用于诊断感染的荧光化合物、其制备方法和应用

摘要

本发明涉及类似于烷基磷脂的新的荧光化合物，在其结构中含有高度光稳定的荧光基团并发射可见光谱波长范围内的光。所述化合物容易导入微生物中，从而能够通过荧光显微镜来检测和鉴定所述微生物。所述新荧光化合物还可以快速且容易地诊断病原微生物的存在性，其特征表现为它们对用烷基磷脂处理的抗性。

权利要求

1.用于区分性鉴定微生物的荧光化合物，其特征在于，其含有烷基磷脂衍生物和具有高度光稳定性并发射可见光谱区波长之光的荧光基团。

2.根据权利要求1的荧光化合物，其特征在于，所述烷基磷脂类似物是米替福新(MT)、依地福新(EF)或伊莫福新(IM)。

3.根据权利要求1的荧光化合物，其特征在于，所述烷基磷脂类似物是米替福新(MT)、依地福新(EF)或伊莫福新(IM)的类似物。

4.根据权利要求1的荧光化合物，其特征在于，所述荧光基团是具有高度光稳定性并发射可见光谱波长区之光的荧光基团，其中包括但不限于：具有或不具有取代基的硼二吡咯亚甲基类、呫吨类、罗丹明类、花青类、沙星类、卟啉类、香豆素类和多环烃类。

5.根据权利要求1至4任一项的荧光化合物，其特征在于，所述荧光基团是以下通式所表示的取代或未取代的硼二吡咯亚甲基类(BDP)：其中：

1 2

R ＝H、烷基(直链、支链、取代或未取代的)、芳基或杂芳基(取代或未取代的)，R ＝烷基-、烯基-或炔基-磷脂。

1

6.根据权利要求5的荧光化合物，其特征在于，R 是氢或乙基。

7.根据权利要求1和2任一项的荧光化合物，其特征在于，所述烷基磷脂类似物是米替福新，并且所述荧光基团是以下通式所表示的取代或未取代的BDP：其中：

R1＝H、烷基(直链、支链、取代或未取代的)、芳基或杂芳基(取代或未取代的)。

8.根据权利要求7的荧光化合物，其特征在于，R1是氢(BDP-MT化合物)或乙基(Et-BDP-MT化合物)。

9.获得荧光化合物的方法，其特征在于包括以下步骤：

i)由二乙酰基醇和乙酰乙酸乙酯获得相应的取代α-H-吡咯，ii)使所述α-H-吡咯与适当的α-甲酰吡咯缩合，

iii)使由此形成的二吡咯亚甲基化合物与三氟化硼乙醚反应，iv)引入磷酸胆碱基团。

10.根据权利要求1至8任一项的荧光化合物在制备用于微生物鉴定方法的药物组合物的用途。

11.诊断性药物组合物，其特征在于，包含根据权利要求1至8任一项的化合物。

12.根据权利要求11的诊断性药物组合物，其特征在于，包含以下至少一种化合物：BDP-MT和Et-BDP-MT。

13.根据权利要求11和12任一项所述的诊断性药物组合物在用于鉴定微生物之方法中的用途。

14.根据权利要求13的诊断性药物组合物的用途，其用于生物样品的体外诊断方法中，所述生物样品来自带有传染性疾病的人或兽医学个体，例如但不限制本发明的范围，所述传染性疾病属于下组：角膜炎、利什曼病、非洲和美洲锥虫病、肺炎链球菌肺炎、阿米巴病、滴虫病和霉菌病。

15.根据权利要求14的诊断性药物组合物的用途，其特征在于，所述传染性疾病由属于下组的微生物引起：利什曼原虫(Leishmania sp)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、毛滴虫(Trichomonas sp.)、溶组织性内阿米巴(Entamoeba histolytica)、棘阿米巴(Acanthamoeba sp.)、纳氏虫(Naegleria sp)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、镰刀菌(Fusarium sp.)、梨形四膜虫(Tetrahymena pyriformis)和Balamuthia原虫。

16.根据权利要求14的诊断性药物组合物的用途，其用于源自眼的生物样品的诊断方法中，所述样品例如由角膜刮削获得。

17.根据权利要求13的诊断性药物组合物的用途，其用于既非人也非动物之样品中微生物的鉴定方法中，例如在水、人工眼睛、隐形眼镜、隐形眼镜护理液或角膜保存介质中。

说明书

用于诊断感染的荧光化合物、其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及药物组合物，其用于临床诊断传染病(优选眼科疾病)、以及用于鉴定微生物。

背景技术

[0002] 对于某些危害眼睛之疾病的预防及正确治疗要求对可引发该器官感染的各种微生物进行鉴定。如不尽早进行诊断和治疗，很多此类眼部感染会对患者的视力造成严重的影响。因此在某些情况下有必要对直接感染该器官之病原体进行检测，从眼睛提取易感染组织的代表性小样本组织碎片(活检)或对与所述组织接触之生理液(在此情况下即眼泪)进行分析。对样品中微生物进行检测的常用方法经常是基于获得能增加可能病原体数量的培养物，以辅助随后的鉴定。培养阶段需要1到4天的长时间，此期间内不可使用专门针对感染的药品对患者进行治疗，以免漏掉造成感染的病原体。然而此段较长的等待培养时间会对受感染器官产生极为严重的不良后果，因此应该尽可能使用能缩短正确诊断所需时间的替代检测方法。

[0003] 另一方面，为预防此类传染病，将那些与眼睛长时间接触的物品(如隐形眼镜和相应清洗液)在高度清洁的条件下进行保存和使用以确保无菌是非常重要的。与上述方法类似，要获得这些眼用物品本身或其保存环境是否被污染的可靠信息，通常需要借助费力的微生物培养方法。在此情况下，这种以细胞培养为基础的现有诊断技术的复杂性限制了其应用频率和应用范围，从而导致使用者的感染风险增加。

[0004] 此外，基于使用荧光标记化合物直接添加到怀疑存在微生物之介质中，已经开发了荧光型检测传染性微生物的替代技术。如果将荧光标记化合物导入传染性微生物中，有可能通过使用各种荧光显示设备(如显微镜和流式细胞仪)检测出感染微生物的存在及其形态(Kawamoto，F.，Rapiddiagnosis of malaria by fluorescence microscopy with light microscopeand interference filter.Lancet 1991，337，200-202)。由于这些设备可以识别微弱的荧光强度，因此原则上可以用很少的细胞进行正确的诊断，这就在一定程度上缩短了诊断时间。然而，因荧光标记物缺乏特异性，直接使用荧光标记物检测眼部感染的方法受到了很大的限制，这是由于传统荧光标记与众多眼科致病微生物的亲和力和其与健康眼之细胞和组织的亲和力非常相似，使得用荧光标记对相应病原体进行区分出现了困难。

[0005] 本发明目的在于使用一种简单且经济的方法来提高荧光标记物对感染机体的亲和力。这种新方法是通过将荧光标记物附着在一类具有相对简单分子结构的化合物上来实现的，这些化合物对病原体表现出远高于它对健康眼细胞的亲和力。这些化合物在本发明中用于将荧光标记选择性导入病原体，它们属于烷基磷脂类，其中包括例如米替福新(MT)、依地福新(ET)和伊莫福新(IM)(Croft，S.L；Engel，J.，Miltefosine-discovery ofthe antileishmanial activity of phospholipid derivatives.Trans R Soc TropMed Hyg2006，100 Suppl 1，S4-8)。

[0006] 米替福新(MT)现用于乳腺癌皮肤转移瘤的治疗，在市场上以商品名MILTEX销售。此外因MT表现出很强的抗寄生虫活性，在哥伦比亚、印度和德国其以商品名IMPAVIDO(Zentaris股份有限公司)而被应用于人利什曼病的治疗(Soto，J.；Soto，P.，Miltefosine：oral treatment ofleishmaniasis.Expert Rev Anti Infect Ther 2006，4，(2)，177-85)。最近MT开始被用于犬利什曼病的治疗，商品名为MILTEFORAN(Virbac)。
此外，已经发现MT对其他原生动物也有细胞毒活性，如毛滴虫(Trichomonas)(Blaha，C；Duchene，M.；Aspock，H.；Walochnik，J.，Invitro activity of hexadecylphosphocholine(miltefosine)againstmetronidazole-resistant and-susceptible strains of Trichomonas vaginalis.J Antimicrob Chemother 2006，57，(2)，273-8)、溶 组织性内阿米巴(Entamoeba histolytica)(Seifert，K.；Duchene，M.；Wernsdorfer，W.H.；
Kollaritsch，H.；Scheiner，O.；Wiedermann，G.；Hottkowitz，T.；Eibl，H.，Effects of miltefosine and other alkylphosphocholines on human intestinalparasite Entamoeba histolytica.Antimicrob Agents Chemother 2001，45，(5)，1505-10)、自由生活的阿米巴原虫(如棘阿米巴(Acanthamoeba sp.)或纳氏虫(Naegleria sp.))(Schuster，F.L；Guglielmo，B.J.；Visvesvara，G.S.，In-vitro activity of miltefosine and voriconazole on clinical isolates offree-living amebas：
Balamuthia mandrillaris，Acanthamoeba spp.，andNaegleria fowleri.J Eukaryot Microbiol 2006，53，(2)，121-6；Walochnik，J.；Duchene，M.；Seifert，K.；Obwaller，A.；Hottkowitz，T.；Wiedermann，G.；Eibl，H.；Aspock，H.，Cytotoxic activities of alkylphosphocholines againstclinical isolates of Acanthamoeba spp.Antimicrob Agents Chemother 2002，46，(3)，695-701)，对人类以及其他人类病原体有致病作用，包括真菌、酵母菌(Obando，D.；Widmer，F.；Wright，L.C；Sorrell，T.C；Jolliffe，K.A.，Synthesis，antifungal and antimicrobial activity of alkylphospholipids.Bioorg Med Chem 2007，15，(15)，5158-65；Widmer，F.；Wright，L.C；Obando，D.；Handke，R.；
Ganendren，R.；Ellis，D.H.；Sorrell，T.C.，Hexadecylphosphocholine(miltefosine)has broad-spectrum fungicidalactivity and is efficacious in a mouse model of cryptococcosis.AntimicrobAgents Chemother 2006，50，(2)，414-21)和肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)(Llull，D.，Rivas，L.，Garcia，E.In vitro bactericidal activityof the antiprotozoal drug miltefosine against Streptococcus pneumoniaeand other pathogenic streptococci.Antimicrob Agents Chemother.2007，
51，(5)：1844-8)。

[0007] 对于MT在上述生物体内发挥其细胞毒作用的详细作用机制，我们还知之甚少。针对一些特定寄生虫的最新研究表明，这种构造可能是多靶标类型的，因为MT在上述寄生虫的细胞内浓度很高，在利什曼虫中达到了毫摩尔/升范围的值(Luque-Ortega，J.R.；Rivas，L.，Miltefosine(hexadecylphosphocholine)inhibits cytochrome c oxidase in Leishmaniadonovani promastigotes.Antimicrob Agents Chemother 2007，51，(4)，1327-32；Saugar，J.M.；Delgado，J.；Hornillos，V.；Luque-Ortega，J.R.；
Amat-Guerri，F.； A.U.；Rivas，L.，Synthesis and BiologicalEvaluation of Fluorescent Leishmanicidal Analogues ofHexadecylphosphocholine(Miltefosine)as Probes of AntiparasiteMechanisms.J Med Chem 2007，50，(24)，5994-6003)。 这一假设还得到了利什曼原虫中出现MT耐药菌株现象的支持，因为只有在药物特异性转运到寄生虫体内存在功能缺陷时才会产生上述耐药菌株(Seifert，K.；Perez-Victoria，F.J.；Stettler，M.；Sanchez-Canete，M.P.；Castanys，S.；Gamarro，F.；Croft，S.L，Inactivation of the miltefosine transporter，LdMT，causes miltefosine resistance that is conferred to the amastigotestage of Leishmania donovani and persists in vivo.Int J Antimicrob Agents2007，30，(3)，229-35；Perez-Victoria，F.J.；
Sanchez-Canete，M.P.；Seifert，K.；Croft，S.L；Sundar，S.；Castanys，S.；Gamarro，F.，Mechanisms ofexperimental resistance of Leishmania to miltefosine：Implications forclinical use.Drug Resist Updat 2006，9，(1-2)，26-39；Perez-Victoria，F.J.；
Sanchez-Canete，M.P.；Castanys，S.；Gamarro，F.，Phospholipidtranslocation and miltefosine potency require both L.donovanimiltefosine transporter and the new protein LdRos3 in Leishmaniaparasites.J Biol Chem 2006，281，(33)，
23766-75；Perez-Victoria，F.J.；Gamarro，F.；Ouellette，M.；Castanys，S.，Functional cloning of themiltefosine transporter.A novel P-type phospholipid translocase fromLeishmania involved in drug resistance.J Biol Chem 2003，278，(50)，
49965-71)。这些特异性运载蛋白属于氨基磷脂类转位酶家族，但是这种转运蛋白的准确鉴定仅仅在以下生物中实现：杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)(鉴定为LdMT3)(Perez-Victoria，F.J.；Gamarro，F.；Ouellette，M.；Castanys，S.，Functional cloning of the miltefosinetransporter.A novel P-type phospholipid translocase from Leishmaniainvolved in drugresistance.J Biol Chem 2003，278，(50)，49965-71) 以及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(鉴定为Lem3)(Hanson，P.K.；Malone，L.；
Birchmore，J.L.；Nichols，J.W.，Lem3p is essential for the uptake andpotency of alkylphosphocholine drugs，edelfosine and miltefosine.J BiolChem 2003，278，(38)，36041-50)。在利什曼原虫中转运蛋白突变解释了利什曼虫中米替福新和依地福新抗药性的出现，并随之产生对放射性米替福新导入寄生虫中的抑制；此外在丧失Lem3功能的酿酒酵母菌中出现了对导入荧光磷脂NBD-PC的抑制，这与依地福新抗药性表型有关，是由于药物导入缺陷造成的，尽管这种作用尚未经实验测试(Hanson，P.K.；Malone，L；
Birchmore，J.L；Nichols，J.W.，Lem3p is essential for theuptake and potency of alkylphosphocholine drugs，edelfosine andmiltefosine.J Biol Chem 2003，278，(38)，
36041-50)。

[0008] 从与本发明相关的前期研究得出的结论可以总结如下：i)MT和其他类似的烷基磷脂可选择性进入低等真核生物和转化细胞中；ii)这些药物的致死作用与大量药物进入细胞内有关；iii)MT抗药性机制已经在多种类型寄生虫中鉴定，这是由于药物在这些寄生虫体内积累的缺陷而造成的。

[0009] 近期印度和尼泊尔开始在内脏感染利什曼病的患者身上大量使用MT，尤其是针对那些已对含锑药物治疗产生耐药性的患者(Sundar，S.；Chatterjee，M.，Visceral leishmaniasis-current therapeutic modalities.Indian J Med Res 2006，123，(3)，345-52)；一些南美洲国家将该方案应用于犬利什曼病的治疗(Soto，J.；Soto，P.，Miltefosine：oral treatment ofleishmaniasis.Expert Rev Anti Infect Ther 2006，4，(2)，177-85)。由于医院在这种治疗上很难正确控制药量，可以预计将很快出现对MT产生耐药性的寄生虫。动物模型实验表明，耐药性寄生虫(由于MT转运蛋白缺陷)与对药物敏感的寄生虫有相同的毒力(Seifert，K.；Perez-Victoria，F.J.；Stettler，M.；
Sanchez-Canete，M.P.；Castanys，S.；Gamarro，F.；Croft，S.L.，Inactivation of the miltefosine transporter，LdMT，causes miltefosineresistance that is conferred to the amastigote stage of Leishmaniadonovani and persists in vivo.Int J Antimicrob Agents 2007，30，(3)，229-35)。因此，获得快速可控的试剂和方法(正如本发明中提出的)能对耐药性菌株的出现做到早期检测和应对。

[0010] 另一方面，目前针对眼睛中棘阿米巴原虫(Acanthamoeba)(在有不良卫生习惯的隐形眼镜使用者中有特别高发病率的阿米巴感染)的早期诊断，是在先排除了疱疹和真菌感染的可能性之后进行的，上述诊断过程的延误随后有时可能对视力造成不可逆转的损伤(Hammersmith，K.M.，Diagnosis and management of Acanthamoeba keratitis.Curr OpinOphthalmol 2006，17，(4)，327-31)。

[0011] 基于同样的原理，还可将本发明所述化合物应用到对隐形眼镜护理液、清洗液以及移植角膜之保存介质的质量检测上。最近，由于隐形眼镜护理液被镰刀菌污染造成的事故给一大批患者造成了严重后果，并使生产商蒙受了巨大经济损失(Chang，D.C；Grant，G.B.；O′Donnell，K.；Wannemuehler，K.A.；Noble-Wang，J.；Rao，C.Y.；Jacobson，L.M.；Crowell，C.S.；Sneed，R.S.；Lewis，F.M.；Schaffzin，J.K.；Kainer，M.A.；Genese，C.A.；
Alfonso，E.C；Jones，D.B.；Srinivasan，A.；Fridkin，S.K.；Park，B.J.，Multistate outbreak of Fusarium keratitis associated with useof a contact lens solution.JAMA 2006，296，(8)，953-63；Centers forDisease Control and Prevention(CDC)，Update：Fusariumkeratitis-United States，2005-2006.MMWR Morb Mortal Wkly Rep
2006，55，(20)，563-4)。

[0012] 自由生活的原生动物群体组成了可用来检测水质和环境污染的生物(Martin-Cereceda，M.；Perez-Uz，B.；Serrano，S.；Guinea，A.，Dynamicsof protozoan and metazoan communities in a full scale wastewatertreatmentplant by rotating biological contactors.Microbiol Res 2001，156，(3)，225-38)，因此，可利用本发明的化合物，通过荧光类似物的积累和导入，从而对这些生物进行检测和显示。

[0013] 先前的一些研究中已经合成和使用过烷基磷脂的荧光类似物：

[0014] 1.-先前已制备相似化合物(依地福新)的类似物，其用苯基四烯(feniltetraeno)基团进行标记，并注意到该标记基本上不改变药物的生物活性(Quesada，E.；Delgado，J.；Gajate，C；Mollinedo，F.； A.U.；Amat-Guerri，F.，Fluorescent phenylpolyene analogues of the etherphospholipid edelfosine for the selective labeling of cancer cells.J MedChem 2004，47，(22)，5333-5)。

[0015] 2.-已经制备了用诸如苯基四烯或苯基三烯炔(feniltrienino)基团进行标记的MT类似物，其保持了原药的抗寄生虫活性，并且还能特异性进入对药物敏感的利什曼原虫寄生虫株中，但不能进入有耐药性的寄生虫株中(Saugar，J.M.；Delgado，J.；Hornillos，V.；Luque-Ortega，J.R.；Amat-Guerri，F.； A.U.；Rivas，L，Synthesis and BiologicalEvaluation of Fluorescent Leishmanicidal Analogues ofHexadecylphosphocholine(Miltefosine)as Probes of AntiparasiteMechanisms.J Med Chem 2007，50，(24)，5994-6003)。

[0016] 3.-已将戊烷脒DB-99的荧光类似物用于非洲锥虫病中对含砷药物治疗有耐药性之生物的早期检测中(Stewart，M.L；Krishna，S.；Burchmore，R.J.；Brun，R.；de Koning，H.P.；Boykin，D.W.；Tidwell，R.R.；Hall，J.E.；Barrett，M.P.，Detection of arsenical drug resistance inTrypanosoma brucei with a simple fluorescence test.Lancet2005，366，(9484)，486-7)。在布氏锥虫中(引起上述感染的微生物)，戊烷脒和DB99通过与含砷药物相同的转运蛋白进入到寄生虫体内。因此，这种转运蛋白的缺失和功能障碍会抑制戊烷脒和DB-99的内化，因此也抑制其荧光标记物的内化，并且出现了含砷药物耐药性的表型。

发明内容

[0017] 发明简述

[0018] 本发明的一个方面涉及用于区分性鉴定微生物的荧光化合物(后面将其称为本发明的化合物)，它包括烷基磷脂类似物和具有高度光稳定性并发射可见光谱区波长之光的荧光基团。

[0019] 本发明中所用的术语“烷基磷脂类似物”是指通过合成获得的一种化合物，其结构与烷基磷脂的结构相似。如本发明所用，术语“烷基磷脂”是指结构中包含与亲水性部分相缀合之亲脂性部分的化合物，其中所述亲脂性部分由碳和氢原子之线状或环状组合构成(烷基部分)，所述亲水性部分由酯化或游离的磷酸基构成(磷脂)。例如但不限制本发明的范围，所述烷基磷脂包括：十六烷基磷酸胆碱(米替福新，MT)，1-O-十八烷基-2-O-甲基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(依地福新，EF)和1-S-十六烷基-2-甲氧基甲基-消旋-甘油-3-磷酸胆碱(伊莫福新，IM)。烷基磷脂类似物的实例是示例性的，不限制本发明的范围，全-(E)-13-苯基十三烷-6，8，10，12-四烯基磷酸胆碱和全-(E)-13-苯基十三烷-8，10，12-三烯-6-炔基磷酸胆碱。

[0020] 本发明中所用的术语“微生物”是指任何的原生动物、阿米巴原虫、真菌、酵母和细菌，例如但不限制本发明的范围，其属于下组：利什曼原虫(Leishmania sp)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、毛滴虫(Trichomonas sp.)、溶组织性内阿米巴(Entamoeba histolytica)、棘阿米巴(Acanthamoeba sp.)、纳氏虫(Naegleria sp.)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、镰刀菌(Fusarium sp.)、梨形四膜虫(Tetrahymena pyriformis)和Balamuthia原虫。

[0021] 本发明中所用的术语“荧光基团”，是指发射可见光谱区波长之光并具有高度光稳定性的荧光基团，例如但不限制本发明的范围，其中包括：硼二吡咯亚甲基类(borodipirrometenos)、呫吨类(xantenos)、罗丹明类、花青类(cianinas)、沙星类(oxacinas)、卟啉类、香豆素类和多环烃类(hidrocarburos policiclicos)，它们可以具有或不具有取代基。

[0022] 本发明的一个更具体方面涉及本发明的化合物，其中所述烷基磷脂类似物是米替福新(MT)、依地福新(EF)或伊莫福新(IM)。

[0023] 本发明的一个更具体方面涉及本发明的化合物，其中所述烷基磷脂类似物是米替福新(MT)、依地福新(EF)或伊莫福新(IM)的类似物。

[0024] 本发明的一个具体方面涉及本发明的化合物，其中所述荧光基团是取代或未取代的硼二吡咯亚甲基类(BDP)。

[0025] 本发明的一个具体方面涉及本发明的化合物，其中所述烷基磷脂衍生物是米替福新，并且所述荧光基团是取代或未取代的BDP。

[0026] 本发明的一个更具体方面涉及本发明的化合物，其是BDP-MT或Et-BDP-MT。

[0027] 本发明的一个具体方面涉及获得本发明化合物的方法，其包括以下步骤：

[0028] i)由二乙酰基醇(dicetoalcohol)和乙酰乙酸乙酯获得相应的取代α-H-吡咯，[0029] ii)使所述α-H-吡咯与适当的α-甲酰吡咯缩合，

[0030] iii)使由此形成的二吡咯亚甲基化合物与三氟化硼乙醚反应，

[0031] iv)引入磷酸胆碱基团。

[0032] 本发明的另一个具体方面涉及本发明化合物在制备用于微生物鉴定方法的药物组合物的用途。

[0033] 本发明的另一个具体方面涉及诊断性药物组合物(以下称为本发明的诊断性药物组合物)，其包含本发明的化合物，例如化合物BDP-MT或Et-BDP-MT。

[0034] 最后，本发明的一个具体方面是本发明的诊断性药物组合物的用途，其中本发明的药物组合物用于微生物鉴定方法中。

[0035] 本发明的另一个更具体方面涉及本发明的诊断性药物组合物用于生物样品的体外诊断方法中的用途，其中所述生物样品来自带有传染性疾病的人或兽医学个体，例如但不限制本发明的范围，所述传染性疾病属于下组：角膜炎、利什曼病、非洲和美洲锥虫病、肺炎链球菌肺炎、阿米巴病、滴虫病和霉菌病。

[0036] 本发明的另一个更具体的实施方案涉及本发明药物组合物的用途，其中所述传染性疾病是由微生物引起，例如但不限制本发明的范围，所述微生物属于下组：利什曼原虫(Leishmania sp)、布氏锥虫(Trypanosomabrucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、毛滴虫(Trichomonas sp.)、溶组织性内阿米巴(Entamoeba histolytica)、棘阿米巴(Acanthamoeba sp.)、纳氏虫(Naegleria sp.)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、镰刀 菌(Fusarium sp.)、梨形 四膜虫(Tetrahymena pyriformis) 和Balamuthia原虫。

[0037] 本发明的另一个更具体实施方案涉及本发明诊断性药物组合物的用途，其用于源自眼睛的生物样品的诊断方法中，例如所述样品由角膜刮削获得。

[0038] 本发明的另一个更具体实施方案涉及本发明诊断性药物组合物的用途，其用于鉴定既非人也非动物之样品中微生物的方法中，例如在水、人工眼睛、隐形眼镜、隐形眼镜护理液或角膜保存介质中。

[0039] 发明详述

[0040] 本发明的基础在于，发明人已经发现，生物活性的烷基磷脂类似物(例如化合物BDP-MT或Et-BDP-MT)在其结构中含有发射可见光谱区波长为400-700nm之光的高度光稳定性的荧光基团(Slavik，J.，FluorescentProbes in Cellular and Molecular Biology1ed.；CRC Press：Boca Ratón，FL，2004；p 320)，它们很容易被导入微生物中，并且这种导入可通过常规荧光显微镜来检测。因此，图像诊断专家可以很容易地识别出是否存在能够导入上述化合物的微生物，如真菌、原生动物、甚至一些细菌如肺炎链球菌等。同时，一旦鉴定其物种，所述专家就能够推断出对烷基磷脂治疗的潜在耐药性，这种耐药性与化合物导入缺陷以及对烷基磷脂细胞毒性之抗性的表型有直接关系。

[0041] 因此可以将荧光类似物加入到怀疑有微生物存在的培养基或组织中，以检测是否存在微生物。例如，将含有所述化合物的药物组合物直接施加到角膜上。如果确实如此，所述荧光类似物会迅速标记出这些微生物，以便用常规显微镜观察对微生物进行视觉鉴定。此外，如果所述生物含有原始药物MT的特异性转运蛋白，将会在微生物内观察到迅速出现荧光。相反，如果所述生物对MT有耐药性，在相同条件下则不能在寄生虫体内观察到荧光的出现。用这种方式即能获得可迅速简单地诊断这些微生物是否存在和/或是否存在对原药MT之耐药性的方法。

[0042] 更具体来说，例如作为本发明的具体实例，已经合成并生物学测试了一系列的MT荧光类似物，其特征在于其将硼二吡咯亚甲基荧光基团(BDP)引入了所述化合物的脂肪链中(见实施例)。当将上述类似物添加到存在棘阿米巴营养体和真菌菌丝的生理介质中时，所述类似物将会迅速被导入上述两种微生物体内，使其恰当显现，以便随后根据其形态特征进行有效的个体鉴定。该方法将有助于对眼中微生物进行区分性诊断，因为有可能将所述化合物以滴眼液形式施加到眼睛以直接进行观察。此外，上述方法还可用于诊断生物组织或生理液样品(如角膜碎屑)中是否存在微生物，或者用于检验移植角膜保存液体或隐形眼镜清洁护理液。

[0043] 下面提到的是这些化合物的可能应用，基于迄今为止已经实施并在现有技术中总结的研究：

[0044] 1.-快速可靠地诊断视觉疾病，如由真菌或阿米巴(棘阿米巴)感染引起的角膜炎。

[0045] 2.-快速可靠地诊断人工眼睛(隐形眼镜等)、隐形眼镜护理液或角膜保存介质是否被污染(首先要检测上述介质中是否存在病原微生物)。

[0046] 3.-快速诊断患者或动物(狗)是否感染了抗寄生虫药米替福新的耐药性利什曼菌株，检测来自上述病患的生理液体(包括外周血)、组织活检和样品中是否存在有耐药性的寄生虫。

[0047] 4.-快速诊断环境卫生程度，对与环境相关的水体系中的自由生活原生动物进行鉴定。

[0048] 5.-基于这些荧光类似物在不同器官和实验动物组织中的区分性鉴定，使用生物成像技术，在细胞研究和动物实验中，对米替福新以及类似烷基磷脂的药理学和生物学性质，进行宏观和分子水平的研究。

[0049] 因此，本发明的一个方面涉及用于区分性鉴定微生物的荧光化合物(随后将称为本发明的化合物)，它包括烷基磷脂类似物物和具有高度光稳定性并发射可见光谱波长区之光的荧光基团。

[0050] 本发明中所用的术语“烷基磷脂类似物”是指通过合成获得的一种化合物，其结构与烷基磷脂的结构相似。如本发明所用，术语“烷基磷脂”是指结构中包含与亲水性部分相缀合之亲脂性部分的化合物，其中所述亲脂性部分由碳和氢原子之线状或环状组合构成(烷基部分)，所述亲水性部分由酯化或游离的磷酸基构成(磷脂)。例如但不限制本发明的范围，所述烷基磷脂包括：十六烷基磷酸胆碱(米替福新，MT)，1-O-十八烷基-2-O-甲基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(依地福新，EF)和1-S-十六烷基-2-甲氧基甲基-消旋-甘油-3-磷酸胆碱(伊莫福新，IM)。烷基磷脂类似物的实例是示例性的，不限制本发明的范围，全-(E)-13-苯基十三烷-6，8，10，12-四烯基磷酸胆碱和全-(E)-13-苯基十三烷-8，10，12-三烯-6-炔基磷酸胆碱。

[0051] 本发明中所用的术语“微生物”是指任何的原生动物、阿米巴原虫、真菌、酵母和细菌，例如但不限制本发明的范围，其属于下组：利什曼原虫(Leishmania sp)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、毛滴虫(Trichomonas sp.)、溶组织性内阿米巴(Entamoeba histolytica)、棘阿米巴(Acanthamoeba sp.)、纳氏虫(Naegleria sp.)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、镰刀菌(Fusarium sp.)、梨形四膜虫(Tetrahymena pyriformis)和Balamuthia原虫。

[0052] 本发明中所用的术语“荧光基团”，是指发射可见光谱区波长之光并具有高度光稳定性的荧光基团，例如但不限制本发明的范围，其中包括：硼二吡咯亚甲基类(borodipirrometenos)、呫吨类(xantenos)、罗丹明类、花青类(cianinas)、沙星类(oxacinas)、卟啉类、香豆素类和多环烃类(hidrocarburos policiclicos)，它们可以具有或不具有取代基。

[0053] 本发明的一个更具体方面涉及本发明的化合物，其中所述烷基磷脂类似物是米替福新(MT)、依地福新(EF)或伊莫福新(IM)。

[0054] 本发明的一个更具体方面涉及本发明的化合物，其中所述烷基磷脂类似物是米替福新(MT)、依地福新(EF)或伊莫福新(IM)的类似物。

[0055] 本发明的一个具体方面涉及本发明的化合物，其中所述荧光基团是取代或未取代的硼二吡咯亚甲基类(BDP)。

[0056] 本发明的一个具体方面涉及本发明的化合物，其中所述烷基磷脂衍生物是米替福新，并且所述荧光基团是取代或未取代的BDP。

[0057] 本发明的一个更具体方面涉及本发明的化合物，其是BDP-MT或Et-BDP-MT。

[0058] 本发明的一个具体方面涉及获得本发明化合物的方法，其包括以下步骤：

[0059] i)由二乙酰基醇和乙酰乙酸乙酯获得相应的取代α-H-吡咯，

[0060] ii)使所述α-H-吡咯与适当的α-甲酰吡咯缩合，

[0061] iii)使由此形成的二吡咯亚甲基化合物与三氟化硼乙醚反应，

[0062] iv)引入磷酸胆碱基团。

[0063] 本发明的另一个具体方面涉及本发明化合物在制备用于微生物鉴定方法的药物组合物的用途。

[0064] 本发明的另一个具体方面涉及诊断性药物组合物(以下称为本发明的诊断性药物组合物)，其包含本发明的化合物，例如化合物BDP-MT或Et-BDP-MT。

[0065] 最后，本发明的一个具体方面是本发明的诊断性药物组合物的用途，其中本发明的药物组合物用于微生物鉴定方法中。

[0066] 本发明的另一个更具体方面涉及本发明的诊断性药物组合物用于生物样品的体外诊断方法中的用途，其中所述生物样品来自带有传染性疾病的人或兽医学个体，例如但不限制本发明的范围，所述传染性疾病属于下组：角膜炎、利什曼病、非洲和美洲锥虫病、肺炎链球菌肺炎、阿米巴病、滴虫病和霉菌病。

[0067] 本发明的另一个更具体的实施方案涉及本发明药物组合物的用途，其中所述传染性疾病是由微生物引起，例如但不限制本发明的范围，所述微生物属于下组：利什曼原虫(Leishmania sp)、布氏锥虫(Trypanosomabrucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、毛滴虫(Trichomonas sp.)、溶组织性内阿米巴(Entamoeba histolytica)、棘阿米巴(Acanthamoeba sp.)、纳氏虫(Naegleria sp.)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、镰刀 菌(Fusarium sp.)、梨形 四膜虫(Tetrahymena pyriformis) 和Balamuthia原虫。

[0068] 本发明的另一个更具体实施方案涉及本发明诊断性药物组合物的用途，其用于源自眼睛的生物样品的诊断方法中，例如所述样品由角膜刮削获得。

[0069] 本发明的另一个更具体实施方案涉及本发明诊断性药物组合物的用途，其用于鉴定既非人也非动物之样品中微生物的方法中，例如在水、人工眼睛、隐形眼镜、隐形眼镜护理液或角膜保存介质中。

附图说明

[0070] 图1.-通过中间体1至5，合成荧光类似物BDP-MT和Et-BDP-MT。

[0071] 图2.-杜氏利什曼原虫前鞭毛体中米替福新耐药性的差异性检测(MHOM/ET/67/L82菌株)。MT敏感型(WT)(上行)或耐药性(R40)(底行)杜氏利什曼原虫前鞭毛体在26℃下与7.5μM BDP-MT一起孵育2小时，用牛血清蛋白(BSA)将其清洗三次，然后用激发波长为488nm、检测波长范围为502-555nm的共聚焦显微镜进行观察。

[0072] 图3.-用BDP-MT对两种不同形式的卡氏棘阿米巴(Acanthamoebacastellanii)进行差异性染色。卡氏棘阿米巴的包囊(a)和营养体(b)在32℃下与5μM BDP-MT一起孵育15分钟，用BSA溶液(10mg/ml)进行清洗，然后用激发波长为488nm、检测波长范围为502-555nm的共聚焦显微镜进行观察。

[0073] 图4.-用BDP-MT对镰刀菌和两种形式之卡氏棘阿米巴同时进行差异性染色。卡氏棘阿米巴的营养体(a)和包囊(b)、连同镰刀菌的菌丝(c)与5μMBDP-MT一起孵育15分钟，随后用BSA溶液进行清洗，然后用激发波长为488nm、检测波长范围为502-555nm的共聚焦显微镜进行观察。

[0074] 图5.-用ET-BDP-MT对镰刀菌和两种形式之卡氏棘阿米巴同时进行差异性染色。卡氏棘阿米巴的营养体(a)和包囊(b)、连同镰刀菌的菌丝(c)与5μMEt-BDP-MT在30℃下一起孵育15分钟，随后用BSA进行清洗，然后用带有CCD相机和480-520nm发射波长滤光片的荧光显微镜观察荧光。

[0075] 图6.-用BDP-MT对梨形四膜虫(作为自由活动的原生动物)染色。梨形四膜虫与5μM BDP-MT一起孵育4小时，然后用2％多聚甲醛清洗并固定，以避免其在成像过程中移动。最后用激发波长为488nm、发射检测范围为502-555nm的共聚焦显微镜观察梨形四膜虫的细胞。

[0076] 实施例

[0077] 实施例1.结构中添加可见光区荧光基团的两种米替福新类似物的制备：BDP-MT和Et-BDP-MT。

[0078] 从相应的吡咯开始，通过相似的两步法方法，获得这两种相似的包含硼二吡咯亚甲基类(BDP)生色团的荧光类似物(图1)。从而，在三氯氧磷存在下，使得α-H-吡咯3与2-甲酰-3，5-二甲基-1H-吡咯缩合或者与2-甲酰-3，5-二甲基-4-乙基-1H-吡咯缩合(MacDonald反应)。在三乙胺存在下，通过与三氟化硼乙醚反应，所形成的相应吡咯亚甲基在原位转化为各自相应取代的BDP染料4和5。在最后的合成步骤中，在三甲基胺存在下通过与2-氯-1，3，2-二氧磷杂环戊烷-2-氧化物反应从而引入磷酸胆碱基团。如下获得前体化合物：在碳酸钾和冠醚18-冠-6存在下，使得乙酰丙酮与11-溴-1-十一烷醇在丙酮中通过单烷基取代作用来获得所述二乙酰基醇；乙氧羰基吡咯2由以下两步形成：1)乙酰乙酸乙酯用亚硝酸酸钠处理，2)在1存在下，所得的羟亚胺化合物用锌/乙酸还原(Johnson-Knorr合成)。通过用水/乙醇中氢氧化钠处理使得2脱羧基从而获得所述α-H-吡咯3。2-甲酰-3，5-二甲基-1H-吡咯是一种商业产品，而对应的2-甲酰-4-乙基-3，5-二甲基-1H-吡咯是在二甲基甲酰胺中通过用三氯氧磷使2，5-二甲基-3-乙基-1H-吡咯(kriptopirrol)甲酰化而获得的。

[0079] 实施例2.通过引入BDP-MT荧光类似物来诊断是否存在对米替福新药物敏感或有耐药性的利什曼寄生虫。

[0080] 杜氏利什曼原虫前鞭毛体的MHOM/ET/67/L82菌株和米替福新耐药菌株由Simon Croft教授(伦敦热带卫生与医学院，伦敦，英国)提供，并按照常用方法培养：在26℃下在添加10％灭活胎牛血清、庆大霉素、青霉素和2mM谷氨酰胺的RPMI培养基中培养。除了在培养基中添加40μM MT以外，MT耐药菌株与对MT敏感的亲本菌株生长条件相同。在静止状态下收集以上两种寄生虫，用不含酚红的RPMI 1640培养基清洗，并在加入7.5μM BDP-MT6
后，在26℃下在上述培养基中孵育2小时到2×10 寄生虫/mL的密度。接下来在不含脂肪酸的10mg/mL BSA存在下用所述培养基清洗三次，最后用激发波长为488nm、发射波长检测范围为502-555nm的Leica TCS-SP2-AOBS-UV共聚焦显微镜进行活体检测。

[0081] 从图2中可以观察到：对药物敏感的寄生虫菌株出现强烈的细胞内荧光，然而在耐药寄生虫菌株中由于掺入标记类似物BDP-MT较差，其细胞内荧光强度较弱。

[0082] 实施例3.通过BDP-MT区分性诊断眼部寄生虫

[0083] 3.1.卡氏棘阿米巴的包囊和营养体

[0084] 卡氏棘阿米巴的包囊和营养体是由的Carmen del 博士(马德里SanPablo CEU大学)提供的。营养体在27℃下在含5％胎牛血清的CDC培养基中生长，然后用不含胎牛血清的上述培养基清洗，并在相同培养基中在32℃的温度下将营养体与5μM
5
BDP-MT一起孵育15分钟，至7×10 个营养体的密度。孵育之后，用含有10mg/mL BSA的上述培养基来清洗营养体，然后用激发波长为488nm、发射检测范围为502-555nm的Leica TCS-SP2-AOBS-UV共聚焦显微镜进行活体观察。

[0085] 由图3可见：卡氏棘阿米巴的营养体(寄生虫的代谢活性形式)由于掺入了高量的BDP-MT而显示出了强烈的细胞内荧光标记。而在该图的包囊中，荧光染色都集中在表面上。由于上述实验是用自由活动的微生物进行的，因营养体的移动，其在透射图像和荧光图像中的位置会有细微的差别。

[0086] 3.2.卡氏棘阿米巴包囊和营养体以及镰刀菌菌丝同时用荧光标记。

[0087] 真菌镰刀菌的菌丝维持在含Saboroud培养基的琼脂糖中。在32℃下在含有抗生素且无胎牛血清的RPMI 1640培养基中进行细胞扩增。清洗之后，在BDP-MT 5μM存在下，在不含酚红的相同培养基中在32℃温度下重悬菌丝15分钟。然后用BSA清洗三次，使用激发波长为488nm、发射检测范围为502-555nm的Leica TCS-SP2-AOBS-UV共聚焦显微镜进行活体观察。掺入BDP-MT之后，菌丝、营养体和包囊所有三种的荧光图像观察到与之前发生很大区别，菌丝形态明显被拉长，而体积相对较小的卡氏棘阿米巴营养体呈现出不规则的形状；上述两种情况下都观察到荧光类似物掺入到细胞中，而在卡氏棘阿米巴的包囊(基本上呈球状)中仅在其表面观察到荧光标记，这与与之前实施例中描述的情形相同。

[0088] 实施例4.通过荧光类似物Et-BDP-MT诊断病原微生物的存在。

[0089] 以上所提到的使用BDP-MT化合物的病原体荧光标记技术同样可以应用于其他类似物，其中通过改变这些类似物中荧光基团的结构，使激发和发射波长出现在可见光谱中其他不同区域。为了进一步说明这种扩展，本实施例中使用类似物Et-BDP-MT。与类似物BDP-MT相比，该类似物中的激发和发射波长都发生了红移。图5中的三幅图像包含了用Et-BDP-MT染色后的代表性微生物实例，分别显示了卡氏棘阿米巴营养体(A)、卡氏棘阿米巴包囊(B)和镰刀菌菌丝(C)。将上述三种微生物在5μM Et-BDP-MT类似物存在下孵育30分钟进行标记。随后使用含BSA 10mg/mL的培养基进行清洗，最后用与Zeiss荧光显微镜上(带有480-520nm发射光滤光器)偶联的Leica DFC350FX CCD数码相机拍照。

[0090] 在上述三种微生物中均观测到了与BDP-MT所得图像类似的荧光图样；卡氏棘阿米巴的营养体细胞内有荧光标记，相同微生物的包囊表面有荧光标记，镰刀菌菌丝也已被标记，这表明BDP-MT获得的数据也可较容易地扩展应用到其它结构类似的化合物中。

[0091] 实施例5.用BDP-MT对自由活动的四膜虫进行荧光标记。

[0092] 原生动物梨形四膜虫的细胞在蛋白酶蛋白胨葡萄糖培养基(ProteasaPeptona4
Glucosa Médium)中扩增，通过离心收集细胞(密度为10 个细胞/mL)。随后与BDP-MT 5μM一起孵育4小时，再用2％多聚甲醛清洗并固定30分钟，最后用激发波长为488nm、发射检测范围为502-555nm的Leica TCS-SP2-AOBS-UV共聚焦显微镜进行观测。

[0093] 从图6中可以观察到，微生物中掺入了大量的荧光化合物，这样就能够进行鉴定和定位，甚至在细胞浓度较低的地方也能如此。