性，使用替代的扩增方法以在用捕捉抗体包被ELISA板之后使用反复的抗原结合。基本上，这导致结合于捕捉抗体的抗原量增加，尽管96-孔ELISA板的50μl体积限制。简言之，该反复的抗原加载涉及在夹心ELISA中在洗涤并添加检测抗体之前重复几次抗原结合步骤，例如，2或3或4或5次等。自然而然，每个等分试样的抗原样品是在标准的温育期间之后，下一等分试样添加之前去除的。可修饰重复的次数以优化测定法(例如，参数如信噪比、检出限和在半最大信号处检测出的抗原量)，这取决于测试的样品的特性(例如，样品类型)，而无需不必要的实验尝试。
[1127] 例如，多至约20次重复样品加载(即，多至20x替代扩增)可提供低背景信号，并降低Rv1265蛋白的检出限。
[1128] 实施例9
[1129] 示例性的表达供检测结核分枝杆菌的单克隆抗体的浆细胞瘤的微生物保藏
[1130] 虽然并不承认需要任何生物材料的保藏以进行本文中概括描述的发明，或其任何实施例，但是将下述浆细胞瘤根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯 条 约 (Budapest treaty on the International Recognition of theDeposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure)的规定如下所述保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)：
[1131] 1.产生结合于来自分枝杆菌复合菌组(特别是结核分枝杆菌)的KARI蛋白的单克隆抗体Mo2B1(同物异名：2B1)的命名为2B1C11的小鼠细胞系于2009年5月21日以ATCC保藏号_________保藏于ATCC；
[1132] 2.产生结合于来自分枝杆菌复合菌组(特别是结核分枝杆菌)的BSX蛋白的单克隆抗体Mo639F的命名为PRO0107-639F的小鼠浆细胞瘤细胞系于2008年3月6日以ATCC保藏号PTA-9013保藏于ATCC；
[1133] 3.产生结合于来自分枝杆菌复合菌组(特别是结核分枝杆菌)的S9蛋白的单克隆抗体Mo1025F的命名为PRO 0126-1025F的小鼠浆细胞瘤细胞系于2008年3月6日以ATCC保藏号PTA-9011保藏于ATCC；
[1134] 4.产生结合于来自分枝杆菌复合菌组(特别是结核分枝杆菌)的Rv1265蛋白的单克隆抗体Mo785E的命名为PRO 0122-785E的小鼠浆细胞瘤细胞系于2007年5月16日以ATCC保藏号PTA-8441保藏于ATCC；
[1135] 5.产生结合于来自分枝杆菌复合菌组(特别是结核分枝杆菌)的TetR样蛋白的单克隆抗体Mo788C的命名为PRO 0123-788C的小鼠浆细胞瘤细胞系于2007年5月16日以ATCC保藏号PTA-8440保藏于ATCC；和
[1136] 6.产生结合于来自分枝杆菌复合菌组(特别是结核分枝杆菌)的EF-Tu蛋白的单克隆抗体Mo524D的命名为PRO 0107-524D的小鼠浆细胞瘤细胞系于2008年3月6日以ATCC保藏号PTA-9012保藏于ATCC。