基于同源重组DNA的克隆方法及组合物

摘要

本发明涉及将供体DNA分子在预定位置克隆至受体载体内的方法和组合物。这些方法基于供体DNA、受体载体以及含有外切酶和单链DNA结合蛋白的酶合剂的体外治疗介导的同源重组。

权利要求

1.一种将供体DNA分子克隆至受体载体预定位置的方法，该方法包含以下步骤：a)通过将第一序列和第二序列分别添加至供体DNA分子的5′端和3′端来制备扩展供体DNA分子，其中，第一序列和第二序列中的任一者独立地至少具12个核苷酸长，且分别与受体载体的第一区域与第二区域完全一致；

b)提供包含以下物质的反应混合物

i)受体载体，

ii)扩展供体DNA分子，及

iii)包含外切酶和单链DNA结合蛋白的酶合剂；

iv）反应混合物进一步包含1至10mg/l三(羟甲基)氨基甲烷、1至10mg/l的NaCl、

0.1至10mg/l对乙二胺四乙酸、0.1至10mg/l氯化镁、10至200g/l的甘油、10至50mg/l的牛血清白蛋白、0.1至10mg/l腺苷-5′-三磷酸、0.1至10g/l二硫苏糖醇，且其中反应混合物的pH为5.0至9.0；

c)反应混合物经培养获得中间产物；

d)利用中间产物进行细胞转化，获得转化细胞；及

e)在一定条件下培养该转化细胞，得到包含位于第一区域与第二区域之间的供体DNA的重组DNA分子。

2.根据权利要求项1所述的方法，其中该受体载体为环形载体或线性载体。

3.根据权利要求项2所述的方法，其中该第一区域与该第二区域分别位于线性载体的

3′端和5′端。

4.根据权利要求项1所述的方法，其中利用包含第一序列的第一PCR引物和包含第二序列互补序列的第二PCR引物，通过聚合物酶链反应制备扩展供体DNA分子。

5.根据权利要求项1所述的方法，其中外切酶选自由以下各物组成的群组：大肠杆菌核酸外切酶I、大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ、大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ、噬菌体λ核酸外切酶、噬菌体T7-核酸外切酶基因及其组合物。

6.根据权利要求项1所述的方法，其中单链DNA结合蛋白选自由以下各物组成的群组：极端耐热单链DNA结合蛋白、RecA、T4基因32单链结合蛋白及大肠杆菌单链DNA结合蛋白及其组合物。

7.根据权利要求项6所述的方法，其中酶合剂包含由以下酶组合物组成的群组：大肠杆菌核酸外切酶I与RecA、大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ与RecA、大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ与RecA、噬菌体λ核酸外切酶与RecA、噬菌体T7-核酸外切酶基因6Ⅲ与RecA、大肠杆菌核酸外切酶I与Tth RecA、大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ与Tth RecA、大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ与Tth RecA、噬菌体λ核酸外切酶与Tth RecA、噬菌体T7-核酸外切酶基因6Ⅲ与Tth RecA、大肠杆菌核酸外切酶I与ET SSB、大肠杆菌核酸外切酶I与T4基因32单链结合蛋白、大肠杆菌核酸外切酶I与大肠杆菌SSB、大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ与ET SSB、大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ与T4基因32单链结合蛋白、大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ与大肠杆菌SSB、大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ与ET SSB、大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ与T4基因32单链结合蛋白;以及大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ与大肠杆菌SSB。

8.根据权利要求项1所述的方法，其中反应混合物包含1至100mg/l的外切酶以及1至100mg/l的单链DNA结合蛋白。

9.根据权利要求项1所述的方法，其中步骤（c）中，在10℃至38℃的温度下培养15分钟至60分钟。

10.根据权利要求项1所述的方法，其中细胞为大肠杆菌细胞，且受体载体为包含复制起点的质粒，其在大肠杆菌细胞中指挥质粒的复制。

11.根据权利要求项1所述的方法，其中转化细胞表达了来自重组DNA的标记基因，该标记基因使得转化细胞的选择或筛选得以完成。

12.一种用于将供体DNA分子在预定位置克隆至受体载体内的组合物，其包含：a)包含外切酶和单链DNA结合蛋白的酶合剂；以及

b)反应缓冲液：组分包含1至10mg/l三(羟甲基)氨基甲烷、1至10mg/l的NaCl、0.1至10mg/l对乙二胺四乙酸、0.1至10mg/l氯化镁、10至200g/l的甘油、10至50mg/l的牛血清白蛋白、0.1至10mg/l腺苷-5′-三磷酸、0.1至10g/l二硫苏糖醇，且其中反应缓冲液的pH为5.0至9.0。

13.根据权利要求项12所述的组合物，其中外切酶选自由以下各酶组成的群组：大肠杆菌核酸外切酶Ⅰ、大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ、大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ、噬菌体λ核酸外切酶及噬菌体T7-核酸外切酶基因6。

14.根据权利要求项13所述的组合物，其中单链DNA结合蛋白选自由以下蛋白组成的群组：极端耐热单链DNA结合蛋白、RecA、T4基因32单链结合蛋白及大肠杆菌单链DNA结合蛋白。

15.根据权利要求项14所述的组合物，其中包含酶组合物的酶合剂选自由以下各物组成的群组：大肠杆菌核酸外切酶I与RecA、大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ与RecA、大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ与RecA、噬菌体λ核酸外切酶与RecA、噬菌体T7-核酸外切酶基因6Ⅲ与RecA、大肠杆菌核酸外切酶I与Tth RecA、大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ与Tth RecA、大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ与Tth RecA、噬菌体λ核酸外切酶与Tth RecA、噬菌体T7-核酸外切酶基因6Ⅲ与Tth RecA、大肠杆菌核酸外切酶I与ET SSB、大肠杆菌核酸外切酶I与T4基因32单链结合蛋白、大肠杆菌核酸外切酶I与大肠杆菌SSB、大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ与ET SSB、大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ与T4基因32单链结合蛋白、大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ与大肠杆菌SSB、大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ与ET SSB、大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ与T4基因32单链结合蛋白;以及大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ与大肠杆菌SSB。

16.一种用于在预定位置将供体DNA分子克隆至受体载体内的试剂盒，该试剂盒包含：a)权利要求14项的组合物；以及

b)在克隆中使用这些组合物的说明书。

17.根据权利要求项16所述的试剂盒，其进一步包含用于克隆的感受态细胞。

18.一种用于将供体DNA分子在预定位置克隆至受体载体内的组合物，该组合物包含：a)受体载体，

b)在供体DNA分子的5′端和3′端分别包含第一序列和第二序列的扩展供体DNA分子，其中第一序列与第二序列中的任一者独自地至少具12个核苷酸长，且分别与受体载体的第一区域与第二区域完全一致；

c)包含外切酶和单链DNA结合蛋白的酶合剂，以及

d)反应缓冲液，其组分包括1至10mg/l三(羟甲基)氨基甲烷、1至10mg/l的NaCl、

0.1至10mg/l对乙二胺四乙酸、0.1至10mg/l氯化镁、10至200g/l的甘油、10至50mg/l的牛血清白蛋白、0.1至10mg/l腺苷-5′-三磷酸、0.1至10g/l二硫苏糖醇，且其中反应混合物的pH为5.0至9.0。

说明书

基于同源重组DNA的克隆方法及组合物

[0001] 对相关申请的交叉参考

[0002] 本申请享有并主张2008年9月10日提交的美国法典第35条119款(e)美国临时专利申请61/095877号的优先权，其公开内容整体并入此案以供参考。

技术领域

[0003] 本发明的实施例涉及用于分子克隆的方法及组合物，尤其是将供体DNA在预定位置克隆至受体载体内。

背景技术

[0004] 在分子生物学研究和生物技术行业，始终需要将所需的DNA分子克隆至载体内，尤其是在特定位置。将供体DNA在预定位置克隆至诸如质粒之类的受体载体内的传统方法通常包括六大步骤：(i)利用一或两种限制性核酸内切酶进行受体载体DNA的酶切，纯化线性载体；(ii)在供体DNA分子不在的情况下，利用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)处理线性载体，以使得连接过程中线性载体的自环化程度最小；(iii)利用PCR引物借助聚合酶链反应(PCR)扩增供体DNA，添加至用于线性化载体DNA的一或两种限制性核苷酸内切酶的扩增供体DNA限制性酶识别位点的5′端和3′端；(iv)利用线性化载体DNA所用的限制性核苷酸内切酶对扩增供体DNA进行内切，接着纯化内切供体DNA；(v)利用DNA连接酶将纯化供体DNA与纯化线性载体连接起来；以及(vi)将连接产物转化为受体细胞，例如大肠杆菌感受态细胞，选择含有所要克隆产物的转化细胞，其中供体DNA于所需克隆位点插入至载体内。传统克隆方法繁琐、费时。克隆效率相对较低。也受限于载体和供体DNA上适当限制性内切酶识别位点的可用性。

[0005] 基于重组的方法已被用于加速克隆。例如，Pentao Liu等(Genome Res(2003)13：476-484)所述的用于生成条件性剔除突变的重组工程方法。该方法使用噬菌体大肠杆菌同源重组系统，而无需限制性酶或DNA连接酶。特别是，该方法利用经λ噬菌体Red蛋白介导的同源重组，由细菌人工染色体(BAC)通过缺口修复克隆方法将DNA亚克隆至高拷贝质粒内，且与Cre或Flpe重组酶一起，将loxP或FRT位点引入至亚克隆DNA内。在此方法中使用长于45-55-bp的同源区域。类似许多其他重组方法，该方法取决于受体载体内的特定序列以及宿主细胞内特定噬菌体蛋白的表达，从而限制了只有特定载体和宿主细胞可使用。

[0006] 重组克隆的另一实例由Clontech Laboratories公司(加州，山景城，94043)开TM发：In-Fusion PCR克隆试剂盒。这种试剂盒旨在在没有PCR限制性酶切、连接或平端抛TM
光的情况，使得一步完成任何PCR片段至任何线性载体的克隆。In-Fusion 系统使得PCR片段顶端融合至线性载体的同远端。同源3′和5′区域通过将15bp扩增添加至两种PCRTM
引物产生，以便正好与线性载体两端相匹配。方法包括将线性载体、PCR片段和In-FusionTM
酶培养30分钟，随后完成大肠杆菌细胞的转化。In-Fusion 酶是一种将双链扩增添加至TM
单链DNA并将这些区域融合至线性载体的相应端的专利蛋白。同时In-Fusion 系统可快TM
速定向克隆PCR产物，而无载体和宿主细胞的限制，其取决于专利In-Fusion 酶，因此限制TM
了只能使用Clontech公司或其分支机构所售的In-Fusion PCR克隆试剂盒或类似系统。

[0007] 因此，需要一种新型的快速简单的方法能够将供体DNA克隆至载体的预定位置。本发明申请中描述了这样一种方法。根据本发明实施例的方法使用酶合剂来替代TM TMIn-fusion 酶，其具有所有In-fusion PCR克隆试剂盒的所有优势，同时克隆效率更高。

发明内容

[0008] 一方面，本发明实施例涉及一种将供体DNA分子克隆至受体载体预定位置的方法，该方法包含以下步骤：

[0009] a)通过将第一序列和第二序列分别添加至供体DNA分子的5′端和3′端来制备扩展供体DNA分子，其中，第一序列和第二序列中的任一者独立地至少具12个核苷酸长，且与受体载体的第一区域和第二区域分别至少有90％相一致；

[0010] b)提供包含以下物质的反应混合物

[0011] i)受体载体，

[0012] ii)扩展供体DNA分子，及

[0013] iii)包含外切酶和单链DNA结合蛋白的酶合剂；

[0014] c)反应混合物经培养获得中间产物；

[0015] d)利用中间产物进行细胞转化，获得转化细胞；及

[0016] e)在一定条件下培养该转化细胞，得到包含位于第一区域与第二区域之间的供体DNA的重组DNA分子。

[0017] 在本发明的一个实施例中，扩增供体DNA通过聚合酶链反应(PCR)来制备。

[0018] 另一方面，发明实施例涉及一种用于将供体DNA分子克隆至受体载体预定位置的组合物，该组合物包含：

[0019] a)包含内切酶和单链DNA结合蛋白的酶合剂；以及

[0020] b)反应缓冲液。

[0021] 本发明的一个实施例也涉及一种用于将供体DNA分子克隆至受体载体预定位置的试剂盒。这种试剂盒包含本发明实施例的组合物以及克隆中使用试剂盒的说明书。

[0022] 另一方面，发明实施例涉及一种用于将供体DNA分子克隆至受体载体预定位置的系统。该系统包含：

[0023] a)受体载体，

[0024] b)在供体DNA分子的5′端和3′端分别包含第一序列和第二序列的扩展供体DNA分子，其中第一序列与第二序列中的任一者独自地至少具12个核苷酸长，且分别于受体载体的第一区域与第二区域至少90％一致；

[0025] c)包含外切酶和单链DNA结合蛋白的酶合剂，以及

[0026] d)细胞随包含(a)、(b)和(c)的反应混合物培养后形成的中间产物发生转化，借此转化细胞产生了包含位于第一区域与第二区域之间的供体DNA的重组DNA分子。

[0027] 本发明的其他方面、特性和优点将通过以下公开为大家所知，包括本发明的详细描述及其优选实施例和所附权利要求书。

附图说明

[0028] 结合附图可更好地理解上述发明内容及以下发明详细说明。出于说明本发明的目的，在图中描述目前优选的实施例。但应理解的是，本发明不限于所示的确切配置和工具。

[0029] 图中：

[0030] 图1为本发明实施例方法的示意图。

具体实施方式

[0031] 除非另有规定，本文中所用的所有技术和科学术语具有本发明所涉及的行业普通技术人员所普遍理解的相同含义。另外，本文所用的某些术语具有发明说明所设定的含义。本文所引用的所有专利、公开的专利申请及出版物均并入本发明中作为参考。应注意的是，除非本文另有明确规定，本文及所附权利要求书中的所用的单数形式“一”和“这一”包括其复数参考形式。

[0032] 本文中所用的“序列”是指单体在聚合物中发生的线性顺序，例如多肽中氨基酸的顺序或多核苷酸中的核苷酸顺序。

[0033] 本文中所用的术语“核苷酸序列”、“核酸”或“多核苷酸”是指聚合物中脱氧核苷酸或核苷酸以单链或双链形式的排列组合。核酸序列由以下碱基的天然核苷酸组成：T、A、C、G、U和/或天然核苷酸的合成类似物。在本发明中，腺苷缩写为“A”，胞苷缩写为“C”，鸟苷缩写为“G”，胸苷缩写为“T”，尿苷缩写为“U”。多核苷酸可以是单链或双链核苷酸。除非另外说明，多核苷酸没有规定长度，因此其包括大型核酸以及较短的核酸，例如寡核苷酸。

[0034] 本文中使用传统符号来描述多核苷酸序列。单链核苷酸序列的左端为5′-端。双链多核苷酸序列的左端为正链的5′-端，被看作是双链的上游链。双链多核苷酸序列的右端为负链的5′-端，被看作是双链的下链。自5′向3′添加核苷酸至新生RNA转录的方向被称为转录方向。作为mRNA的具相同序列额DNA链被称为“编码链”。自5′端向DNA上参照点的DNA链序列被称为“上游序列”，而自3′端向DNA上参照点的DNA链序列被称为“下游序列”。

[0035] 本文中所用的“核苷酸补体”为与核苷酸完全互补的一种核酸序列。

[0036] 如本行业中所熟知的“序列同源性”为两个或两个以上多肽序列或两个或两个以上多核苷酸序列之间的关系，通过比较序列来确定。在两个或两个以上多肽序列或两个或两个以上多核苷酸序列之间的关系中，本文所用的“同源性”是指当最佳对齐和分析这些序列时，核苷酸或氨基酸残基的百分比分别相同。计算同源性以及对齐区域上两个序列之间同源性匹配的百分比，包括长度上的缺口。进行手动分析或使用序列比较算法。为了比较序列，通常将一个序列用作参考序列，与查询序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入电脑，指定子序列的位置，必要时，指定序列算法程序参数。

[0037] 通过本行业熟知的方法进行序列优化比对，例如Needleman & Wunsch(J.Mol.Biol.48：443(1970))、Smith & Waterman(Adv.Appl.Math.2：482(1981)) 或 Pearson & Lipman(Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 85：2444(1988))的同源算法，通过这些算法的计算机实现(Wisconsin基因软件包内的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group公司，地址：575 Science Dr.，Madison，Wis.)或通过外观检查。适用于确定序列同源性百分比和序列相似性的算法的一个实例为BLAST算法(Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990))。进行BLAST分析的软件可自美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站获得。

[0038] 本文中所用的“重组”是指由多核苷酸、细胞、病毒粒子或有机体编码而成的多核苷酸、多肽，可使用分子生物学技术进行对其进行部分修改，但不修改其天然状态。

[0039] 本文中所用的“重组DNA分子”是指不作为天然产物存在的DNA分子，而是利用分子生物学技术制备的。

[0040] 本文中所用的“转化细胞”、“转染细胞”、“转化”和“重组细胞”都是指引入重组多核苷酸序列的细胞。例如，转化细胞可含有至少一个天然细胞(非转化)形式中不存在的核苷酸序列，或可以表达那些异常表达、低表达或表达不完全的天然基因。转化细胞也可含有天然形式细胞中所发现的基因，其中基因可通过人工方法进行修改并重新引入细胞内。这个词强调细胞在载体上含有重组多核苷酸序列或已整合至细胞染色体内。

[0041] 可使用以下任何适当方法将重组DNA序列引入宿主细胞内，例如：电穿孔、磷酸钙沉淀法、显微注射、转化、基因枪法和病毒感染。重组DNA可能会或可能不会被整合到(共价键连接)构成细胞基因组的染色体DNA内。例如，重组DNA可始终位于附着性元素上，例如质粒。另外，对于稳定转化或转染的细胞而言，重组DNA可融入染色体内，以便通过染色体复制借由子细胞进行遗传。其稳定性借助稳定转化或转染细胞的能力来描述，以便建立由含有外源DNA的众多子细胞组成的细胞系或细胞克隆。应进一步了解的是，术语“转化细胞”不仅是指特定受试细胞，同时也指这一细胞的后代或潜在的后代。由于突变或环境影响，某些修改可能发生在后续代，在这种情况下，事实上这些后代可能与母细胞不一致，但这仍然包括在本文所用的术语范围内。

[0042] 本文中所用的术语“载体”是指能够将另一核酸运送至它所连接的另一核酸的核酸分子。一种载体为质粒，是指可插入额外的DNA片段内的环形双链DNA环。其他类型的载体包括但不限于细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)和噬菌体。某些载体能够在宿主细胞内完成自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附着性哺乳动物载体)。当引入宿主细胞时，其他载体(例如非附着性哺乳动物载体)可整合至宿主细胞的基因组内，因此随着宿主基因组进行复制。此外，某些载体(表达载体)能够将基因表达指向其切实可连接的基因。一般来说，重组DNA技术中所用的载体通常以质粒形式存在。这些质粒可以是单拷贝、低拷贝、中拷贝或高拷贝质粒。例如，借助Sambrook等人(Molecular Cloning，Laboratory Manual，第二版(1989)，冷泉港实验室出版社)与Ioannou等人(Nature Genet.6(1994)，84-89)或本文所引用的参考文献描述这些载体的实例。然而，本发明意欲也包括载体的其他形式，诸如病毒载体(例如复制缺陷逆转录病毒、腺病毒和腺体相关病毒)、BAC、YAC和质粒，这些载体均具有同样效果。

[0043] 特殊设计的载体使得不同宿主之间的DNA克隆或宿主之间的DNA穿梭得以进行，例如细菌-酵母或细菌-动物细胞或细菌-真菌细胞或细菌-无脊椎动物细胞。本领域普通技术人员均知道这众多载体，且适当载体的选择是一个选择的问题。对于其他用于原核和真核细胞的适当表达系统而言，参见上文中Sambrook等人著作的第16和第17章。

[0044] 本发明实施例涉及一种DNA快速克隆方法，它在传统DNA克隆技术以及其他重组克隆方法上作出了明显改善。根据本发明的实施例，几乎所有供体DNA分子利用一种方法均可克隆至任何载体的预定位置，该方法不再需要传统DNA克隆方法中的众多步骤，例如PCR扩增供体DNA的限制性酶切、利用碱性磷酸酶进行限制性酶切受体载体的脱磷酸作用、使用DNA连接酶进行供体DNA与受体DNA之间的连接等。根据本发明实施例的方法可大幅度地降低克隆时间和成本，同时为克隆中所用的载体和宿主细胞提供更好地使用适应性。根据本发明实施例的克隆方法利用供体DNA分子与受体载体之间同源重组。

[0045] 在本发明的一方面，使用包含以下步骤的方法，将供体DNA分子克隆至受体载体预定位置内：

[0046] a)通过将第一序列和第二序列分别添加至供体DNA分子的5′端和3′端来制备扩展供体DNA分子，其中，第一序列和第二序列中的任一者独立地至少具12个核苷酸长，且与受体载体的第一区域和第二区域分别至少有90％相一致；

[0047] b)提供包含以下物质的反应混合物

[0048] i)受体载体，

[0049] ii)扩展供体DNA分子，及

[0050] iii)包含外切酶和单链DNA结合蛋白的酶合剂；

[0051] c)反应混合物经培养获得中间产物；

[0052] d)利用中间产物进行细胞转化，获得转化细胞；及

[0053] e)在一定条件下培养该转化细胞，得到包含位于第一区域与第二区域之间的供体DNA的重组DNA分子。

[0054] 受体载体

[0055] 根据本发明所述内容，本领域普通技术人员均可简单地理解本发明中受体载体的选择和使用。受体载体可以是本领域所熟知的任何载体，例如质粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、病毒或噬菌体。

[0056] 在本发明的一个实施例中，受体载体具有一复制序列的起点，其使得转化原核或真核宿主细胞内的构建重组DNA的自生复制得以实现。例如，受体载体可具有大肠杆菌宿主细胞内构建重组DNA的自主复制的ColEl复制起点，2μ酵母宿主细胞的复制起点或病毒复制起点用于含有适当复制因子的宿主细胞以供病毒复制，例如SV40复制起点。

[0057] 在本发明的另一实施例中，受体载体具有能促进所构建重组DNA的整合或并入转化细胞基因组内的序列。

[0058] 在本发明的实施例中，受体载体含有一序列，其使得构建重组DNA表达受体载体不表达的标记基因产品，从而借助标记基因产品的存在的选择或筛选，完成含有重组DNA的转化细胞的选择或筛选。这可以通过重组DNA的设计来完成，例如，借助供体DNA的插入，提供标记基因的缺少元素。

[0059] 在本发明的另一实施例中，受体载体含有一序列，其使得所构建的重组DNA不表达受体载体所表达的标记基因产品，从而借助标记基因产品的缺失的选择或筛选，完成含有重组DNA的转化细胞的选择或筛选。这可以通过重组DNA的设计来完成，例如，借助供体DNA的插入使得标记基因无效。

[0060] 标记基因可以是选择性标记基因，该基因的表达可进行选择性介质上转化细胞的选择。选择性标记基因的实例包括但不限于，那些赋予抗药性的编码蛋白，例如抗生素、G418、潮霉素和甲氨蝶呤；以及那些在缺乏必须营养素的介质上赋予生长能力的编码蛋白。

[0061] 标记基因也可以是报告基因，报告基因的表达可使用常规实验室技术进行转化细胞的简单筛选。报告基因的实例包括但不限于，那些编码绿色荧光蛋白(GFP)、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、氯霉素乙酰转移酶、β-葡萄糖醛酸酶、新霉素磷酸转移酶、黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶等。

[0062] 受体载体内差异表达的标记基因及构建重组DNA，可自仅含有受体载体的那些转化细胞中，完成含有重组DNA的转化细胞的简单选择或筛选。然而，由于本发明方法所提供的高克隆效率，这样一个特性对于本发明方法而言，可能存在，但不必须。根据本发明所述内容，利用本领域所熟知的方法，可通过PCR筛选方法很容易地确认含有重组DNA的转化子。

[0063] 供体DNA可克隆至受体载体的任意预定位置。根据试验需求选择克隆位置。供体DNA可在替代或切除一部分载体的情况下，或没有替代或切除一部分载体的情况下插入受体载体。如果由于同源重组，切除掉一部分自动复制的受体载体，要采取审慎态度确保载体复制起点仍然位于构建重组DNA中。

[0064] 一旦选择好插入供体DNA分子的位置，应很容易地分辨受体载体上所选位置两侧区域的序列，例如，通过载体原有序列或通过区域的顺序。

[0065] 本文中所用的“第一区域”是指位于预定插入位置的5′端上游的序列。当需要将供体DNA准确插入插入位置的5′端时，第一区域与预定插入位置的第一或5′端最大额核苷酸相连。

[0066] 本文中所用的“第二区域”是指位于预定插入位置的3′端下游的序列。当需要将供体DNA准确插入插入位置的3′端时，第二区域与预定插入位置的最后一个或3′端最大的核苷酸相连。

[0067] 在本发明的实施例中，受体载体为质粒，用于插入供体DNA的预定位置位于限制性内切酶切割位点，或位于两个限制性内切酶切割位点之间。质粒通过一或两种限制性内切酶进行消化。限制性酶消化后，这一伙两种限制性酶经热灭活，且线性质粒经凝胶纯化或柱纯化法进行纯化。第一区域和第二区域分别是位于线性质粒两端的序列。

[0068] 在本发明的另一实施例中，受体载体是环形、未经任何限制性酶消化或切割的。根据本发明实施例，可在反应混合物中直接使用未切割质粒用于同源重组。

[0069] 扩展供体DNA分子的制备

[0070] 任何供体DNA都可利用本发明克隆至载体。供体DNA分子的实例包括但不限于cDNA或基因组DNA片段。供体DNA分子可以是所需要的基因编码蛋白。也可以是所需要的携带基因突变或基因病变的序列，用于快速形成DNA突变。基因突变或基因病变包括但不限于：1)切除目标DNA的一或多个核苷酸；2)向目标DNA添加一或多个核苷酸；3)取代目标DNA的一或多个核苷酸；等。DNA突变形成，例如引入包括点突变、增删在内的DNA突变，如使用常规方法进行DNA克隆，传统上以相同方式进行。本发明方法也可用于DNA突变快速形成，从而显著降低DNA突变形成的时间和相关费用。

[0071] 在本发明实施例中，通过向供体DNA两端添加第一序列或第二序列进行扩增，其中第一序列或第二序列与上文所述的受体载体的第一区域或第二区域具有足够的同源性，因此高效同源组合物恰恰分别发生在第一序列与第一区域之间，以及第二序列与第二区域之间。

[0072] 在本发明的另一实施例中，第一序列和第二序列各具12个核苷酸长，且与第一和第二区域分别具有至少约90％的序列同源性。例如，第一序列和第二序列各具12、15、20、25、30、35、40、45、50个核苷酸长，且与第一和第二区域分别具有约90％、95％或100％的序列同源性。

[0073] 在本发明的一个实施例中，第一序列和第二序列各具至少12个核苷酸长，且分别于第一区域和第二区域具有约100％序列同源性。

[0074] 根据本发明所述内容，使用本领域所熟知的任何方法来制备扩展供体DNA分子。例如，扩展供体DNA可通过化学合成来制备。扩展DNA也可进行重组制备，随后进行适当的限制性酶裂解和纯化。

[0075] 在优选实施例中，扩展供体DNA分子可通过PCR来制备。每一PCR引物都由两部分组成：5′插入序列和3′端供体DNA特定序列。一PCR引物含有第一序列作为5′插入序列，其他引物含有第二序列的补体。根据本发明所述内容，可使用本领域所熟知的方法进行PCR引物中3′端供体DNA特定序列。例如，供体DNA特定序列必须对供体DNA上目标区域具有特定意义，可以是10-25个碱基长，具有约35-65％的GC浓度。作为优选，两种PCR引物具有在55-70℃范围内的类似融化温度(Tm)等。

[0076] 根据本发明所述内容，可使用本领域中所熟知的任何PCR应用。借由大家所熟知2
的知识或常规实验方法选择或优化PCR条件，例如模板和引物的数量、Mg+和dNTP的浓度、退火和热循环条件等。

[0077] 在本发明的实施例中，可以所需次序在受体载体的预定位置上克隆不止一个供体DNA分子。扩展供体DNA分子两端的插入序列经设计，以便以预定顺序完成供体DNA分子之间的同源重组，并完成预定位置上供体DNA分子与受体载体之间的同源重组。

[0078] 另外，可首先使用本领域熟知的方法将多个供体DNA分子结合在一起，例如DNA连接或融合PCR。接着可将含有多个供体DNA分子的联产品利用本发明方法插入受体载体内。

[0079] 在本发明的另一实施例中，一组具有同源序列的供体DNA分子，例如来自于DNA文库或cDNA文库，可在受体载体的预定位置进行克隆。例如，可使用一对通用PCR引物借由PCR，将第一和第二序列添加至每一供体DNA分子的两端。接着利用本文所述方法，将扩展过的同源供体DNA分子借由同源重组克隆至受体载体。

[0080] 酶合剂

[0081] 不同于使用专利融合酶的Clontech公司的In-FusionTM克隆系统，一种通过在两端识别15bp重叠，将PCR产生的供体序列融合至线性载体的蛋白。本发明方法在扩展供体DNA分子和受体载体体外治疗中使用酶合剂，以此启动和介导同源重组，并通过转化细胞的体内重组系统来完成。

[0082] 本发明实施例的酶合剂包含外切酶和单链DNA结合蛋白。每一蛋白可以被本领域熟知的类似蛋白所替代，这些类似蛋白能够以大致相同的方法起作用。

[0083] 本文中所使用的术语“外切酶”是指通过在3′或5′端打破磷酸二酯键的水解反应，自多核苷酸链一端依次分开核苷酸的酶。“外切酶”可以是3′端向5′端的外切酶，也可以是5′端向3′端的外切酶。大肠杆菌核酸外切酶I和外切酶III为两种具有3′-核酸外切除单链降解活性的常用3′→5′端核酸外切酶。大肠杆菌核酸外切酶VII和T7-核酸外切酶基因6为具有5′-核酸外切除单链降解活性的常用5′→3′端核酸外切酶。

[0084] 核酸外切酶起源于原核生物，诸如大肠杆菌核酸外切酶，或真核生物，诸如酵母、线虫、小鼠或人类核酸外切酶。

[0085] 可用于本发明的核酸外切酶实例包括但不限于大肠杆菌核酸外切酶I、大肠杆菌核酸外切酶III、大肠杆菌核酸外切酶VII、噬菌体λ核酸外切酶及噬菌体T7-核酸外切酶基因6或其组合物。

[0086] 本文中所用的“单链DNA结合蛋白”，也称为SSB或SSBP，是指结合DNA单链区域的蛋白。“SSB”可源自人体病毒。“SSB”可以是单体，诸如噬菌体和病毒体内所发现的许多蛋白，或者也可以是多聚体，诸如四聚体细菌SSB或异源三聚体真核复制蛋白A(RPA)。

[0087] 可用于本发明的单链DNA结合蛋白实例包括但不限于极端耐热单链DNA结合蛋白(ET SSB)、RecA(诸如大肠杆菌RecA(任何由大肠杆菌重组表达的RecA)或其衍生物)、T4基因32单链结合蛋白、极端嗜热RecA(Tth RecA)及大肠杆菌单链DNA结合蛋白或其组合物。

[0088] 根据本发明实施例的酶合剂可包含外切酶和SSB的任意组合。这些组合物实例包括但不限于由以下各物组成的群组：大肠杆菌核酸外切酶I与RecA、大肠杆菌核酸外切酶III与RecA、大肠杆菌核酸外切酶VII与RecA、噬菌体λ核酸外切酶与RecA、噬菌体T7-核酸外切酶基因6III与RecA、大肠杆菌核酸外切酶I与Tth RecA、大肠杆菌核酸外切酶III与TthRecA、大肠杆菌核酸外切酶VII与Tth RecA、噬菌体λ核酸外切酶与Tth RecA、噬菌体T7-核酸外切酶基因6III与Tth RecA、大肠杆菌核酸外切酶I与ET SSB、大肠杆菌核酸外切酶I与T4基因32单链结合蛋白、大肠杆菌核酸外切酶I与大肠杆菌SSB、大肠杆菌核酸外切酶III与ET SSB、大肠杆菌核酸外切酶III与T4基因32单链结合蛋白、大肠杆菌核酸外切酶III与大肠杆菌SSB、大肠杆菌核酸外切酶VII与ET SSB、大肠杆菌核酸外切酶VII与T4基因32单链结合蛋白；以及大肠杆菌核酸外切酶VII与大肠杆菌SSB。

[0089] 体外治疗

[0090] 根据本发明实施例，通过在反应混合物中将DNA分子和酶合剂进行体外培养，以此开始、介导或促进扩展供体DNA与受体载体之间的同源重组。

[0091] 反应混合物包含受体载体、扩展供体分子、酶合剂和反应缓冲液。

[0092] 反应缓冲液包含缓冲剂、盐和腺苷-5′-三磷酸(ATP)，其pH为约5.0至约9.0。在本发明实施例中，反应缓冲液包含三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、NaCl、EDTA、MgCl2、甘油、牛血清白蛋白(BSA)、ATP和二硫苏糖醇(DTT)，pH约为6.8至7.4。这些试剂中的每一种都可由本领域中熟知的在溶液中以类似方式起作用的类似试剂所替代。例如，BSA可由本领域中熟知的酪蛋白和/或其他试剂替代。NaCl也可由KCl替代。

[0093] 另一方面，本发明实施例涉及一种用于将供体DNA分子克隆至受体载体预定位置的组合物。该组合物包含：a)包含外切酶和单链DNA结合蛋白的酶合剂，以及b)反应缓冲液。

[0094] 酶合剂与反应缓冲液可由试剂盒提供，用于将供体DNA分子克隆至受体载体预定位置，试剂盒也包括克隆中使用酶合剂和反应缓冲液的说明书。试剂盒可能进一步含有用于克隆中转化的感受态细胞。试剂盒也可包括用于克隆的对照载体或DNA分子。

[0095] 酶合剂和反应缓冲液能够以适用于其应用的多种形式提供。例如，酶合剂能以浓缩液形式或冻干形式提供，附带或没有附带稀释或重组缓冲液。反应缓冲液以浓缩或冻干形式于一个容器中提供。此外，以独立容器提供的反应缓冲液的一或多种成分可在使用时组合在一起。

[0096] 在本发明的一个实施例中，反应混合物包含约0.5至10ng/μl受体载体。例如，反应混合物可含有约0.5、1、5或10ng/μl受体载体。

[0097] 在本发明的一个实施例中，反应混合物含有约1至约30ng/μl扩展DNA分子。例如，反应混合物可含有约1、5、10、15、20、25或30ng/μl扩展DNA分子。

[0098] 在本发明的一个实施例中，反应混合物含有约1至约100ng/μl单链DNA结合蛋白。例如，反应混合物可含有约1、5、15、25、35、45、55、65、75、85、95或100mg/l单链DNA结合蛋白。

[0099] 在本发明的一个实施例中，反应混合物含有约1至约100ng/μl外切酶。例如，反应混合物可含有约1、5、15、25、35、45、55、65、75、85、95或100mg/l外切酶。

[0100] 在本发明的一个实施例中，1L反应混合物含有约1g至10g Tris(例如约5g Tris)；约0.1g至10g NaCl(例如约5g)；约0.1g至10g EDTA(例如约2g)；约0.1g至约10g MgCl2(例如约1g)；约10g至约200g甘油(例如约50g)；约10g至50g BSA(例如约
20g)；约0.1g至约10g ATP(例如约1g)；约0.1g至约10g DDT(例如约1g)；约1mg至约
100mgRecA(例如75mg)(例如，大肠杆菌RecA，任何经大肠杆菌重组表达的RecA或其衍生物)；约1mg至约100mg大肠杆菌核酸外切酶VII(例如约35mg)。反应混合物进一步包含约0.5ng/μl至约10ng/μl线性载体(例如5ng/μl)以及约1ng/μl至约30ng/μl扩展供体DNA(诸如约5至约15ng/μl)。反应混合物的pH可以为约5.0至约9.0，例如约6.8至7.4左右或约7.6。

[0101] 在本发明实施例中，反应混合物在约10至38℃温度下培养10至60分钟。

[0102] 在本发明的另一实施例中，反应混合物在室温下培养约30分钟。

[0103] 应注意的是，本发明不限于本文中所述的浓度、成分或实验条件。也可使用等效浓度、成分或实验条件。

[0104] 细胞转化

[0105] 反应混合物体外培养后形成中间产物。由本发明内容可知，使用本行业熟知的方法可将中间产物转化至宿主细胞内。

[0106] 中间产物可通过传统转化或转染技术引入原核或真核细胞内，这些技术包括但不限于磷酸钙或氯化钙共沉淀法、电穿孔、DEAE-葡聚糖介导转染、脂质转染、原生质体融合及病毒感染。转化或转染宿主细胞的适当方法可见Sambrook等人(supra)的著作及其他实验室手册。

[0107] 对于稳定转染哺乳动物细胞而言，可知只有一小部分细胞可将外源DNA集成到其基因组内，这取决于所用的表达载体和转染技术而定。为了识别和选择这些整合体，通常将编码选择性标记(例如，抗生素抗性)的基因随基因兴趣引入宿主细胞。优选考虑的选择性标记包括赋予抗药性的标记，例如G418、潮霉素和甲氨蝶呤药物。经引入核酸稳定转染的细胞可通过药物选择进行识别(例如，亦并入选择性标记基因的细胞才能生存，而其他细胞则死亡)。

[0108] 适用于本发明转化的细胞包括但不限于细菌细胞(例如革兰氏阴性细菌细胞或革兰氏阳性细菌细胞)、酵母细胞、哺乳动物细胞等。

[0109] 在本发明的一个实施例中，用于转化的细胞为感受态大肠杆菌细胞。例如，约2-10μl反应混合物经培养根据标准转化程序用于转化50μl感受态细胞。

[0110] 已转化的细胞可在选择介质上进行选择。含有重组DNA的细胞包含在受体载体预定位置插入的供体DNA，使用PCR筛选方法可进行筛选。

[0111] 不希望被理论束缚，大家相信在本发明实施例的方法中，同源重组是在受体载体和供体DNA的体外治疗过程中发生和介导的，且在转化细胞体内完成。大家相信在体外治疗中，外切酶作用于线性扩展供体DNA分子的两端，得到两端单链DNA(ssDNA)突出部分。单链结合蛋白(SSB)结合至ssDNA突出部分，以便防止其降解，特别是引入宿主细胞，例如大肠杆菌。人们相信体外治疗后形成的中间产物中，ssDNA突出部分与受体载体的第一或第二区域中互补序列形成碱基对相互作用。当中间产物引入宿主细胞时，同源重组分别在第一区域和第一序列及第二区域和第二序列之间发生，从而得到宿主细胞的重组功能。

[0112] 不考虑其实际机制，发现使用本发明方法，可将不同大小的供体DNA分子高效克隆至载体预定位置。

[0113] 表1总结了1千碱、2千碱和3千碱大小的供体DAN分子至UC57载体的克隆结果。

[0114] 表1

[0115]PCR DNA大 1千碱 2千碱 4千碱
菌落数量 -1200 -1000 221
阳性率 8/8 7/8 7/8

[0116] 在每一个重组试验中，8种菌落经筛选用于PCR DNA的正确插入。

[0117] 另一方面，本发明实施例涉及一种用于将供体DNA分子克隆至受体载体预定位置的系统。该系统包含：

[0118] a)受体载体，

[0119] b)在供体DNA分子的5′端和3′端分别包含第一序列和第二序列的扩展供体DNA分子，其中第一序列与第二序列中的任一者独自地至少具12个核苷酸长，且分别于受体载体的第一区域与第二区域至少90％一致；

[0120] c)包含外切酶和单链DNA结合蛋白的酶合剂，以及

[0121] d)细胞随包含(a)、(b)和(c)的反应混合物培养后形成的中间产物发生转化，借此转化细胞产生了包含位于第一区域与第二区域之间的供体DNA的重组DNA分子。

[0122] 现已对本发明的各个实施例进行描述。但应注意的是，这些具体实施例的描述仅出于说明发明构思的目的。本领域技术人员应能理解在不背离本发明构思的情况下，对这些实施例作出修改。因此，据了解本发明不限于所公开的特定实施例，但其目的是覆盖所附权利要求书中所定义的在本发明精神和范畴内的修改。

[0123] 参考文献

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